JP2004144526A

JP2004144526A - Malaria infection diagnostic agent and plasmodium stain

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Publication number: JP2004144526A
Application number: JP2002307611A
Authority: JP
Inventors: Masataka Ihara; 井原　正隆; Kiyomasa Takasu; 高須　清誠; Arisuke Wataya; 綿矢　有佑; Keishuku Kin; 金　惠淑
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-10-22
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2004-05-20
Anticipated expiration: 2022-10-22
Also published as: JP3904505B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a malaria infection diagnostic agent and a Plasmodium stain capable of detecting Plasmodium easily and surely by staining selectively the Plasmodium in blood, and to provide a discrimination method of a malaria infectious disease capable of detecting easily and surely the Plasmodium parasitizing in erythrocyte of peripheral blood, and a staining method of the Plasmodium. <P>SOLUTION: A specific rhodacyanine type dye compound is included, and the rhodacyanine type dye compound is accumulated in a cell small organ of the Plasmodium in the erythrocyte to emit fluorescence, to thereby enable diagnosis of malaria infection. Preferably, the rhodacyanine type dye compound has independently a five-membered or six-membered nitrogen-including heterocycle having an un-substituted or substituted group. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロダシアニン系色素化合物を有効成分として含有するマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤、これを用いたマラリア感染症の判定方法や、マラリア原虫の染色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアはハマダラカを媒体として人体に注入されたマラリア原虫に感染して発病する感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫には熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．　ｆａｌｃｉｐａｒｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．　ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）等があり、世界中で患者数２〜３億人、死者年間２〜３百万人と推定されている。近年、殺虫剤耐性の蚊や、マラリアの特効薬として多用されてきたクロロキン（式（Ｖ）（ａ））に耐性を有するマラリア原虫が出現し、対策が困難となっている。抗マラリア剤又は抗マラリア化合物としては、２個の複素環を含有するオルソ−縮合系の新規化合物（例えば、特許文献１参照。）や、ＩＣＡＭ−１発現抑制作用を有する化合物を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献２参照。）や、５’−ｏ−スルファモイル−２−クロロアデノシン等のヌクレオシド誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献３参照。）や、トリコテセン類等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献４参照。）や、シクロプロジギオシン等を有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献５参照。）や、リミノフェナジンを有効成分として含有するマラリア予防又は治療薬（例えば、特許文献６参照。）や、キノリン誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア薬耐性克服剤（例えば、特許文献７参照。）や、５−フルオロオロチン酸及びスルファモノメトキシンを有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献８参照。）等が知られている。
【０００３】
一方、クロロキンに耐性をもつマラリア原虫に対して、メフロキン（式（Ｖ）（ｂ））、プリマキン等のクロロキン類似のキノリン環を持つアミン化合物が使用されており、最近では生薬である青嵩（和名：クソニンジン）から抽出されたアルテミシニン（式（Ｖ）（ｃ））等のパーオキシ環状化合物や、マラリア原虫のミトコンドリアに存在するチトクロームｂを阻害するアトバコン（式（Ｖ）（ｄ））等、パーオキシドやキノンという酸化段階の高い化合物が有効な治療薬として使われていた。しかしながら、これらの薬剤に対しても耐性を示すマラリア原虫がすでに現れたことが報告されており、新規なマラリア剤に対して次々に耐性を有するマラリア原虫が出現し、これらの抗マラリア薬が使えなくなる日はそう遠くはないと考えられている。また、マラリア原虫に対して有効であるキニーネ（式（Ｖ）（ｅ））は、腎不全を引き起こす可能性が高く、キニーネは最終治療としてのみ用いられているのが現状であり、感染の予防や、治療を保証することはできなかった。
【０００４】
【化１７】

【０００５】
本発明者らは、各種抗マラリア剤に耐性を有するマラリア原虫に対して有効であり、副作用が少ない抗マラリア剤として、上記抗マラリア剤と全く違う構造を持つ新化学療法剤の開発のためランダムスクリーニングを行った結果、クロロキンに匹敵する抗マラリア活性を示すロダニン母核（４−オキソチアゾリジン環）を有するロダシアニン色素化合物（式（ＶＩ）（ａ））（ＥＣ_５０＝７０ｎＭ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ＝２１０）が有用であることを見い出し、既に報告している（例えば、特許文献９参照。）。更に、かかるロダシアニン色素化合物に種々の置換基を導入してロダシアニン系色素化合物を合成し、抗マラリア活性について検定したところ、ロダニン母核の特定位（Ｎ−３位）にアリル基が導入された化合物（式（ＶＩ）（ｂ））（ＥＣ_５０＝１２ｎＭ、ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ＝１０００）が非常に高い抗マラリア活性と優れた選択毒性を有することを確認して既に報告している（特願２００１−２２０５７９号）。
【０００６】
【化１８】

