JP2004147550A - Nucleic acid fragment, method and kit for detecting microorganism - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物、特に院内感染に関わる特定の微生物のリボゾームＲＮＡの検出に有用な核酸断片に関し、さらに、その核酸断片を利用した微生物の検出・同定方法、及びその検出方法に使用する検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、微生物全般、特に院内感染に関わる微生物の検出・同定は以下のような方法により実施されている。例えば、▲１▼寒天培地を用いた微生物分離同定法、▲２▼血液培養（敗血症関連微生物の培養に利用）、▲３▼ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、▲４▼リバーストランスクリプショナルＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、▲５▼ノーザンブロットおよびドットブロットハイブリダイゼーションなどが知られている。
しかしながら、上記の方法は様々な問題点を含んでいる。▲１▼寒天培地を用いた微生物分離同定法は、培養時間が長いため、同定に時間がかかり、目的外微生物の混入に細心の注意を要する。▲２▼血液培養（敗血症関連微生物の培養に利用）もまた、血液培養後、上記分離培養ならびにディスク法を実施して微生物の同定を行うため、時間がかかる。また、リンパ球等の血球成分に潜む微生物は血液培養によって増菌しないことがしばしばあり、見かけ上陰性と判断されることがある。▲３▼ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法では、血液中・培地中などに含まれるＰＣＲ阻害物質（例えばヘムタンパク質など）を完全に除去しつつ微生物ＤＮＡを抽出するには熟練の技術が必要であるだけでなく、個人の能力に依存する場合がある。また、死菌のゲノムＤＮＡも抽出されるため、実質的な生菌数に換算することが困難である。▲４▼リバーストランスクリプショナルＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法では、ＰＣＲ阻害物質を完全に除去する必要があり、また、微生物ＲＮＡを抽出する際にＲＮＡ分解酵素を完全に失活させる必要があり、極めて熟練の技術を要する。さらに▲５▼ノーザンブロットおよびドットブロットハイブリダイゼーションは、操作が煩雑であり熟練の技術を要し、また、定量的解析が困難であるという問題があり、ほとんど実用されていない。
一方本出願人は先に、生物種の検出方法において、当該生物種のリボゾームＲＮＡに対して隣接した２つの核酸プローブを利用してハイブリダイゼーション法を実施することを提案している（特許文献１参照。）
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−３９３９８号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物、特に院内感染原因微生物の検出・同定に有用な核酸断片（核酸プローブ）を提供することを目的とする。本発明の目的はまた、その核酸断片を用いて、対象とする微生物を特異的に且つ高感度で、さらに簡便に且つ迅速に検出することができる微生物検出方法を提供することであり、さらにはその微生物検出方法を実施するのに使用する検出用キットを提供することである。
なお、本明細書中で単に「核酸断片」とは、特に記載のない限りＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片及びペプチド核酸断片を包含してさす。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を達成するために、微生物のリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）において個々の微生物に固有配列があること、ｒＲＮＡは１本鎖であってＲＮａｓｅの分解を受けるが２本鎖になると分解されない、などの性質に注目し、院内感染に関わる微生物のｒＲＮＡの分析、研究を行った。その結果、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２３Ｓ ｒＲＮＡ、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の２３Ｓ ｒＲＮＡ、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の ２３Ｓ ｒＲＮＡ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｃｅ）の１８Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子の塩基配列において、各微生物に固有の部分配列を見出し、その配列に対する逆相補鎖核酸断片をプローブとして用いることにより、これらの対象微生物を迅速に且つ特異的に同定することができることに成功した。
【０００６】
従って本発明は、クレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ及びカンジダ・アルビカンスから選ばれる微生物のリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、下記配列１〜１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片である。
上記配列１〜６はクレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列であり、上記配列７〜１２はスタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列であり、上記配列１３〜１６はシュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列であり、配列１７及び１８はカンジダ・アルビカンスの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列である。
【０００８】
本発明はさらに、クレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ及びカンジダ・アルビカンスから選ばれる微生物のリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、該微生物のリボゾームＲＮＡ上で、上記配列１〜１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片にも向けられている。
【０００９】
本発明は具体的に、クレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ リボゾームＲＮＡの部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、上記配列１〜６のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、並びにクレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ リボゾームＲＮＡ上で、前記核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片である。
本発明はまた、具体的に、スタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ リボゾームＲＮＡの部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、該配列７〜１２のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、並びにスタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ リボゾームＲＮＡ上で、前記核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片である。
【００１０】
本発明はまた、具体的に、シュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ リボゾームＲＮＡの部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、該配列１３〜１６のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、並びにシュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ リボゾームＲＮＡ上で、前記核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片である。
本発明はまた、具体的に、カンジダ・アルビカンスの１８Ｓ リボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって、配列１７及び１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、並びにカンジダ・アルビカンスの１８Ｓ リボゾームＲＮＡ遺伝子上で、前記核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片である。
【００１１】
本発明はさらに、上記の核酸断片をプローブとして用いる各微生物の検出方法にも向けられている。従って、本発明はクレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ及びカンジダ・アルビカンスから選ばれる微生物の検出方法であって、対象とする微生物の上記核酸断片を使用することを特徴とする、検出方法である。この検出方法としてはＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法が挙げられ、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション法などがある。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の核酸断片を用いて、本出願人が先に開発し特開平７−３９３９８号公報にて開示している、いわゆる隣接ハイブリダイゼーション法を実施し対象微生物を検出・同定することを特徴とする微生物の検出法を提供するものである。
よって本発明は、クレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ及びカンジダ・アルビカンスから選ばれる微生物の検出方法であって、（１）対象とする微生物のリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列を有するＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片又はペプチド核酸断片であって上記配列１〜１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、及び（２）該微生物のリボゾームＲＮＡ上で該核酸断片（１）がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片のうち、一方を標識プローブとして、他方を担体に固定した捕捉プローブとして用いてハイブリダイゼーション法を行い、該微生物を検出することを特徴とする検出方法である。
本発明の検出方法において使用する核酸断片の長さは１０塩基以上で、好ましくは５０塩基までで、さらに好ましくは１５〜５０塩基である。
【００１３】
本発明はさらに、上記検出方法に使用するための検出用キットであり、具体的に下記の成分を含む検出用キット：
（イ）上記核酸断片（１）を固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された上記核酸断片（２）；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液、
又は、下記の成分を含む検出用キット：
（イ）標識物質で標識された上記核酸断片（１）；
（ロ）上記核酸断片（２）を固定化した担体；
（ハ）標識物質を検出するための試薬；
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液
である。
本発明の微生物検出用キットはさらに、溶菌液を含んでもよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明はクレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ又はカンジダ・アルビカンスのリボゾームＲＮＡ遺伝子から各固有の配列を見出したことを基礎とする。
ある特定の遺伝子が特異的に有する塩基配列を検索して、ＰＣＲプライマーやハイブリダイゼーションプローブを設計する場合、通常、類似配列や類似機能を持った遺伝子の配列と特定の遺伝子との配列同士のホモロジー検索を行い、選択する配列のホモロジーが６０％以下且つＧＣ含量（選択した配列に含まれるＧとＣの存在比を％で表す値）が４０〜６０％になるように設計する。
ちなみにＰＣＲやハイブリダイゼーションの反応温度は、それらのプライマーやプローブの配列の長さとＧＣ含量に依存するので、一般に温度条件を厳しく設定する必要がある。これに対し、隣接プローブを用いるハイブリダイゼーション法では８０％程度のホモロジーでも遺伝子の特異配列を見分けることが可能である。
各種の遺伝子は、通常、遺伝子ごとにかなり高い特異性を示す配列を有する。しかしながら、ｒＲＮＡのようにあらゆる生物に存在する遺伝子は、共通配列が極めて多いため、生物種固有の配列を見出すことは容易でない。特に同種の生物（微生物を含む）の場合、９５％以上という高いホモロジーを示すことがしばしばある。このように各微生物に固有のｒＲＮＡ遺伝子配列を見出してくる困難性に加えて、例えば長さ４０塩基前後の領域に隣接する２種のプローブを設計するときに、隣接するプローブ間で長さやＧＣ含量をほぼ一致させ、好ましくは完全に一致させ、かつ類似配列を持った他の微生物との不一致塩基対（少なくとも３塩基）の数を隣接するプローブ間でほぼ一致させる、好ましくは完全に一致させることが望まれる。
