【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫抑制剤に関する。さらに、詳しくは、本発明はヒストンＨ１に対する抗体を含有する、免疫抑制（特に、移植免疫抑制）に有用な薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植拒絶反応をいかにして制御できるかにかかってきている。拒絶反応は、移植片を生体が異物と認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。これらの免疫反応を抑制するために、臨床上、従来から用いられている免疫抑制剤としては、ステロイド剤（例えば、プレドニゾロン）、代謝拮抗剤（例えば、アザチオプリン、ミゾリビン）、抗生物質（例えば、シクロスポリンＡ、タクロリムス）等が挙げられる。これら薬剤の登場により、腎、心、肝臓移植はすでに一般医療として定着し、肺、膵、小腸移植は、成績向上に伴い次第に普及しつつある（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、これら薬剤には、少なからぬ副作用があり、例えばステロイド剤は、他の免疫抑制剤と比較して、幅広い作用を有するが、免疫抑制作用は一般に弱く、長期連続投与により有効性の減少や抵抗性の発現が見られることがある。アザチオプリンは、核酸合成を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮するが、その使用は細菌などの感染症発症の危険性を増大させ、また、骨髄抑制作用（白血球減少・血小板減少・貧血）と肝臓障害を引き起こすことがある。ミゾリビンは、アザチオプリンと比べ、骨髄抑制作用と肝臓障害が少ないという利点を持つ反面、免疫抑制効果がそれほど高くない。シクロスポリンＡ、タクロリムスは、きわめて強力な免疫抑制活性を持ち、臓器移植の成績向上に貢献した薬剤である。しかしながら、これらには、重篤な中枢神経毒性、腎毒性等があることが明らかとなり、その使用に際しては、細心の注意が必要とされる（非特許文献２）。
【０００４】
一方、臓器移植において、肝臓はきわめて特異な臓器として注目されている。それは、ある種の異系動物間の組み合わせにおいて、同所性肝移植が免疫抑制剤の投与なしに成功することが示されてきたためである（非特許文献３）。これとは別に、肝炎等の肝細胞障害時には免疫抑制状態になることから、障害肝や再生肝が免疫抑制物質を産生しているのではないかと考えられた（非特許文献４）。
【０００５】
このような考えのもと、現在までに数種類の免疫抑制タンパク質が報告されているが、以下にその例を示す。
【０００６】
（Ｌ―アルギナーゼ）
肝細胞内より分離されたＬ―アルギナーゼは、肝が障害を受けた際に血中に放出されると考えられた免疫抑制タンパク質である。大量に放出されたＬ―アルギナーゼは、Ｌ―アルギニンを消化してＬ―オルニチンと尿素を生成させ、体内でアルギニン欠乏状態を作り出し、リンパ球の活発な増殖を抑えるものと考えられる（非特許文献５および特許文献１）。しかし、一方で、アルギニンを加えることによりこの状態は改善されることから、個々の細胞でアルギニン供給量の異なる生体で、例えば、アルギニン供給能の高い肝臓で、長期にわたり拒絶反応を抑制することができるかに疑問点がある。また、大量にアルギニンを消化させることは、同時に大量の尿素を生成させるため、臨床上問題のある高窒素血症を生じさせ、投与が長期にわたれば、腎不全を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献６）。
【０００７】
（超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ））
この物質は、肝細胞より分泌され血清中に出てくるものと考えられている。ＶＬＤＬは末梢血単核球のＤＮＡ合成を阻害してその活性化を抑制する（非特許文献７）。しかし、薬剤としてＶＬＤＬ投与を長期に行うことは、血清ＶＬＤＬの上昇およびリポプロテインリパーゼにより転換された中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）値の上昇を慢性化させ、高脂血症、トリグリセライド血症、糖尿病、尿毒症、動脈硬化を引き起こす可能性がある（非特許文献８）。
【０００８】
（α―フェトプロテインおよび初期妊娠因子（ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｆａｃｔｏｒ））
特殊な状態で、肝臓より免疫抑制タンパク質が分泌されることも知られている。肝癌の腫瘍マーカーとして知られるα―フェトプロテインも免疫抑制力があり、胎仔マウスから同定され、調べられた（非特許文献９）。初期妊娠性因子は、妊娠初期の妊婦尿中、血中から検出された免疫抑制力を有するタンパク質（非特許文献１０）であり、また、肝葉切除後に分泌されることも確かめられた。これらのタンパク質は、非特異的にリンパ球の増殖を抑制する物質で、肝障害が生じた際の旺盛な肝再生力に随伴する物質と思われる。しかし、肝移植が誘導する免疫寛容を説明するに至っていない。
【０００９】
（可溶性クラスＩ抗原）
臨床の肝移植において、多量のドナー型の可溶性クラスＩ抗原が移植直後からレシピエントの血液中に認められる。同物質が免疫寛容を誘導するものと考えられたが、インビボにおいて、同物質を投与しても免疫抑制が十分に誘導されなかった（非特許文献１１）。
【００１０】
（肝抑制因子（ｌｉｖｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆａｃｔｏｒ−１：ＬＳＦ―１））
ラット肝移植後の血清を経時的に採取し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで電気泳動を行うことにより得られた分子量約４０ｋＤの免疫抑制タンパク質であり、その効果は、極めて高いと推測されるが、タンパク質の同定が行われておらず（非特許文献１２）、薬剤として実用化するためには、今後さらなる検討が必要である。
【００１１】
（インドールアミン酸素添加酵素（ＩＤＯ））
ＩＤＯは、肝臓以外の臓器由来免疫抑制性タンパク質である。マウス異系父母間の受胎産物の生育に関して、ＩＤＯが胎盤の多核栄養芽層で発現していること、さらに受胎産物の拒絶反応を抑制することが示された（非特許文献１３）。また、ＩＤＯを移植免疫抑制剤として使用する試みも報告されている（特許文献２）
【００１２】
（抗ＭＨＣ抗体）
ラット肝移植後の血清中にドナー型ＭＨＣクラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体が認められた（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。抗クラスＩ抗体は、上述の可溶性クラスＩ抗原と複合体を形成し、免疫抑制作用を有する可能性が考えられている。また、抗クラスＩＩ抗体は、組織片に存在するクラスＩＩ抗原（分子量３５ｋＤの鎖と分子量２８〜２９ｋＤの鎖からなる）をマスクすることにより免疫抑制作用を有すると考えられている。
【００１３】
以上のように、現在臨床上使用されている免疫抑制剤には、骨髄抑制作用、肝臓障害中枢神経毒性、腎毒性等の副作用が知られている。また肝移植後に認められた免疫抑制タンパク質も、臨床上応用可能な活性を持つものは未だ発見されていない。
【００１４】
本発明者らは、ラット異系間同所性肝移植モデルにおいて、肝移植後のラット血清に免疫抑制活性があることを認め、その本体が肝移植直後に発現する免疫グロブリン様物質であることを見出した（特許文献３）。さらに、この免疫グロブリン様物質がラット脾臓由来の３種類のタンパク質（分子量７３ｋＤ／等電点５．２、分子量３４ｋＤ／等電点４．９、分子量３１ｋＤ／等電点５．３）を特異的に認識するものであり、したがって前述の抗ＭＨＣ抗体とは異なるものであると考えた。
【００１５】
【特許文献１】
特開平３―１５７３９９号公報
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ／５０９０１Ａ１号パンフレット
【特許文献３】
特開２００１−２３３９００号公報
【非特許文献１】
今日の移植，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，５３，１９９８
【非特許文献２】
今日の移植，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，３７，１９９８
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２２３，４２７，１９６９
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５１，６５５，１９７４
【非特許文献５】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３１，２４２７，１９８３
【非特許文献６】
ｍｅｄｉｃｉｎａ，ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１１，６０，１９９４
【非特許文献７】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ｖｏｌ．１１９ ２１２９ １９７７
【非特許文献８】
ｍｅｄｉｃｉｎａ ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．１１ １７９ １９９４
【非特許文献９】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１４１，２６９，１９７５
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２７８，６４９，１９７９
【非特許文献１１】
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．５０，６７８，１９９０
【非特許文献１２】
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．３，１７４，１９９５
【非特許文献１３】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８１，１１９１，１９９８
【非特許文献１４】
臨床科学，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６，１９９０
【非特許文献１５】
生体防御，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，１９９０
【非特許文献１６】
細胞工学，ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．５，１９９３