【０００７】
このようなマラリア感染症に対する治療の現況において、重篤症状を回避するため早期発見・早期治療が重要である。また、近年では流行地域からの渡航者や帰国者からのマラリアの流入が危惧されており、それらの該当者に対する感染の的確な診断剤や診断方法が必要である。従来からマラリア感染症の診断方法として、ギムザ染色やアクリジンオレンジ染色を用いた方法が使用されている。ギムザ染色法は血液をメタノール固定後、ｐＨ７．２〜７．４のバッファーを用いてギムザ染料により細胞核等を染色する方法であり、アクリジンオレンジ法はアクリジンオレンジ染料を用いて核等を染色する方法であり、その他、核のＤＮＡと結合するＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）により核の染色によるマラリア感染の診断方法等も知られている。
また、ｂａｓｉｃ　ｂｌｕｅ　４１（Ｃｏｌｏｕｒ　Ｉｎｄｅｘ　Ｎｏ．１１１５４）によりマラリア原虫が染色されることが知られている（例えば、特許文献１０参照。）。ｂａｓｉｃ　ｂｌｕｅ　４１は式（ＶＩＩ）に示すモノアゾ化合物であり、赤血球中のマラリア原虫をギムザ染料より正確に迅速に染色することが明らかにされている。
【０００８】
【化１９】

【０００９】
しかしながら、これら公知の診断方法に用いられる染料は、マラリア原虫のみならず、寄生する赤血球の細胞等を染色したり白血球の核も染色するため、感染したかどうか、また、完治したかどうか明快な診断が困難である。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−７６７３号公報
【特許文献２】
特開平１１−２２８４４６号公報
【特許文献３】
特開平１１−２２８４２２号公報
【特許文献４】
特開平１１−２２８４０８号公報
【特許文献５】
特開平１０−２６５３８２号公報
【特許文献６】
特開平８−２３１４０１号公報
【特許文献７】
特開平８−７３３５５号公報
【特許文献８】
特開平８−５９４７１号公報
【特許文献９】
特開２０００−１９１５３１号公報
【特許文献１０】
国際公開第８５／５４４６号パンフレット
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液中においてマラリア原虫を選択的に染色し、マラリア原虫を容易に、確実に検出することができるマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤を提供し、末梢血の赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出できるマラリア感染の検出方法や、マラリア感染症の診断方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述のロダシアニン系色素化合物についての抗マラリア活性の研究の過程において、ロダシアニン系色素化合物が血液中のマラリア原虫の小器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）に選択的に集積し、赤血球組織には結合しないことを見い出し、ロダシアニン系色素化合物を末梢血に接触させることにより赤血球に寄生するマラリア原虫の有無を高精度に検出することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）
【００１４】
【化２０】

【００１５】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ｒ^３は未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ａ及びＢは独立して窒素含有複素環を表し、ｎは０、１又は２の整数を表し、Ｘ⁻は薬学的に許容しうるアニオンを表す。］で示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア感染診断剤に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染の診断を可能とすることを特徴とする請求項１記載のマラリア感染診断剤（請求項２）や、一般式（Ｉ）中、Ａ及びＢが、独立して未置換若しくは置換基を有する５員又は６員の窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項１又は２記載のマラリア感染診断剤（請求項３）や、一般式（Ｉ）中、Ａが、酸素族原子を含む窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項３記載のマラリア感染診断剤（請求項４）や、一般式（Ｉ）中、Ｘ⁻が、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかを表すことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマラリア感染診断剤（請求項５）や、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物が、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物であることを特徴とする請求項１記載のマラリア感染診断剤（請求項６）に関する。
【００１６】
【化２１】

【００１７】
【化２２】

【００１８】
【化２３】

【００１９】
また、本発明は、一般式（Ｉ）
【００２０】
【化２４】

【００２１】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ｒ^３は未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ａ及びＢは独立して窒素含有複素環を表し、ｎは０、１又は２の整数を表し、Ｘ⁻は薬学的に許容しうるアニオンを表す。］で示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア原虫染色剤（請求項７）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項７記載のマラリア原虫染色剤（請求項８）や、一般式（Ｉ）中、Ａ及びＢが、独立して未置換若しくは置換基を有する５員又は６員の窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項７又は８記載のマラリア原虫染色剤（請求項９）や、一般式（Ｉ）中、Ａが、酸素族原子を含む窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項９記載のマラリア原虫染色剤（請求項１０）や、一般式（Ｉ）中、Ｘ⁻が、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかを表すことを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のマラリア原虫染色剤（請求項１１）や、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物が、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物であることを特徴とする請求項７記載のマラリア原虫染色剤（請求項１２）に関する。
【００２２】
【化２５】