本発明者は上記のような困難を克服し、また、隣接するプローブとして望ましい条件を満足するように、各微生物のｒＲＮＡ遺伝子から微生物の検出に有用な固有配列を見出してきた。
【００１５】
本発明の核酸断片は、クレブシエラ・ニューモニア、スタフィロコッカス・エピデルミジス、シュードモナス・アエルギノーサ及びカンジダ・アルビカンスの各微生物のｒＲＮＡの検出方法に利用することができ、そのような方法として例えばＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
以下に、ハイブリダイゼーション法の例として、いわゆる隣接ハイブリダイゼーションについて説明する。
検出のターゲットとする微生物に応じて、該微生物のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列である上記配列１〜１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、及び該微生物のｒＲＮＡ上で該核酸断片がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片を用意し、それらを用いて、そのいずれか一方を標識プローブとし、他方を担体に固定した捕捉プローブとして用いて、検体に対してハイブリダイゼーション法を行う。より詳しくは、被検ｒＲＮＡを含む試料と標識プローブを担体に固定された捕捉プローブと接触させて、被検ｒＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイゼーションさせ、被検ｒＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより、被検ｒＲＮＡの存在を検出する。
本発明の検出方法に用いる核酸断片は１０塩基以上で、好ましくは５０塩基までで、さらに好ましくは１５〜５０塩基の長さである。本発明において「隣接する」とは、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることを意味する。
上述の核酸断片は、常法に従って化学的に合成することができる。なお、標識プローブと捕捉プローブの核酸断片の種類は通常同一とするのが望ましい。例えばＤＮＡ断片を標識プローブとするとき、捕捉プローブもＤＮＡ断片とするのが望ましい。
【００１６】
本発明に従った、上記４種の各微生物検出用の合成核酸断片の塩基配列の例を以下の表１にまとめる。
【００１７】
【表１】
上記配列２は、クレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列１がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列１と２の核酸断片で検出されるクレブシエラ・ニューモニアの２３ＳｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｇｃｕｇｇｕｇｕｇｕ ａｇｇｕｇａａｇｃｃ ｃｃｕｇｃｃｇｇｇｕ ｇｇａｇｇａｃｃａｇ ｕ ３’ 長さ ４１
（配列番号１）である。
配列４は、クレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列３がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列３と４の核酸断片で検出されるクレブシエラ・ニューモニアの２３ＳｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｕｇｇｕｇｕｇｕａｇ ｇｕｇａａｇｃｃｃｃ ｕｇｃｃｇｇｇｕｇｇ ａｇｇａ ３’ 長さ ３４
（配列番号２）である。
配列６は、クレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列５がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列５と６の核酸断片で検出されるクレブシエラ・ニューモニアの２３ＳｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｃａｕｇｕａｇｇｃｕ ｇｇｕｕｇｕｃｃａｇ ｇｃａａａｕｃｃｇｇ ａｕａａｕｃａａｇａ ｇｇｕｇ ３’ 長さ４４
（配列番号３）である。
【００１９】
上記配列８は、スタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列７がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列７と８の核酸断片で検出されるスタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｇｇｕｇｃｕｇｕｇｕ ｇｃａｃｇｕｕｃａａ ｇｃａｇｕａａｇｇｃ ｕｇａｇｕｇｕ ３’ 長さ ３７
（配列番号４）である。
配列１０は、スタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列９がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列９と１０の核酸断片で検出されるスタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｇｃａｃｕｃａｕａｕ ｇａｇｃｕｇｕｇａｕ ｇｇｇｇａｇａｇｇａ ａａｕｕｇｕｕｕｃｃ ３’ 長さ ４０
（配列番号５）である。
配列１２は、スタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列１１がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列１１と１２の核酸断片で検出されるスタフィロコッカス・エピデルミジスの２３Ｓ ｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ａａｇｇｕｇｃｕｇｕ ｇｕｇｃａｃｇｕｕｃ ａａｇｃａｇｕａａｇ ｇｃｕｇａｇｕｇｕｕ ａｇｇ ３’ 長さ４３
（配列番号６）である。
【００２０】
配列１４は、シュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列１３がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列１３と１４の核酸断片で検出されるシュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｕｇｃｇｃｃｇｇｃｕ ａｇｇｇｕｇａａｇｇ ａｕｕｕａｃｕｃｃｇ ｕａａｇｇｇｃｕｇ ３’ 長さ ３９
（配列番号７）である。
配列１６は、シュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列１５がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列１５と１６の核酸断片で検出されるシュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡの部分配列は、
５’ ｇｇｇａｕｕａｇｃａ ａｇｃｕｕｃａｕｕｇ ａｕｕｕｕａｇｃｇｇ ａａｃｇｃｕｃｕａｇ ｕｇ ３’ 長さ ４２
（配列番号８）である。
【００２１】
配列１８は、カンジダ・アルビカンスの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列へ、配列１７がハイブリダイゼーションする部分配列の５′側に隣接する部分配列にハイブリダイゼーションするものである。
上記配列１７と１８の核酸断片で検出されるカンジダ・アルビカンスの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列は、
５’ ｇａｇｇａａｕｇｕｇ ｇｃａｃｇｇｃｕｕｃ ｕｇｃｕｇｕｇｕｇｕ ａｇｃｃｕｃｕｇａｃ ３’ 長さ ４０
（配列番号９）である。
配列１及び２の例でいえば、そのどちらか一方を標識プローブとして用い、他方を捕捉プローブとして用いることができる。
【００２２】
核酸断片を標識物質で標識して標識プローブとする。標識プローブの調製法は特定されるものではなく、使用する標識物質としては、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
標識プローブは、ハイブリダイゼーションの実施の際には、一般にハイブリダイゼーション溶液中に溶解された状態（プローブ液ともいう）で使用される。使用するハイブリダイゼーション溶液の組成は常法に従ったものでよく、例えばＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）といった塩類、ホルムアミド、ブロッキング試薬、界面活性剤、ｔＲＮＡ、ＤＮＡなどを適当な濃度で含む。また、使用する核酸断片の種類に応じてハイブリダイゼーション溶液の組成を適宜変動させてもよい。例えばペプチド核酸を用いる場合には条件が比較的緩くてもハイブリダイゼーションする一方、塩濃度を高くするとペプチド核酸が析出してくる傾向があるので、塩濃度を低くすることが好ましい。よって、例えばＳＳＣを含ませずに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、３０％ホルムアミド、１％ブロッキング液という組成が典型的に挙げられる。
【００２３】
捕捉プローブは適当な担体に固定すればよく、核酸断片を直接的にあるいは間接的に担体に固定することができる。担体として例えば核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートあるいは標識した捕捉用プローブの標識物質を特異的に固定化する化合物を固定化したマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は特に限定されるものでない。例えば、直接物理的な方法で核酸断片を担体に固定する方法として、上記の有機ポリマーを素材とするプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ又はペプチド核酸溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法などがある。その他、ビオチン−アビジン反応や抗原抗体反応を利用して間接的に核酸断片を担体に固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
上記の捕捉プローブ用核酸断片の溶液は、担体への固定法に応じた適当な反応液として調製することができる。該反応液の組成は例えば緩衝液、ＥＤＴＡといったキレート剤及び塩類などを含む。
【００２４】
次に被検 ｒＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体に固定した捕捉プローブと接触させて被検 ｒＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイゼーションさせる。次いで被検 ｒＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検 ｒＲＮＡを検出する。
血液、尿、その他の検体試料からの被検ｒＲＮＡの調製法は、特定されるものではないが、安全かつ簡便に行うためには、例えば水酸化ナトリウム等を含む塩基性化合物の水溶液（一般に溶菌液と称される）などで細胞を溶解した後、塩酸などで中和すればよい。
【００２５】
調製されたｒＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、一般に１５〜６０℃で３分〜１８時間程度ハイブリダイゼーションを行う。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄した後、標識物質を検出するための試薬を加え一定時間反応させる。標識物質を検出するための試薬としては、例えば標識物質と結合する物質に酵素を結合させたもの、さらに、その酵素の基質が挙げられる。
【００２６】
標識物質と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合ペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、標識プローブがジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）で標識されている場合には抗Ｄｉｇ 免疫グロブリンとペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。このような物質は、実際の使用にあたってはコンジュゲート液と称される液中に含めた状態で使用される。コンジュゲート液の組成は適宜選択することができ、例えば緩衝液、ＥＤＴＡといったキレート剤、塩類、ブロッキング液などを含む。
標識物質と結合する物質を反応させた後、適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適当な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えばペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもできる。このような酵素基質は発色溶液として適宜調液しておくことができる。
上記洗浄液１、２は特定されるものではないが、例えば０．０５％程度の界面活性剤を含む生理食塩水などを用いることができる。
【００２７】
本発明はさらに、上記のような検出方法に使用するための検出用キットに向けられている。すなわち、検出のターゲットとする微生物に応じて、（１）該微生物のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の逆相補鎖塩基配列である上記配列１〜１８のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片、及び
