JP2004159504A - Gene transfer agent composition comprising polyamidoamine dendron - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a highly safe gene transfer agent having excellent transfer efficiency and to provide a kit for gene transfer and a method for gene transfer. <P>SOLUTION: The gene transfer agent composition comprises a polyamidoamine dendron. Thereby, the gene transfer agent having remarkably improved gene transfer efficiency as compared with that of a conventional gene transfer agent and low cytotoxicity is obtained. Furthermore, a technology for gene transfer having both excellent aspects of safety and transfer efficiency is established. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【００１０】
本発明の好ましいポリアミドアミンデンドロンを以下に示す。
【００１１】
【化２】

【００１２】
本発明の遺伝子導入剤組成物は、ポリアミドアミンデンドロンの他に、リン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数１２から１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
【００１３】
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質とポリアミドアミンデンドロンの合計量を１００重量部とした場合にリン脂質３０〜９０重量部、ポリアミドアミンデンドロン７０〜１０重量部、好ましくはリン脂質５０〜８０重量部、ポリアミドアミンデンドロン５０〜２０重量部、より好ましくはリン脂質６０〜７０重量部、ポリアミドアミンデンドロン４０〜３０重量部である。
【００１４】
リン脂質の他に、遺伝子導入剤組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
【００１５】
ポリアミドアミンデンドロン脂質を単独で用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜２０重量部、好ましくは３〜１５重量部、より好ましくは５〜７重量部使用する。また、ポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜５０重量部、好ましくは５〜３０重量部、より好ましくは１０〜１５重量部使用する。
【００１６】
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
【００１７】
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
【００１８】
本発明の組成物の形態としては、ポリアミドアミンデンドロン（ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８）のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質が単に混合物として存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質とが組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。該脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
【００１９】
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
【００２０】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子径が５０ｎｍから数μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５ｎｍから５０ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成していると考えればよい。
【００２１】
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【００２２】
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５から５０ｍＭが好ましく、１０から２０ｍＭがさらに好ましい。
【００２３】
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、０．０１ｍＭから２０ｍＭがさらに好ましい。
【００２４】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００２５】
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持させることができるといったメリットがある。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子を効率良く導入することができる。
【００２７】
イン・ビトロでの遺伝子導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子含有導入剤組成物を添加したり、本発明の遺伝子含有組成物を含有する培地で標的とする細胞を培養する等の手段により、行うことができる。
【００２８】
イン・ビボでの遺伝子導入は、本発明の遺伝子含有組成物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の遺伝子導入剤と比較して、遺伝子導入効率を格段に向上し、かつ、細胞毒性の低い遺伝子導入剤が得られ、安全性及び導入効率の両面に優れた遺伝子導入技術が確立された。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００３１】
なお、以下の実施例において、「リポプレックス」とは本発明のデンドロン脂質とＤＮＡの複合体を意味する。
実施例１
１． デンドロン脂質（ＤＬ）の合成
１．１． ＤＬ−Ｇ−０．５の合成
蒸留したアクリル酸メチル（１４ｍｌ， ０．１５６ｍｏｌ）にジ−ｎ−ドデシルアミン（２．００ｇ， ５．６６ｍｍｏｌ）を溶かし、窒素雰囲気において８０℃で１８時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒 石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１）で精製した。（収量２．３８７ｇ， ９６．１％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８５ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２３ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．３８ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３５ （ｔ， Ｈｆ）， δ ２．４０ （ｔ， Ｈｄ）， δ ２．７４ （ｔ， Ｈｅ）， δ ３．６３ （ｓ， ＯＣＨ３）；^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２７．１， ２７．５， ２９．３， ２９．６ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．２ （Ｃｆ）， δ ４９．３ （Ｃｅ）， δ ５１．４ （ＯＣＨ３）， δ ５３．９ （Ｃｄ）， δ １７３．３ （ＣＯＯＣＨ３）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ ４４０．７ （Ｍ＋１）．１．２． ＤＬ−Ｇ０の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５ （２．１６２ｇ， ４．９２ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ， １．２３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０４８ｇ， ０．９７９ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１００ｍｌ， １．５０ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） によって精製した。（収量１．９４５ｇ， ８４．６％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８５ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２３ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．４１ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３３ （ｔ， Ｈｆ）， δ ２．３９ （ｔ， Ｈｄ）， δ ２．６２ （ｔ， Ｈｅ）， δ ２．７６ （ｔ， Ｈｈ）， δ ３．２５ （ｍ， Ｈｇ）， δ ８．６５ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．６， ２６．６， ２７．６， ２９．３， ２９．６ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．７ （Ｃｆ）， δ ４１．９ （Ｃｈ）， δ ４２．２ （Ｃｇ）， δ ５０．３ （Ｃｅ）， δ ５３．３ （Ｃｄ）， δ １７３．３ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ ４６８．２ （Ｍ＋１）．
１．３． ＤＬ−Ｇ０．５の合成
