JP2004154029A - トレハロース受容体並びにそれを用いるトレハロースの検出方法 - Google Patents
トレハロース受容体並びにそれを用いるトレハロースの検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】哺乳動物におけるトレハロース受容体を解明し、それを用いて、抽出精製工程や誘導体化を必要とせず、試料中のトレハロースを直接的にかつ容易に検出する方法を提供することを課題とする。
【解決方法】特定のアミノ酸配列を有する蛋白質からなる哺乳動物のトレハロース受容体、又はそれを人為的に発現させた動物細胞によるカルシウムイオンの流入を検出することによるトレハロース検出方法を提供することにより課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決方法】特定のアミノ酸配列を有する蛋白質からなる哺乳動物のトレハロース受容体、又はそれを人為的に発現させた動物細胞によるカルシウムイオンの流入を検出することによるトレハロース検出方法を提供することにより課題を解決する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物におけるトレハロース受容体並びにトレハロース受容体を用いるトレハロース検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌、第４５巻、第６号、３８１−３８４頁、１９９８年
【非特許文献２】サイエンス、２８９巻、１１６−１１９頁、２０００年
【非特許文献３】ネイチャー、４１３巻、１３号、２１１−２２５頁、２００１年
【非特許文献４】セル、１０６巻、３８１−３９０頁、２００１年
【非特許文献５】ネイチャー、４１６巻、１４号、１９９−２０２頁、２００２年
【０００３】
トレハロースは、澱粉原料からの生産技術が確立されたことにより、安価に製造可能となり、トレハロースを配合した食品や化粧品が市場に出回るようになった。近年、消費者保護の観点から、食品や化粧品などの配合成分のデータを表示することが求められるようになり、これはトレハロースについても同様であって、表示の正当性を確認するためにも、食品や化粧品中のトレハロースを検出する方法が必要である。従来提案されいるトレハロースの検出方法としては、非特許文献１で開示される検出方法、すなわち、食品などから糖類を抽出し、それをトリメチルシリル誘導体化した後、ガスクロマトグラフィーにより分離してトレハロースの含有量を計測するというものがある。この方法は、多くの食品に適用可能であり、ｐｐｍ単位の精度で測定可能であるものの、試料から糖質成分を抽出精製する工程、トリメチルシリル誘導体化が必要であり、操作が煩雑であってより簡単な方法が求められている。
【０００４】
トレハロースは、砂糖の４５％の甘味度を舌により体感できることから、舌の味蕾に存在する味覚細胞により感知されていると考えられるので、トレハロース受容体の存在が示唆され、この受容体を用いれば、トレハロースの検出をより容易かつ簡便に行うことが可能になるものと思われるが、ヒトを含めた哺乳動物におけるトレハロース受容体は、その存在が未だ知られていない。すなわち、非特許文献２で開示されるように、ショウジョウバエにおいては、トレハロース受容体がクローニングされているが、本発明者等が得た知見によれば、ショウジョウバエのトレハロース受容体のＤＮＡ配列を利用して、マウスの舌組織からｍＲＮＡを調製し、遺伝子クローニングを試みたところ、ショウジョウバエで発見されたトレハロース受容体蛋白質に相当する蛋白質はマウスなどの哺乳動物において発見することはできなかった。
【０００５】
非特許文献３には、スクロースの受容体をはじめとするさまざまな味覚に関する受容体が明らかにされ、例えば、非特許文献４で開示される甘味受容体としては、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３のヘテロ２量体であるスクロース受容体や、非特許文献５で開示されるＴ１Ｒ１とＴ１Ｒ３のヘテロ２量体であるＬ−アミノ酸受容体が開示されている。また、非特許文献４には、Ｇ蛋白質のαサブユニットである、α１５、α１６及びαＺが上記甘味受容体の反応に関与していることが記載されている。しかしながら、これらの文献はいずれもトレハロースの受容体については何らの教示を与えるものでない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような背景の下に為されたもので、哺乳動物におけるトレハロース受容体を解明するとともに、それを用いて、抽出精製工程や誘導体化を必要とせず、試料中のトレハロースを直接的にかつ容易に検出する方法を提供することを課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、哺乳類におけるトレハロース受容体を解明すべく、研究を重ねた結果、意外にも、哺乳動物においては、スクロース受容体の一部とＧ蛋白質のαサブユニットとが組み合わさって、トレハロース受容体を形成していることを見出し、また、このトレハロース受容体を用いれば、トレハロースを特異的に、かつ、定量的に検出可能であることを確認し、本発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、本発明は、哺乳動物におけるトレハロース受容体を提供するとともに、トレハロース受容体を発現させた細胞及びそれを用いたトレハロース検出方法を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明が明らかにしたトレハロース受容体とは、Ｇ蛋白質αサブユニットの一種であるα１５（配列表における配列番号１）、α１６（配列表における配列番号２）、αＺ（配列表における配列番号３）を共発現させた細胞、若しくは、α１５（配列表における配列番号１）とともに、モーディーら、モレキュラーファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第５７巻、１３−２３頁、２０００年に開示されるα１６／Ｚキメラ蛋白質（配列表における配列番号４）を共発現させた細胞において、甘味受容体の一つであるＴ１Ｒ３（配列表における配列番号５）を発現させることにより、細胞膜上に形成される新規な組み合わせの味覚受容体である。本発明で用いられるＧ蛋白質αサブユニットやＴ１Ｒ３蛋白質は、哺乳動物由来であれば、特にそれら由来の動物種は限定されず、また、各蛋白質がそれぞれ異なる動物種のものとなってもよい。これらの蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列については、遺伝子データバンク、例えば「ＧＥＮＢＡＮＫ」などに開示されるものを利用することができる。とりわけ、Ｔ１Ｒ３蛋白質及びα１５がマウス由来、α１６及びαＺがヒト由来であるものが、感度に優れるので好ましい。さらに、トレハロースを感受することができる範囲内で、各蛋白質においてアミノ酸の欠失、置換、付加があってもよい。また、これらの蛋白質を、例えば、Ｔ１Ｒ３にα１５、α１６、α１６／Ｚキメラ蛋白質を連結して発現させたり、それぞれの蛋白質を同一のベクターで発現させることができる。なお、上記のα１６／Ｚキメラ蛋白質（配列表における配列番号４）は、受容体発現に必要な遺伝子数を減じる効果があり、本発明に有利に利用できる。
【００１０】
本発明で用いられるトレハロース受容体を発現させる細胞としては、種類、由来動物などを問わず、本発明のトレハロース受容体が細胞膜上に形成され、かつ、それがトレハロースと結合又は反応することによって、細胞がなんらかの反応を示す限り、どのような細胞を用いてもよい。トレハロースに対する特異性を高めるために、味覚細胞などの味覚受容体を有する細胞を避け、味覚受容体を有しない細胞を用いるのが好ましい。とりわけ、ヒト胎児腎臓上皮細胞由来の２９３細胞株（理研ジーンバンク、ＲＣＢ１６３７）は、味覚受容体を有しておらず、また、後述する細胞内カルシウムイオンの検出が比較的容易に行えるので、本発明において有利に用いられる。
【００１１】