（２）該微生物のｒＲＮＡ上で該核酸断片（１）がハイブリダイゼーションするリボゾームＲＮＡの部分配列の３′側もしくは５′側に隣接する部分配列の逆相補鎖塩基配列を有する核酸断片を用いて、上記核酸断片（１）及び（２）のうち一方を標識物質で標識した標識核酸断片；上記核酸断片（１）及び（２）のうち他方を固定化した担体；該標識物質を検出するための試薬；及びハイブリダイゼーション溶液を備えた検出用キットとすることができる。
本発明の検出用キットにはさらに溶菌液を含ませることができる。溶菌液として水酸化ナトリウム等を含む塩基性化合物の水溶液、具体例として１Ｎ ＮａＯＨ水溶液がある。溶菌液には、続いて用いる中和用の塩酸などの酸を付属させてもよい。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【実施例１】
隣接ハイブリダイゼーション法によるクレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の検出
院内感染の原因菌の一つであるクレブシエラ・ニューモニアは、免疫能の低下した患者に肺炎を引き起こす肺炎桿菌である。クレブシエラ・ニューモニアを対象として隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。以下の配列番号１０と配列番号１１のＤＮＡを合成した。これらの配列は表１中の配列３及び４に各々相当する。両者はクレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的な部分相補鎖であり、配列番号１１のＤＮＡは配列番号１０のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡはクレブシエラ・ニューモニアの２３Ｓ ｒＲＮＡへハイブリダイゼーションする。陽性コントロールＤＮＡとして、クレブシエラ・ニューモニア ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な相同鎖である配列番号１２のＤＮＡ（配列番号１０及び１１を連ねた配列に対する相補的配列）を用いた。
【００２９】
【表２】反応液
標識プローブには配列番号１０のＤＮＡを５′ディゴキシゲニン標識したＤＮＡを用いて、表３に示されるプローブ液を調製した。
【００３１】
【表３】プローブ液
＊＊ あらかじめ１００ ℃、１０分の変性処理を行う。
【００３２】
配列番号１２のＤＮＡを陽性コントロールとして用いた。陽性コントロール合成ＤＮＡを０〜１００ｆｍｏｌ／ｔｅｓｔの適当な濃度になるように緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）， １０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０））に溶解し、陽性コントロール溶液とした。陽性コントロール溶液５０μｌ とプローブ液５０μｌ を捕捉プローブが固定されたプレートに入れ、３７℃で１時間振盪した。洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で数回洗浄した。表４に示す抗ディゴキシゲニンヒツジ抗体−ペルオキシダーゼ（抗Ｄｉｇ−ＰＯＤ）を含むコンジュゲート液をプレートに１００μｌ入れ、３７℃で１時間反応させた。
【表４】コンジュゲート液
洗浄液で数回洗浄後、表５に示す発色溶液をプレートに加え、青色液の吸光度を６６０ ｎｍの波長で測定した。
【表５】発色溶液
【００３４】
【表６】
図１及び表６の結果から５０ ａｍｏｌ／ｔｅｓｔまで発色が確認され、上記のように設計したプローブによりクレブシエラ・ニューモニアを極めて低濃度まで検出できることが判った。
【００３６】
［クレブシエラ・ニューモニアに対する特異性試験］
クレブシエラ・ニューモニアからの被検ｒＲＮＡを以下のようにして調製した。菌を白金耳などで栄養液体培地（Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ ｇ， Ｍｅａｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ３ ｇ， ＮａＣｌ ５ ｇ／滅菌水 １ Ｌ）に懸濁し、３７℃で一晩培養した。なお、生菌数は１０μｌ の懸濁液をとり適当に希釈して栄養寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩培養し、出現したコロニー数と希釈率とから求めた。菌体培養液を溶菌液（０．８ Ｎ ＮａＯＨ， ２．５％ ＳＤＳ， ５％ ポリエチエングリコール１０００）に混合し、１０分間静置した後、中和液（０．２ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．５ Ｎ ＨＣｌ）を加えて中和し、これを被検ｒＲＮＡ溶液とした。
【００３７】
検出感度を測定するために菌体培養液は栄養液体培地で適当に希釈して各濃度（ｃｏｎｃ．）とし、以下の試験に供した。また、プローブセットの菌特異性を判定するために、種々の菌を上記と同様の手順で処理し以下の操作に供した。
被検ｒＲＮＡ溶液５０μｌ とプローブ液５０μｌ を捕捉プローブが固定されたプレートに入れ、３７℃で１時間振盪した。洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で数回洗浄した。ここに発色溶液を入れ、１５分後に６６０ ｎｍの吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。図２及び表７にその結果を示す。図２の写真は、発色反応開始後１５分に撮影したものである。
下記表７は図２の写真に示されるプレートの各レーンＡ〜Ｄの各ウェルＮｏ．の内容を表したものである。吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）の測定は発色反応後１５分に行った。この表中、微生物略号欄の略号は次のように表される。
Ｋｐｎ：クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
Ｓｅｐ：スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）
Ｐａｅ：シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
Ｃａｌ：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｃｅ）
Ｂｓｐ：バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）
Ｅｆａ：エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
Ｓａｕ：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）
Ｓｓａ：スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）
ＸＬ１：エシェリキア・コリ ＸＬ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１）
【００３８】
【表７】
図２及び表７に示される結果から、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ の菌が存在していれば検出されることが示される。通常０．５ ｍｍ 径程度のコロニーには１０６ 以上の菌は普通に得られるので、上記の結果はこのような小さいコロニーでも検出が行えることを示すものである。また、配列番号１０及び配列番号１１のＤＮＡをそれぞれ標識用プローブと捕捉用プローブとして用いた場合、クレブシエラ・ニューモニアを特異的に検出し、他の菌種では発色しないことが示された。
【００４０】
さらに、上記実施例に用いた配列番号１０及び配列番号１１とは異なる領域のクレブシエラ・ニューモニア ２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的領域の部分相補鎖ＤＮＡである配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６で表される配列のＤＮＡを用い、各種微生物を用いて特異性試験を実施した。これらの配列は各々、表１中の配列１、２、５及び６に相当する。配列番号１４のＤＮＡは配列番号１３のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡはクレブシエラ・ニューモニア ２３Ｓ ｒＲＮＡへハイブリダイゼーションする。また、配列番号１６のＤＮＡは配列番号１５のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡはハイブリダイゼーションする。隣接ハイブリダイゼーション法の実施は上記実施例と同じである。表８に、使用した捕捉プローブと標識プローブの組み合わせとともに、測定した吸光度の結果を示す。試験操作は実施例１に準拠した。
【表８】吸光度
Ｋｐｎ：クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
Ｓｅｐ：スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）
Ｐａｅ：シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
Ｃａｌ：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｃｅ）
Ｂｓｐ：バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）
Ｅｆａ：エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
Ｓａｕ：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）
Ｓｓａ：スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）Ｓｓａ：スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）
ＸＬ１：エシェリキア・コリ ＸＬ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１）
Ｓｃｅ：サッカロマイセス・セレビサエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）
ＭＯＬＴ−１（ｈｕｍａｎ）：ヒト白血病由来細胞
【００４２】
表８に示された結果より、本発明のクレブシエラ・ニューモニア ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的ないずれかの核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして使用することで、クレブシエラ・ニューモニアを特異的に検出することができることが判る。
【００４３】
【実施例２】
隣接ハイブリダイゼーション法によるスタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の検出
スタフィロコッカス・エピデルミジスはしばしば院内感染問題で取り上げられる微生物であり、免疫能の低下した患者等に感染し、敗血症，細菌性心内膜炎，尿路感染症を引き起こす。スタフィロコッカス・エピデルミジスを対象として隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。捕捉プローブ用として配列番号１７で表されるＤＮＡを、標識プローブ用として配列番号１８で表されるＤＮＡを作製した。これらの配列は各々、表１の配列１１及び１２に相当する。共にスタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的な相補鎖の配列であり、配列番号１８のＤＮＡは配列番号１７のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡはスタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする。
【００４４】
被検ｒＲＮＡ溶液の調製ならびに隣接ハイブリダイゼーション法の実施は、クラブシエラ・ニューモニアの実施例で用いた方法に準拠した。陽性コントロールＤＮＡとしてスタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な相同鎖である配列番号１９のＤＮＡ（配列番号１７及び１８を連ねた配列に対する相補的配列）を用いた。図３に、陽性コントロールを用いたスタフィロコッカス・エピデルミジス検出・同定用プローブの評価の結果を表す。
【００４５】
【表９】
図３及び表９に示された結果から、１００ ａｍｏｌ／ｔｅｓｔまで発色が確認され、上記のように設計したプローブによりスタフィロコッカス・エピデルミジスを極めて低濃度まで検出できることが判った。
【００４７】
［スタフィロコッカス・エピデルミジスに対する特異性試験］
配列番号１７及び配列番号１８のＤＮＡを用いた隣接ハイブリダイゼーション法のスタフィロコッカス・エピデルミジスに対する特異性を調べた。方法は実施例１に準拠する。図４及び下記表１０にその結果を示す。図４の写真は、発色反応開始後１５分に撮影したものである。下記表１０は図４の写真に示されるプレートの各レーンＡ〜Ｄの各ウェルＮｏ．の内容を表したものである。吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）の測定は発色反応後１５分に行った。この表中、微生物略号欄の略号は表７と同じ意味である。
【００４８】
【表１０】
図４及び表１０の結果から、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ の菌が存在していれば検出されることが示された。また、配列番号１７と配列番号１８のＤＮＡをそれぞれ捕捉用プローブと標識用プローブとして用いた場合、スタフィロコッカス・エピデルミジスを特異的に検出し、他の菌種では発色しないことが示された。
【００５０】