ＤＬ−Ｇ０（２．２５６ｇ， ４．８２ｍｍｏｌ）をメタノール（１７．５ｍｌ， ０．４３１ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（４３．５ｍｌ， ０．４８５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒 石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１ のち ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。（収量２．６３４ｇ， ８５．４％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８４ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２１ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．３９ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３０ （ｔ， Ｈｆ）， δ ２．３８ （ｍ， Ｈｊ）， δ ２．３９ （ｍ， Ｈｄ）， δ ２．４９ （ｔ， Ｈｈ）， δ ２．６７ （ｔ， Ｈｅ）， δ ２．７３ （ｔ， Ｈｉ）， δ ３．２５ （ｍ， Ｈｇ）， δ ３．６３ （ｓ， ＯＣＨ３）， δ７．７６ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．６， ２６．７， ２７．６， ２９．３， ２９．６， ３１．９ ａｎｄ ３２．５ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３３．１ （Ｃｊ）， δ ３６．９ （Ｃｆ）， δ ４９．１ （Ｃｉ）， δ ５０．１ （Ｃｅ）， δ ５１．５ （ＯＣＨ３）， δ ５３．０ （Ｃｄ）， δ ５３．５ （Ｃｈ）， δ １７２．７ （ＣＯＯＣＨ３）， δ １７２．８ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ ６４０．８ （Ｍ＋１）．１．４． ＤＬ−Ｇ１の合成
ＤＬ−Ｇ０．５（０．７１４ｇ， １．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０．５ｍｌ， ０．５０５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０１１ｇ， ０．２２４ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（３７．５ｍｌ， ０．５６２ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） によって精製した。（収量０．６７４ｇ， ８６．４％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８４ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２２ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．３８ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．１２ （ｍ， ＮＨ２）， δ ２．２８ （ｍ， Ｈｊ）， δ ２．３１ （ｍ， Ｈｆ）， δ ２．３６ （ｍ， Ｈｄ）， δ ２．４６ （ｔ， Ｈｈ）， δ ２．６３ （ｔ， Ｈｅ）， δ ２．７０ （ｔ， Ｈｉ）， δ ２．７９ （ｔ， Ｈｌ）， δ ３．１７ （ｍ， Ｈｇ）， δ ３．２５ （ｍ， Ｈｋ）， δ ７．４５ ａｎｄ ８．６３ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．０ （Ｃａ）， δ ２２．６， ２６．５， ２７．６， ２９．２， ２９．６ ａｎｄ ３１．８ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．９ ａｎｄ ３４．３ （Ｃｆ， Ｃｊ）， δ ３７．８ （Ｃｇ）， δ ４１．３ ａｎｄ ４１．９ （Ｃｋ， Ｃｌ）， δ ５０．０ （Ｃｉ）， δ ５０．８ （Ｃｅ）， δ ５２．９ （Ｃｄ）， δ ５３．３ （Ｃｈ）， δ １７３．４ ａｎｄ １７２．９ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ ６９７．４ （Ｍ＋１）．
１．５． ＤＬ−Ｇ１．５の合成
ＤＬ−Ｇ１（１．５３９ｇ， ２．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（８６．５ｍｌ， ２．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１５２ｍｌ， １．６９ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒 ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。（収量１．７０３ｇ， ７４．０％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８８ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２６ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．４５ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３７ （ｍ， Ｈｊ）， δ ２．４４ （ｍ， Ｈｄ）， δ ２．５６ （ｍ， Ｈｈ）， δ ２．７７ （ｍ， Ｈｉ）， δ ３．２９ （ｍ， Ｈｇ）， δ ３．６８ （ｓ， ＯＣＨ３）， δ ７．０４ ａｎｄ ８．０８ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２６．５， ２７．６， ２９．４， ２９．６ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．７， ３３．０ ａｎｄ ３３．９ （Ｃｊ）， δ ３７．２ ａｎｄ ３７．５ （Ｃｇ）， δ ４９．３ ａｎｄ ５０．０ （Ｃｉ）， δ ５０．２ （Ｃｅ）， δ ５１．７ （ＯＣＨ３）， δ ５２．８ （Ｃｄ）， δ ５３．０ ａｎｄ ５３．４ （Ｃｈ）， δ １７２．３ （ＣＯＯＣＨ３）， δ １７２．７ ａｎｄ １７３．１ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ １０４１．５ （Ｍ＋１）．
１．６． ＤＬ−Ｇ２の合成
ＤＬ−Ｇ１．５（１．７０３ｇ， １．６４ｍｍｏｌ）をメタノール（４６ｍｌ， １．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０３２ｇ， ０．６５５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１３４ｍｌ， ２．００ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） によって精製した。（収量１．７１３ｇ， ９０．８％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８７ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２５ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．４２ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．１３ （ｍ， ＮＨ２）， δ ２．３３ （ｍ， Ｈｊ）， δ ２．３６ （ｍ， Ｈｄ）， δ ２．５２ （ｍ， Ｈｈ）， δ ２．７３ （ｍ， Ｈｉ）， δ ２．８２ （ｍ， Ｈｌ）， δ ３．２４ （ｍ， Ｈｇ）， δ ３．２７ （ｍ， Ｈｋ）， δ ７．７４， ７．７９ ａｎｄ ８．５８ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．２ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２６．６， ２７．７， ２９．４， ２９．７ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３３．０， ３４．０ ａｎｄ ３４．３ （Ｃｆ， Ｃｊ）， δ ３７．８ （Ｃｇ）， δ ４１．５ ａｎｄ ４２．２ （Ｃｋ， Ｃｌ）， δ ５０．２ （Ｃｉ）， δ ５０．５ （Ｃｅ）， δ ５３．０ （Ｃｄ）， δ ５３．３ （Ｃｈ）， δ １７２．６， １７３．０ ａｎｄ １７３．４ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ １１５３．０ （Ｍ＋）．
１．７． ＤＬ−Ｇ２．５の合成
ＤＬ−Ｇ２（１．７１３ｇ， １．４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１２０ｍｌ， ２．９６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１００ｍｌ， １．１２ｍｏｌ）に徐々に加え、３０℃で２５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒 ジクロロメタン：メタノール＝８５：１５ のち ８０：２０）で精製した。（収量１．９００ｇ， ６９．４％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８８ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２６ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．４５ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３７ （ｍ， Ｈｊ）， δ ２．４４ （ｍ， Ｈｄ）， δ ２．５６ （ｍ， Ｈｈ）， δ ２．７６ （ｍ， Ｈｉ）， δ ３．２８ （ｍ， Ｈｇ）， δ ３．６８ （ｓ， ＯＣＨ３）， δ ７．１３， ７．６７ ａｎｄ ８．１２ （ｍ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２６．５， ２７．６， ２９．４， ２９．６， ２９．７ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．７ （Ｃｆ）， ３３．９ （Ｃｊ）， δ ３７．２ ａｎｄ ３７．５ （Ｃｇ）， δ４９．３ ａｎｄ ４９．９ （Ｃｉ）， δ ５０．２ （Ｃｅ）， δ ５１．７ （ＯＣＨ３）， δ ５２．６ （Ｃｄ）， δ ５３．０ａｎｄ ５３．４ （Ｃｈ）， δ １７２．４ （ＣＯＯＣＨ３）， １７３．０ （ＣＯＯＣＨ３）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ １８４０．７ （Ｍ＋）．
１．８． ＤＬ−Ｇ３の合成