【００２３】
【化２６】

【００２４】
【化２７】

【００２５】
本発明は、一般式（Ｉ）
【００２６】
【化２８】

【００２７】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ｒ^３は未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ａ及びＢは独立して窒素含有複素環を表し、ｎは０、１又は２の整数を表し、Ｘ⁻は薬学的に許容しうるアニオンを表す。］で示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア感染症の判定方法（請求項１３）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染症を判定することを特徴とする請求項１３記載のマラリア感染症の判定方法（請求項１４）や、一般式（Ｉ）中、Ａ及びＢが、独立して未置換若しくは置換基を有する５員又は６員の窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項１３又は１４記載のマラリア感染症の判定方法（請求項１５）や、一般式（Ｉ）中、Ａが、酸素族原子を含む窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項１５記載のマラリア感染症の判定方法（請求項１６）や、一般式（Ｉ）中、Ｘ⁻が、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかを表すことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載のマラリア感染症の判定方法（請求項１７）や、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物が、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物であることを特徴とする請求項１３記載のマラリア感染症の判定方法（請求項１８）に関する。
【００２８】
【化２９】

【００２９】
【化３０】

【００３０】
【化３１】

【００３１】
本発明は、一般式（Ｉ）
【００３２】
【化３２】

【００３３】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ｒ^３は未置換若しくは置換基を有するＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有するＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、Ａ及びＢは独立して窒素含有複素環を表し、ｎは０、１又は２の整数を表し、Ｘ⁻は薬学的に許容しうるアニオンを表す。］で示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア原虫の染色方法（請求項１９）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項１９記載のマラリア原虫の染色方法（請求項２０）や、一般式（Ｉ）中、Ａ及びＢが、独立して未置換若しくは置換基を有する５員又は６員の窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項１９又は２０記載のマラリア原虫の染色方法（請求項２１）や、一般式（Ｉ）中、Ａが、酸素族原子を含む窒素含有複素環を表わすことを特徴とする請求項２１記載のマラリア原虫の染色方法（請求項２２）や、一般式（Ｉ）中、Ｘ⁻が、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかを表すことを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか記載のマラリア原虫の染色方法（請求項２３）や、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物が、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物であることを特徴とする請求項１９記載のマラリア原虫の染色方法（請求項２４）に関する。
【００３４】
【化３３】