上記実施例に用いた配列番号１７と配列番号１８とは異なる領域のスタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的領域の部分相補鎖ＤＮＡである配列番号２０、２１、２２及び２３で表される配列のＤＮＡを用いて特異性試験を実施した。これらの配列は各々、表１中の配列７〜１０に相当する。
配列番号２１のＤＮＡは配列番号２０のＤＮＡの、配列番号２３のＤＮＡは配列番号２２のＤＮＡのそれぞれ３′側に隣接して、スタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡへハイブリダイゼーションする。隣接ハイブリダイゼーション法の実施は上記実施例に同じである。下記表１１に、使用した捕捉プローブと標識プローブの組み合わせとともに、測定した吸光度の結果を示す。試験操作は実施例１に準拠した。
【表１１】吸光度
表１１の結果より、本発明のスタフィロコッカス・エピデルミジス ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的ないずれかの核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして使用することによって、スタフィロコッカス・エピデルミジスを特異的に検出することができることがわかる。
【００５２】
【実施例３】
隣接ハイブリダイゼーション法によるシュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の検出
緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは院内感染や日和見感染の原因菌としてよく知られており、各種薬剤に対して自然耐性や獲得耐性を示しやすことが知られている。シュードモナス・アエルギノーサを対象として隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。捕捉プローブ用として配列番号２４で表されるＤＮＡを、標識プローブ用として配列番号２５で表されるＤＮＡを作製した。これらの配列は各々、表１の配列１５及び１６に相当する。共にシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的な相補鎖の配列であり、配列番号２５のＤＮＡは配列番号２４のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡはシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする。被検ｒＲＮＡ溶液の調製ならびに隣接プローブ法の実施はクレブシエラ・ニューモニアの実施例で用いた方法に準拠した。陽性コントロールＤＮＡとしてシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な相同鎖である配列番号２６のＤＮＡ（配列番号２４及び２５を連ねた配列に対する相補的配列）を用いた。図５に、陽性コントロールを用いたシュードモナス・アエルギノーサ検出・同定用プローブの評価の結果を表す。
【００５３】
【００５４】
【表１２】
図５及び表１２に示された結果から、１００ ａｍｏｌ／ｔｅｓｔまで発色が確認され、上記のように設計したプローブによりシュードモナス・アエルギノーサを極めて低濃度まで検出できることが判った。
【００５６】
［シュードモナス・アエルギノーサに対する特異性試験］
配列番号２４のＤＮＡ及び配列番号２５のＤＮＡを用いた隣接ハイブリダイゼーション法のシュードモナス・アエルギノーサに対する特異性を調べた。方法は実施例１に準拠する。図６及び下記表１３にその結果を示す。図６の写真は、発色反応開始後１５分に撮影したものである。表１３は図６の写真に示されるプレートの各レーンＡ〜Ｄの各ウェルＮｏ．の内容を表したものである。吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）の測定は発色反応後１５分に行った。この表中、微生物略号欄の略号は表７と同じ意味である。
【００５７】
【表１３】
図６及び表１３の結果から、１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ の菌が存在していれば検出されることが示された。また、配列番号２４のＤＮＡと配列番号２５のＤＮＡをそれぞれ捕捉用プローブと標識用プローブとして用いた場合、シュードモナス・アエルギノーサを特異的に検出し、他の菌種では発色しないことが示された。
【００５９】
上記実施例に用いた配列番号２４及び配列番号２５とは異なる領域のシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡの特異的領域の部分相補鎖ＤＮＡである配列番号２７のＤＮＡ及び配列番号２８のＤＮＡを用いて特異性試験を実施した。これらの配列は各々、表１の配列１３及び１４に相当する。配列番号２８のＤＮＡは配列番号２７のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＡＮはシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列上へハイブリダイゼーションする。隣接ハイブリダイゼーション法の実施は上記実施例に同じである。表１４に使用した捕捉プローブと標識プローブの組み合わせとともに、測定した吸光度の結果を示す。試験操作は実施例１に準拠した。
【表１４】吸光度
表１４に示す結果より、本発明のシュードモナス・アエルギノーサ ２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的ないずれかの核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして使用することによって、シュードモナス・アエルギノーサを特異的に検出することができることがわかる。
【００６１】
【実施例４】
隣接ハイブリダイゼーション法によるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出
カンジダ・アルビカンスは日和見感染菌のうちの一つで、カンディダ属の中では最も病原性が強いため、院内感染で問題となっている。カンジダ・アルビカンスを対象として隣接ハイブリダイゼーション法を実施した。標識プローブ用として配列番号２９で表されるＤＮＡを、捕捉プローブ用として配列番号３０で表されるＤＮＡを作製した。これらの配列は各々、表１中の配列１７及び１８に相当する。共にカンジダ・アルビカンス １８Ｓ ｒＲＮＡの特異的な相補鎖の配列であり、配列番号３０のＤＮＡは配列番号２９のＤＮＡの３′側に隣接して両ＤＮＡは、カンジダ・アルビカンス １８Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする。被検ｒＲＮＡ溶液の調製ならびに隣接ハイブリダイゼーション法の実施は、クレブシエラ・ニューモニアの実施例で用いた方法に準拠した。陽性コントロールＤＮＡとしてカンジダ・アルビカンス １８Ｓ ｒＲＮＡに特異的な相同鎖である配列番号３１のＤＮＡ（配列番号２９及び３０を連ねた配列に対する相補的配列）を用いた。図７に、陽性コントロールを用いたカンジダ・アルビカンス検出・同定用プローブの評価の結果を表す。
【００６２】
【００６３】
【表１５】
図７及び表１５に示された結果から、５０ ａｍｏｌ／ｔｅｓｔまで発色が確認され、上記のように設計したプローブによりカンジダ・アルビカンスを極めて低濃度まで検出できることが判った。
【００６５】
［カンジダ・アルビカンスに対する特異性試験］
配列番号２９のＤＮＡ及び配列番号３０のＤＮＡを用いた隣接ハイブリダイゼーション法のカンジダ・アルビカンスに対する特異性を調べた。方法は実施例１に準拠する。図８及び下記表１６にその結果を示す。図８の写真は、発色反応開始後１５分に撮影したものである。表１６は図８の写真に示されるプレートの各レーンＡ〜Ｄの各ウェルＮｏ．の内容を表したものである。吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）の測定は発色反応後１５分に行った。この表中、微生物略号欄の略号は表７と同じ意味である。
【００６６】
【表１６】
図８及び表１６の結果から、１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ の菌が存在していれば検出されることが示された。また、配列番号２９のＤＮＡと配列番号３０のＤＮＡをそれぞれ捕捉用プローブと標識用プローブとして用いた場合、カンジダ・アルビカンスを特異的に検出し、他の菌種では発色しないことが示された。
【００６８】
また、配列番号２９と配列番号３０のＤＮＡをそれぞれ標識用プローブと捕捉用プローブとして隣接プローブを実施した。隣接ハイブリダイゼーション法の実施は上記実施例に同じである。表１７に使用した捕捉プローブと標識プローブの組み合わせとともに、測定した吸光度の結果を示す。試験操作は実施例１に準拠した。
【００６９】
【表１７】吸光度
表１７に示された結果より、本発明のカンジダ・アルビカンス １８Ｓ ｒＲＮＡに特異的ないずれかの核酸断片を標識プローブ、捕捉プローブとして使用することによって、カンジダ・アルビカンスを特異的に検出することができることがわかる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の核酸断片を微生物の検出・同定に用いることにより、特定の微生物を特異的に且つ高感度で、簡便に検出することができる。本発明の微生物の検出方法によれば、検体中に対象とする微生物が極めて低濃度で存在する場合でも、あるいは異種の微生物が混在する場合でも、対象とする微生物を検出することができる。また、本発明の微生物検出用キットによれば簡便に上記の検出方法を実施することができる。
【００７１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】クレブシエラ・ニューモニア陽性コントロールに対して、本発明の核酸断片を用いて隣接ハイブリダイゼーション法を実施したときのプレート上の各ウェルの発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図２】クレブシエラ・ニューモニアに対する、本発明の核酸断片を用いた隣接ハイブリダイゼーション法の特異性試験での発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図３】スタフィロコッカス・エピデルミジス陽性コントロールに対して、本発明の核酸断片を用いて隣接ハイブリダイゼーション法を実施したときのプレート上の各ウェルの発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図４】スタフィロコッカス・エピデルミジスに対する、本発明の核酸断片を用いた隣接ハイブリダイゼーション法の特異性試験での発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図５】シュードモナス・アエルギノーサ陽性コントロールに対して、本発明の核酸断片を用いて隣接ハイブリダイゼーション法を実施したときのプレート上の各ウェルの発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図６】シュードモナス・アエルギノーサに対する、本発明の核酸断片を用いた隣接ハイブリダイゼーション法の特異性試験での発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図７】カンジダ・アルビカンス陽性コントロールに対して、本発明の核酸断片を用いて隣接ハイブリダイゼーション法を実施したときのプレート上の各ウェルの発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。
【図８】カンジダ・アルビカンスに対する、本発明の核酸断片を用いた隣接ハイブリダイゼーション法の特異性試験での発色状況を撮影した写真である。そのときに測定した吸光度を示す表を添える。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to nucleic acid fragments useful for detecting ribosomal RNAs of microorganisms, particularly specific microorganisms involved in hospital-acquired infections, and further relates to a method for detecting and identifying microorganisms using the nucleic acid fragments, and a method for detection used in the detection method. About the kit.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art Conventionally, detection and identification of microorganisms in general, particularly microorganisms related to hospital-acquired infections, have been performed by the following methods. For example, (1) a method for separating and identifying microorganisms using an agar medium, (2) a blood culture (used for culturing sepsis-related microorganisms), (3) a polymerase chain reaction (PCR) method, (4) a reverse transcriptional PCR ( RT-PCR), (5) Northern blot, dot blot hybridization and the like.