本発明で用いられるトレハロース受容体を発現させる方法としては、まず、上記の受容体蛋白質をコードするＤＮＡ、つまり、例えば、配列番号１乃至５に開示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを入手する必要がある。ＤＮＡを入手する方法としては、ＤＮＡの全部又は一部を化学合成により合成する方法、動物のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡから、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により選別採取する方法などが挙げられ、それらを適宜組み合わせて本発明に必要なＤＮＡを得ることができる。
【００１２】
上記のＤＮＡにコードされるトレハロース受容体蛋白質を細胞膜上に発現させるには、適宜の動物細胞発現用発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞に導入すればよい。発現ベクターとしては、通常、動物細胞に用いられる発現ベクターを適宜選択すればよく、適宜の薬剤耐性遺伝子、発現プロモーター領域、ポリアデニル化部位、ポリリンカー、制限酵素切断部位、エンハンサー領域などを配した発現ベクターを用いることができ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクターなど、どのような種類のベクターをも用いることができる。また、発現形態が一過的な発現であっても、恒常的な発現であってもよく、目的に応じて適宜選択すればよい。また、各Ｇ蛋白質及び受容体蛋白質をコードするＤＮＡをそれぞれ単一の発現ベクターに組み込んでも、単一の発現ベクター上に複数種のＧ蛋白質及び受容体蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現させてもよい。
【００１３】
本発明によるトレハロースの検出方法は、スクロース受容体の一部とＧ蛋白質αサブユニットの一部との新規な組み合わせによるトレハロース受容体を膜表面に発現させた動物細胞に対して、トレハロースが含まれていると想定される試料を添加し、その中に含まれるトレハロースがトレハロース受容体と結合することによって引き起こされる生化学的な反応を測定することにより、試料中のトレハロースを検出するというものである。本発明に用いられる生化学的な反応としては、細胞内シグナル伝達系に関与する反応が挙げられ、それに関わる物質、例えば、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテインキナーゼＣ、カルシウムイオンなどの量の増減を測定する方法が挙げられる。とりわけ、カルシウムイオンの流入を測定する方法が最も簡便かつ感度に優れる有力な手法であり、本発明において有利に実施できる。
【００１４】
細胞内におけるカルシウムイオンの測定方法としては、カルシウムイオンと結合することにより、蛍光を発する試薬、例えば、モレキュラープローブス社販売の商品名『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』などの細胞内におけるカルシウムイオン検出用試薬が挙げられ、反応させることによって発せられる蛍光を、市販のプレート式、キュベット式、フローサイトメトリー式の蛍光検出装置により測定する方法、蛍光顕微鏡などで肉眼的に観察する方法などが挙げられる。
【００１５】
本発明のトレハロースの検出方法によれば、様々な食品又は化粧品などを被検対象品として、それらに含有まれるトレハロースを特異的に測定することができる。被検対象品が固体、ペースト、ゲル又は親油性液体ならば、水性溶媒により被検対象品に含まれるトレハロースを溶解し、不溶物質を除去して試料とする。また、被検対象が親水性液体ならば、そのまま、あるいは、いったん乾燥固化したものを水性溶媒で再溶解したものを用いることもできる。また、例えば、細胞毒性を有する物質、ミネラル、又は色素などの、トレハロースの検出に支障のある不純物質が試料中に混在する場合は、適宜の分離方法、例えば、活性炭吸着法、有機溶媒抽出法、遠心分離法、膜濾過法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法などの方法で、また、不純物質を適宜の酸、アルカリ、還元剤、酸化剤などの薬剤、分解酵素などで処理し、試料からトレハロース以外の不要な物質を除去することもできる。また、必要ならば、トレハロース分解酵素であるトレハラーゼを処理した試料を陰性対象として用いれば、より正確なトレハロース含量が測定可能であり、特にバックグラウンドが高い場合は有利となる。本発明によるトレハロースの検出方法における検出感度は、試料溶液中におけるトレハロース濃度で５ｍＭ以上乃至５００ｍＭの範囲で測定可能である。したがって、試料溶液中のトレハロース濃度がこの範囲内でない場合は、試料を段階的に濃縮又は希釈することによって、上記測定範囲内になるように調節すればよい。
【００１６】
本発明のトレハロースの検出方法は、上記の食品や化粧品に含まれるトレハロースの含量を測定することに用いられるほか、例えば、トレハロースなどの糖質を誘導体化することによる甘味度の増減効果を検討するといった、新規甘味料の検索にも利用できる。
【００１７】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【実施例１】
＜Ｇ蛋白質αサブユニット蛋白質発現用ベクターの構築＞
【００１９】
【実施例１−１】
＜Ｇ蛋白質αサブユニット蛋白質α１５をコードするＤＮＡの調製＞
マウス骨髄性白血病由来細胞株ＷＥＨＩ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−６８）から、常法にしたがい、ｍＲＮＡを含むＲＮＡを抽出精製し、このＲＮＡ１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、リボヌクレアーゼＩにより混在するＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。また、Ｇ蛋白質αサブユニットα１５ＤＮＡ（配列表の配列番号６）の５’末端のＤＮＡ配列に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含む塩基配列を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号７）、３’末端のＤＮＡ配列に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を含む塩基配列を付加したＰＣＲ用アンチセンスプライマーを作製した（配列表における配列番号８）。上記ｃＤＮＡ及びＰＣＲ用プライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいＰＣＲを行い、Ｇ蛋白質α１５をコードするＤＮＡを得た。
【００２０】
【実施例１−２】
＜Ｇ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡの調製＞
ヒト骨髄性白血病由来細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２４０）又はＵ９３７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）から、常法にしたがい、ｍＲＮＡを含むＲＮＡを抽出精製し、このＲＮＡ１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、常法にしたがい、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、常法にしたがい、リボヌクレアーゼＩによりＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。また、Ｇ蛋白質α１６ＤＮＡ（配列表の配列番号９）及びＧ蛋白質αＺＤＮＡ（配列表の配列番号１０）を得るべく、α１６の開始コドン付近のＤＮＡ配列、すなわち塩基番号２０２から２２１までの配列の５’側に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号１１）、α１６の塩基番号１１９６から１２１１までの相補配列の５’側にαＺの塩基番号９４６から９６０までの相補配列を付加したアンチセンスプライマー（配列表の配列番号１２）を作製した。一方、αＺＤＮＡを得るべく、配列表における配列番号１０の塩基番号９４６から９６０までの配列の５’側にα１６の塩基番号１１９５から１２１１までの配列を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号１３）、αＺの塩基番号１０６８から１０８６までの相補配列の５’側に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を付加したアンチセンスプライマー（配列表の配列番号１４）を作製した。これらｃＤＮＡ及びＰＣＲプライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいそれぞれＰＣＲを行い、Ｇ蛋白質α１６及びＧ蛋白質αＺをコードするＤＮＡを得た。これらを混ぜ合わせ、熱変成した後、オーバーラップした部分をアニーリングさせた後、さらにＰＣＲを行い、約１２００ｂｐのα１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを得た。