【００１６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述のような副作用等の問題点の少ない免疫抑制剤を提供することであり、特に臓器移植において拒絶反応を特異的に抑制することができる抗原特異的な移植免疫抑制を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝移植後のラット血清が免疫抑制活性を有することを見出した。さらに、その免疫抑制活性の中心が前記血清のＩｇＧ成分であり、この抗体は自己リンパ球上の特異抗原（７３，３４，３１ｋＤ）を認識することも見出した。前記抗原から３１ｋＤタンパク質を単離、シークエンスして、その部分配列構造から明らかとなったフラグメントについて、ＢＬＡＳＴ解析を行った。その結果、該配列と高いホモロジーを有するタンパク質としてヒストンＨ１タンパク質（ラット、ウシ、ヒト）を同定した。そこで、ヒストンＨ１タンパク質に対するポリクローナル抗体を入手し、その免疫抑制活性を調べたところ、免疫抑制効果を確認した。さらに、臓器移植拒絶のモデル系として、認められているラット異所性心移植試験の結果、その拒絶抑制効果を確認した。くわえて、抗ヒストンポリクローナル抗体が肝移植後のラット血清中で発現されていることも確認した。以上のような知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明はヒストンＨ１に対する抗体を含有する免疫抑制剤を提供する。
【００１９】
好ましくは、前記免疫抑制剤の有効成分である、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２０】
また好ましくは、前記ヒストンがヒト由来である。
【００２１】
また、上記免疫抑制剤は、移植免疫抑制に適用されることが特に好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を含有する免疫抑制のための薬学的組成物を提供する。
【００２３】
好ましくは、前記薬学的組成物において、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２４】
また好ましくは、前記薬学的組成物において、ヒストンがヒト由来である。
【００２５】
さらに、本発明は、免疫抑制を必要とするヒトを含む哺乳動物に、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を投与することからなる、該哺乳動物の治療方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、前記治療方法において、免疫抑制が移植免疫抑制である。
【００２７】
また好ましくは、前記治療方法において、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２８】
また好ましくは、前記治療方法において、ヒストンがヒト由来である。
【００２９】
くわえて、本発明は、ヒトを含む哺乳動物レシピエントに、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を投与することからなる、該哺乳動物レシピエントで移植拒絶を防ぐ方法をも提供する。
【００３０】
また、本発明は、ラット脾細胞から単離、精製された抗原性タンパク質であって、
該タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された分子量３１ｋＤと、等電点電気泳動によって決定された等電点５．３を有し、さらにＲＲＫＡＳＧＰＰＶＳＥＬＩＴＫＡＶで表される部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする前記単離、精製されたタンパク質を提供する。
【００３１】
また、本発明は、異系間同所性肝移植後のラット血清から単離、精製されたタンパク質であって、
該タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された分子量３７ｋＤと、等電点電気泳動によって決定された等電点約５．０を有し、さらに移植後期のラット血清に発現することを特徴とする前記単離、精製されたタンパク質を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、ヒトを含む哺乳動物レシピエントにおいて肝移植の拒絶反応の有無を診断する方法であって、
移植後の血清中に発現される自己抗原タンパク質に対する該血清の免疫反応性レベルを測定するステップを含み、ここで該免疫反応性レベルは前記拒絶反応の有無の指標である、
ことを特徴とする前記診断方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、前記免疫反応性レベルが抗ヒストンＨ１抗体価であることを特徴とする上記診断方法を提供する。
【００３４】
なお、本発明の免疫抑制剤は、臓器・組織移植（特に、肝移植）における拒絶反応の防止に有用であるのみならず、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の炎症性疾患の治療薬としての可能性もある。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００３６】
本発明に係るタンパク質類は、例えば、Ｋａｍａｄａらの手法（Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．９３，６４，１９８３）を用いて、異種ラット間（例えば、ＤＡ系ラットからＰＶＧ系ラット）で同所肝移植手術を行うことによりそれらの発現を誘導させることができる。具体的には、ＤＡ系ラツトの肝臓をＰＶＧ系ラットへ移植する。肝臓移植後の血液を採取し、遠心分離後上清を回収して、タンパク質類を含む血清を得ることができる。
【００３７】
この血清から前記タンパク質類を精製する方法としては、例えば、Ｏｄａら手法（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ Ｖｏｌ．２０４， Ｎｏ． ３ １１３１，１９９４）に準じる。具体的には、血清をＤＥＡＥセファロースカラムにかけ、吸着したタンパク質画分を溶出する。さらに、ＣＮ−Ｂｒ活性化セファロースカラムで溶出して、精製を行う。得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動すると、タンパク質バンドが回収される。
【００３８】
本発明に係る肝移植後のラット血清（以下、ラット肝移植後血清、または単に肝移植後血清という）は、免疫抑制活性を有するが、これはラット脾臓リンパ球を用いる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで確認できる（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，１９９４）。この結果から、移植後のレシピエントＰＶＧラットの血清中には、免疫抑制因子が存在することが明らかとなった。さらに、前記血清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム等を用いて、ＩｇＧ画分を精製し、或いは除去してＩｇＧ除去画分を調製できる。これらの各画分と血清とをＭＬＲアッセイで分析すると、免疫抑制活性の本体はＩｇＧ画分であることが明らかとなった。
【００３９】
さらに、このＩｇＧ画分は、ラット脾細胞由来の１つ以上の抗原性タンパク質を特異的に認識する。これらの抗原タンパク質は、分子量３１ｋＤ／等電点５．３、３４ｋＤ／等電点４．９、および７３ｋＤ／等電点５．２を示すタンパク質である（前掲特許文献３）。
【００４０】
前記抗原性タンパク質のうちから、単離・精製された分子量３１ｋＤのタンパク質を常法に従い、そのＮ−末端配列部分を解析し、さらに得られた配列を、ＢＬＡＳＴ解析を介してホモロジー検索を行ったところ、既知タンパク質であるヒトヒストンＨ１の推定エピトープ部分と高いホモロジーを有することが分かった。この部分配列は、配列表の配列番号１に記載されているように、ＲＲＫＡＳＧＰＰＶＳＥＬＩＴＫＡＶである。
【００４１】
本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体とは、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含有し、それぞれは常法に従いヒストンＨ１或いはその抗原性断片に対する抗体として作製される。なお、本明細書で使用する「抗体」という用語は、前記のヒストンＨ１抗原に対する抗体、および該抗体の断片または誘導体、さらにはその修飾体（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体等）を意味する。前記誘導体および修飾体は、抗体からその免疫抑制活性の強化、抗原性の低減、副作用の軽減、または血中安定性の改善等の目的で作製されるものである。そのような修飾体の一例として、ポリエチレングリコールやデキストランで抗体を修飾したものは、血中半減期が延びることが知られている。
【００４２】
ポリクローナル抗体の作製は、まず免疫原であるヒストンＨ１をアジュバントに混合し、哺乳動物を免疫感作し、その動物から抗血清を得ることによってなされる。免疫感作の方法は、通常の抗血清を得るための方法であれば、特に限定されるものではないが、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバンドが最適である。
【００４３】
前記哺乳動物としては、ウサギ、ラット、ヤギ等が利用できるが、抗血清の量的確保の問題、飼育条件等を考慮するとウサギが適している。例えば、ウサギに免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等のいずれを介しても可能である。接種間隔、接種量についても特に制限されるものではないが、例えば２週間間隔で、２〜１０回接種することが好ましい。摂取量は１回当たり、ヒストンＨ１量として１０μｇ以上、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇ用いることが望ましい。最終免疫後、３〜１０日目、好ましくは７日目に全採血を行い、抗血清を得る。得られた抗血清を精製する方法としては、通常の抗体を精製する様々な方法が利用可能であるが、特にアフィニティークロマトグラフィーが最適である。精製抗体は、常法に従って免疫抑制活性を測定する（例えば、上記ＭＬＲアッセイ）のに必要な濃度に濃縮調整する。
【００４４】
モノクローナル抗体の作製は、Ｋｏｅｈｉｅｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの手法（Ｋｏｅｈｉｅｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５，１９７５）に準じて行うことができる。すなわち、免疫動物の脾臓細胞と同種動物由来のミエローマ細胞との融合によってつくられる融合細胞（ハイブリドーマ）から製造することができる。細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、細胞融合の効率が高く、増殖性がよいマウスミエローマ細胞が好ましくは、利用される。免疫感作の方法は、上述のポリクローナル抗体作製の場合と異ならないが、使用する動物としては、マウスが好ましい。最終免疫後、脾細胞を取り出す。次いで、免疫したマウスの脾臓細胞由来リンパ球を適当なミエローマ細胞と融合させる。融合にはセンダイウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融合剤を使用する。融合細胞を適当な培地（ＨＡＴ培地等）で、選択的に増殖する。増殖した細胞を目的とする抗体の産生能に関して、スクリーニングし、望ましい細胞株（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローン）を得る。得られたモノクローナル抗体は、常法によって精製する。精製抗体は、これも常法に従って免疫抑制活性アッセイに必要な濃度に濃縮調整する。