However, the above method has various problems. {Circle around (1)} In the method for separating and identifying microorganisms using an agar medium, since the culturing time is long, it takes time to identify the microorganisms, and it is necessary to pay close attention to the contamination of microorganisms other than the target. {Circle around (2)} Blood culture (used for culturing sepsis-related microorganisms) also requires time since the above-described separation culture and disk method are performed after blood culture to identify microorganisms. Microorganisms lurking in blood cell components such as lymphocytes are often not enriched by blood culture, and may be judged to be apparently negative. {Circle around (3)} In the polymerase chain reaction (PCR) method, a skilled technique is required to completely remove a PCR inhibitor (for example, a heme protein) contained in blood or a medium while extracting microbial DNA. As well as the ability of the individual. In addition, since genomic DNA of dead bacteria is also extracted, it is difficult to convert them into a substantial viable count. {Circle around (4)} In the reverse transcriptional PCR (RT-PCR) method, it is necessary to completely remove the PCR inhibitor and to completely inactivate the ribonuclease when extracting microbial RNA, Requires extremely skilled skills. Furthermore, (5) Northern blot and dot blot hybridizations are not practically used because of their complicated operations, requiring skilled techniques, and the difficulty of quantitative analysis.
On the other hand, the present applicant has previously proposed that in a method for detecting a biological species, a hybridization method is performed using two nucleic acid probes adjacent to ribosomal RNA of the biological species (Patent Document 1). reference.)
[0003]
[Patent Document 1]
JP-A-7-39398
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a nucleic acid fragment (nucleic acid probe) useful for detecting and identifying microorganisms, particularly microorganisms causing hospital-acquired infection. Another object of the present invention is to provide a microorganism detection method capable of detecting a target microorganism specifically and with high sensitivity, more easily and quickly using the nucleic acid fragment. An object of the present invention is to provide a detection kit used for carrying out the microorganism detection method.
In this specification, the term “nucleic acid fragment” simply includes a DNA fragment, an RNA fragment, and a peptide nucleic acid fragment unless otherwise specified.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventor has determined that each microorganism has a unique sequence in the microbial ribosomal RNA (rRNA), and that the rRNA is single-stranded and undergoes RNase degradation, but is degraded when it becomes double-stranded. Focusing on properties such as not being performed, analysis and study of rRNA of microorganisms involved in hospital-acquired infections were conducted. As a result, 23S rRNA of Klebsiella pneumoniae, 23S rRNA of Staphylococcus epidermidis, 23S rRNA of Staphylococcus epidermidis, and Pseudomonas aeruginosa aeruginosa aeruginosa (Pseudomonas aerginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa aerginosa aeruginosa aeruginosa aeruginosa aerginosa) By finding a partial sequence unique to each microorganism in the base sequence and using a nucleic acid fragment of the reverse complementary strand corresponding to the sequence as a probe, it was possible to quickly and specifically identify these target microorganisms.
[0006]
Accordingly, the present invention provides a DNA fragment or an RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence of a partial sequence of a ribosomal RNA gene of a microorganism selected from Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans And a nucleic acid fragment containing at least 10 contiguous bases in any of the
The
[0008]
The present invention further provides a DNA fragment or RNA fragment or peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary base sequence of a partial sequence of a ribosomal RNA gene of a microorganism selected from Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. Wherein, on the ribosomal RNA of the microorganism, a nucleic acid fragment containing at least 10 consecutive nucleotides of any of the
[0009]
Specifically, the present invention relates to a DNA fragment or an RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary base sequence of a partial sequence of 23S ribosomal RNA of Klebsiella pneumoniae, wherein A nucleic acid fragment containing at least 10 consecutive bases, and a reverse complementary strand of a partial sequence adjacent to the 3'-side or 5'-side of the partial sequence of the ribosomal RNA to which the nucleic acid fragment hybridizes on 23S ribosomal RNA of Klebsiella pneumoniae It is a nucleic acid fragment having a base sequence.
The present invention also specifically relates to a DNA fragment or an RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary base sequence of a partial sequence of a 23S ribosomal RNA of Staphylococcus epidermidis, wherein the nucleic acid fragment comprises any one of the
[0010]
The present invention also specifically relates to a DNA fragment or an RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary base sequence of the partial sequence of 23S ribosomal RNA of Pseudomonas aeruginosa, wherein the sequence is any one of the sequences 13 to 16. And a reverse sequence of a partial sequence adjacent to the 3 ′ side or 5 ′ side of the partial sequence of the ribosomal RNA to which the nucleic acid fragment hybridizes on 23S ribosomal RNA of Pseudomonas aeruginosa It is a nucleic acid fragment having a complementary strand base sequence.
The present invention also specifically relates to a DNA fragment or an RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a reverse complementary base sequence of the partial sequence of the 18S ribosomal RNA gene of Candida albicans, And a partial sequence adjacent to the 3 'or 5' side of the partial sequence of the ribosomal RNA to which the nucleic acid fragment hybridizes on the 18S ribosomal RNA gene of Candida albicans. It is a nucleic acid fragment having a reverse complementary strand base sequence.
[0011]
The present invention is further directed to a method for detecting each microorganism using the above nucleic acid fragment as a probe. Therefore, the present invention is a method for detecting a microorganism selected from Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, characterized by using the nucleic acid fragment of the microorganism of interest, It is a detection method. Examples of the detection method include a PCR method and a hybridization method, such as a Northern blot hybridization method.
[0012]
The present invention further uses the nucleic acid fragment of the present invention to detect and identify a target microorganism by performing a so-called adjacent hybridization method previously developed by the present applicant and disclosed in JP-A-7-39398. And a method for detecting microorganisms.
Therefore, the present invention relates to a method for detecting a microorganism selected from Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, wherein (1) reverse complementation of a partial sequence of a ribosomal RNA gene of the microorganism of interest. A DNA fragment or a RNA fragment or a peptide nucleic acid fragment having a chain base sequence, wherein the nucleic acid fragment comprises at least 10 consecutive bases of any of the
The length of the nucleic acid fragment used in the detection method of the present invention is 10 bases or more, preferably up to 50 bases, and more preferably 15 to 50 bases.
[0013]
The present invention further provides a detection kit for use in the above detection method, specifically a detection kit comprising the following components:
(A) a carrier on which the nucleic acid fragment (1) is immobilized;
(B) the nucleic acid fragment (2) labeled with a labeling substance;
(C) a reagent for detecting a labeling substance;
(D) hybridization solution,
Alternatively, a detection kit containing the following components:
(A) the nucleic acid fragment (1) labeled with a labeling substance;
(B) a carrier on which the nucleic acid fragment (2) is immobilized;
(C) a reagent for detecting a labeling substance;
(D) Hybridization solution
It is.
The kit for detecting microorganisms of the present invention may further include a lysate.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is based on the finding of each unique sequence from the ribosomal RNA gene of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa or Candida albicans.
When designing a PCR primer or a hybridization probe by searching for a base sequence that a specific gene has, a homology between a sequence of a gene having a similar sequence or a similar function and a sequence of the specific gene is usually used. A search is performed, and a design is performed so that the homology of the selected sequence is 60% or less and the GC content (a value indicating the abundance ratio of G and C contained in the selected sequence in%) is 40 to 60%.