【００２１】
【実施例１−３】
＜Ｇ蛋白質α１５及びα１６／Ｚキメラ蛋白質を共発現するベクターの構築＞
発現ベクターとして、ピューロマイシン耐性遺伝子、ＥＦ−１α（延長因子）プロモーターなどを有するエッジ・バイオシステムズ社販売のプラスミドベクターｐＥＡＫ１２を採用し、その制限酵素ＳｐｅＩ切断部位に制限酵素ＥｃｏＲＶ切断部位を付加した発現ベクターｐＥＡＫＳ１、及びｐＥＡＫＳ１の制限酵素切断部位ＢａｍＨＩにさらにＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位を付加させた発現ベクターｐＥＡＫＳ２を常法にしたがい調製した。まず、実施例１−１で得たＧ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡ又は実施例１−２で得たＧ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫＳ１又はｐＥＡＫＳ２のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩの位置に常法にしたがってライゲーションし、Ｇ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ１、及び、Ｇ蛋白質α１６／Ｚ蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ２を得た。次に、Ｇ蛋白質α１６／Ｚ蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ２を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、プロモーター領域とともにＧ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を調製し、それをＧ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ１のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に、常法にしたがってライゲーションし、Ｇα１５及びＧα１６／Ｚキメラ蛋白質を共発現するベクター『ｐＥＡＫ／ＥＦ２−Ｇα（１５＋１６／Ｚ）を得た（図１参照）。なお、使用したＰＣＲプライマーの一覧表を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【実施例２】
＜マウス甘味受容体蛋白質発現用ベクターの構築＞
【００２４】
【実施例２−１】
＜Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３ＤＮＡの調製＞
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス１６匹より舌組織約２．４ｇを採取した。常法にしたがって、マウス舌由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを調製した。この１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、常法にしたがい、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、常法にしたがい、リボヌクレアーゼＩによりＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。次に、マウス由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ１（配列表における配列番号１６）、Ｔ１Ｒ２（配列表における配列番号１７）及びＴ１Ｒ３（配列表における配列番号１８）のＤＮＡを得るために、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースに登録されているＤＮＡ配列をもとに、開始コドン付近の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を付加したセンスプライマー、及び、終始コドン付近の相補塩基配列に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を付加したアンチセンスプライマーを作製した。上記ｃＤＮＡ及びＰＣＲ用プライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいＰＣＲを行い、５‘末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を、３’末端に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を有する、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡを得た。
【００２５】
【実施例２−２】
＜甘味受容体発現ベクターの構築＞
発現ベクターは、実施例１−３で用いた発現ベクターｐＥＡＫＳ１において、薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子（インビトロジェン社販売の発現ベクターｐＲＥＰ９由来）に組み替えた発現ベクター「ｐＥＡＫＳＮ１」を常法により作製した。単独発現の場合には、実施例２−１で得たＤＮＡをそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫＳＮ１のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの位置に常法にしたがってライゲーションし、甘味受容体Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３用の発現ベクターを得た（図２参照）。共発現の場合には、ｐＥＡＫＳ２のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの位置にいずれかの甘味受容体を導入した発現ベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化して、プロモーター領域及び甘味受容体蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、これを甘味受容体蛋白質をコードするＤＮＡを含むｐＥＡＫＳＮ１のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に、常法にしたがってライゲーションし、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２共発現ベクター、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３共発現ベクター、及びＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３共発現ベクターを得た。なお、使用したＰＣＲ用プライマーの一覧表を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【実施例３】