【００４５】
本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制活性を有し、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の組織もしくは臓器の移植、骨髄移植による移植片対ホスト（レシピエント）反応（拒絶反応）の治療および予防のために、さらには自己免疫疾患等の治療および予防のために、処置計画において有用である。特定的には、本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制剤の有効成分として、通常の薬剤と同様に薬学的に許容される担体等とともに、薬学的組成物の形態で被験者（ヒトを含む哺乳動物）に投与される。例えば、注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に溶解し、点滴、静注、皮下注等で投与する。必要ならば、適当な緩衝剤、保存剤または安定化剤（ヒト血清アルブミン、ブドウ糖等）を含有させてもよい。本発明の免疫抑制剤を移植免疫抑制に使用する場合、移植臓器への潅流または局所投与、バルーンカテーテルを利用した投与が好ましい。肝移植の拒絶反応を抑制するために使用する場合、特に門脈内投与が好ましい。その投与量は、被験者の状態、年齢等により異なるが、通常、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇを１回または数回に分けて投与することが好ましい。通常、本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制を必要とする疾患の進行度また状態に応じて、所望の治療的効果を発揮するのに十分な量で薬学的組成物に含まれる。また、投与期間は、１回のみとすることもできるが、数日から数ヶ月の間に反復投与してもよい。
【００４６】
以上、本発明の免疫抑制剤について、抗ヒストンＨ１抗体を詳細に説明してきたが、該抗体に限らず、本発明に係るタンパク質（特に、抗原性タンパク質）に反応性を示す拮抗剤であれば、同様に免疫抑制活性をもつことが期待される。従って本発明は、低分子量化合物を含むこのような拮抗剤をも包含する。
【００４７】
本発明の免疫抑制剤は、特に移植免疫抑制剤として有用であるが、その他にリウマチ、アトピー、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患にも有効であり得る。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１） ラット免疫抑制物質の誘導
Ｋａｍａｄａらの手法（前掲）を用いて、ラットの同所性肝移植手術を行った。手術には、２００〜３００ｇの雄のＰＶＧ系、ＤＡ系ラット（Ｈａｒｌａｎ社）を用いて、ＤＡラットの肝臓をＰＶＧラットに移植した。肝移植手術後、経時的に血液を採取（７、１４、１８、２１、６３日目）した。その血液を１００ｘｇで遠心分離して、上清を回収して、肝移植後血清を得た。
【００５０】
（実施例２） ラット肝移植後血清のＭＬＲアッセイ
無処理のＰＶＧ系ラット由来の脾臓リンパ球（応答反応）およびマイトマイシンＣ（和光純薬工業株式会社製）処理を行ったＤＡ系ラット由来の脾臓リンパ球（刺激細胞）を用いた。応答細胞と刺激細胞をそれぞれ１ｘ１０６細胞／ｍｌ、８ｘ１０６細胞／ｍｌに増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）、ウシ胎仔血清（ライフテックオリエンタル株式会社製））で調製した。各細胞懸濁液１００μｌを９６穴丸底プレート（Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に播種した後、ＰＶＧコントロール血清および実施例１で得た肝移植後血清を４μｌ（終濃度約２％）添加して５日間培養した。また、陽性対照として、タクロリムス（ＦＫ５０６：藤沢薬品工業株式会社製）を添加して、培養した。ＢｒｄＵラベリング＆ディテクションキットＩＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、培養５日目の細胞内ＤＮＡに取り込まれたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）量を指標として細胞増殖度を測定した。ここで、細胞増殖能が高い程（Ｔ細胞が活性化されている）、取り込み量も多くなる。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、肝移植後の採取血清には、免疫抑制活性が認められ、しかも移植中期から後期の血清の免疫抑制活性は、強力な免疫抑制剤であるタクロリムスと同等であった。したがって、肝移植後のレシピエントＰＶＧ血清中には、免疫抑制因子が存在することが明らかとなった。
【００５１】
（実施例３） ラット肝移植後血清の分析
ラット肝移植後血清をウエスタンブロット法で分析した。ＤＡ、ＰＶＧコントロール血清およびラット肝移植後血清（実施例１）各１μｌを１．５ｍｌチューブに入れ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸 ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール：和光純薬工業株式会社製））を３μｌ加え、５分間煮沸してサンプルとした。このサンプル溶液１μｌを１０％ポリアクリルアミドゲルにアプライして、電気泳動を行った。
【００５２】
電気泳動後、セミドライブブロッテイング装置（ＡＴＴＯ科学機器社製）を用いて、イモビロン−Ｐトランスファーメンブレン０．４５μｍポリビニリデンフロライドメンブレン（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）にブロッティング（ブロッティングバッファー：２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール、和光純薬工業株式会社製）を行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液（３％スキムミルク、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、１０ｍＭリン酸緩衝液、和光純薬工業株式会社製）に浸し、室温で１時間振盪した。１／５００００（ｖ／ｖ）量のラットＩｇＧのＨ、Ｌ鎖に対する抗体Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇ’ｓ（抗ラットＩｇＧ）、ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭリン酸緩衝液）にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間振盪した。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｔ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）により検出し、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム株式会社製）に露光後現像した。その結果を図２に示す。図中、上の段のスポット列は、Ｈ鎖（５０ｋＤ）に対応し、下段のスポット列は、Ｌ鎖（２７ｋＤ）に対応する。
【００５３】
図２に示した結果から、ＰＶＧコントロールと比較して、肝移植後の血清中、免疫染色されるＩｇＧ成分が経時的に増加していることが分かる。
【００５４】
（実施例４） ラット肝移植後血清中のＩｇＧ画分の分離
ＦＰＬＣシステム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）、Ｈｉｔｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いて、ラット肝移植後血清（１４、６３日目）を分画した。１０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でＨｉｔｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを平衡化した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍希釈したラット肝移植後血清１ｍｌをアプライした。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄した後、１０ｍｌの０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．５、和光純薬工業株式会社製）で吸着画分（ＩｇＧ）を溶出させた。１ＭＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ９．０を添加して、溶液のｐＨを中性とした。溶出画分を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を使用して濃縮し、バッファーをリン酸緩衝液に置換し、元の血清の容積（１００μｌ）にした。
【００５５】
（実施例５） ラット肝移植後血清中のＩｇＧ画分の免疫抑制活性
実施例４で得られたＩｇＧ画分の免疫抑制活性を実施例２と同様にして、ＭＬＲアッセイで測定した。すなわち、ＰＶＧコントロール血清、肝移植後１４日目の血清（ネイティヴ）、該血清のＩｇＧ画分、そして、肝移植後６３日目の血清、該血清のＩｇＧ画分のそれぞれを濃度調節して免疫抑制活性を測定した。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、いずれの場合もＩｇＧ画分は、ネイティヴな血清と同程度の免疫抑制活性を示した。これらのデータからラット肝移植後血清中の免疫活性物質は、ＩｇＧ画分であることが分かる。
【００５６】
（実施例６） ラット肝移植後血清が認識する抗原
ＰＶＧラットから摘出した脾臓から脾細胞を採取した。脾細胞と１％ＳＤＳ溶液を１：５（ｖ／ｖ）の割合で混合して十分に攪拌した。全液量の１／３０量の１０ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ：和光純薬工業株式会社製）を添加して、氷中に３０分間静置することにより、ラット脾細胞抽出物を得た。その抽出物２．５μｌに等量の非還元サンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を加え、５分間煮沸した。１２．５％ポリアクリルアミドゲルに５μｌのサンプル溶液をアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、実施例３の方法と同様にＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ブロッキング後、１／５０００（ｖ／ｖ）量の肝移植後血清（１４日目）を加えたブロッキング溶液中でインキュベートした。ＰＶＦＤ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、１／５００００（ｖ／ｖ）量のラットＩｇＧ抗体を添加したＰＢＳ中で１時間振盪した。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｔにより検出し、Ｘ線フィルムに露光後現像した。その結果を図４（ｂ）に示す。