【００３５】
【化３４】

【００３６】
【化３５】

【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば特に制限されるものではない。一般式（Ｉ）中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表す。上記Ｃ１〜Ｃ８のアルキル基としては、直鎖のみならず分枝鎖を有するものであってもよく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、２−メチル−ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘプチル基、２−メチル−ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基等を例示することができ、上記Ｃ６〜Ｃ８のアリール基としては、フェニル基、ｐ−トリル基、４−キシル基等を例示することができる。これらのＣ１〜Ｃ８のアルキル基又はＣ６〜Ｃ８のアリール基に結合される置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、オキソ基、アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、アルケニル基等を例示することができる。
【００３８】
また、一般式（Ｉ）中、Ｒ^３は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、かかるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基としては、具体的には、一般式（Ｉ）中のＲ^１及びＲ^２におけるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基と同様のものを挙げることができ、特に、メチル基、アリル基、ベンジル基、（２−テトラヒドロフラニル）メチル基等が好ましい。
【００３９】
また、一般式（Ｉ）中、Ａはロダニン環に結合する炭素原子に対してα位に窒素原子が結合される窒素含有複素環であり、Ｂで表される窒素含有複素環と同一又は異なっていてもよい５員又は６員環の窒素含有複素環であることが好ましく、更に、ロダニン環に結合する炭素原子に対してα位に硫黄、酸素、セレン等の酸素族原子が結合される窒素含有複素環であることが好ましく、このうち特に硫黄原子、酸素原子が結合される窒素含有複素環であることが好ましい。かかる一般式（Ｉ）におけるＡで表される窒素含有複素環としては、具体的には、ピロリジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾリジン、チアゾール、イソチアゾール、２−チアゾリン、イソオキサゾール、オキサゾール、１，２，５−オキサジアゾール等や、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、２Ｈ−１，４−チアジン、４Ｈ−１，４−チアジン、モルホリン、４Ｈ−１，４−オキサジン等から一つの水素原子を除いたものなどを例示することができる。５員又は６員環の窒素含有複素環を構成する炭素原子に結合する置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等のアルキル基や、フェニル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，４−キシリル基等のアリール基や、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基等のアルコキシ基や、カルボキシル基や、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基や、シアノ基、水酸基、アミノ基や、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子などを挙げることができ、かかる窒素含有複素環の置換基は窒素含有複素環とオルト縮合環を形成してもよい。かかる置換基が窒素含有複素環とオルト縮合環を形成した場合の一般式（Ｉ）におけるＡで表される窒素含有複素環としては、具体的には、インドリン、イソインドリン、インドール、イソインドール、インダゾール、２Ｈ−インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチアゾリン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、１，８−ナフチリジン等から一つの水素を除いたもの等を例示することができる。
【００４０】
また、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される窒素含有複素環としては、ｎは０、１又は２のいずれかの整数を表す共役系であり、Ａで表される窒素含有複素環と同一又は異なっていてもよい５員又は６員の窒素含有複素環であることが好ましい。かかる一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、上記一般式（Ｉ）におけるＡで表される窒素含有複素環と同様の窒素含有複素環を挙げることができ、ピロリジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール等や、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン等の複素環から水素原子一つを除いたものなどを例示することができる。５員又は６員環の窒素含有複素環を構成する炭素原子に結合する置換基としては、具体的には、上述のＡで表される窒素含有複素環における置換基と同様のものを挙げることができ、かかる窒素含有複素環の置換基は窒素含有複素環とオルト縮合環を形成してもよい。かかる置換基が窒素含有複素環とオルト縮合環を形成した場合一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、インドリン、イソインドリン、インドール、イソインドール、インダゾール、２Ｈ−インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、１，８−ナフチリジン等から一つの水素を除いたものなどを例示することができる。
【００４１】
また、本発明の一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物中、Ｘ⁻は薬学的に許容しうるアニオンを示し、ハロゲンイオン、スルホン酸イオン、スルファミン酸イオン、水酸化物イオン等を挙げることができ、具体的には、ハロゲンイオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等を例示することができ、スルホン酸イオンとしては、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、２−ヒドロキシエタンスルホン酸イオン等の脂肪族及び芳香族スルホン酸イオン等を例示することができ、スルファミン酸イオンとしては、シクロヘキサンスルファミン酸イオンを例示することができ、その他、メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオン等の硫酸イオン、硫酸水素イオン、ホウ酸イオン、アルキル及びジアルキルりん酸イオン、カルボン酸イオン、炭酸イオン等を挙げることができる。薬学的に許容し得るアニオンの好ましい具体例としては塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、吉草酸イオン、クエン酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、乳酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、水酸化物イオン等が挙げられ、これらのうち特に、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかが好ましい。
【００４２】
上記のような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物としては、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を、好ましい具体例として挙げることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物として、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（ＩＩ））、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロリド（式（ＩＩＩ））、４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（ＩＶ））等を例示することができる。
【００４３】
このような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物の製造方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法によって製造することができる。例えば、式（ＶＩＩＩ）に示すように５工程で行なわれ、一般式（Ｉ）中、Ａで表される窒素含有複素環化合物にメチルチオ基等の脱離基が導入された誘導体、例えば、２−（メチルチオ）ベンゾチアゾリン（２−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（ａ）をアニソール溶媒下、ｐ−トルエンスルホン酸メチルを用いてＮ−メチル化した誘導体（ｂ）とした後に、トリエチルアミン等の存在下、ロダニン環化合物、例えば、３−エチルロダニン（ｃ）と反応させロダニン環が導入されたメロシアニン化合物（ｄ）に変換する。さらにメロシアニン化合物（ｄ）をｐ−トルエンスルホン酸メチル等を用いてチオメチル化して誘導体（ｅ）へと変換した後に、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される共役化合物である窒素含有複素環、例えば、Ｎ−メチルピコリニウムｐ−トルエンスルホネート（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｉｃｏｌｉｎｉｕｍ　ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ｆ）等と縮合させ、最後にイオン交換することでロダシアニン系化合物（ｇ）を総収率３８％で得ることができる。
【００４４】
【化３６】