＜各種甘味受容体発現細胞の調製＞
実施例１−３で得たＧ蛋白質α１５、α１６／Ｚキメラ蛋白質（以下、「Ｇ蛋白質αサブユニット」という）を共発現するベクターを、ヒト胎児腎臓上皮由来２９３細胞株（理研ジーンバンク、ＲＣＢ Ｎｏ１６３７）に、常法のリポフェクション法により遺伝子導入した。導入細胞は、ピューロマイシン（エッジ・バイオシステムズ社販売、商品名『ピューロマイシン』）１ｍｇ／ｌを含有する１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変最小培地（Ｄ−ＭＥＭ）で細胞濃度２×１０６個／ｍｌで懸濁したのち、プラスチックシャーレで培養した。１０〜１４日後、ピューロマイシン耐性の細胞コロニーを回収し、ｍＲＮＡレベルでのＧ蛋白質αサブユニットの発現を確認して、Ｇ蛋白質αサブユニット発現細胞株を得た。この細胞に、実施例２−２で調製した甘味受容体であるＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３を単独発現用の発現ベクター、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３、又は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共発現用の発現ベクターを常法のリポフェクション法で遺伝子導入した後、『ピューロマイシン』１ｍｇ／ｌ及び『ジェネチシン』５００ｍｇ／ｌを含有する１０％ウシ胎児血清を有するＤ−ＭＥＭに懸濁し、細胞培養用プラスチックシャーレで培養した後、１０〜１４日後、両薬剤耐性の細胞コロニーを回収し、導入した遺伝子が想定したとおりに発現していることを常法のＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡレベルでの発現を確認し、Ｇ蛋白質と甘味受容体が発現している細胞を得た。なお、対照として、Ｇ蛋白質又は甘味受容体遺伝子を含まない発現ベクターのみを導入したものを用意した。
【００２８】
【実施例４】
＜甘味受容体でのトレハロース及びスクロース反応性テスト＞
常法の細胞内カルシウムイオン測定方法にしたがって測定した。すなわち、実施例３で調製したＧ蛋白質及び甘味受容体を発現している２９３細胞をプラスチックシャーレでコンフルエント状態まで培養した後、０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により剥離させ、１０％ウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地に細胞濃度１×１０６個／ｍｌに懸濁し、細胞内カルシウム検出試薬であるモレキュラープローブス社販売の商品名『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』を最終濃度２μＭとなるように添加し、３７℃で３０〜９０分間培養することにより、カルシウム検出試薬『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』を細胞内に取り込ませた。これを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するカルシウムイオン測定用緩衝液で洗浄し、細胞外の試薬を除去し、同緩衝液で細胞濃度２．６７×１０７個／ｍｌに懸濁し、１００μｍメッシュで濾過し、２５℃で３０分静置した後、ガラスキュベット（日立製作所（株）販売）に細胞懸濁液を２ｍｌ入れ、蛍光分光強度計（日立製作所（株）製造、商品名『ＨＩＴＡＣＨＩ ６５０−４０』にセットした。
【００２９】
試料の糖質として、トレハロース（片山化学工業（株）販売）、対照として、スクロース（和光純薬工業（株）販売）を、上記のカルシウムイオン測定用緩衝液で１Ｍに溶解した。これを上記の細胞懸濁液の入ったガラスキュベットに０．６７ｍｌ添加し、撹拌した後、励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍでの蛍光強度を測定し、反応性の有無を調べた。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３に示すように、Ｇ蛋白質αサブユニット及びＴ１Ｒ３発現細胞において、トレハロースに対する反応性が検出された。一方、対照のスクロースは、Ｇ蛋白質αサブユニット、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３発現細胞において、反応性が検出された。この結果は、トレハロース受容体においては、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２は不要であり、Ｇ蛋白質αサブユニットとともにＴ１Ｒ３のみが必要であること、トレハロースとスクロースは異なる受容体により認識されていることが判明した。
【００３２】
【実施例５】
＜トレハロース受容体における他の甘味成分の検出＞
実施例４において、Ｇ蛋白質αサブユニットと甘味受容体Ｔ１Ｒ３のみを発現させた細胞における、各種甘味を有する物質に対する反応性を測定した。すなわち、表４に示す各種甘味物質について、それぞれカルシウムイオンの流入の測定を、実施例４と同様にして行った。結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
表４に示すとおり、トレハロース受容体は、トレハロース以外の糖質には反応性がなく、トレハロースを特異的に認識することが判明した。したがって、各種甘味料が混在する状況下においても、トレハロースを特異的に検出することが可能である。
【００３５】
【実施例６】
＜トレハロース受容体におけるトレハロースの定量＞
市販の９６穴マイクロプレートに、実施例４で調製した細胞懸濁液０．１ｍｌずつを播種し、これに、実施例４のカルシウムイオン測定用緩衝液により各種濃度に希釈したトレハロース溶液、すなわち、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１，０００ｍＭ、又は２，０００ｍＭを０．１ｍｌずつ添加し、濃度マルチプレート用自動蛍光測定装置（大日本製薬（株）販売、商品名『フルオロスキャンアセントＷ／ＤＦ』）により、励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍで測定し、蛍光強度の積分値を算出した。なお、陰性対照はトレハロース無添加の試料を用いた。結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】
表５に示すように、トレハロース濃度５ｍＭ以上から、トレハロースの検出が可能となり、５００ｍＭまでは直線性を有していた。したがって、この結果は、トレハロース濃度５ｍＭ乃至５００ｍＭの範囲内で定量的にトレハロース濃度が測定できることを示している。
【００３８】
【発明の効果】
本発明は、哺乳動物における受容体の新規な組み合わせによるトレハロース受容体によって、トレハロースの検出や定量を、簡便に実施できる。また、トレハロースに特異的な受容体を利用しているので、他の糖質、例えばスクロースが混入している試料であっても測定可能である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＧ蛋白質αサブユニットα１５及びα１６／Ｚ共発現ベクターの構造を示す。
【図２】本発明によるＴ１Ｒ３蛋白質発現ベクターの構造を示す。
【符号の説明】
ＥＦ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：延長因子プロモーター
Ｇα１５：Ｇ蛋白質αサブユニットα１５
ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌ：ポリＡ付加シグナル
Ｇα１６／Ｚ：Ｇ蛋白質αサブユニットα１６／Ｚキメラ蛋白質
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物におけるトレハロース受容体並びにトレハロース受容体を用いるトレハロース検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌、第４５巻、第６号、３８１−３８４頁、１９９８年