ＤＬ−Ｇ２．５（０．１１５ｇ， ０．０６３ｍｍｏｌ）をメタノール（２．５３ｍｌ， ０．６２５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．００１２ｇ， ０．０２５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（５．００ｍｌ， ０．０７５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） によって精製した。（収量０．１１４ｇ， ８８．４％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８８ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２６ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．４２ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．３７ （ｂｒ， Ｈｊ）， δ ２．５４ （ｂｒ， Ｈｈ）， δ ２．７５ （ｂｒ， Ｈｉ）， δ ２．８３ （ｂｒ， Ｈｌ）， δ ３．２４ （ｂｒ， Ｈｇ）， δ ３．２９ （ｂｒ， Ｈｋ）， δ ７．９４， ８．０７ ａｎｄ ８．５７ （ｂｒ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．２ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２６．５， ２７．７， ２９．４， ２９．７ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３４．０ ａｎｄ ３４．３ （Ｃｆ， Ｃｊ）， δ ３７．８ （Ｃｇ）， δ ４１．４ ａｎｄ ４１．９ （Ｃｋ， Ｃｌ）， δ ５０．１ （Ｃｉ）， δ ５０．５ （Ｃｅ）， δ ５２．９ （Ｃｄ）， δ ５３．３ （Ｃｈ），δ １７２．８ ａｎｄ １７３．１ （ＣＯＮＨ）； ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ ２０６６．０ （Ｍ＋）．１．９． ＤＬ−Ｇ３．５の合成
ＤＬ−Ｇ３（１．００４ｇ， ０．４８６ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ， ０．９８６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（３５ｍｌ， ０．３９ｍｏｌ）に徐々に加え、２５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） により二度精製後、さらにシリカゲル（展開溶媒 ジクロロメタン：メタノール＝８：２）で精製した。（収量１．１４１ｇ， ６８．２％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ ０．８８ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２３ （ｓ， Ｈｂ）， δ ２．３７ （ｂｒ， Ｈｊ）， δ ２．４４ （ｂｒ， Ｈｄ）， δ ２．５４ （ｂｒ， Ｈｈ）， δ ２．７６ （ｂｒ， Ｈｉ）， δ ３．２７ （ｂｒ， Ｈｇ）， δ ３．６７ （ｓ， ＯＣＨ３）， δ ７．１３， ７．７１ ａｎｄ ８．１０ （ｂｒ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １４．１ （Ｃａ）， δ ２２．７， ２９．４， ２９．７ ａｎｄ ３１．９ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３２．７ （Ｃｆ）， ３３．８ （Ｃｊ）， δ ３７．２ ａｎｄ ３７．５ （Ｃｇ）， δ ４９．３ ａｎｄ ４９．９ （Ｃｉ）， δ ５０．６ （Ｃｅ）， δ ５１．７ （ＯＣＨ３）， δ ５２．５ （Ｃｄ）， δ ５３．０ （Ｃｈ）， δ １７２．４ （ＣＯＯＣＨ３）， δ １７２．６ ａｎｄ １７３．１ （ＣＯＮＨ）．
１．１０． ＤＬ−Ｇ４の合成
ＤＬ−Ｇ３．５（１．１４１ｇ， ０．３３１ｍｍｏｌ）をメタノール（１８．５ｍｌ， ０．４５６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．００６５ｇ， ０．１３３ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（３７ｍｌ， ０．５５４ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（溶離液 メタノール） により二度精製した。（収量０．６９９ｇ， ５４．２％．）
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ０．８５ （ｍ， Ｈａ）， δ １．２６ （ｓ， Ｈｂ）， δ １．３７ （ｍ， Ｈｃ）， δ ２．２０ （ｂｒ， Ｈｊ）， δ ２．３０ （ｂｒ， Ｈｄ）， δ ２．５７ （ｂｒ， Ｈｈ）， δ ２．６５ （ｂｒ， Ｈｉ）， δ ３．０７ （ｂｒ， Ｈｋ）， δ ７．９１， ７．９８ ａｎｄ ８．１６ （ｂｒ， ＣＯＮＨ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １４．０ （Ｃａ）， δ ２２．２， ２７．０， ２９．１ ａｎｄ ３１．４ （Ｃｂ， Ｃｃ）， δ ３３．３ （Ｃｆ， Ｃｊ）， δ ３７．０ （Ｃｇ）， δ ４１．７ （Ｃｋ， Ｃｌ）， δ ４９．７ （Ｃｉ）， δ ５２．２ （Ｃｈ）， δ １７１．６ （ＣＯＮＨ）．
２． 測定
２．１． 電気泳動による複合体形成能の評価
デンドロン脂質（ＤＬ−Ｇ１，ＤＬＧ２，ＤＬＧ−３，ＤＬＧ４）のクロロホルム溶液（ＤＬＧ４についてはメタノール溶液）から溶媒を減圧留去し、脂質薄膜を得た。これにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、調製したデンドロン脂質分散液を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５μｌ）にＮ／Ｐ比が０．２、０．４、０．６、０．７、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６になるように加えて混合し（全量１０μｌ）、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した。調製したリポプレックスを０．６ｗｔ％アガロースゲルに加え、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ／ ２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ／ ２ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａバッファー中において１００Ｖの電位下、３０分間電気泳動を行った。なお、電気泳動は Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ Ｃｏ．）を用いて行った（図１）。
２．２． リポプレックスの調製
２．２．１デンドロン脂質とプラスミドＤＮＡとのリポプレックス
カチオン性脂質（ＤＬ−Ｇ１、ＤＬ−Ｇ２、ＤＬ−Ｇ３、ＤＬ−Ｇ４）のクロロホルム溶液（ＤＬ−Ｇ４についてはメタノール溶液）からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにＰＢＳを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）と種々の濃度の脂質分散液（５０μｌ）を加えて混合し、室温で１０分間インキュベーションして、リポプレックスを得た図２。
２．２．２．ＤＬ−Ｇ３、ＤＯＰＥ、プラスミドからなるリポプレックス
ＤＬ−Ｇ３（４１．７μｇ）と種々の量のＤＯＰＥからなる混合薄膜に、ＰＢＳ ０．５ｍｌを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、混合脂質分散液を調製した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）に混合脂質分散液を種々のＮ／Ｐ（ＤＬ−Ｇ３の１級アミノ基／ＤＮＡのリン酸エステル、モル／モル）比に混合し、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した（図３，図４）。
２．２．３．ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ、プラスミドからなるリポプレックス
カチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルバモイル］コレステロール）（１６１．３μｇ）とＤＯＰＥ（２４０μｇ）の混合薄膜にＰＢＳ ２．５ｍｌを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、混合脂質分散液を調製した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）に混合脂質分散液をＮ／Ｐ比が２になるように加えて混合し、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した（図４）。
２．３． 遺伝子導入
アフリカミドリザル腎臓由来のＣＶ−１細胞を２４穴ディッシュ１穴当たり５．０×１０^４個になるように撒き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム０．５ｍｌ中、３７℃で一晩培養した。その後、０．３６ｍＭ ＣａＣｌ_２と０．４２ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋））で３回洗浄した後、血清を含まないＤＭＥＭメディウム１ｍｌを加え、１穴当たり所定量のプラスミドＤＮＡを含むリポプレックスを細胞に加え、４時間インキュベーションした。その後ＰＢＳ（＋）で３回洗浄して、細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム１ｍｌを加え４０時間培養した（図２，図３，図４）。
【００３２】
図１〜図４に示されるように、本発明の遺伝子導入剤は、デンドロンがＤＬ−Ｇ２からＤＬ−Ｇ４へ大きくなるにつれて高い遺伝子導入効率を発現することが明らかになった。特にＤＬ−Ｇ４は高い遺伝子導入効率を有している。
２．４． ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価
リポプレックスと処理し、４０時間培養した後、ＰＢＳ（＋）で３回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり８０μｌの細胞溶解剤を加えて細胞を溶かし、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その上澄みを回収した。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性及びタンパク量を、ピッカジーンルシフェラーゼアッセイキット（東洋インキ）およびＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｉｅｒｃｅ） により行った。
２．５． リポプレックスの細胞毒性
リポプレックスで処理した細胞を４０時間培養後、メディウムを除去し、新しい１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウムを１穴当たり２００μｌずつ加えた。さらにＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）を１穴当たり２０μｌずつ加え、２時間インキュベーションした。次にメディウムを除去して０．１Ｍ ＨＣｌ含有イソプロパノール（５００μｌ）を加えた。その溶液を遠心チューブに回収し、１５０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離を行った。上澄み液を５７０ｎｍの吸光度を測定することによって生細胞数を求め、リポプレックスと処理していない細胞を培養した場合との比（％）を求めた（図４）。
【００３３】