【００５７】
また、電気泳動後のゲルを染色液（０．２５％クマシーブリリアントブル−Ｒ−２５０（ＣＢＢ）／エタノール：酢酸：水＝９：２：９、和光純薬工業株式会社製）に浸し、１時間振盪しながら染色した。染色後、脱色液（エタノール：酢酸：水＝２５：８：６５）に浸し、１時間振盪しながら脱色した。その後保存液（メタノール：酢酸：水＝１０：１５：１７５、和光純薬工業株式会社製）に浸して、バッククランドを脱色した。タンパク質分子量マーカーとして、ＬＭＷマーカキット（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いた。その結果を図４（ａ）に示す。
【００５８】
図４（ａ）および図４（ｂ）に示した結果から、肝移植後血清を用いて免疫染色すると、主に脾細胞由来の３種類のタンパク質（それぞれ分子量７３ｋＤ、３４ｋＤ、３１ｋＤ）が特異的に認識されることが明らかとなった。
【００５９】
（実施例７） 免疫欠損させたラット肝移植後血清の免疫抑制活性
ＰＶＧラットから摘出した脾臓から脾細胞を採取した。その脾細胞を超音波処理した後、遠心分離して不溶性ペレットを得た。ラット肝移植後血清（１８日目）をＲＰＭＩ培地中の前記不溶性ペレットに添加して、３７℃で３時間インキュベートした。インュベート後、遠心分離して、その上清をＭＬＲアッセイ用の培養系に添加して、実施例２と同様に、免疫抑制活性のアッセイを行った。コントロールとして、無処理の肝移植後血清（１８日目）、ＰＶＧ血清（無処理と処理）、ＤＡ血清等を用いた。その結果を図５に示す。
【００６０】
脾細胞由来の抗原タンパク質によって同タンパク質に特異的なＩｇＧ成分を取り除いた肝移植後血清は、ネイティヴな血清と比較して免疫抑制活性が低下していた。
【００６１】
（実施例８） ラット脾細胞から抗原性タンパク質の分離およびシークエンス実施例６に記載した電気泳動の結果、分離された３１ｋＤタンパク質をＣＮ−Ｂｒ−活性化セファロース４Ｂゲル（アマシャムファルマシアバイオテック社製）アフィニティーカラムで精製した。このようにして得られた分子量３１ｋＤタンパク質のＣＮＢｒ分解断片をプロテインシークエンサー（４７６Ａプロテインシークエンサー、ＡＢＩ社）で解析した。決定された部分配列をＢＬＡＳＴ検索にかけ、既知のタンパク質とのホモロジーを調べたところ、ヒトヒストンＨ１等の配列の部分一致をみた。ヒトヒストンＨ１の部分配列と前記シークエンスされた配列とのアラインメントを図６に示す。なお、ホモロジーが見出された部分（図中、四角で囲まれている）は、ヒト、ウシおよびラットにおいて、保存されている。また、３１ｋＤタンパク質を等電点測定用バッファーに混合して、サンプル溶液を調製した。常法に従い、膨潤させたＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙｓｔｒｉｐ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にサンプル溶液をアプライして、等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色すると、このタンパク質は、等電点５．３を有していた。
【００６２】
さらに、電気泳動後、実施例６に記載の方法に従い、クマシー染色した。その結果を図７（ａ）に示す。図中、レーンＡは、脾細胞抽出物を表し、レーンＢは、ウシヒストンＨ１を表す。
【００６３】
また、電気泳動の結果、分離さらに精製された３１ｋＤタンパク質および３４ｋＤタンパク質を実施例３と同様に、ウエスタンブロット法により免疫染色した。染色に使用した抗体は、抗ＩｇＧ抗体（コントロール）（後述）と抗ヒストンＨ１抗体（後述）であった。免疫染色の結果を図７（ｂ）に示す。この結果から、分子量約３１ｋＤおよび３４ｋＤのタンパク質は、抗ヒストンＨ１抗体によって認識されることが明らかとなった。図中、レーンＣは、精製した３４ｋＤタンパク質を表し、レーンＤは、精製した３１ｋＤタンパク質を表す。
【００６４】
（実施例９） ラット肝移植後血清から新規タンパク質類の分離と精製
タンパク質類の分離精製は、Ｏｄａらの方法に（前掲）準じて行った。ラット肝移植後血清（６３日目）５ｍｌを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化を行ったＤＥＡＥセファロースカラムにアプライし、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出した。ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂゲル（アマシャムファルマシアバイオテック社製）アフィニティーカラムに前記溶出液をアプライし、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて、タンパク質画分を溶出した。タンパク質画分を分離して、分子量３７ｋＤタンパク質を得た。このタンパク質を等電点測定用バッファーに混合して、サンプル溶液を調製した。常法に従い膨潤させたＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙｓｔｒｉｐ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にサンプル溶液をアプライして、等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色すると、このタンパク質は、等電点４．８６、４．８６、５．０４および５．０４をそれぞれ有する４種類の蛋白の混合物であることが分かった。
【００６５】
（実施例１０） 抗ヒストンＨ１抗体のインビトロ免疫抑制活性
前述のＭＬＲアッセイを用いて、抗ヒストンＨ１抗体のインビトロ免疫抑制活性を試験した。抗ヒストンＨ１抗体としては、市販の抗ヒストンＨ１ウサギポリクローナル抗体（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−１０８０６）を使用した。この抗体は、全長ヒトヒストンＨ１に対するポリクローナル抗体である。コントロール抗体としては、ウサギＩｇＧ（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−２０２７）を使用した。両抗体は、アッセイに先立って、ウルトラフリーＭＣ５０００ＮＭＷＬフィルター・ユニット（ミリポア社製）で脱塩処理後、バッファーをＰＢＳに置換した。このように前処理した各抗体を実施例２に記載したように、ＭＬＲアッセイ用の培養培地にＩｇＧ量０〜１．６μｇで添加し、培養した。細胞増殖度を同様に測定した結果を図８に示す。図８から明らかなように、抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制活性を有している。
【００６６】
（実施例１１） 抗ヒストンＨ１抗体のインビボ免疫抑制活性
臓器移植拒絶のモデル系である異所性心移植手術（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）を用いて、抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性を試験した。試験には、実施例１０と同じく、市販の抗ヒストンＨ１ウサギポリクローナル抗体（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−１０８０６）を使用した。Ｋａｍａｄａらの方法（上掲）に従い、ＤＡ系ラット（ドナー）の心臓をＰＶＧ系ラット（レシピエント）に移植し、術後１時間以内に、生理食塩水（大塚製薬）で３００μｇ／ｍｌに調製した１ｍｌの抗ヒストンＨ１抗体溶液を皮下投与した。対象群として、無処理の群を設けた。
【００６７】
無処理群では、平均生着日数が＜９．０日であったのに対して、抗ヒストンＨ１抗体の投与群では、平均生着日数が１４．３日となった。投与群において、移植された心臓は、生着日数が増加した。また、投与群のラットを開腹して、各臓器を観察したが、無処理の群と同様に、特に異常は認められなかった。このように、抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性がインビボでも観察されたことから、抗体の移植における拒絶抑制効果が明らかとなった。
【００６８】
（実施例１２） ラット肝移植後血清の抗ヒストン抗体価の測定
ラット肝移植後血清（７〜６６日目）の抗ヒストン抗体価を標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて、測定した。その結果を図９に示す。移植後、１４〜２１日目の間に抗体価が上昇していることが分かる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明の免疫抑制剤は、優れた免疫抑制作用を示すので、移植免疫抑制剤として、特に臓器・組織移植の際、拒絶反応の抑制に有用である。
【００７０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】肝移植後血清の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す棒グラフである。
【図２】肝移植後血清をウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。
【図３】肝移植後血清中のＩｇＧ画分およびネイティヴ血清の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す図である。（ａ）は、肝移植後１４日目の血清からの結果、（ｂ）は、肝移植後６３日目の血清からの結果を示す。
【図４】肝移植後血清のＩｇＧが認識する抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。（ａ）はクマシー染色の結果を、（ｂ）は免疫染色の結果を示す。
【図５】肝移植後血清を免疫欠損させて、その免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す棒グラフである。
【図６】ラット脾細胞由来の抗原性タンパク質の部分配列とラット、ウシ、ヒト各ヒストンＨ１の部分配列との配列アラインメント図である。
【図７】ラット脾細胞由来の抗原性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。（ａ）はクマシー染色の結果を、（ｂ）は免疫染色の結果を示す。
【図８】抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す図である。
【図９】肝移植後血清について抗ヒストンＨ１抗体価を測定した結果を示す棒グラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to immunosuppressants. More specifically, the present invention relates to an agent containing an antibody against histone H1 and useful for immunosuppression (particularly, transplantation immunosuppression).