Incidentally, the reaction temperature of PCR or hybridization depends on the length of the sequences of those primers and probes and the GC content, so that it is generally necessary to set the temperature conditions strictly. On the other hand, in the hybridization method using adjacent probes, it is possible to identify a specific sequence of a gene even with a homology of about 80%.
Each type of gene usually has a sequence that shows a fairly high specificity for each gene. However, genes such as rRNA that exist in all organisms have an extremely large number of consensus sequences, so that it is not easy to find a sequence unique to the species. Particularly, the same kind of organisms (including microorganisms) often show a high homology of 95% or more. In addition to the difficulty of finding a rRNA gene sequence unique to each microorganism as described above, for example, when designing two types of probes adjacent to a region having a length of about 40 bases, the length and GC between adjacent probes are determined. The contents are substantially matched, preferably completely matched, and the number of mismatched base pairs (at least 3 bases) with other microorganisms having similar sequences is substantially matched, preferably completely matched, between adjacent probes. It is desired.
The present inventor has found a unique sequence useful for detecting microorganisms from the rRNA gene of each microorganism so as to overcome the above-described difficulties and satisfy the desirable conditions as an adjacent probe.
[0015]
The nucleic acid fragment of the present invention can be used for the detection of rRNA of microorganisms of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, such as PCR and hybridization. Law and the like.
Hereinafter, so-called adjacent hybridization will be described as an example of the hybridization method.
Depending on the microorganism to be detected, a nucleic acid fragment comprising at least 10 contiguous bases in any of the
The nucleic acid fragment used in the detection method of the present invention has at least 10 bases, preferably up to 50 bases, and more preferably 15 to 50 bases. In the present invention, “adjacent” means not separated, that is, completely adjacent.
The above-described nucleic acid fragment can be chemically synthesized according to a conventional method. It is preferable that the types of the nucleic acid fragments of the labeled probe and the capture probe are usually the same. For example, when a DNA fragment is used as a labeled probe, it is desirable that the capture probe is also a DNA fragment.
[0016]
Examples of the base sequences of the synthetic nucleic acid fragments for detecting each of the above four microorganisms according to the present invention are summarized in Table 1 below.
[0017]
[Table 1]
The
The partial sequence of the 23S rRNA of Klebsiella pneumonia detected in the nucleic acid fragments of the
5 'gcuggugugu aggugaagcc ccugccggggu ggaggaccagu 3' length 41
(SEQ ID NO: 1).
The partial sequence of 23S rRNA of Klebsiella pneumonia detected in the nucleic acid fragments of the
5 'uguguguguag gugaagcccc ugccggggugg agga 3' length 34
(SEQ ID NO: 2).
The partial sequence of the 23S rRNA of Klebsiella pneumonia detected in the nucleic acid fragments of the
5 'cauguagggcu gguuguccag gcaaaaccgg auauacaaga ggug 3' length 44
(SEQ ID NO: 3).
[0019]
The
The partial sequence of 23S rRNA of Staphylococcus epidermidis detected in the nucleic acid fragments of the
5 'gggcugugu gcacguucaa gcaguaaggc ugagugu 3' length 37
(SEQ ID NO: 4).
The partial sequence of 23S rRNA of Staphylococcus epidermidis detected in the nucleic acid fragments of the
5 'gcacuauau gagcugugau gggggagagga aauuguuucc 3' length 40
(SEQ ID NO: 5).
The partial sequence of 23S rRNA of Staphylococcus epidermidis detected in the nucleic acid fragments of the
5 'aagugucugu gugcacguuc aagcaguaag gcugagugu agg 3' length 43
(SEQ ID NO: 6).
[0020]
Sequence 14 hybridizes to the 23S rRNA gene sequence of Pseudomonas aeruginosa to a partial sequence adjacent to the 5 'side of the partial sequence to which sequence 13 hybridizes.
The partial sequence of 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa detected in the nucleic acid fragments of the above sequences 13 and 14 is as follows:
5 'ugcgccgggcu agggugaagg auuaacccg uaagggcug 3' length 39
(SEQ ID NO: 7).
Sequence 16 hybridizes to the 23S rRNA gene sequence of Pseudomonas aeruginosa to a partial sequence adjacent to the 5 'side of the partial sequence to which
The partial sequence of 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa detected in the nucleic acid fragments of the
5 'gggauuagca agcuucauug auuuuagcgg aacgcucuag ug 3' length 42
(SEQ ID NO: 8).
[0021]
Sequence 18 hybridizes to the Candida albicans 18S rRNA gene sequence and to a partial sequence adjacent to the 5 'side of the partial sequence to which
The partial sequence of the Candida albicans 18S rRNA gene detected in the nucleic acid fragments of the
5 'gaggaaugug gcacggcucu gucugugugu agcucucuac 3' length 40
(SEQ ID NO: 9).
In the case of
[0022]
The nucleic acid fragment is labeled with a labeling substance to obtain a labeled probe. The method for preparing the labeled probe is not specified, and examples of the labeling substance to be used include digoxigenin, biotin, deoxyuridine bromide, and fluoroescein.
When performing hybridization, the labeled probe is generally used in a state of being dissolved in a hybridization solution (also referred to as a probe solution). The composition of the hybridization solution to be used may be a conventional one. For example, salts such as SSC (0.15 M sodium chloride / 0.015 M sodium citrate), formamide, blocking reagent, surfactant, tRNA, DNA, etc. Include at appropriate concentration. Further, the composition of the hybridization solution may be appropriately changed according to the type of the nucleic acid fragment used. For example, when a peptide nucleic acid is used, hybridization can be performed even under relatively mild conditions, whereas when the salt concentration is increased, the peptide nucleic acid tends to precipitate. Therefore, it is preferable to reduce the salt concentration. Therefore, for example, a composition typically containing 10 mM phosphate buffer (pH 7.5), 30% formamide, and 1% blocking solution without SSC is typically exemplified.
[0023]
The capture probe may be immobilized on an appropriate carrier, and the nucleic acid fragment can be immobilized directly or indirectly on the carrier. As the carrier, for example, a microtiter plate made of an organic polymer having a high binding property to a nucleic acid or a microtiter plate immobilized with a compound that specifically immobilizes a labeled substance of a labeled capture probe can be used. The method for immobilizing the capture probe is not particularly limited. For example, as a method of directly fixing a nucleic acid fragment to a carrier by a physical method, a method in which a capture probe DNA or RNA or peptide nucleic acid solution is placed on a plate made of the above organic polymer, dried, and then fixed by ultraviolet irradiation or the like and so on. In addition, a method of indirectly fixing a nucleic acid fragment to a carrier using a biotin-avidin reaction or an antigen-antibody reaction, or a covalent bonding method such as a glutaraldehyde method may be used.
The solution of the nucleic acid fragment for a capture probe can be prepared as an appropriate reaction solution according to the method of immobilization on a carrier. The composition of the reaction solution contains, for example, a buffer, a chelating agent such as EDTA, and salts.
[0024]
Next, the sample containing the test rRNA and the labeled probe are brought into contact with the capture probe immobilized on the carrier, and the test rRNA is hybridized with the capture probe and the labeled probe. Next, the test rRNA is detected by detecting the labeling substance of the label probe bound to the test rRNA.
The method for preparing the test rRNA from blood, urine, and other sample samples is not specified, but for safe and simple operation, for example, an aqueous solution of a basic compound containing sodium hydroxide or the like (generally lysed (Referred to as a solution), and then neutralized with hydrochloric acid or the like.
[0025]
The prepared rRNA solution is added to a carrier on which a capture probe is immobilized together with a labeled probe, and hybridization is generally performed at 15 to 60 ° C. for about 3 minutes to 18 hours. After washing with an appropriate solution (washing solution 1), a reagent for detecting a labeling substance is added and reacted for a certain time. Examples of the reagent for detecting a labeling substance include a substance in which an enzyme is bound to a substance that binds to a labeling substance, and a substrate of the enzyme.
[0026]
The substance that binds to the labeling substance is not specified. For example, when the labeling probe is labeled with biotin, a mixture of biotin-binding peroxidase and avidin, or the labeling probe is labeled with digoxigenin (Dig) In this case, a conjugate of anti-Dig immunoglobulin and peroxidase can be used. Such a substance is used in a state of being contained in a liquid called a conjugate liquid in actual use. The composition of the conjugate solution can be appropriately selected and includes, for example, a buffer solution, a chelating agent such as EDTA, salts, and a blocking solution.
After reacting the substance that binds to the labeling substance, washing with an appropriate solution (washing solution 2), an appropriate enzyme substrate is added. Although the enzyme substrate is not specified, for example, when peroxidase is used, a blue reaction product can be obtained by using tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide as substrates. Of course, a fluorescent substrate or a luminescent substrate can also be used. Such an enzyme substrate can be appropriately prepared as a color developing solution.