図４に示されるように、本発明のデンドロン（ＤＬ−Ｇ３）は、従来汎用されているＤＣ−ｃｈｏｌと比較して遺伝子導入活性が向上し（図４Ａ，Ｂ）、かつ、遺伝子導入活性を有する量（ＤＮＡ量が１〜２μｇ）において細胞生存率が６５％以上と有意に高く（図４Ｃ）、高い遺伝子導入活性及び低毒性を同時に達成した、非常に優れた遺伝子導入剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】デンドロン脂質とＤＮＡの複合体形成を示す。図１において、「Ａ」はＤＬ−Ｇ１リポプレックス、「Ｂ」はＤＬ−Ｇ２リポプレックス、「Ｃ」はＤＬ−Ｇ３リポプレックス、「Ｄ」はＤＬ−Ｇ４リポプレックスを各々示す。
【図２】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図２は、各種のＮ／Ｐ比を有するＤＬ−Ｇ２，ＤＬ−Ｇ３またはＤＬ−Ｇ４リポプレックスで処理したＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（ｇルシフェラーゼ／ｍｇ蛋白質（Ａ）およびｇルシフェラーゼ／ウェル（Ｂ））を示す。細胞（５×１０^４）は血清を含まない培地中１μｇのＤＮＡを含むリポプレックスで処理された。ＮおよびＰは、各々脂質の第一級アミノ基及びＤＮＡホスフェートの当量を示す。
【図３】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図３Ａは、ＤＯＰＥ／ＤＬ−Ｇ３比を変化させたリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性を示し、図３Ｂは、Ｎ／Ｐ比を変化させたリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性を示す。
【図４】ＤＣ−ｃｈｏｌリポプレックスとの比較を示す。図４は、ＤＬ−Ｇ３／ＤＯＰＥリポプレックスまたはＤＣ−ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（（Ａ）：ｇルシフェラーゼ／ｍｇ蛋白質、（Ｂ）：ｇルシフェラーゼ／ウェル）及び細胞生存度（Ｃ）を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene transfer agent, a gene transfer kit, and a gene transfer method.
[0002]
[Prior art and its problems]
A viral vector is known as a highly efficient gene transfer agent used for gene therapy and the like. However, the virus vector has been reported to have serious side effects that cause death in clinical applications. Have been.
[0003]
Non-viral vectors are safer than viral vectors, but have the disadvantage of low gene transfer efficiency.
[0004]
An object of the present invention is to provide a gene transfer agent, a gene transfer kit and a gene transfer method which are excellent in safety and transfer efficiency.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides the following gene transfer agent, gene transfer kit and gene transfer method.
Item 1. A gene transfer composition comprising a compound represented by any of the following formulas DL-G1 to DL-G8.
DL-G1: R¹R²NX (XH₂)₂
DL-G2: R¹R²NX (X (XH₂)₂)₂
DL-G3: R¹R²NX (X (X (XH₂)₂)₂)₂
DL-G4: R¹R²NX (X (X (X (XH₂)₂)₂)₂)₂
DL-G5: R¹R²NX (X (X (X (X (XH₂)₂)₂)₂)₂)₂
DL-G6: R¹R²NX (X (X (X (X (X (XH₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂
DL-G7: R¹R²NX (X (X (X (X (X (X (XH₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂
DL-G8: R¹R²NX (X (X (X (X (X (X (X (XH₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂)₂
(Where R¹And R²Represents the same or different alkyl groups, alkoxy groups, aryl groups and aralkyl groups. X is -CH₂CH₂CONHCH₂CH₂N-. )
Item 2. The gene transfer agent composition according to claim 1, further comprising a phospholipid.
Item 3. 3. The composition according to claim 2, wherein the phospholipid is DOPE.
Item 4. Item 7. A method for introducing a gene into a cell, comprising applying the gene introduction agent or the gene introduction agent composition according to any one of Items 1 to 3 to a cell together with the gene in vitro or in vivo.
Item 5. A gene introduction kit comprising the composition according to claim 1.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the polyamidoamine dendron of any of DL-G1 to DL-G8 of the present invention:
Examples of the alkyl group include a linear or branched alkyl group having 6 to 20 carbon atoms such as hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, eicosyl, and 2-ethylhexyl. No.
Examples of the alkoxy group include hexyloxy, heptyloxy, octyloxy, nonyloxy, decyloxy, undecyloxy, dodecyloxy, tridecyloxy, tetradecyloxy, hexadecyloxy, octadecyloxy, eicosyloxy, and 2-ethylhexyloxy. A straight-chain or branched alkoxy group having 6 to 20 carbon atoms is exemplified.
Aryl groups include benzyl, naphthyl, biphenyl, anthranyl, phenanthryl and the like.
Examples of the aralkyl group include benzyl, phenethyl and the like.
[0007]
X is -CH₂CH₂CONHCH₂CH₂N- represents N-, and the terminal N generally has two hydrogen atoms, but one hydrogen atom may be substituted with a hydrophobic amino acid such as leucine, valine, isoleucine, norleucine, phenylalanine, and tyrosine. .
[0008]
The polyamidoamine dendron of the present invention can be produced, for example, as follows.
[0009]
Embedded image

[0010]
Preferred polyamidoamine dendrons of the present invention are shown below.
[0011]
Embedded image

[0012]
The gene transfer agent composition of the present invention can suitably contain a phospholipid in addition to the polyamidoamine dendron. Examples of such a phospholipid include phosphatidylethanolamine, phospharidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, plasmalogen and phosphatidic acid, and these may be used alone or in combination of two or more. Can be used in combination. Of these, phosphatidylethanolamine and phospharidylcholine are preferably used alone or in combination. Fatty acid residues of these phospholipids are not particularly limited, and include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 18 carbon atoms. Specifically, lauroyl group, myristoyl group And a palmitoyl group, a stearoyl group, an oleoyl group, a linoleyl group, and the like, and DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) is particularly preferable.