[0002]
[Prior art]
As the surgical techniques for organ transplantation have significantly improved, the success or failure of organ transplant surgery depends on how postoperative transplant rejection can be controlled. Rejection occurs when the body recognizes the graft as a foreign body and elicits a series of immune reactions to eliminate it. To suppress these immune reactions, clinically conventionally used immunosuppressants include steroids (eg, prednisolone), antimetabolites (eg, azathioprine, mizoribine), antibiotics (eg, cyclosporine) A, tacrolimus) and the like. With the advent of these drugs, kidney, heart, and liver transplants have already become established as general medical treatments, and lung, pancreas, and small intestine transplants are gradually becoming popular with improved results (Non-Patent Document 1).
[0003]
However, these drugs have considerable side effects, for example, steroids have a broader effect than other immunosuppressive drugs, but their immunosuppressive effects are generally weak, and their efficacy is reduced by long-term continuous administration. Expression of resistance may be seen. Azathioprine exerts immunosuppressive effects by inhibiting nucleic acid synthesis, but its use increases the risk of developing infectious diseases such as bacteria, and has a myelosuppressive effect (leukopenia, thrombocytopenia, anemia). May cause liver damage. Mizoribine has the advantages of a myelosuppressive effect and less liver damage than azathioprine, but it does not have a very high immunosuppressive effect. Cyclosporin A and tacrolimus are drugs that have extremely strong immunosuppressive activity and have contributed to improved results in organ transplantation. However, it is clear that these have serious central nervous toxicity, nephrotoxicity and the like, and their use requires careful attention (Non-Patent Document 2).
[0004]
On the other hand, in organ transplantation, the liver is attracting attention as a very unique organ. This is because orthotopic liver transplantation has been shown to be successful without administration of immunosuppressants in certain combinations between allogeneic animals (Non-Patent Document 3). Separately from this, since an immune-suppressed state occurs during hepatocellular injury such as hepatitis, it was thought that the injured liver and the regenerating liver may produce immunosuppressive substances (Non-Patent Document 4).
[0005]
Based on this idea, several types of immunosuppressive proteins have been reported so far, examples of which are shown below.
[0006]
(L-arginase)
L-arginase isolated from hepatocytes is an immunosuppressive protein thought to be released into the blood when the liver is damaged. It is thought that L-arginase released in large quantities digests L-arginine to produce L-ornithine and urea, creates an arginine deficiency state in the body, and suppresses the active proliferation of lymphocytes (Non-Patent Document) 5 and Patent Document 1). However, on the other hand, since this condition is improved by adding arginine, it is possible to suppress rejection for a long time in a living body having a different arginine supply amount in individual cells, for example, in a liver having a high arginine supply capacity. I have a question whether I can do it. It has also been suggested that digestion of arginine in large amounts may produce clinically problematic hypernitremia because it produces large amounts of urea at the same time, and may cause renal failure if administered over a long period of time. (Non-Patent Document 6).
[0007]
(Very low density lipoprotein (VLDL))
It is thought that this substance is secreted from hepatocytes and comes out in serum. VLDL inhibits DNA synthesis of peripheral blood mononuclear cells and suppresses their activation (Non-Patent Document 7). However, long-term administration of VLDL as a drug chronically increases serum VLDL and increases the levels of intermediate density lipoprotein (IDL) and low density lipoprotein (LDL) converted by lipoprotein lipase, Blood, triglyceridemia, diabetes, uremia, and arteriosclerosis (Non-Patent Document 8).
[0008]
(Α-fetoprotein and early pregnancy factor)
It is also known that the liver secretes immunosuppressive proteins under special conditions. Α-fetoprotein, which is known as a tumor marker for liver cancer, also has immunosuppressive power, and was identified and examined from fetal mice (Non-Patent Document 9). The early gestational factor is a protein having immunosuppressive power detected in urine and blood of pregnant women during early pregnancy (Non-patent Document 10), and was also confirmed to be secreted after hepatectomy. These proteins are substances that non-specifically suppress the proliferation of lymphocytes, and are thought to be substances that accompany the vigorous liver regeneration when liver damage occurs. However, it does not explain the immune tolerance induced by liver transplantation.
[0009]
(Soluble class I antigen)
In clinical liver transplantation, a large amount of soluble class I antigen of the donor type is found in the blood of the recipient immediately after transplantation. The substance was thought to induce immune tolerance, but administration of the substance did not sufficiently induce immunosuppression in vivo (Non-Patent Document 11).
[0010]
(Liver suppressor factor-1: LSF-1)
It is an immunosuppressive protein with a molecular weight of about 40 kD obtained by collecting serum over time after rat liver transplantation and performing electrophoresis by SDS-PAGE, and its effect is presumed to be extremely high. No identification has been performed (Non-Patent Document 12), and further study is needed in the future to put it to practical use as a drug.
[0011]
(Indoleamine oxygenase (IDO))
IDO is an immunosuppressive protein derived from organs other than the liver. Regarding the growth of the conceptus between mouse heterozygous parents, it was shown that IDO is expressed in the polynuclear trophoblast of the placenta and that it suppresses conception product rejection (Non-Patent Document 13). Attempts to use IDO as a transplant immunosuppressant have also been reported (Patent Document 2).
[0012]
(Anti-MHC antibody)
Antibodies to donor-type MHC class I antigen and class II antigen were observed in serum after rat liver transplantation (Non-Patent Document 14, Non-Patent Document 15, Non-Patent Document 16). It is considered that an anti-class I antibody may form a complex with the above-mentioned soluble class I antigen and have an immunosuppressive effect. In addition, anti-class II antibodies are considered to have an immunosuppressive effect by masking class II antigens (consisting of a chain having a molecular weight of 35 kD and a chain having a molecular weight of 28 to 29 kD) present on tissue pieces.
[0013]
As described above, the immunosuppressants currently used clinically are known to have side effects such as myelosuppressive action, central nervous toxicity of liver injury and nephrotoxicity. In addition, no immunosuppressive protein that has been observed after liver transplantation has yet been found to have clinically applicable activity.
[0014]
The present inventors have confirmed that rat serum after liver transplantation has immunosuppressive activity in a rat allogeneic orthotopic liver transplantation model, and that the main body is an immunoglobulin-like substance expressed immediately after liver transplantation. (Patent Document 3). Furthermore, this immunoglobulin-like substance specifically identified three kinds of proteins derived from rat spleen (molecular weight 73 kD / isoelectric point 5.2, molecular weight 34 kD / isoelectric point 4.9, molecular weight 31 kD / isoelectric point 5.3). Therefore, it was considered to be different from the above-mentioned anti-MHC antibody.
[0015]
[Patent Document 1]
JP-A-3-157399
[Patent Document 2]
International Publication No. WO / 50901A1 pamphlet
[Patent Document 3]
JP 2001-233900 A
[Non-patent document 1]
Today's transplant, vol. 11, No. 1,53,1998
[Non-patent document 2]
Today's transplant, vol. 11, No. 1,37,1998
[Non-Patent Document 3]
Nature, vol. 223,427,1969
[Non-patent document 4]
Nature, vol. 251,655,1974
[Non-Patent Document 5]
J. Immunol. , Vol. 131,2427,1983
[Non-Patent Document 6]
medicina, vol. 31, No. 11,60,1994
[Non-Patent Document 7]
J. Immunol. vol. 119 2129 1977
[Non-Patent Document 8]
medicina vol. 31 No. 11 179 1994
[Non-Patent Document 9]
J. Exp. Med. , Vol. 141, 269, 1975
[Non-Patent Document 10]
Nature, vol. 278,649,1979
[Non-Patent Document 11]
Transplantation, vol. 50,678,1990
[Non-Patent Document 12]
Transplant. Immunol. , Vol. 3,174,1995
[Non-patent document 13]
Science, vol. 281, 1191, 1998
[Non-patent document 14]
Clinical Science, vol. 26, No. 6,1990
[Non-Patent Document 15]
Biological defense, vol. 7, No. 1,1990
[Non-Patent Document 16]
Cell Engineering, vol. 12, no. 5,1993
[0016]
[Problems to be solved by the present invention]
An object of the present invention is to provide an immunosuppressant having few problems such as side effects as described above, and particularly to an antigen-specific transplant immunosuppression that can specifically suppress rejection in organ transplantation. To provide.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found that rat serum after liver transplantation has immunosuppressive activity. Furthermore, it has been found that the center of the immunosuppressive activity is the IgG component of the serum, and that this antibody recognizes a specific antigen (73, 34, 31 kD) on autologous lymphocytes. A 31 kD protein was isolated and sequenced from the antigen, and BLAST analysis was performed on the fragment revealed from the partial sequence structure. As a result, a histone H1 protein (rat, bovine, human) was identified as a protein having high homology with the sequence. Then, a polyclonal antibody against histone H1 protein was obtained and its immunosuppressive activity was examined, and the immunosuppressive effect was confirmed. Furthermore, as a model system of organ transplant rejection, the rat ectopic heart transplantation test confirmed its rejection inhibitory effect as a result. In addition, it was confirmed that the anti-histone polyclonal antibody was expressed in rat serum after liver transplantation. The present invention has been completed based on the above findings.