【非特許文献２】サイエンス、２８９巻、１１６−１１９頁、２０００年
【非特許文献３】ネイチャー、４１３巻、１３号、２１１−２２５頁、２００１年
【非特許文献４】セル、１０６巻、３８１−３９０頁、２００１年
【非特許文献５】ネイチャー、４１６巻、１４号、１９９−２０２頁、２００２年
【０００３】
トレハロースは、澱粉原料からの生産技術が確立されたことにより、安価に製造可能となり、トレハロースを配合した食品や化粧品が市場に出回るようになった。近年、消費者保護の観点から、食品や化粧品などの配合成分のデータを表示することが求められるようになり、これはトレハロースについても同様であって、表示の正当性を確認するためにも、食品や化粧品中のトレハロースを検出する方法が必要である。従来提案されいるトレハロースの検出方法としては、非特許文献１で開示される検出方法、すなわち、食品などから糖類を抽出し、それをトリメチルシリル誘導体化した後、ガスクロマトグラフィーにより分離してトレハロースの含有量を計測するというものがある。この方法は、多くの食品に適用可能であり、ｐｐｍ単位の精度で測定可能であるものの、試料から糖質成分を抽出精製する工程、トリメチルシリル誘導体化が必要であり、操作が煩雑であってより簡単な方法が求められている。
【０００４】
トレハロースは、砂糖の４５％の甘味度を舌により体感できることから、舌の味蕾に存在する味覚細胞により感知されていると考えられるので、トレハロース受容体の存在が示唆され、この受容体を用いれば、トレハロースの検出をより容易かつ簡便に行うことが可能になるものと思われるが、ヒトを含めた哺乳動物におけるトレハロース受容体は、その存在が未だ知られていない。すなわち、非特許文献２で開示されるように、ショウジョウバエにおいては、トレハロース受容体がクローニングされているが、本発明者等が得た知見によれば、ショウジョウバエのトレハロース受容体のＤＮＡ配列を利用して、マウスの舌組織からｍＲＮＡを調製し、遺伝子クローニングを試みたところ、ショウジョウバエで発見されたトレハロース受容体蛋白質に相当する蛋白質はマウスなどの哺乳動物において発見することはできなかった。
【０００５】
非特許文献３には、スクロースの受容体をはじめとするさまざまな味覚に関する受容体が明らかにされ、例えば、非特許文献４で開示される甘味受容体としては、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３のヘテロ２量体であるスクロース受容体や、非特許文献５で開示されるＴ１Ｒ１とＴ１Ｒ３のヘテロ２量体であるＬ−アミノ酸受容体が開示されている。また、非特許文献４には、Ｇ蛋白質のαサブユニットである、α１５、α１６及びαＺが上記甘味受容体の反応に関与していることが記載されている。しかしながら、これらの文献はいずれもトレハロースの受容体については何らの教示を与えるものでない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような背景の下に為されたもので、哺乳動物におけるトレハロース受容体を解明するとともに、それを用いて、抽出精製工程や誘導体化を必要とせず、試料中のトレハロースを直接的にかつ容易に検出する方法を提供することを課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、哺乳類におけるトレハロース受容体を解明すべく、研究を重ねた結果、意外にも、哺乳動物においては、スクロース受容体の一部とＧ蛋白質のαサブユニットとが組み合わさって、トレハロース受容体を形成していることを見出し、また、このトレハロース受容体を用いれば、トレハロースを特異的に、かつ、定量的に検出可能であることを確認し、本発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、本発明は、哺乳動物におけるトレハロース受容体を提供するとともに、トレハロース受容体を発現させた細胞及びそれを用いたトレハロース検出方法を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明が明らかにしたトレハロース受容体とは、Ｇ蛋白質αサブユニットの一種であるα１５（配列表における配列番号１）、α１６（配列表における配列番号２）、αＺ（配列表における配列番号３）を共発現させた細胞、若しくは、α１５（配列表における配列番号１）とともに、モーディーら、モレキュラーファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第５７巻、１３−２３頁、２０００年に開示されるα１６／Ｚキメラ蛋白質（配列表における配列番号４）を共発現させた細胞において、甘味受容体の一つであるＴ１Ｒ３（配列表における配列番号５）を発現させることにより、細胞膜上に形成される新規な組み合わせの味覚受容体である。本発明で用いられるＧ蛋白質αサブユニットやＴ１Ｒ３蛋白質は、哺乳動物由来であれば、特にそれら由来の動物種は限定されず、また、各蛋白質がそれぞれ異なる動物種のものとなってもよい。これらの蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列については、遺伝子データバンク、例えば「ＧＥＮＢＡＮＫ」などに開示されるものを利用することができる。とりわけ、Ｔ１Ｒ３蛋白質及びα１５がマウス由来、α１６及びαＺがヒト由来であるものが、感度に優れるので好ましい。さらに、トレハロースを感受することができる範囲内で、各蛋白質においてアミノ酸の欠失、置換、付加があってもよい。また、これらの蛋白質を、例えば、Ｔ１Ｒ３にα１５、α１６、α１６／Ｚキメラ蛋白質を連結して発現させたり、それぞれの蛋白質を同一のベクターで発現させることができる。なお、上記のα１６／Ｚキメラ蛋白質（配列表における配列番号４）は、受容体発現に必要な遺伝子数を減じる効果があり、本発明に有利に利用できる。
【００１０】
本発明で用いられるトレハロース受容体を発現させる細胞としては、種類、由来動物などを問わず、本発明のトレハロース受容体が細胞膜上に形成され、かつ、それがトレハロースと結合又は反応することによって、細胞がなんらかの反応を示す限り、どのような細胞を用いてもよい。トレハロースに対する特異性を高めるために、味覚細胞などの味覚受容体を有する細胞を避け、味覚受容体を有しない細胞を用いるのが好ましい。とりわけ、ヒト胎児腎臓上皮細胞由来の２９３細胞株（理研ジーンバンク、ＲＣＢ１６３７）は、味覚受容体を有しておらず、また、後述する細胞内カルシウムイオンの検出が比較的容易に行えるので、本発明において有利に用いられる。
【００１１】
本発明で用いられるトレハロース受容体を発現させる方法としては、まず、上記の受容体蛋白質をコードするＤＮＡ、つまり、例えば、配列番号１乃至５に開示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを入手する必要がある。ＤＮＡを入手する方法としては、ＤＮＡの全部又は一部を化学合成により合成する方法、動物のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡから、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により選別採取する方法などが挙げられ、それらを適宜組み合わせて本発明に必要なＤＮＡを得ることができる。
【００１２】
上記のＤＮＡにコードされるトレハロース受容体蛋白質を細胞膜上に発現させるには、適宜の動物細胞発現用発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞に導入すればよい。発現ベクターとしては、通常、動物細胞に用いられる発現ベクターを適宜選択すればよく、適宜の薬剤耐性遺伝子、発現プロモーター領域、ポリアデニル化部位、ポリリンカー、制限酵素切断部位、エンハンサー領域などを配した発現ベクターを用いることができ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクターなど、どのような種類のベクターをも用いることができる。また、発現形態が一過的な発現であっても、恒常的な発現であってもよく、目的に応じて適宜選択すればよい。また、各Ｇ蛋白質及び受容体蛋白質をコードするＤＮＡをそれぞれ単一の発現ベクターに組み込んでも、単一の発現ベクター上に複数種のＧ蛋白質及び受容体蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んで発現させてもよい。