[0013]
The blending amount of the phospholipid is not particularly limited, but when the total amount of the phospholipid and the polyamidoamine dendron is 100 parts by weight, the phospholipid is 30 to 90 parts by weight, the polyamidoamine dendron is 70 to 10 parts by weight, preferably the phospholipid 50. To 80 parts by weight, 50 to 20 parts by weight of polyamidoamine dendron, more preferably 60 to 70 parts by weight of phospholipid, and 40 to 30 parts by weight of polyamidoamine dendron.
[0014]
In addition to the phospholipid, examples of the additive that can be contained in the gene transfer agent composition include cholesterol and the like.
[0015]
When the polyamideamine dendron lipid is used alone, the mixing ratio of the gene and the gene transfer agent is 1 to 20 parts by weight, preferably 3 to 15 parts by weight, more preferably 5 to 5 parts by weight of the gene transfer agent per 1 part by weight of the gene. Use 7 parts by weight. When a mixture of polyamidoamine dendron lipid and phospholipid is used, the mixing ratio of the gene and the gene transfer agent is 1 to 50 parts by weight of the gene transfer agent, preferably 5 to 30 parts by weight, relative to 1 part by weight of the gene. More preferably, 10 to 15 parts by weight are used.
[0016]
The gene may be any of oligonucleotide, DNA and RNA, and in particular, a gene for introduction in vitro such as transformation, and a gene that acts by being expressed in vivo, for example, a gene for gene therapy, an experimental animal Genes used for breeding of industrial animals such as livestock and domestic animals are preferred. Examples of the gene for gene therapy include genes encoding bioactive substances such as antisense oligonucleotides, antisense DNA, antisense RNA, enzymes, and cytokines.
[0017]
Examples of cells into which the gene is introduced include animal cells such as humans, eukaryotic cells such as plant cells, and prokaryotic cells such as bacteria.
[0018]
As the form of the composition of the present invention, only the polyamidoamine dendron (DL-G1 to DL-G8) may be present, or the polyamidoamine dendron and the phospholipid may be simply present as a mixture. The dendron and the phospholipid may be combined to form a lipid membrane structure. The existence form of the lipid membrane structure and the method for producing the same are not particularly limited. Examples of the existence form include a dried lipid mixture form, a form dispersed in an aqueous solvent, and a form obtained by drying the same. And frozen forms.
[0019]
The dried lipid mixture can be produced, for example, by dissolving the lipid component to be used once in an organic solvent such as chloroform and then performing drying under reduced pressure using an evaporator or spray drying using a spray dryer.
[0020]
Examples of the form in which the lipid membrane structure is dispersed in an aqueous solvent include unilamellar liposomes, multilamellar liposomes, O / W emulsions, W / O / W emulsions, spherical micelles, string micelles, and irregular lamellar structures. And the like. The size of the dispersed lipid membrane structure is not particularly limited. For example, in the case of a liposome or an emulsion, the particle size is 50 nm to several μm, and in the case of a spherical micelle, the particle size is Is from 5 nm to 50 nm. In the case of string-like micelles or irregular layered structures, the thickness per layer may be considered to be 5 nm to 10 nm and these layers are formed.
[0021]
The composition of the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, but in addition to water, aqueous solutions of sugars such as glucose, lactose, and sucrose; aqueous solutions of polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol; And buffer solutions such as citrate buffer and phosphate buffered saline, physiological saline, and a medium for cell culture. In order to stably store the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is important to minimize the electrolyte in the aqueous solvent from the viewpoint of physical stability such as aggregation. From the viewpoint of lipid chemical stability, it is important to set the pH of the aqueous solvent from weakly acidic to near neutral (pH 3.0 to 8.0) or to remove dissolved oxygen by nitrogen bubbling. . Further, when freeze-drying storage or spray-drying storage is used, effective storage is possible by using a sugar aqueous solution, and when freeze-preserving, using a sugar aqueous solution or a polyhydric alcohol aqueous solution, respectively.
[0022]
The concentration of the additive in these aqueous solvents is not particularly limited. For example, in a sugar aqueous solution, the concentration is preferably 2 to 20% (W / V), and more preferably 5 to 10% (W / V). preferable. In the polyhydric alcohol aqueous solution, 1 to 5% (W / V) is preferable, and 2 to 2.5% (W / V) is more preferable. In the buffer, the concentration of the buffer is preferably 5 to 50 mM, more preferably 10 to 20 mM.
[0023]
Although the concentration of the lipid membrane structure in the aqueous solvent is not particularly limited, the concentration of the total amount of the phospholipid used as the lipid membrane structure in the present invention is preferably from 0.001 mM to 100 mM, and is preferably from 0.1 mM to 100 mM. More preferred is from 01 mM to 20 mM.
[0024]
The form in which the lipid membrane structure is dispersed in an aqueous solvent is produced by adding the above-mentioned dried lipid mixture to an aqueous solvent, and further emulsifying with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier, or the like. be able to. The liposome can also be produced by a well-known method, for example, a reverse phase evaporation method, and is not particularly limited. When it is desired to control the size of the lipid membrane structure, extrusion (extrusion filtration) may be performed under high pressure using a membrane filter or the like having a uniform pore size.
[0025]
Examples of a method for further drying the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent include ordinary freeze drying and spray drying. As the aqueous solvent at this time, as described above, an aqueous sugar solution, preferably an aqueous sucrose solution or an aqueous lactose solution, may be used. Here, once the lipid membrane structure dispersed in an aqueous solvent is produced and then dried, the lipid membrane structure can be stored for a long period of time. Since the lipid mixture is well hydrated, there is an advantage that the gene itself can be efficiently retained in the lipid membrane structure.
[0026]
The gene transfer agent of the present invention can be applied to not only genes but also drugs having high hydrophilicity, high molecular weight bioactive peptides, drugs such as proteins which are hardly introduced into cells, and the like. By using the composition of the present invention, a gene can be efficiently introduced into cells both in vitro and in vivo.
[0027]
In vitro gene transfer can be performed by adding the gene-containing transfection agent composition of the present invention to a suspension containing the target cells, or treating the target cells in a medium containing the gene-containing composition of the present invention. It can be performed by means such as culturing.
[0028]
Gene transfer in vivo may be performed by administering the gene-containing composition of the present invention to a host. The means of administration to the host may be oral or parenteral, but parenteral administration is preferred. The dosage form may be a commonly known dosage form, and the dosage form for oral administration includes, for example, tablets, powders, granules, syrups and the like. Examples of dosage forms for parenteral administration include injections, eye drops, ointments, suppositories and the like. Of these, injections are preferred, and intravenous injection and local injection into target cells or organs are preferred as administration methods.
[0029]
【The invention's effect】
According to the present invention, gene transfer efficiency is significantly improved as compared with conventional gene transfer agents, and a gene transfer agent having low cytotoxicity is obtained, and gene transfer excellent in both safety and transfer efficiency is obtained. Technology has been established.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
[0031]
In the following examples, “lipoplex” means a complex of the dendron lipid and DNA of the present invention.