The
[0027]
The present invention is further directed to a detection kit for use in the above-described detection method. That is, depending on the microorganism to be detected, (1) contains at least 10 contiguous bases in any one of the above-mentioned
(2) Using a nucleic acid fragment having the reverse complementary strand base sequence of the partial sequence adjacent to the 3 ′ or 5 ′ side of the partial sequence of the ribosomal RNA to which the nucleic acid fragment (1) hybridizes on the rRNA of the microorganism A labeled nucleic acid fragment in which one of the nucleic acid fragments (1) and (2) is labeled with a labeling substance; a carrier on which the other of the nucleic acid fragments (1) and (2) is immobilized; And a detection kit comprising a hybridization solution.
The detection kit of the present invention can further contain a lysate. As a lysate, there is an aqueous solution of a basic compound containing sodium hydroxide or the like. The lysate may be accompanied by an acid such as hydrochloric acid for subsequent neutralization.
[0028]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Detection of Klebsiella pneumoniae by flanking hybridization method
Klebsiella pneumoniae, one of the causative agents of nosocomial infections, is a Klebsiella pneumoniae that causes pneumonia in immunocompromised patients. Adjacent hybridization was performed on Klebsiella pneumoniae. The following DNAs of SEQ ID NOs: 10 and 11 were synthesized. These sequences correspond to
[0029]
[Table 2] Reaction solution
A probe solution shown in Table 3 was prepared using a DNA obtained by labeling the DNA of SEQ ID NO: 10 with 5 ′ digoxigenin as a labeled probe.
[0031]
[Table 3] Probe liquid
** Denature at 100 ° C for 10 minutes in advance.
[0032]
The DNA of SEQ ID NO: 12 was used as a positive control. The positive control synthetic DNA was dissolved in a buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0)) to an appropriate concentration of 0 to 100 fmol / test. did. 50 μl of the positive control solution and 50 μl of the probe solution were placed on a plate on which the capture probe was fixed, and shaken at 37 ° C. for 1 hour. Washing was performed several times with a washing solution (physiological saline containing 0.05% Tween 20). 100 μl of a conjugate solution containing an anti-digoxigenin sheep antibody-peroxidase (anti-Dig-POD) shown in Table 4 was added to the plate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
[Table 4] Conjugate solution
After washing several times with the washing solution, the coloring solution shown in Table 5 was added to the plate, and the absorbance of the blue solution was measured at a wavelength of 660 nm.
[Table 5] Coloring solution
[0034]
[Table 6]
From the results in FIG. 1 and Table 6, color development was confirmed up to 50 amol / test, and it was found that Klebsiella pneumonia could be detected to an extremely low concentration with the probe designed as described above.
[0036]
[Specificity test for Klebsiella pneumonia]
Test rRNA from Klebsiella pneumonia was prepared as follows. The bacterium was suspended in a nutrient liquid medium (Peptone 5 g, Meat Extract 3 g, NaCl 5 g / sterile water 1 L) using a platinum loop or the like, and cultured at 37 ° C. overnight. The viable cell count was determined by taking 10 μl of the suspension, diluting it appropriately, applying it to a nutrient agar medium, culturing it at 37 ° C. overnight, and determining the number of colonies that appeared and the dilution ratio. The cell culture was mixed with a lysate (0.8 N NaOH, 2.5% SDS, 5% polyethylene glycol 1000), allowed to stand for 10 minutes, and then neutralized (0.2 M phosphate buffer). (PH 7.0), 0.5 N HCl) was added to neutralize, and this was used as a test rRNA solution.
[0037]
In order to measure the detection sensitivity, the bacterial cell culture solution was appropriately diluted with a nutrient liquid medium to each concentration (conc.) And subjected to the following tests. In addition, in order to determine the bacterial specificity of the probe set, various bacteria were treated in the same procedure as described above and subjected to the following operation.
50 μl of the test rRNA solution and 50 μl of the probe solution were placed on a plate on which the capture probe was fixed, and shaken at 37 ° C. for 1 hour. Washing was performed several times with a washing solution (physiological saline containing 0.05% Tween 20). The coloring solution was added thereto, and the absorbance at 660 nm (Absorbance) was measured after 15 minutes. FIG. 2 and Table 7 show the results. The photograph in FIG. 2 was taken 15 minutes after the start of the coloring reaction.
Table 7 below shows each well No. of each lane A to D of the plate shown in the photograph of FIG. It shows the contents of. Absorbance (Absorbance) was measured 15 minutes after the color reaction. In this table, the abbreviations in the microorganism abbreviation column are represented as follows.
Kpn: Klebsiella pneumoniae
Sep: Staphylococcus epidermidis
Pae: Pseudomonas aeruginosa
Cal: Candida albicans
Bsp: Bacillus sp.
Efa: Enterococcus faecalis
Sau: Staphylococcus aureus
Ssa: Staphylococcus saprophyticus
XL1: Escherichia coli XL1
[0038]
[Table 7]
From the results shown in FIG. 2 and Table 7, 1.0 × 10 6 This indicates that cells / ml are detected if present. Usually, a colony with a diameter of about 0.5 mm 6 The above results show that even such small colonies can be detected, since these bacteria are commonly obtained. When the DNAs of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 were used as a probe for labeling and a probe for capture, respectively, Klebsiella pneumoniae was specifically detected, and it was shown that other bacterial strains did not develop color.
[0040]
Furthermore, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15 which are partial complementary strand DNAs of the specific region of Klebsiella pneumoniae 23S rRNA in a region different from SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 used in the above Examples A specificity test was carried out using DNA having the sequence represented by No. 16 and various microorganisms. Each of these sequences corresponds to
[Table 8] Absorbance
Kpn: Klebsiella pneumoniae
Sep: Staphylococcus epidermidis
Pae: Pseudomonas aeruginosa
Cal: Candida albicans
Bsp: Bacillus sp.
Efa: Enterococcus faecalis
Sau: Staphylococcus aureus
Ssa: Staphylococcus saprophyticus Ssa: Staphylococcus saprophyticus
XL1: Escherichia coli XL1
Sce: Saccharomyces cerevisae
MOLT-1 (human): Human leukemia-derived cells
[0042]
From the results shown in Table 8, it is possible to specifically detect Klebsiella pneumoniae by using any of the nucleic acid fragments specific to Klebsiella pneumoniae 23S rRNA of the present invention as a labeling probe and a capture probe. I understand.
[0043]
Detection of Staphylococcus epidermidis by flanking hybridization method
Staphylococcus epidermidis is a microorganism that is often taken up in the problem of nosocomial infection and infects patients with reduced immunity, etc., causing sepsis, bacterial endocarditis, and urinary tract infection. Flanking hybridization was performed on Staphylococcus epidermidis. A DNA represented by SEQ ID NO: 17 was prepared for a capture probe, and a DNA represented by SEQ ID NO: 18 was prepared for a labeled probe. Each of these sequences corresponds to
[0044]
The preparation of the test rRNA solution and the implementation of the flanking hybridization method were based on the methods used in Examples of Crab Sierra Pneumonia. As a positive control DNA, DNA of SEQ ID NO: 19 (complementary sequence to the sequence of SEQ ID NOS: 17 and 18), which is a homologous strand specific to Staphylococcus epidermidis 23S rRNA, was used. FIG. 3 shows the results of evaluation of a probe for detecting and identifying Staphylococcus epidermidis using a positive control.
[0045]
[Table 9]
From the results shown in FIG. 3 and Table 9, color development was confirmed up to 100 amol / test, and it was found that Staphylococcus epidermidis could be detected to an extremely low concentration with the probe designed as described above.
[0047]
[Specificity test for Staphylococcus epidermidis]
The specificity of the flanking hybridization method using DNAs of SEQ ID NOs: 17 and 18 to Staphylococcus epidermidis was examined. The method is based on Example 1. FIG. 4 and Table 10 below show the results. The photograph in FIG. 4 was taken 15 minutes after the start of the coloring reaction. Table 10 below shows each well No. of each lane A to D of the plate shown in the photograph of FIG. It shows the contents of. Absorbance (Absorbance) was measured 15 minutes after the color reaction. In this table, the abbreviations in the microorganism abbreviation column have the same meanings as in Table 7.
[0048]
[Table 10]
From the results of FIG. 4 and Table 10, 1.0 × 10 6 It was shown that cells were detected if cells / ml were present. In addition, when the DNAs of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were used as a probe for capture and a probe for labeling, respectively, Staphylococcus epidermidis was specifically detected, and it was shown that other strains did not develop color.
[0050]
Sequences represented by SEQ ID NOs: 20, 21, 22 and 23 which are partial complementary strand DNAs of the specific region of Staphylococcus epidermidis 23S rRNA in a region different from SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 used in the above Examples A specificity test was carried out using the DNA of Example 1. These sequences correspond to
The DNA of SEQ ID NO: 21 hybridizes to the DNA of SEQ ID NO: 20, and the DNA of SEQ ID NO: 23 hybridizes to Staphylococcus epidermidis 23S rRNA adjacent to the 3 ′ side of the DNA of SEQ ID NO: 22. The implementation of the flanking hybridization method is the same as in the above example. Table 11 below shows the results of the measured absorbance along with the combinations of the capture probe and the labeled probe used. The test operation was in accordance with Example 1.