【００４５】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば、特に制限されるものではないが、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を、水、ＤＭＳО、ＤＭＦ、オリーブ油等の溶液に溶解した液剤や、使用時に適宜水等に溶解できる錠剤等とすることができる。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体、その他公知の添加剤を添加して製造できる。
【００４６】
本発明のマラリア感染症の判定方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて判定をすることができる。本発明のマラリア感染症の判定方法は、採血した血液にロダシアニン系化合物が血液に対して、１．０×１０^−７〜１．０×１０^−５モル濃度、好ましくは２．０×１０^−６モル濃度程度となるようにマラリア感染診断剤を添加して、１０分〜５時間、好ましくは１時間程度、培養（軽く振盪もしくは放置）して接触させた後、光学顕微鏡により、例えば、４５０〜４８０ｎｍの偏光フィルタを通した観察により行なうことができる。ロダシアニン系色素化合物が血液、特に、赤血球に寄生するマラリア原虫の細胞核以外の細胞小器官（オルガネラ）（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）に特異的に集積し、橙色から赤色の蛍光を発する。特に、血液中のヒトマラリア原虫や、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）においては蛍光の発光を容易に検出することができる。しかも、ロダシアニン系色素化合物はマラリア原虫が寄生する赤血球や、末梢血中の白血球等他のものには集積しないため、赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出することができる。
【００４７】
また、ロダシアニン系色素化合物による染色はマラリア原虫の細胞小器官を赤い蛍光に染色するため、細胞核を選択的に赤色以外の色に染色する染料、例えば、青色に染色するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）等を、本発明のマラリア感染診断剤と混合して用いることにより、マラリア原虫の細胞核と、小器官とをそれぞれ異なる色で染色することもできる。
【００４８】
また、本発明のマラリア原虫の染色方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて診断することができる。本発明のマラリア原虫の染色方法は、上記マラリア感染症の判別方法と同様にして、採血した血液に本発明のマラリア原虫染色剤を接触させることにより行なうことができる。
【００４９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：化合物（ＩＩ）の合成
４．０ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、５．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液５．５ｍＬを１３０℃で１．５時間攪拌した。混合物を室温に冷却後、７４ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに３．８３ｇの３−（２−プロペニル）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、０℃にて１時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶５．５１ｇを得た。この粗結晶の２．１ｇと９．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に７．５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とし、１２０℃にて１．５時間撹拌した後、室温に冷却しアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別し、アセトンで洗浄し乾燥した結果、８．６４ｇの粗結晶を得た。この粗結晶の８．６４ｇと、４．７１ｇの１−メチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと８５．０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で７．０ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、３．９４ｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は３２％であった。
ｍ．ｐ．　２４９−２５１℃；　ＩＲ　（ＫＢｒ）　ｃｍ^−１：　１０３８，　１１８９，　１０５７，　１５３９，　１６３６，　３４７１；　^１Ｈ−ＮＭＲ　（３００　ＭＨｚ，　ＤＭＳＯ−ｄ_６　）　：δ　２．２７　（３Ｈ，　ｓ），　４．０４　（６Ｈ，　ｓ），　４．６９　（２Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　４．９　Ｈｚ），　５．２７−５．３３　（２Ｈ，　ｍ），　５．８１−５．９２　（１Ｈ，　ｍ），　５．８５　（１Ｈ，　ｓ），　７．０９　（２Ｈ，　ｄ，Ｊ　＝　７．７　Ｈｚ），　７．２８　（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ　＝　７．４，　７．７　Ｈｚ），　７．４０　（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ　＝　６．５，　７．６Ｈｚ），　７．４５−７．４９　（３Ｈ，　ｍ），　７．６０　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．２　Ｈｚ），　７．８５　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　７．７　Ｈｚ），　７．９８　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．２　Ｈｚ），　８．２５　（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ　＝　７．６，　８．２　Ｈｚ），　８．６３　（１Ｈ，ｄ，　Ｊ　＝　６．５　Ｈｚ）；　Ａｎａｌ　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ_２９Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_４Ｓ_３：　Ｃ，　５９．４５；　Ｈ，　４．８１；　Ｎ，　７．４３：　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，　５９．２５，　Ｈ，　４．８０；　Ｎ，　７．２９．
【００５０】
実施例２：化合物（ＩＩＩ）の合成
２．９８ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、３．７４ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液４．１ｍＬを１２０℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、混合物に６０ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに２．６７ｇの３−エチル−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、１０℃にて４時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶４．５２ｇを得た。この粗結晶１．０２ｇと１．４７ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に１．０ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とした。これを１３０℃にて２．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後にアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別した。沈殿をアセトンで洗浄し、乾燥した結果、１．４７ｇの粗結晶を得た。
この粗結晶０．５０ｇと、１．２２ｇの１−エチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと２０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で１．７ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、０．２８ｇのｐ−トルエンスルホナート塩を得た。
メタノールに浸潤した強塩基性陰イオン交換樹脂（アルドリッチ製アンバーライトＩＲＡ−４００（Ｃｌ）を充填したイオン交換カラムに移した。４０ｍｇの上記化合物のメタノール／ジクロロメタン溶液をカラムに通し、溶出液を集めて減圧濃縮した。残渣をメタノールに加熱溶解したものに酢酸エチルを加えた。得られた沈殿を吸引濾別した後、酢酸エチルで洗浄し２５ｍｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロライドを得た。全行程の収率は３０％、ｍ．ｐ．２５３−２５７℃であった。
【００５１】
実施例３：化合物（ＩＶ）の合成