Example 1
1. Synthesis of Dendron Lipid (DL)
1.1. Synthesis of DL-G-0.5
Di-n-dodecylamine (2.00 g, 5.66 mmol) was dissolved in distilled methyl acrylate (14 ml, 0.156 mol), and the mixture was refluxed at 80 ° C. for 18 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted methyl acrylate was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified on silica gel (developing solvent: petroleum ether: diethyl ether = 2: 1). (Yield 2.387 g, 96.1%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.85 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 1.38 (m, Hc), δ 2.35 (t, Hf), δ 2.40 (t, Hd) ), Δ 2.74 (t, He), δ 3.63 (s, OCH3);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 27.1, 27.5, 29.3, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.2 (Cf), δ 49 .3 (Ce), δ 51.4 (OCH3), δ 53.9 (Cd), δ 173.3 (COOCH3); TOF-MS m / z 440.7 (M + 1). 1.2. Synthesis of DL-G0
DL-G-0.5 (2.162 g, 4.92 mmol) was dissolved in methanol (50 ml, 1.23 mol). This solution was slowly added to distilled ethylenediamine (100 ml, 1.50 mol) containing sodium cyanide (0.048 g, 0.979 mmol) and stirred at 45 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted ethylenediamine were distilled off under reduced pressure, and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol). (Yield 1.945 g, 84.6%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.85 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 1.41 (m, Hc), δ 2.33 (t, Hf), δ 2.39 (t, Hd) ), Δ 2.62 (t, He), δ 2.76 (t, Hh), δ 3.25 (m, Hg), δ 8.65 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.6, 26.6, 27.6, 29.3, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf), δ 41 .9 (Ch), δ 42.2 (Cg), δ 50.3 (Ce), δ 53.3 (Cd), δ 173.3 (CONH); TOF-MS m / z 468.2 (M + 1).
1.3. Synthesis of DL-G0.5
DL-G0 (2.256 g, 4.82 mmol) was dissolved in methanol (17.5 ml, 0.431 mol). This solution was slowly added to distilled methyl acrylate (43.5 ml, 0.485 mol) and stirred at 35 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted methyl acrylate were distilled off under reduced pressure, and the residue was purified on silica gel (developing solvent: petroleum ether: diethyl ether = 2: 1 followed by dichloromethane: methanol = 9: 1). (Yield 2.634 g, 85.4%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.84 (m, Ha), δ 1.21 (s, Hb), δ 1.39 (m, Hc), δ 2.30 (t, Hf), δ 2.38 (m, Hj) ), Δ 2.39 (m, Hd), δ 2.49 (t, Hh), δ 2.67 (t, He), δ 2.73 (t, Hi), δ 3.25 (m, Hg) ), Δ 3.63 (s, OCH3), δ7.76 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.6, 26.7, 27.6, 29.3, 29.6, 31.9 and 32.5 (Cb, Cc), δ 33.1 (Cj) ), Δ 36.9 (Cf), δ 49.1 (Ci), δ 50.1 (Ce), δ 51.5 (OCH3), δ 53.0 (Cd), δ 53.5 (Ch), δ 172.7 (COOCH3), δ 172.8 (CONH); TOF-MS m / z 640.8 (M + 1). 1.4. Synthesis of DL-G1
DL-G0.5 (0.714 g, 1.12 mmol) was dissolved in methanol (20.5 ml, 0.505 mol). This solution was slowly added to distilled ethylenediamine (37.5 ml, 0.562 mol) containing sodium cyanide (0.011 g, 0.224 mmol) and stirred at 45 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted ethylenediamine were distilled off under reduced pressure, and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol). (Yield 0.674 g, 86.4%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.84 (m, Ha), δ 1.22 (s, Hb), δ 1.38 (m, Hc), δ 2.12 (m, N)H2), δ 2.28 (m, Hj), δ 2.31 (m, Hf), δ 2.36 (m, Hd), δ 2.46 (t, Hh), δ 2.63 (t, He), δ 2.70 (t, Hi), δ 2.79 (t, Hl), δ 3.17 (m, Hg), δ 3.25 (m, Hk), δ 7.45 and 8. 63 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.0 (Ca), δ 22.6, 26.5, 27.6, 29.2, 29.6 and 31.8 (Cb, Cc), δ 32.9 and 34.3 (Cf) , Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.3 and 41.9 (Ck, Cl), δ 50.0 (Ci), δ 50.8 (Ce), δ 52.9 (Cd), δ 53.3 (Ch), δ 173.4 and 172.9 (CONH); TOF-MS m / z 697.4 (M + 1).
1.5. Synthesis of DL-G1.5
DL-G1 (1.539 g, 2.21 mmol) was dissolved in methanol (86.5 ml, 2.13 mol). This solution was slowly added to distilled methyl acrylate (152 ml, 1.69 mol) and stirred at 35 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted methyl acrylate were distilled off under reduced pressure, and purified by silica gel (developing solvent: dichloromethane: methanol = 9: 1). (Yield 1.703 g, 74.0%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.45 (m, Hc), δ 2.37 (m, Hj), δ 2.44 (m, Hd) ), Δ 2.56 (m, Hh), δ 2.77 (m, Hi), δ 3.29 (m, Hg), δ 3.68 (s, OCH3), δ 7.04 and 8.08 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.6, 29.4, 29.6 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7, 33.0 and 33 .9 (Cj), δ 37.2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 50.0 (Ci), δ 50.2 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.8 (Cd), δ 53.0 and 53.4 (Ch), δ 172.3 (COOCH3), δ 172.7 and 173.1 (CONH); TOF-MS m / z 1041.5 (M + 1).
1.6. Synthesis of DL-G2
DL-G1.5 (1.703 g, 1.64 mmol) was dissolved in methanol (46 ml, 1.13 mol). This solution was slowly added to distilled ethylenediamine (134 ml, 2.00 mol) containing sodium cyanide (0.032 g, 0.655 mmol) and stirred at 45 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted ethylenediamine were distilled off under reduced pressure, and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol). (Yield 1.713 g, 90.8%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.87 (m, Ha), δ 1.25 (s, Hb), δ 1.42 (m, Hc), δ 2.13 (m, N)H2), δ 2.33 (m, Hj), δ 2.36 (m, Hd), δ 2.52 (m, Hh), δ 2.73 (m, Hi), δ 2.82 (m, H Hl), δ 3.24 (m, Hg), δ 3.27 (m, Hk), δ 7.74, 7.79 and 8.58 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.2 (Ca), δ 22.7, 26.6, 27.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 33.0, 34.0 and 34 0.3 (Cf, Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.5 and 42.2 (Ck, Cl), δ 50.2 (Ci), δ 50.5 (Ce), δ 53.0 (Cd), δ 53.3 (Ch), δ 172.6, 173.0 and 173.4 (CONH); TOF-MS m / z 1153.0 (M +).