[Table 11] Absorbance
From the results in Table 11, it is possible to specifically detect Staphylococcus epidermidis by using any nucleic acid fragment specific to Staphylococcus epidermidis 23S rRNA of the present invention as a labeling probe and a capture probe. We can see that we can do it.
[0052]
Detection of Pseudomonas aeruginosa by the adjacent hybridization method
Pseudomonas aeruginosa is well known as a causative agent of hospital-acquired infections and opportunistic infections, and is known to easily exhibit natural resistance and acquired resistance to various drugs. Adjacent hybridization was performed on Pseudomonas aeruginosa. A DNA represented by SEQ ID NO: 24 was prepared for a capture probe, and a DNA represented by SEQ ID NO: 25 was prepared for a labeled probe. These sequences correspond to
[0053]
[0054]
[Table 12]
From the results shown in FIG. 5 and Table 12, color development was confirmed up to 100 amol / test, and it was found that Pseudomonas aeruginosa could be detected to an extremely low concentration with the probe designed as described above.
[0056]
[Specificity test for Pseudomonas aeruginosa]
The specificity of Pseudomonas aeruginosa by the adjacent hybridization method using the DNA of SEQ ID NO: 24 and the DNA of SEQ ID NO: 25 was examined. The method is based on Example 1. FIG. 6 and Table 13 below show the results. The photograph in FIG. 6 was taken 15 minutes after the start of the coloring reaction. Table 13 shows each well No. of each lane A to D of the plate shown in the photograph of FIG. It shows the contents of. Absorbance (Absorbance) was measured 15 minutes after the color reaction. In this table, the abbreviations in the microorganism abbreviation column have the same meanings as in Table 7.
[0057]
[Table 13]
From the results of FIG. 6 and Table 13, 1.0 × 10 6 It was shown that cells were detected if cells / ml were present. In addition, when the DNA of SEQ ID NO: 24 and the DNA of SEQ ID NO: 25 were used as a capture probe and a labeling probe, respectively, Pseudomonas aeruginosa was specifically detected, and it was shown that no other bacterial species developed color.
[0059]
Specificity using DNA of SEQ ID NO: 27 and DNA of SEQ ID NO: 28, which are partial complementary strand DNAs of the specific region of Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA in a region different from SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 used in the above Examples The test was performed. Each of these sequences corresponds to sequences 13 and 14 in Table 1. The DNA of SEQ ID NO: 28 is adjacent to the 3 'side of the DNA of SEQ ID NO: 27, and both DNAs hybridize to Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA base sequence. The implementation of the flanking hybridization method is the same as in the above example. Table 14 shows the results of the measured absorbance along with the combination of the capture probe and the labeled probe used. The test operation was in accordance with Example 1.
[Table 14] Absorbance
From the results shown in Table 14, it can be seen that Pseudomonas aeruginosa can be specifically detected by using any of the nucleic acid fragments specific to Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA of the present invention as a labeling probe and a capture probe. .
[0061]
Detection of Candida albicans by flanking hybridization
Candida albicans is one of the opportunistic pathogens and is the most pathogenic of the genus Candida, which has been a problem with nosocomial infections. Adjacent hybridization was performed on Candida albicans. The DNA represented by SEQ ID NO: 29 was prepared for a labeling probe, and the DNA represented by SEQ ID NO: 30 was prepared for a capture probe. Each of these sequences corresponds to
[0062]
[0063]
[Table 15]
From the results shown in FIG. 7 and Table 15, color development was confirmed up to 50 amol / test, and it was found that Candida albicans can be detected to an extremely low concentration with the probe designed as described above.
[0065]
[Specificity test for Candida albicans]
The specificity to Candida albicans of the adjacent hybridization method using the DNA of SEQ ID NO: 29 and the DNA of SEQ ID NO: 30 was examined. The method is based on Example 1. FIG. 8 and Table 16 below show the results. The photograph in FIG. 8 was taken 15 minutes after the start of the coloring reaction. Table 16 shows each well No. of each lane A to D of the plate shown in the photograph of FIG. It shows the contents of. Absorbance (Absorbance) was measured 15 minutes after the color reaction. In this table, the abbreviations in the microorganism abbreviation column have the same meanings as in Table 7.
[0066]
[Table 16]
From the results of FIG. 8 and Table 16, 1.0 × 10 6 It was shown that cells were detected if cells / ml were present. When the DNA of SEQ ID NO: 29 and the DNA of SEQ ID NO: 30 were used as a capture probe and a labeling probe, respectively, Candida albicans was specifically detected, and it was shown that other strains did not develop color.
[0068]
Adjacent probes were performed using the DNAs of SEQ ID NOS: 29 and 30 as labeling probes and capture probes, respectively. The implementation of the flanking hybridization method is the same as in the above example. Table 17 shows the results of the measured absorbance along with the combination of the capture probe and the labeled probe used. The test operation was in accordance with Example 1.
[0069]
[Table 17] Absorbance
From the results shown in Table 17, Candida albicans can be specifically detected by using any of the nucleic acid fragments specific to Candida albicans 18S rRNA of the present invention as a labeling probe and a capture probe. I understand.
[0070]
【The invention's effect】
By using the nucleic acid fragment of the present invention for detection and identification of microorganisms, specific microorganisms can be specifically, highly sensitively and easily detected. According to the method for detecting a microorganism of the present invention, the target microorganism can be detected even when the target microorganism is present in an extremely low concentration in the sample or when different types of microorganisms are mixed. Further, according to the microorganism detection kit of the present invention, the above-described detection method can be easily carried out.
[0071]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the color development of each well on a plate when an adjacent hybridization method was performed using a nucleic acid fragment of the present invention on a Klebsiella pneumonia positive control. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 2 is a photograph showing the color development of Klebsiella pneumoniae in a specificity test of an adjacent hybridization method using the nucleic acid fragment of the present invention. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 3 is a photograph showing the color development of each well on a plate when an adjacent hybridization method is performed using a nucleic acid fragment of the present invention with respect to a Staphylococcus epidermidis positive control. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 4 is a photograph showing the color development of Staphylococcus epidermidis in a specificity test of the adjacent hybridization method using the nucleic acid fragment of the present invention. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 5 is a photograph showing the color development of each well on a plate when a Pseudomonas aeruginosa positive control was subjected to the adjacent hybridization method using the nucleic acid fragment of the present invention. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 6 is a photograph showing the color development of Pseudomonas aeruginosa in a specificity test of the adjacent hybridization method using the nucleic acid fragment of the present invention. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 7 is a photograph showing the color development of each well on a plate when the adjacent hybridization method was performed using the nucleic acid fragment of the present invention for a Candida albicans positive control. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
FIG. 8 is a photograph showing a color development state in a specificity test of Candida albicans by the adjacent hybridization method using the nucleic acid fragment of the present invention. A table showing the absorbance measured at that time is attached.
Claims (15)
（イ）該核酸断片（１）を固定化した担体；
（ロ）標識物質で標識された該核酸断片（２）；
（ハ）該標識物質を検出するための試薬；
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液A detection kit for use in the method according to claim 12, comprising the following components:
(A) a carrier on which the nucleic acid fragment (1) is immobilized;
(B) the nucleic acid fragment (2) labeled with a labeling substance;
(C) a reagent for detecting the labeling substance;
(D) Hybridization solution
（イ）標識物質で標識された該核酸断片（１）；
（ロ）該核酸断片（２）を固定化した担体；
（ハ）該標識物質を検出するための試薬；
（ニ）ハイブリダイゼーション溶液A detection kit for use in the method according to claim 12, comprising the following components:
(A) the nucleic acid fragment (1) labeled with a labeling substance;
(B) a carrier on which the nucleic acid fragment (2) is immobilized;
(C) a reagent for detecting the labeling substance;
(D) Hybridization solution
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008545432A (en) * | 2005-06-02 | 2008-12-18 | アドヴァンディーエックス，インコーポレイテッド | Peptide nucleic acid probe for analyzing microorganisms |
| US7595164B2 (en) | 2007-12-26 | 2009-09-29 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid |
-
2002
- 2002-10-30 JP JP2002315970A patent/JP2004147550A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008545432A (en) * | 2005-06-02 | 2008-12-18 | アドヴァンディーエックス，インコーポレイテッド | Peptide nucleic acid probe for analyzing microorganisms |
| US7595164B2 (en) | 2007-12-26 | 2009-09-29 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid |
| US7670780B2 (en) | 2007-12-26 | 2010-03-02 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid |
| US9109262B2 (en) | 2007-12-26 | 2015-08-18 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid |
| US9109263B2 (en) | 2007-12-26 | 2015-08-18 | Gen-Probe Incorporated | Compositions to detect Candida albicans nucleic acid |
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