[0018]
That is, the present invention provides an immunosuppressant containing an antibody against histone H1.
[0019]
Preferably, the antibody against histone H1, which is an active ingredient of the immunosuppressant, is an anti-histone H1 polyclonal antibody.
[0020]
Also preferably, the histone is of human origin.
[0021]
In addition, it is particularly preferable that the immunosuppressant is applied to transplant immunosuppression.
[0022]
Further, the present invention provides a pharmaceutical composition for immunosuppression comprising a therapeutically effective amount of an antibody against histone H1 together with a pharmaceutically acceptable carrier.
[0023]
Preferably, in the pharmaceutical composition, the antibody against histone H1 is an anti-histone H1 polyclonal antibody.
[0024]
Also preferably, in the pharmaceutical composition, the histone is of human origin.
[0025]
Further, the present invention provides a method for treating a mammal, including a human in need of immunosuppression, comprising administering a therapeutically effective amount of an antibody against histone H1 to the mammal.
[0026]
Preferably, in the treatment method, the immunosuppression is transplant immunosuppression.
[0027]
Also preferably, in the treatment method, the antibody against histone H1 is an anti-histone H1 polyclonal antibody.
[0028]
Also preferably, in the treatment method, the histone is derived from a human.
[0029]
In addition, the present invention also provides a method of preventing transplant rejection in a mammalian recipient, including a human, comprising administering to the mammalian recipient, including a human, a therapeutically effective amount of an antibody to histone H1.
[0030]
Further, the present invention is an antigenic protein isolated and purified from rat splenocytes,
The protein has a molecular weight of 31 kD determined by SDS-PAGE, an isoelectric point of 5.3 determined by isoelectric focusing, and further includes a partial amino acid sequence represented by RRKASGGPPVSELITKAV. An isolated and purified protein is provided.
[0031]
Further, the present invention is a protein isolated and purified from rat serum after allogeneic orthotopic liver transplantation,
The protein having a molecular weight of 37 kD determined by SDS-PAGE, an isoelectric point of about 5.0 as determined by isoelectric focusing, and further expressing in rat serum at a later stage of transplantation. Provide isolated and purified proteins.
[0032]
Furthermore, the present invention is a method for diagnosing the presence or absence of liver transplant rejection in a mammalian recipient including humans,
Measuring the immunoreactivity level of the serum against an autoantigen protein expressed in the serum after transplantation, wherein the immunoreactivity level is an indicator of the presence or absence of the rejection reaction.
The diagnostic method is provided.
[0033]
Further, the present invention provides the above-mentioned diagnostic method, wherein the immunoreactivity level is an anti-histone H1 antibody titer.
[0034]
The immunosuppressive agent of the present invention is useful not only for preventing rejection in organ / tissue transplantation (particularly, liver transplantation), but also as a therapeutic agent for inflammatory diseases such as autoimmune diseases and allergic diseases. There is a possibility.
[0035]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0036]
The proteins according to the present invention can be subjected to orthotopic liver transplantation between different types of rats (for example, from DA rats to PVG rats) using the method of Kamada et al. (Surgary, vol. 93, 64, 1983). By doing so, their expression can be induced. Specifically, the liver of a DA rat is transplanted into a PVG rat. Blood after liver transplantation is collected, and supernatant is collected after centrifugation to obtain serum containing proteins.
[0037]
A method for purifying the proteins from this serum is, for example, according to the method of Oda et al. (BBRC Vol. 204, No. 31131, 1994). Specifically, the serum is applied to a DEAE Sepharose column to elute the adsorbed protein fraction. Further, elution is performed with a CN-Br activated Sepharose column, and purification is performed. When the obtained sample is electrophoresed by SDS-PAGE, a protein band is recovered.
[0038]
Rat serum after liver transplantation according to the present invention (hereinafter referred to as serum after rat liver transplantation or simply serum after liver transplantation) has immunosuppressive activity, which is due to a mixed lymphocyte reaction (MLR) using rat spleen lymphocytes. ) Assay (John EC et al., Current protocols in Immunology vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, 1994). These results revealed that the serum of the recipient PVG rats after transplantation contained an immunosuppressive factor. Furthermore, the IgG fraction can be purified or removed from the serum using a Protein G column or the like to prepare an IgG-free fraction. Analysis of each of these fractions and serum by MLR assay revealed that the main body of immunosuppressive activity was the IgG fraction.
[0039]
In addition, the IgG fraction specifically recognizes one or more antigenic proteins from rat splenocytes. These antigenic proteins are proteins having a molecular weight of 31 kD / isoelectric point 5.3, 34 kD / isoelectric point 4.9, and 73 kD / isoelectric point 5.2 (Patent Document 3 mentioned above).
[0040]
Among the antigenic proteins, the isolated and purified protein having a molecular weight of 31 kD was analyzed in accordance with a conventional method, and its N-terminal sequence was analyzed. The obtained sequence was subjected to homology search via BLAST analysis. However, it has been found that the protein has high homology with the putative epitope portion of human histone H1, which is a known protein. This partial sequence is RRKASGPVPVSELITKAV as described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0041]
The anti-histone H1 antibody according to the present invention includes a polyclonal antibody and a monoclonal antibody, each of which is prepared as an antibody against histone H1 or an antigenic fragment thereof according to a conventional method. As used herein, the term “antibody” refers to an antibody against the above-mentioned histone H1 antigen, a fragment or derivative of the antibody, and a modified form thereof (eg, Fab, F (ab) ′). 2 Fragments, chimeric antibodies, or humanized antibodies). The derivatives and modified products are prepared from antibodies for the purpose of enhancing their immunosuppressive activity, reducing antigenicity, reducing side effects, or improving blood stability. As an example of such a modified product, a product obtained by modifying an antibody with polyethylene glycol or dextran is known to have an increased blood half-life.
[0042]
The production of a polyclonal antibody is performed by first mixing histone H1, which is an immunogen, with an adjuvant, immunizing a mammal, and obtaining an antiserum from the animal. The immunization method is not particularly limited as long as it is a method for obtaining ordinary antisera, but Freund's complete adjuvant is optimal as the adjuvant.
[0043]
Rabbits, rats, goats and the like can be used as the mammal, but rabbits are suitable in view of the problem of securing a sufficient amount of antiserum and breeding conditions. For example, when immunizing a rabbit, it can be performed via any of subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, and intramuscular routes. The inoculation interval and the amount of inoculation are not particularly limited, but it is preferable to inoculate 2 to 10 times at intervals of 2 weeks, for example. It is desirable to use 10 μg or more, preferably 100 μg to 10 mg of histone H1 per dose. After the final immunization, whole blood is collected on days 3 to 10, preferably on day 7, to obtain antiserum. As a method for purifying the obtained antiserum, various methods for purifying an ordinary antibody can be used, and affinity chromatography is particularly optimal. The purified antibody is concentrated and adjusted to a concentration required for measuring immunosuppressive activity (for example, the above-mentioned MLR assay) according to a conventional method.
[0044]
Monoclonal antibodies can be prepared according to the method of Koeher Milstein et al. (Koeher Milstein, Nature 256, 495, 1975). That is, it can be produced from a fused cell (hybridoma) produced by fusing spleen cells of an immunized animal with myeloma cells derived from the same animal. As the myeloma cells used for cell fusion, mouse myeloma cells having high cell fusion efficiency and good proliferation are preferably used. The method of immunization is not different from the above-mentioned case of producing a polyclonal antibody, but a mouse is preferably used as an animal. After the final immunization, the spleen cells are removed. The spleen cell-derived lymphocytes of the immunized mouse are then fused with appropriate myeloma cells. For the fusion, a fusion agent such as Sendai virus and polyethylene glycol (PEG) is used. The fused cells are selectively grown in an appropriate medium (such as HAT medium). Proliferated cells are screened for the ability to produce the desired antibody to obtain a desired cell line (monoclonal antibody-producing hybridoma clone). The obtained monoclonal antibody is purified by a conventional method. The purified antibody is also concentrated and adjusted to a concentration required for an immunosuppressive activity assay in accordance with a conventional method.