１．０ｍｌの４−メチルキノリンと１．８ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物を７０℃にて１．５時間攪拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで２．３ｇの１−メチル−４−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９１％であった。次に、この１−メチル−４−メチルキノリニウム＝ｐ−トルエンスルホナート０．１７ｇと、３−エチル４，５−ジヒドロ−５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−メチルチオ−４−オキソチアゾリウム＝ｐ−トルエンスルホンナート０．２５ｇと、２．６ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した後、７０℃で０．２１ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで０．２９ｇの４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９３％であった。
ｍ．ｐ．２６７−２６９℃；ＩＲ　（ＫＢｒ）　ｃｍ^−１：１２０８，　１５０７，　１６１６，　３３９６；　^１Ｈ−ＮＭＲ　（３００　ＭＨｚ，　ＤＭＳＯ−ｄ_６　）　δ：　１．２９　（３Ｈ，　ｔ，　Ｊ　＝　７．１　Ｈｚ），　２．２７　（３Ｈ，　ｓ），　４．１１　（３Ｈ，　ｓ），　４．２５（３Ｈ，　　ｓ），　　４．２５−４．２９　（２Ｈ，　ｑ，　Ｊ　＝　７．１　Ｈｚ），　６．８５　（１Ｈ，　ｓ），　７．１０　（２Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．２　Ｈｚ），　７．２７　（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ　＝　７．７　Ｈｚ），　　７．４７　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．２　Ｈｚ），７．５１−７．５５　（１Ｈ，　ｍ），　７．６４　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．２　Ｈｚ），　７．７６−７．８５　（２Ｈ，　ｍ），　８．００　（１Ｈ，　ｔ，Ｊ　＝　７．８　Ｈｚ），　８．１０　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ），　８．６６　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝６．９　Ｈｚ），　８．７４　（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ　＝　８．５　Ｈｚ），　；　Ａｎａｌ　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ_３１Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_４Ｓ_３・２Ｈ_２Ｏ：　Ｃ，　５８．１９；　Ｈ，　５．２０；　Ｎ，　６．５７．　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ，　５８．３１；　Ｈ，　４．９９；　Ｎ，　６．６２．
【００５２】
実施例４：ヒトマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、Ｐ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＦＣＲ−３株（ＡＴＣＣ３０９３２）を用いた。実験に用いた培地は、ろ過滅菌したＲＰＭＩ　１６４０培地で、ｐＨを７．４に合わせ、ヒト血清を１０％となるように添加した。マラリア原虫の培養は、Ｏ_２濃度５％、ＣＯ_２濃度５％、Ｎ_２濃度９０％、温度３６．５℃の条件下で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は５％にして用いた。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は０．１％とした。２４穴培養プレートを用いて培養し、培地は毎日交換し、感染率４％で植継ぎを行った。供試サンプルにはマラリア感染率が３０〜５０％になった感染血液を使用した。なお、感染率は薄層塗抹標本を作成し、ギムザ染色あるいはＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ染色を行った後、顕微鏡（油浸、１，０００×）下で計測し、マラリア原虫感染率を下記式から算出した。
マラリア原虫感染率（％）＝｛（感染赤血球数）／（総赤血球数）｝×１００
得られたヒトマラリア感染血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて１時間振盪し、染色を行なった。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図１（参考写真１参照）に示し、マラリア原虫の拡大図を図２（参考写真２参照）に示す。図１中、マラリア原虫の組織（オルガネラ）が赤い蛍光の斑点（参考写真１）として確認でき、図２中、薄赤色で囲まれた円状のものは単細胞のマラリア原虫を示し、マラリア原虫の特定の組織（オルガネラ）が赤い蛍光（参考写真２）となって確認できた。
【００５３】
比較例として、ヒトマラリア感染標本についてギムサ染色により染色を行なった。ヒトマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図３（参考写真３参照）に示す。図３中、グレーで囲まれた円状のものは赤血球を示し、黒い斑点（参考写真３）がマラリア原虫の代謝物（ヘモゾイン）を示し、それを囲む白抜きの部分が単細胞マラリア原虫を示す。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のＰ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは赤色の蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５４】
実施例５：ネズミマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉを用いた。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉマラリアに感染（感染率３０〜６０％）したＩＣＲマウスより心採血で得たネズミ血清１．０ｍＬにヘパリン１０μＬを加え、軽く振盪する。得られた血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて３０分間振盪し、染色を行った。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸　１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図４（参考写真４参照）に示す。図４中、濃い緑の円状のものは赤血球を示し、薄い緑の円状のものはマラリア原虫を示し、マラリア原虫中に赤い（黄色に呈色されている）蛍光の斑点（参考写真４）として色素が集積した組織が確認でき、細胞核が青色の点として確認できた。
【００５５】
比較例として、ネズミマラリア感染標本についてギムザ染色により染色を行なった。ネズミマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸　１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図５（参考写真５参照）に示す。図５中、薄黄色で囲まれた円状のものは赤血球を示し、赤血球中にマラリア原虫が褐色の斑点として確認された。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のマラリア原虫は赤い蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ロダシアニン系色素化合物は血液中のマラリア原虫に特異的に集積し、赤い蛍光を発するため、マラリア原虫を容易に確実に検出することができ、マラリア感染の診断を容易に且つ確実に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図２】図１に示すヒトマラリア原虫の拡大図である。
【図３】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図４】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。
【図５】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a malaria parasite staining agent and a malaria infection diagnostic agent containing a rhodacyanine dye compound as an active ingredient, a method for determining malaria infection using the same, and a method for staining malaria parasite.
[0002]
[Prior art]