1.7. Synthesis of DL-G2.5
DL-G2 (1.713 g, 1.49 mmol) was dissolved in methanol (120 ml, 2.96 mol). This solution was gradually added to distilled methyl acrylate (100 ml, 1.12 mol) and stirred at 30 ° C. for 25 hours. Thereafter, methanol and unreacted methyl acrylate were distilled off under reduced pressure, and purified by silica gel (developing solvent: dichloromethane: methanol = 85: 15, then 80:20). (Yield 1.900 g, 69.4%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.45 (m, Hc), δ 2.37 (m, Hj), δ 2.44 (m, Hd) ), Δ 2.56 (m, Hh), δ 2.76 (m, Hi), δ 3.28 (m, Hg), δ 3.68 (s, OC)H3), δ 7.13, 7.67 and 8.12 (m, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.6, 29.4, 29.6, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf) ), 33.9 (Cj), δ 37.2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 49.9 (Ci), δ 50.2 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.6 (Cd), δ 53.0 and 53.4 (Ch), δ 172.4 (COOCH3), 173.0 (COOCH3); TOF-MS m / z 1840.7 (M +).
1.8. Synthesis of DL-G3
DL-G2.5 (0.115 g, 0.063 mmol) was dissolved in methanol (2.53 ml, 0.625 mol). This solution was slowly added to distilled ethylenediamine (5.00 ml, 0.075 mol) containing sodium cyanide (0.0012 g, 0.025 mmol) and stirred at 45 ° C. for 55 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted ethylenediamine were distilled off under reduced pressure, and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol). (Yield 0.114 g, 88.4%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.88 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.42 (m, Hc), δ 2.37 (br, Hj), δ 2.54 (br, Hh) ), Δ 2.75 (br, Hi), δ 2.83 (br, Hl), δ 3.24 (br, Hg), δ 3.29 (br, Hk), δ 7.94, 8.07. and 8.57 (br, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.2 (Ca), δ 22.7, 26.5, 27.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 34.0 and 34.3 (Cf) , Cj), δ 37.8 (Cg), δ 41.4 and 41.9 (Ck, Cl), δ 50.1 (Ci), δ 50.5 (Ce), δ 52.9 (Cd), δ 53.3 (Ch), δ 172.8 and 173.1 (CONH); TOF-MS m / z 2066.0 (M +). 1.9. Synthesis of DL-G3.5
DL-G3 (1.004 g, 0.486 mmol) was dissolved in methanol (40 ml, 0.986 mol). This solution was gradually added to distilled methyl acrylate (35 ml, 0.39 mol) and stirred at 25 ° C. for 50 hours. Thereafter, methanol and unreacted methyl acrylate were distilled off under reduced pressure, purified twice with a Sephadex LH-20 column (eluent methanol), and further purified with silica gel (developing solvent dichloromethane: methanol = 8: 2). (Yield 1.141 g, 68.2%.)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 0.88 (m, Ha), δ 1.23 (s, Hb), δ 2.37 (br, Hj), δ 2.44 (br, Hd), δ 2.54 (br, Hh) ), Δ 2.76 (br, Hi), δ 3.27 (br, Hg), δ 3.67 (s, OCH3), δ 7.13, 7.71 and 8.10 (br, CONH);^ThirteenC NMR (400 MHz, CDCl₃): Δ 14.1 (Ca), δ 22.7, 29.4, 29.7 and 31.9 (Cb, Cc), δ 32.7 (Cf), 33.8 (Cj), δ 37. 2 and 37.5 (Cg), δ 49.3 and 49.9 (Ci), δ 50.6 (Ce), δ 51.7 (OCH3), δ 52.5 (Cd), δ 53.0 (Ch), δ 172.4 (COOCH3), δ 172.6 and 173.1 (CONH).
1.10. Synthesis of DL-G4
DL-G3.5 (1.141 g, 0.331 mmol) was dissolved in methanol (18.5 ml, 0.456 mol). This solution was slowly added to distilled ethylenediamine (37 ml, 0.554 mol) containing sodium cyanide (0.0065 g, 0.133 mmol) and stirred at 45 ° C. for 55 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, methanol and unreacted ethylenediamine were distilled off under reduced pressure, and purified twice using a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol). (Yield 0.699 g, 54.2%.)
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.85 (m, Ha), δ 1.26 (s, Hb), δ 1.37 (m, Hc), δ 2.20 (br, Hj), δ 2.30 (br, Hd), δ 2.57 (br, Hh), δ 2.65 (br, Hi), δ 3.07 (br, Hk), δ 7.91, 7.98 and 8.16 (br, CON)H);^ThirteenC NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 14.0 (Ca), δ 22.2, 27.0, 29.1 and 31.4 (Cb, Cc), δ 33.3 (Cf, Cj), δ 37.0 (Cg) , Δ 41.7 (Ck, Cl), δ 49.7 (Ci), δ 52.2 (Ch), δ 171.6 (CONH).
2. Measurement
2.1. Evaluation of complex formation ability by electrophoresis
The solvent was distilled off under reduced pressure from a chloroform solution (methanol solution for DLG4) of the dendron lipid (DL-G1, DLG2, DLG-3, DLG4) to obtain a lipid thin film. PBS (phosphate buffered saline) was added thereto, and ultrasonic waves were irradiated for 2 minutes using a bath-type ultrasonic irradiation device to prepare a lipid dispersion. Next, the prepared dendron lipid dispersion was added to a 20 mM Tris-HCl plasmid DNA solution (1 μg / 5 μl) at an N / P ratio of 0.2, 0.4, 0.6, 0.7, 0.8, 1. 0, 1.2, 1.4, and 1.6 were added and mixed (total volume: 10 μl), and incubated at room temperature for 10 minutes to prepare a lipoplex. The prepared lipoplex was added to a 0.6 wt% agarose gel, and subjected to electrophoresis in a 40 mM Tris / 20 mM NaOAc / 2 mM EDTA-2Na buffer at a potential of 100 V for 30 minutes. The electrophoresis was performed using a Mupid mini gel electrophoresis tank (ADVANCE Co.) (FIG. 1).
2.2. Preparation of lipoplex
2.2.1 Lipoplex of Dendron Lipid and Plasmid DNA
A solvent was removed from a chloroform solution (a methanol solution for DL-G4) of the cationic lipids (DL-G1, DL-G2, DL-G3, and DL-G4) using a rotary evaporator to form a lipid thin film. . PBS was added thereto, and ultrasonic waves were irradiated for 2 minutes using a bath-type ultrasonic irradiation device to prepare a lipid dispersion. Next, a 20 mM Tris-HCl plasmid DNA solution (1 μg / 50 μl) and various concentrations of lipid dispersions (50 μl) were added and mixed, followed by incubation at room temperature for 10 minutes to obtain a lipoplex (FIG. 2).