[0045]
The anti-histone H1 antibody according to the present invention has immunosuppressive activity, and is a graft-to-host (recipient) reaction (rejection reaction) by transplantation of a tissue or organ such as heart, kidney, liver, bone marrow, skin, or bone marrow transplantation. Is useful in treatment regimens for the treatment and prevention of, and for the treatment and prevention of autoimmune diseases and the like. Specifically, the anti-histone H1 antibody according to the present invention can be used as an active ingredient of an immunosuppressant together with a pharmaceutically acceptable carrier or the like in the form of a pharmaceutical composition in the form of a pharmaceutical composition (human or human). Including mammals). For example, the drug is dissolved in physiological saline for injection, distilled water for injection, or the like, and administered by infusion, intravenous injection, subcutaneous injection, or the like. If necessary, appropriate buffers, preservatives or stabilizers (human serum albumin, glucose and the like) may be contained. When the immunosuppressive agent of the present invention is used for transplantation immunosuppression, perfusion or local administration to a transplanted organ or administration using a balloon catheter is preferred. When used for suppressing liver transplant rejection, intraportal administration is particularly preferred. The dose varies depending on the condition, age, etc. of the subject, but it is usually preferable to administer 0.1 to 100 mg / kg, preferably 1 to 10 mg / kg, once or in several divided doses. Generally, the anti-histone H1 antibody according to the present invention is included in a pharmaceutical composition in an amount sufficient to exert a desired therapeutic effect, depending on the progress and condition of the disease requiring immunosuppression. The administration period may be only once, but may be repeated between several days to several months.
[0046]
As described above, the anti-histone H1 antibody has been described in detail with respect to the immunosuppressant of the present invention. However, the present invention is not limited to the antibody, and any antagonist that is reactive with the protein of the present invention (particularly, antigenic protein) may be used. Are expected to have immunosuppressive activity as well. Accordingly, the present invention also includes such antagonists, including low molecular weight compounds.
[0047]
The immunosuppressant of the present invention is particularly useful as a transplant immunosuppressant, but may also be effective for autoimmune diseases such as rheumatism, atopy, and systemic lupus erythematosus.
[0048]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0049]
(Example 1) Induction of rat immunosuppressive substance
Orthotopic liver transplantation was performed on rats using the technique of Kamada et al. (Supra). For the operation, 200 to 300 g of male PVG rats and DA rats (Harlan) were used, and the liver of DA rats was transplanted to PVG rats. After liver transplantation, blood was collected over time (day 7, 14, 18, 21, 63). The blood was centrifuged at 100 × g, and the supernatant was collected to obtain serum after liver transplantation.
[0050]
(Example 2) MLR assay of serum after rat liver transplantation
Spleen lymphocytes (response reaction) from untreated PVG rats and spleen lymphocytes (stimulator cells) from DA rats treated with mitomycin C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were used. Responder cells and stimulator cells were 1 × 10 6 Cells / ml, 8x10 6 The cells / ml were prepared with a growth medium (RPMI-1640 (manufactured by GIBCO BRL), fetal bovine serum (manufactured by Lifetech Oriental Co., Ltd.)). After 100 μl of each cell suspension was seeded on a 96-well round bottom plate (manufactured by Nunc Brand Products), 4 μl (final concentration of about 2%) of PVG control serum and the serum after liver transplantation obtained in Example 1 were added. Cultured for 5 days. As a positive control, tacrolimus (FK506: manufactured by Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and cultured. Using a BrdU Labeling & Detection Kit III (manufactured by Roche Diagnostics), the degree of cell proliferation was measured using bromodeoxyuridine (BrdU) incorporated into intracellular DNA on day 5 of culture as an index. Here, the higher the cell proliferation ability (the T cell is activated), the larger the uptake amount. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 1, immunosuppressive activity was observed in the serum collected after liver transplantation, and the immunosuppressive activity of the serum in the middle to late stages of transplantation was equivalent to that of tacrolimus, a powerful immunosuppressant. . Therefore, it became clear that immunosuppressive factors were present in the recipient PVG serum after liver transplantation.
[0051]
(Example 3) Analysis of serum after rat liver transplantation
The serum after rat liver transplantation was analyzed by Western blotting. 1 μl each of DA, PVG control serum and rat liver transplantation serum (Example 1) was placed in a 1.5 ml tube, and a sample buffer for SDS-PAGE (125 mM Tris hydrochloride pH 6.8, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol) 3% of 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glycerol, 0.01% (w / v) bromophenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), and boil for 5 minutes to obtain a sample. And 1 μl of this sample solution was applied to a 10% polyacrylamide gel, and electrophoresis was performed.
[0052]
After the electrophoresis, blotting was performed on an Immobilon-P transfer membrane 0.45 μm polyvinylidene fluoride membrane (PVDF membrane, manufactured by Millipore) using a semi-drive blotting apparatus (manufactured by ATTO Scientific Instruments) (blotting buffer: 25 mM Tris-HCl). , 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The blotted PVDF membrane was immersed in a blocking solution (3% skim milk, 0.1% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween 20), 10 mM phosphate buffer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and allowed to stand at room temperature. Shake for 1 hour. PBST (0.1% Tween 20, 10 mM phosphorus) containing 1 / 50,000 (v / v) amount of rat IgG antibodies against H and L chains Goat Anti-RatIg's (anti-rat IgG) and HRP (manufactured by BIOSOURCE INTERNATIONAL). An acid buffer) was immersed in the PVDF membrane and shaken at room temperature for 1 hour. After washing the PVDF membrane once with PBST for 15 minutes once and then for 5 minutes three times, it is detected by an ECL western blotting detection set (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and developed after exposure to an X-ray film (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.). did. The result is shown in FIG. In the figure, the upper row of spots corresponds to the H chain (50 kD), and the lower row of spots corresponds to the L chain (27 kD).
[0053]
From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the immunostained IgG component in the serum after liver transplantation increases with time, as compared to the PVG control.
[0054]
(Example 4) Separation of IgG fraction in serum after rat liver transplantation
Using an FPLC system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and Hitrap Protein G (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), the serum (day 14 and 63) after rat liver transplantation was fractionated. After equilibrating the Hitrap protein G column with 10 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 1 ml of rat liver transplanted serum diluted 10-fold with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) was applied. After washing the column with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), the adsorbed fraction (IgG) was eluted with 10 ml of 0.1 M glycine buffer (pH 2.5, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 1M Tris-HCl, pH 9.0 was added to neutralize the pH of the solution. The eluted fraction was concentrated using a 0.22 μm filter (manufactured by Millipore), and the buffer was replaced with a phosphate buffer to make the original serum volume (100 μl).
[0055]
(Example 5) Immunosuppressive activity of IgG fraction in serum after rat liver transplantation
The immunosuppressive activity of the IgG fraction obtained in Example 4 was measured by the MLR assay in the same manner as in Example 2. That is, the PVG control serum, the serum (native) on the 14th day after liver transplantation, the IgG fraction of the serum, and the serum on the 63rd day after liver transplantation and the IgG fraction of the serum were adjusted for immunity. The inhibitory activity was measured. The result is shown in FIG. As is apparent from FIG. 3, the IgG fraction showed immunosuppressive activity at the same level as native serum in each case. These data show that the immunoreactive substance in the serum after rat liver transplantation is an IgG fraction.
[0056]
(Example 6) Antigen recognized by serum after rat liver transplantation
Splenocytes were collected from spleens extracted from PVG rats. The spleen cells and the 1% SDS solution were mixed at a ratio of 1: 5 (v / v) and sufficiently stirred. 1/30 volume of 10 mg / ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and left in ice for 30 minutes to extract the rat spleen cell extract. Obtained. To 2.5 μl of the extract, an equal volume of non-reducing sample buffer (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glycerol, 0.01% (w / v) bromophenol Blue) and boiled for 5 minutes. 5 μl of the sample solution was applied to a 12.5% polyacrylamide gel, and electrophoresis was performed. After the electrophoresis, blotting was performed on the PVDF membrane in the same manner as in Example 3. After blocking, the mixture was incubated in a blocking solution to which a 1/5000 (v / v) amount of serum after liver transplantation (day 14) was added. After washing the PVFD membrane once with PBST for 15 minutes and three times for 5 minutes, the membrane was shaken for 1 hour in PBS supplemented with 1 / 50,000 (v / v) rat IgG antibody. After the PVDF membrane was washed once with PBST for 15 minutes and three times for 5 minutes, it was detected by ECL western blotting detection set and developed after exposure to an X-ray film. The results are shown in FIG.