Malaria is an infectious disease that develops by infecting malaria parasites injected into the human body using anopheles as a medium. Malaria parasites that infect humans include P. falciparm and P. falciparum. vivax), Plasmodium vivax (P. malariae), Ovarian malaria parasite (P. ovale), and the like. The number of patients is estimated to be 200 to 300 million people worldwide, and it is estimated that 2-3 million people die each year. I have. In recent years, mosquitoes resistant to insecticides and malaria parasites resistant to chloroquine (formula (V) (a)), which has been frequently used as a specific drug for malaria, have emerged, making it difficult to take countermeasures. As an antimalarial agent or an antimalarial compound, a novel ortho-condensed compound containing two heterocycles (for example, see Patent Document 1) or a compound having an ICAM-1 expression inhibitory action is contained as an active ingredient. (For example, see Patent Document 2), an antimalarial agent containing a nucleoside derivative such as 5'-o-sulfamoyl-2-chloroadenosine or the like as an active ingredient (for example, see Patent Document 3). , An antimalarial agent containing trichothecenes or the like as an active ingredient (for example, see Patent Document 4), an antimalarial agent containing cycloprodigiosin or the like as an active ingredient (for example, see Patent Document 5), or limino. An antimalarial drug containing phenazine as an active ingredient (see, for example, Patent Document 6) or an antimalarial drug containing a quinoline derivative or the like as an active ingredient. Malaria drug resistance overcoming agents (for example, see Patent Document 7) and antimalarial agents containing 5-fluoroorotic acid and sulfamonomethoxine as active ingredients (for example, see Patent Document 8) are known. .
[0003]
On the other hand, for malaria parasites that are resistant to chloroquine, amine compounds having a quinoline ring similar to chloroquine such as mefloquine (formula (V) (b)) and primaquine have been used. Peroxycyclic compounds such as artemisinin (formulas (V) and (c)) extracted from Japanese names: xinseng, and atobacons (formulas (V) and (d)) that inhibit cytochrome b present in mitochondria of malaria parasites Compounds with high oxidation stages, such as peroxides and quinones, have been used as effective therapeutic agents. However, it has been reported that malaria parasites that are resistant to these drugs have already appeared, and that malaria parasites that are resistant to new malaria drugs one after another have emerged and these antimalarial drugs can be used. It is thought that the day of disappearance is not so far away. In addition, quinine (formula (V) (e)), which is effective against malaria parasites, has a high possibility of causing renal failure, and quinine is currently used only as a final treatment. And no treatment could be guaranteed.
[0004]
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[0005]
The present inventors have developed a new chemotherapeutic agent having a structure completely different from that of the above antimalarial agent as an antimalarial agent effective against malaria parasites having resistance to various antimalarial agents and having few side effects. As a result of screening, a rhodacyanine dye compound (formula (VI) (a)) having a rhodanine nucleus (4-oxothiazolidine ring) exhibiting antimalarial activity comparable to chloroquine (EC ₅₀ = 70 nM, selectivity = 210) has been found to be useful and has already been reported (for example, see Patent Document 9). Furthermore, a rhodacyanine dye compound was synthesized by introducing various substituents into this rhodacyanine dye compound, and tested for antimalarial activity. As a result, an allyl group was introduced at a specific position (N-3 position) of the rhodocyanine nucleus. Compound (Formula (VI) (b)) (EC ₅₀ = 12 nM, selectivity = 1000) has been reported to have very high antimalarial activity and excellent selective toxicity (Japanese Patent Application No. 2001-220579).
[0006]
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[0007]
In the current state of treatment for such malaria infections, early detection and early treatment are important to avoid serious symptoms. In recent years, there has been a concern that malaria will flow from travelers and returnees from endemic areas, and accurate diagnostic agents and methods for infection of such individuals are needed. Hitherto, methods using Giemsa staining and acridine orange staining have been used as diagnostic methods for malaria infection. The Giemsa staining method is a method of staining cell nuclei and the like with Giemsa dye using a buffer of pH 7.2 to 7.4 after fixing blood with methanol, and the acridine orange method is a method of staining nuclei and the like using acridine orange dye. In addition, a method of diagnosing malaria infection by staining the nucleus with DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) binding to nuclear DNA is also known.