【００１３】
本発明によるトレハロースの検出方法は、スクロース受容体の一部とＧ蛋白質αサブユニットの一部との新規な組み合わせによるトレハロース受容体を膜表面に発現させた動物細胞に対して、トレハロースが含まれていると想定される試料を添加し、その中に含まれるトレハロースがトレハロース受容体と結合することによって引き起こされる生化学的な反応を測定することにより、試料中のトレハロースを検出するというものである。本発明に用いられる生化学的な反応としては、細胞内シグナル伝達系に関与する反応が挙げられ、それに関わる物質、例えば、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ、プロテインキナーゼＣ、カルシウムイオンなどの量の増減を測定する方法が挙げられる。とりわけ、カルシウムイオンの流入を測定する方法が最も簡便かつ感度に優れる有力な手法であり、本発明において有利に実施できる。
【００１４】
細胞内におけるカルシウムイオンの測定方法としては、カルシウムイオンと結合することにより、蛍光を発する試薬、例えば、モレキュラープローブス社販売の商品名『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』などの細胞内におけるカルシウムイオン検出用試薬が挙げられ、反応させることによって発せられる蛍光を、市販のプレート式、キュベット式、フローサイトメトリー式の蛍光検出装置により測定する方法、蛍光顕微鏡などで肉眼的に観察する方法などが挙げられる。
【００１５】
本発明のトレハロースの検出方法によれば、様々な食品又は化粧品などを被検対象品として、それらに含有まれるトレハロースを特異的に測定することができる。被検対象品が固体、ペースト、ゲル又は親油性液体ならば、水性溶媒により被検対象品に含まれるトレハロースを溶解し、不溶物質を除去して試料とする。また、被検対象が親水性液体ならば、そのまま、あるいは、いったん乾燥固化したものを水性溶媒で再溶解したものを用いることもできる。また、例えば、細胞毒性を有する物質、ミネラル、又は色素などの、トレハロースの検出に支障のある不純物質が試料中に混在する場合は、適宜の分離方法、例えば、活性炭吸着法、有機溶媒抽出法、遠心分離法、膜濾過法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法などの方法で、また、不純物質を適宜の酸、アルカリ、還元剤、酸化剤などの薬剤、分解酵素などで処理し、試料からトレハロース以外の不要な物質を除去することもできる。また、必要ならば、トレハロース分解酵素であるトレハラーゼを処理した試料を陰性対象として用いれば、より正確なトレハロース含量が測定可能であり、特にバックグラウンドが高い場合は有利となる。本発明によるトレハロースの検出方法における検出感度は、試料溶液中におけるトレハロース濃度で５ｍＭ以上乃至５００ｍＭの範囲で測定可能である。したがって、試料溶液中のトレハロース濃度がこの範囲内でない場合は、試料を段階的に濃縮又は希釈することによって、上記測定範囲内になるように調節すればよい。
【００１６】
本発明のトレハロースの検出方法は、上記の食品や化粧品に含まれるトレハロースの含量を測定することに用いられるほか、例えば、トレハロースなどの糖質を誘導体化することによる甘味度の増減効果を検討するといった、新規甘味料の検索にも利用できる。
【００１７】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【実施例１】
＜Ｇ蛋白質αサブユニット蛋白質発現用ベクターの構築＞
【００１９】
【実施例１−１】
＜Ｇ蛋白質αサブユニット蛋白質α１５をコードするＤＮＡの調製＞
マウス骨髄性白血病由来細胞株ＷＥＨＩ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−６８）から、常法にしたがい、ｍＲＮＡを含むＲＮＡを抽出精製し、このＲＮＡ１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、リボヌクレアーゼＩにより混在するＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。また、Ｇ蛋白質αサブユニットα１５ＤＮＡ（配列表の配列番号６）の５’末端のＤＮＡ配列に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含む塩基配列を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号７）、３’末端のＤＮＡ配列に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を含む塩基配列を付加したＰＣＲ用アンチセンスプライマーを作製した（配列表における配列番号８）。上記ｃＤＮＡ及びＰＣＲ用プライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいＰＣＲを行い、Ｇ蛋白質α１５をコードするＤＮＡを得た。
【００２０】
【実施例１−２】
＜Ｇ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡの調製＞
ヒト骨髄性白血病由来細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２４０）又はＵ９３７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）から、常法にしたがい、ｍＲＮＡを含むＲＮＡを抽出精製し、このＲＮＡ１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、常法にしたがい、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、常法にしたがい、リボヌクレアーゼＩによりＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。また、Ｇ蛋白質α１６ＤＮＡ（配列表の配列番号９）及びＧ蛋白質αＺＤＮＡ（配列表の配列番号１０）を得るべく、α１６の開始コドン付近のＤＮＡ配列、すなわち塩基番号２０２から２２１までの配列の５’側に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号１１）、α１６の塩基番号１１９６から１２１１までの相補配列の５’側にαＺの塩基番号９４６から９６０までの相補配列を付加したアンチセンスプライマー（配列表の配列番号１２）を作製した。一方、αＺＤＮＡを得るべく、配列表における配列番号１０の塩基番号９４６から９６０までの配列の５’側にα１６の塩基番号１１９５から１２１１までの配列を付加したＰＣＲ用センスプライマー（配列表の配列番号１３）、αＺの塩基番号１０６８から１０８６までの相補配列の５’側に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を付加したアンチセンスプライマー（配列表の配列番号１４）を作製した。これらｃＤＮＡ及びＰＣＲプライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいそれぞれＰＣＲを行い、Ｇ蛋白質α１６及びＧ蛋白質αＺをコードするＤＮＡを得た。これらを混ぜ合わせ、熱変成した後、オーバーラップした部分をアニーリングさせた後、さらにＰＣＲを行い、約１２００ｂｐのα１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを得た。
【００２１】
【実施例１−３】
＜Ｇ蛋白質α１５及びα１６／Ｚキメラ蛋白質を共発現するベクターの構築＞