[0057]
Further, the gel after the electrophoresis was immersed in a staining solution (0.25% Coomassie Brilliant-R-250 (CBB) / ethanol: acetic acid: water = 9: 2: 9, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Stained with shaking for hours. After staining, it was immersed in a destaining solution (ethanol: acetic acid: water = 25: 8: 65) and destained with shaking for 1 hour. Then, it was immersed in a storage solution (methanol: acetic acid: water = 10: 15: 175, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to decolor the backland. As a protein molecular weight marker, an LMW marker kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was used. The result is shown in FIG.
[0058]
From the results shown in FIG. 4 (a) and FIG. 4 (b), three types of proteins mainly derived from splenocytes (molecular weights 73 kD, 34 kD, and 31 kD, respectively) were specific by immunostaining using serum after liver transplantation. It became clear that it was recognized.
[0059]
(Example 7) Immunosuppressive activity of serum after transplantation of immunodeficient rat liver
Splenocytes were collected from spleens extracted from PVG rats. The spleen cells were sonicated and centrifuged to obtain an insoluble pellet. Serum from rat liver transplantation (day 18) was added to the insoluble pellet in RPMI medium and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, the mixture was centrifuged, and the supernatant was added to a culture system for MLR assay, and an immunosuppressive activity assay was performed in the same manner as in Example 2. As controls, untreated serum after liver transplantation (day 18), PVG serum (untreated and treated), DA serum and the like were used. The result is shown in FIG.
[0060]
The serum after liver transplantation, in which IgG components specific to the protein were removed by an antigen protein derived from spleen cells, had reduced immunosuppressive activity compared to native serum.
[0061]
(Example 8) Separation and sequencing of antigenic protein from rat spleen cells As a result of electrophoresis described in Example 6, the separated 31 kD protein was subjected to CN-Br-activated Sepharose 4B gel (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Purified on an affinity column. The thus obtained CNBr-degraded fragment of the 31 kD protein was analyzed with a protein sequencer (476A protein sequencer, ABI). The determined partial sequence was subjected to a BLAST search to examine its homology with a known protein. As a result, a partial match between sequences such as human histone H1 was found. FIG. 6 shows an alignment between the partial sequence of human histone H1 and the sequence thus sequenced. The portion where the homology was found (circled in the figure) is preserved in humans, cows and rats. In addition, a 31 kD protein was mixed with a buffer for isoelectric point measurement to prepare a sample solution. According to a conventional method, the sample solution was applied to swollen Immobiline Drystrip (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and subjected to isoelectric focusing. When the gel after the electrophoresis was stained, the protein had an isoelectric point of 5.3.
[0062]
After electrophoresis, Coomassie staining was performed according to the method described in Example 6. The result is shown in FIG. In the figure, lane A represents a spleen cell extract, and lane B represents bovine histone H1.
[0063]
Further, as a result of electrophoresis, the separated and purified 31 kD protein and 34 kD protein were immunostained by Western blotting in the same manner as in Example 3. The antibodies used for staining were an anti-IgG antibody (control) (described below) and an anti-histone H1 antibody (described below). The results of the immunostaining are shown in FIG. These results revealed that proteins with molecular weights of about 31 kD and 34 kD were recognized by the anti-histone H1 antibody. In the figure, lane C represents the purified 34 kD protein, and lane D represents the purified 31 kD protein.
[0064]
(Example 9) Separation and purification of novel proteins from serum after rat liver transplantation
Separation and purification of proteins were performed according to the method of Oda et al. 5 ml of the serum (day 63) after rat liver transplantation was applied to a DEAE Sepharose column equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), and then applied with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl. Eluted. The eluate was applied to a CNBr-activated Sepharose 4B gel (Amersham Pharmacia Biotech) affinity column, and the protein fraction was eluted using 0.1 M glycine (pH 2.5). The protein fraction was separated to obtain a protein with a molecular weight of 37 kD. This protein was mixed with a buffer for isoelectric point measurement to prepare a sample solution. The sample solution was applied to Immobiline Drystrip (Amersham Pharmacia Biotech) swollen according to a conventional method, and subjected to isoelectric focusing. When the gel after the electrophoresis was stained, it was found that this protein was a mixture of four proteins each having an isoelectric point of 4.86, 4.86, 5.04, and 5.04.
[0065]
(Example 10) In vitro immunosuppressive activity of anti-histone H1 antibody
The in vitro immunosuppressive activity of anti-histone H1 antibodies was tested using the MLR assay described above. As the anti-histone H1 antibody, a commercially available anti-histone H1 rabbit polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology, catalog number sc-10806) was used. This antibody is a polyclonal antibody against full length human histone H1. Rabbit IgG (manufactured by Santa Cruz Biotechnology, catalog number sc-2027) was used as a control antibody. Both antibodies were desalted with an Ultrafree MC5000 NMWL filter unit (Millipore) prior to the assay, and the buffer was replaced with PBS. Each antibody thus pretreated was added to a culture medium for MLR assay in an amount of 0 to 1.6 μg of IgG as described in Example 2, and cultured. FIG. 8 shows the results of similarly measuring the degree of cell proliferation. As is clear from FIG. 8, the anti-histone H1 antibody has an immunosuppressive activity.
[0066]
(Example 11) In vivo immunosuppressive activity of anti-histone H1 antibody
The immunosuppressive activity of the anti-histone H1 antibody was tested using an ectopic heart transplantation surgery (Experimental liver transplantation. 19: CRC Press, 1988), which is a model system for organ transplant rejection. In the test, as in Example 10, a commercially available anti-histone H1 rabbit polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology, catalog number sc-10806) was used. According to the method of Kamada et al. (Supra), the heart of a DA rat (donor) was transplanted into a PVG rat (recipient) and adjusted to 300 μg / ml with saline (Otsuka Pharmaceutical) within 1 hour after the operation. 1 ml of the obtained anti-histone H1 antibody solution was subcutaneously administered. An untreated group was provided as a control group.
[0067]
In the untreated group, the average number of engraftment days was <9.0 days, whereas in the group to which the anti-histone H1 antibody was administered, the average engraftment day was 14.3 days. In the treated group, the transplanted hearts had an increased number of engraftment days. Further, the rats in the administration group were laparotomized and each organ was observed, but no abnormalities were observed as in the untreated group. As described above, the immunosuppressive activity of the anti-histone H1 antibody was also observed in vivo, which revealed the rejection-suppressing effect of the antibody transplantation.
[0068]
(Example 12) Measurement of anti-histone antibody titer of serum after rat liver transplantation
The anti-histone antibody titer of the serum (day 7-66) after rat liver transplantation was measured using a standard ELISA method. The result is shown in FIG. It can be seen that the antibody titer increased between days 14 and 21 after transplantation.
[0069]
【The invention's effect】
Since the immunosuppressant of the present invention exhibits excellent immunosuppressive activity, it is useful as a transplant immunosuppressant, particularly for suppressing rejection during organ / tissue transplantation.
[0070]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a bar graph showing the results of measuring the immunosuppressive activity of serum after liver transplantation by MLR assay.
FIG. 2 shows the results of analysis of serum after liver transplantation by Western blotting.
FIG. 3 is a graph showing the results obtained by measuring the immunosuppressive activities of the IgG fraction and native serum in serum after liver transplantation by MLR assay. (A) shows the results from serum 14 days after liver transplantation, and (b) shows the results from serum 63 days after liver transplantation.
FIG. 4 is a diagram showing the results of analysis of antigens recognized by IgG in serum after liver transplantation by SDS-PAGE and Western blotting. (A) shows the result of Coomassie staining, and (b) shows the result of immunostaining.
FIG. 5 is a bar graph showing the results obtained by immunodeficient serum after liver transplantation and measuring its immunosuppressive activity by MLR assay.
FIG. 6 is a sequence alignment diagram of a partial sequence of an antigenic protein derived from rat spleen cells and partial sequences of rat, bovine, and human histone H1.
FIG. 7 shows the results of analysis of antigenic proteins derived from rat splenocytes by SDS-PAGE and Western blotting. (A) shows the result of Coomassie staining, and (b) shows the result of immunostaining.
FIG. 8 shows the results of measuring the immunosuppressive activity of an anti-histone H1 antibody by an MLR assay.
FIG. 9 is a bar graph showing the results of measuring the anti-histone H1 antibody titer of the serum after liver transplantation.