2.2.2. Lipoplex consisting of DL-G3, DOPE, plasmid
To a mixed thin film composed of DL-G3 (41.7 μg) and various amounts of DOPE, 0.5 ml of PBS was added, and ultrasonic waves were irradiated for 2 minutes using a bath-type ultrasonic irradiation device to prepare a mixed lipid dispersion. did. The mixed lipid dispersion was mixed with a 20 mM Tris-HCl plasmid DNA solution (1 μg / 50 μl) at various N / P (primary amino group of DL-G3 / phosphate ester of DNA, mol / mol), and the mixture was stirred at room temperature. A lipoplex was prepared by incubation for 10 minutes (FIGS. 3 and 4).
2.2.3. Lipoplex consisting of DC-chol, DOPE, plasmid
2.5 ml of PBS was added to a mixed thin film of the cationic lipid DC-Chol (3β [N, N-dimethylaminoethanecarbamoyl] cholesterol) (161.3 μg) and DOPE (240 μg), and a bath-type ultrasonic irradiation device was used. Ultrasonic waves were irradiated for 2 minutes to prepare a mixed lipid dispersion. The mixed lipid dispersion was added to a 20 mM Tris-HCl plasmid DNA solution (1 μg / 50 μl) so that the N / P ratio became 2, and the mixture was incubated at room temperature for 10 minutes to prepare a lipoplex (FIG. 4).
2.3. Gene transfer
African green monkey kidney-derived CV-1 cells were prepared at 5.0 × 10 4 per well of a 24-well dish.⁴The cells were cultivated overnight at 37 ° C. in 0.5 ml of DMEM medium containing 10% FBS. Then, 0.36 mM CaCl₂And 0.42 mM MgCl₂After washing three times with PBS containing PBS (PBS (+)), 1 ml of serum-free DMEM medium was added, lipoplex containing a predetermined amount of plasmid DNA per well was added to the cells, and the cells were incubated for 4 hours. Thereafter, the cells were washed three times with PBS (+) to remove lipoplexes not taken up by cells, and 1 ml of 10% FBS-containing DMEM medium was added, followed by culturing for 40 hours (FIGS. 2, 3 and 4).
[0032]
As shown in FIG. 1 to FIG. 4, it was revealed that the gene transfer agent of the present invention expresses higher gene transfer efficiency as the dendron increases from DL-G2 to DL-G4. In particular, DL-G4 has high gene transfer efficiency.
2.4. Evaluation of gene transfer by luciferase assay
After treating with lipoplex and culturing for 40 hours, the cells were washed three times with PBS (+) and further once with PBS (-), and thereafter, cells were lysed by adding 80 μl of cell lysing agent per well, and 12000 rpm. For 2 minutes, and the supernatant was recovered. The luciferase activity and protein amount of the obtained cell lysate were measured using a Pica Gene luciferase assay kit (Toyo Ink) and BCA Protein Assay Reagent (Pierce).
2.5. Lipoplex cytotoxicity
After culturing the cells treated with the lipoplex for 40 hours, the medium was removed, and 200 μl of fresh DMEM medium containing 10% FBS was added per well. Further, an MTT solution (5 mg / ml PBS) was added in an amount of 20 μl per well and incubated for 2 hours. Next, the medium was removed, and isopropanol (500 μl) containing 0.1 M HCl was added. The solution was collected in a centrifuge tube, and centrifuged at 15000 rpm for 10 seconds. The number of viable cells was determined by measuring the absorbance of the supernatant at 570 nm, and the ratio (%) to that obtained by culturing lipoplex and untreated cells was determined (FIG. 4).
[0033]
As shown in FIG. 4, the dendron (DL-G3) of the present invention has improved gene transfer activity (FIGS. 4A and 4B) and has a lower gene transfer activity than DC-chol, which is conventionally widely used. The cell viability was significantly higher at 65% or more in the amount (DNA amount of 1 to 2 μg) (FIG. 4C), and was a very excellent gene transfer agent that achieved high gene transfer activity and low toxicity at the same time. It was revealed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows complex formation of dendron lipid and DNA. In FIG. 1, “A” indicates a DL-G1 lipoplex, “B” indicates a DL-G2 lipoplex, “C” indicates a DL-G3 lipoplex, and “D” indicates a DL-G4 lipoplex.
FIG. 2 shows the effect of the number of generations on gene transfer activity. FIG. 2 shows luciferase activity (g luciferase / mg protein (A) and g luciferase / well (B)) of CV1 cells treated with DL-G2, DL-G3 or DL-G4 lipoplex having various N / P ratios. ). Cells (5 × 10⁴) Were treated with lipoplex containing 1 μg DNA in medium without serum. N and P indicate the primary amino group of the lipid and the equivalent of DNA phosphate, respectively.
FIG. 3 shows the effect of the number of generations on gene transfer activity. FIG. 3A shows luciferase activity of CV1 cells treated with lipoplex with varying DOPE / DL-G3 ratio, and FIG. 3B shows luciferase of CV1 cells treated with lipoplex with varying N / P ratio. Show activity.
FIG. 4 shows a comparison with DC-chol lipoplex. FIG. 4 shows luciferase activity ((A): g luciferase / mg protein, (B): g luciferase / well) and cells of CV1 cells treated with DL-G3 / DOPE lipoplex or DC-chol / DOPE lipoplex. The viability (C) is shown.

Claims (5)

A gene transfer composition comprising a compound represented by any of the following formulas DL-G1 to DL-G8.
DL-G1: R ¹ R ² NX (XH ₂ ) ₂
DL-G2: R ¹ R ² NX (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂
DL-G3: R ¹ R ² NX (X (X (XH ₂ ) ₂ ) ₂ ) ₂
^{DL-G4: R 1 R 2} NX (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2
^{DL-G5: R 1 R 2} NX (X (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2) 2
^{DL-G6: R 1 R 2} NX (X (X (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2
^{DL-G7: R 1 R 2} NX (X (X (X (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2
^{DL-G8: R 1 R 2} NX (X (X (X (X (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2
(In the formula, R ¹ and R ² are the same or different and represent an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, or an aralkyl group. X represents —CH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ CH ₂ N—.) The gene transfer agent composition according to claim 1, further comprising a phospholipid. 3. The composition according to claim 2, wherein the phospholipid is DOPE. A method for introducing a gene into a cell, comprising applying the gene introduction agent or the gene introduction agent composition according to any one of claims 1 to 3 to a cell together with the gene in vitro or in vivo. A gene introduction kit comprising the composition according to claim 1.

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