発現ベクターとして、ピューロマイシン耐性遺伝子、ＥＦ−１α（延長因子）プロモーターなどを有するエッジ・バイオシステムズ社販売のプラスミドベクターｐＥＡＫ１２を採用し、その制限酵素ＳｐｅＩ切断部位に制限酵素ＥｃｏＲＶ切断部位を付加した発現ベクターｐＥＡＫＳ１、及びｐＥＡＫＳ１の制限酵素切断部位ＢａｍＨＩにさらにＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位を付加させた発現ベクターｐＥＡＫＳ２を常法にしたがい調製した。まず、実施例１−１で得たＧ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡ又は実施例１−２で得たＧ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡを、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫＳ１又はｐＥＡＫＳ２のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩの位置に常法にしたがってライゲーションし、Ｇ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ１、及び、Ｇ蛋白質α１６／Ｚ蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ２を得た。次に、Ｇ蛋白質α１６／Ｚ蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ２を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、プロモーター領域とともにＧ蛋白質α１６／Ｚキメラ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を調製し、それをＧ蛋白質α１５蛋白質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＥＡＫＳ１のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に、常法にしたがってライゲーションし、Ｇα１５及びＧα１６／Ｚキメラ蛋白質を共発現するベクター『ｐＥＡＫ／ＥＦ２−Ｇα（１５＋１６／Ｚ）を得た（図１参照）。なお、使用したＰＣＲプライマーの一覧表を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【実施例２】
＜マウス甘味受容体蛋白質発現用ベクターの構築＞
【００２４】
【実施例２−１】
＜Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３ＤＮＡの調製＞
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス１６匹より舌組織約２．４ｇを採取した。常法にしたがって、マウス舌由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを調製した。この１μｇから、１２．５ｐｍｏｌのランダムヘキサマーをプライマーとして、常法にしたがい、ストラタジーン製の逆転写酵素である商品名『スーパースクリプトＩＩ ＲＴ』で、４２℃で５０分間反応することにより、第１ストランドｃＤＮＡを合成した。引き続き、常法にしたがい、リボヌクレアーゼＩによりＲＮＡを酵素分解し、ＰＣＲの鋳型用のｃＤＮＡを得た。次に、マウス由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ１（配列表における配列番号１６）、Ｔ１Ｒ２（配列表における配列番号１７）及びＴ１Ｒ３（配列表における配列番号１８）のＤＮＡを得るために、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースに登録されているＤＮＡ配列をもとに、開始コドン付近の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を付加したセンスプライマー、及び、終始コドン付近の相補塩基配列に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を付加したアンチセンスプライマーを作製した。上記ｃＤＮＡ及びＰＣＲ用プライマーを用いて、宝酒造株式会社販売の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである商品名『ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ』により、常法にしたがいＰＣＲを行い、５‘末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を、３’末端に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を有する、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡを得た。
【００２５】
【実施例２−２】
＜甘味受容体発現ベクターの構築＞
発現ベクターは、実施例１−３で用いた発現ベクターｐＥＡＫＳ１において、薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子（インビトロジェン社販売の発現ベクターｐＲＥＰ９由来）に組み替えた発現ベクター「ｐＥＡＫＳＮ１」を常法により作製した。単独発現の場合には、実施例２−１で得たＤＮＡをそれぞれ、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＡＫＳＮ１のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの位置に常法にしたがってライゲーションし、甘味受容体Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３用の発現ベクターを得た（図２参照）。共発現の場合には、ｐＥＡＫＳ２のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの位置にいずれかの甘味受容体を導入した発現ベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化して、プロモーター領域及び甘味受容体蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を調製し、これを甘味受容体蛋白質をコードするＤＮＡを含むｐＥＡＫＳＮ１のＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に、常法にしたがってライゲーションし、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２共発現ベクター、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３共発現ベクター、及びＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３共発現ベクターを得た。なお、使用したＰＣＲ用プライマーの一覧表を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【実施例３】
＜各種甘味受容体発現細胞の調製＞
実施例１−３で得たＧ蛋白質α１５、α１６／Ｚキメラ蛋白質（以下、「Ｇ蛋白質αサブユニット」という）を共発現するベクターを、ヒト胎児腎臓上皮由来２９３細胞株（理研ジーンバンク、ＲＣＢ Ｎｏ１６３７）に、常法のリポフェクション法により遺伝子導入した。導入細胞は、ピューロマイシン（エッジ・バイオシステムズ社販売、商品名『ピューロマイシン』）１ｍｇ／ｌを含有する１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変最小培地（Ｄ−ＭＥＭ）で細胞濃度２×１０６個／ｍｌで懸濁したのち、プラスチックシャーレで培養した。１０〜１４日後、ピューロマイシン耐性の細胞コロニーを回収し、ｍＲＮＡレベルでのＧ蛋白質αサブユニットの発現を確認して、Ｇ蛋白質αサブユニット発現細胞株を得た。この細胞に、実施例２−２で調製した甘味受容体であるＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３を単独発現用の発現ベクター、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３、又は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共発現用の発現ベクターを常法のリポフェクション法で遺伝子導入した後、『ピューロマイシン』１ｍｇ／ｌ及び『ジェネチシン』５００ｍｇ／ｌを含有する１０％ウシ胎児血清を有するＤ−ＭＥＭに懸濁し、細胞培養用プラスチックシャーレで培養した後、１０〜１４日後、両薬剤耐性の細胞コロニーを回収し、導入した遺伝子が想定したとおりに発現していることを常法のＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡレベルでの発現を確認し、Ｇ蛋白質と甘味受容体が発現している細胞を得た。なお、対照として、Ｇ蛋白質又は甘味受容体遺伝子を含まない発現ベクターのみを導入したものを用意した。
【００２８】
【実施例４】
＜甘味受容体でのトレハロース及びスクロース反応性テスト＞
常法の細胞内カルシウムイオン測定方法にしたがって測定した。すなわち、実施例３で調製したＧ蛋白質及び甘味受容体を発現している２９３細胞をプラスチックシャーレでコンフルエント状態まで培養した後、０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液により剥離させ、１０％ウシ胎児血清を含有するＤ−ＭＥＭ培地に細胞濃度１×１０６個／ｍｌに懸濁し、細胞内カルシウム検出試薬であるモレキュラープローブス社販売の商品名『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』を最終濃度２μＭとなるように添加し、３７℃で３０〜９０分間培養することにより、カルシウム検出試薬『Ｆｌｕｏ−４．ＡＭ』を細胞内に取り込ませた。これを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５．５ｍＭ Ｄ−グルコース、０．１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するカルシウムイオン測定用緩衝液で洗浄し、細胞外の試薬を除去し、同緩衝液で細胞濃度２．６７×１０７個／ｍｌに懸濁し、１００μｍメッシュで濾過し、２５℃で３０分静置した後、ガラスキュベット（日立製作所（株）販売）に細胞懸濁液を２ｍｌ入れ、蛍光分光強度計（日立製作所（株）製造、商品名『ＨＩＴＡＣＨＩ ６５０−４０』にセットした。
【００２９】
試料の糖質として、トレハロース（片山化学工業（株）販売）、対照として、スクロース（和光純薬工業（株）販売）を、上記のカルシウムイオン測定用緩衝液で１Ｍに溶解した。これを上記の細胞懸濁液の入ったガラスキュベットに０．６７ｍｌ添加し、撹拌した後、励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍでの蛍光強度を測定し、反応性の有無を調べた。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
表３に示すように、Ｇ蛋白質αサブユニット及びＴ１Ｒ３発現細胞において、トレハロースに対する反応性が検出された。一方、対照のスクロースは、Ｇ蛋白質αサブユニット、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３発現細胞において、反応性が検出された。この結果は、トレハロース受容体においては、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２は不要であり、Ｇ蛋白質αサブユニットとともにＴ１Ｒ３のみが必要であること、トレハロースとスクロースは異なる受容体により認識されていることが判明した。
【００３２】
【実施例５】
＜トレハロース受容体における他の甘味成分の検出＞
実施例４において、Ｇ蛋白質αサブユニットと甘味受容体Ｔ１Ｒ３のみを発現させた細胞における、各種甘味を有する物質に対する反応性を測定した。すなわち、表４に示す各種甘味物質について、それぞれカルシウムイオンの流入の測定を、実施例４と同様にして行った。結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
表４に示すとおり、トレハロース受容体は、トレハロース以外の糖質には反応性がなく、トレハロースを特異的に認識することが判明した。したがって、各種甘味料が混在する状況下においても、トレハロースを特異的に検出することが可能である。
【００３５】
【実施例６】
＜トレハロース受容体におけるトレハロースの定量＞
市販の９６穴マイクロプレートに、実施例４で調製した細胞懸濁液０．１ｍｌずつを播種し、これに、実施例４のカルシウムイオン測定用緩衝液により各種濃度に希釈したトレハロース溶液、すなわち、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１，０００ｍＭ、又は２，０００ｍＭを０．１ｍｌずつ添加し、濃度マルチプレート用自動蛍光測定装置（大日本製薬（株）販売、商品名『フルオロスキャンアセントＷ／ＤＦ』）により、励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍで測定し、蛍光強度の積分値を算出した。なお、陰性対照はトレハロース無添加の試料を用いた。結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】
表５に示すように、トレハロース濃度５ｍＭ以上から、トレハロースの検出が可能となり、５００ｍＭまでは直線性を有していた。したがって、この結果は、トレハロース濃度５ｍＭ乃至５００ｍＭの範囲内で定量的にトレハロース濃度が測定できることを示している。
【００３８】
【発明の効果】
本発明は、哺乳動物における受容体の新規な組み合わせによるトレハロース受容体によって、トレハロースの検出や定量を、簡便に実施できる。また、トレハロースに特異的な受容体を利用しているので、他の糖質、例えばスクロースが混入している試料であっても測定可能である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＧ蛋白質αサブユニットα１５及びα１６／Ｚ共発現ベクターの構造を示す。
【図２】本発明によるＴ１Ｒ３蛋白質発現ベクターの構造を示す。
【符号の説明】
ＥＦ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：延長因子プロモーター
Ｇα１５：Ｇ蛋白質αサブユニットα１５
ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌ：ポリＡ付加シグナル
Ｇα１６／Ｚ：Ｇ蛋白質αサブユニットα１６／Ｚキメラ蛋白質
Claims (7)
- 配列表における配列番号１、２、３及び５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、配列表における配列番号１、４及び５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質からなる哺乳動物のトレハロース受容体。
- 請求項１に記載のトレハロース受容体を人為的に発現させた動物細胞。
- 配列表における配列番号１、２、３及び５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は、配列表における配列番号１、４及び５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを動物細胞に導入する工程を含む、トレハロース受容体を人為的に発現させた動物細胞の製造方法。
- 請求項１に記載のトレハロース受容体又は請求項２に記載のトレハロース受容体を人為的に発現させた動物細胞を用いることを特徴とするトレハロースの検出方法。
- トレハロース受容体にトレハロースが結合することによって起こる生化学的反応を検出することを特徴とする請求項４に記載のトレハロースの検出方法。
- 生化学的反応の検出が、カルシウムイオンの流入を測定することによって行われる請求項５に記載のトレハロースの検出方法。
- 請求項２に記載のトレハロース受容体を人為的に発現させた動物細胞と、カルシウムイオンの検出試薬を含んでなるトレハロースの検出キット。
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