It is also known that malaria parasites are stained by basic blue 41 (Color Index No. 11154) (for example, see Patent Document 10). basic blue 41 is a monoazo compound represented by the formula (VII) and has been shown to stain malaria parasites in erythrocytes more accurately and rapidly than Giemsa dye.
[0008]
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[0009]
However, the dyes used in these known diagnostic methods stain not only malaria parasites but also parasitic erythrocytes and the like or leukocyte nuclei, so that it is clear whether they have been infected or whether they have been completely cured. Diagnosis is difficult.
[0010]
[Patent Document 1]
JP-A-2000-7673
[Patent Document 2]
JP-A-11-228446
[Patent Document 3]
JP-A-11-228422
[Patent Document 4]
JP-A-11-228408
[Patent Document 5]
JP-A-10-265382
[Patent Document 6]
JP-A-8-231401
[Patent Document 7]
JP-A-8-73355
[Patent Document 8]
JP-A-8-59471
[Patent Document 9]
JP 2000-191531 A
[Patent Document 10]
International Publication No. 85/5446 pamphlet
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a malaria parasite stain that can selectively and reliably detect malaria parasites in blood, and a malaria infection diagnostic agent capable of reliably detecting malaria parasites in blood. It is an object of the present invention to provide a method for detecting malaria infection and a method for diagnosing malaria infection, which can easily and surely detect malaria parasites parasitizing the varieties.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
In the course of the study of the antimalarial activity of the above rhodacyanine pigment compound, the present inventors selectively accumulated the rhodacyanine pigment compound in organelles of malaria parasite in blood, and caused erythrocyte tissue They found that they did not bind, and confirmed that the presence or absence of malaria parasite parasitizing erythrocytes could be detected with high accuracy by bringing the rhodocyanine dye compound into contact with peripheral blood, thereby completing the present invention.
[0013]
That is, the present invention provides a compound represented by the general formula (I):
[0014]
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[0015]
[Wherein, R ¹ And R ² Independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group; ³ Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, Represents an integer of 1 or 2, and X ⁻ Represents a pharmaceutically acceptable anion. A diagnostic agent for malaria infection characterized by containing the rhodacyanine dye compound represented by the formula (1), wherein the rhodacyanine dye compound accumulates in the organelles of the malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence to cause malaria infection. 2. The diagnostic agent for malaria infection according to claim 1 (claim 2), wherein A and B in formula (I) are independently unsubstituted or substituted. 3. The diagnostic agent for malaria infection according to claim 1 or 2, wherein the nitrogen-containing heterocyclic ring is a 6-membered or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring (claim 3). 4. The diagnostic agent for malaria infection according to claim 3, wherein the heterocyclic ring comprises a heterocyclic ring, and X in the general formula (I). ⁻ Represents any one of p-toluenesulfonic acid ion, chloride ion and hydroxide ion, the diagnostic agent for malaria infection according to any one of claims 1 to 4 (claim 5), and the general formula (I) The diagnostic agent for malaria infection according to claim 1, wherein the rhodacyanine dye compound represented by the formula (1) is a rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV). ).
[0016]
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[0017]
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[0018]
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[0019]
Further, the present invention provides a compound represented by the general formula (I):
[0020]
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[0021]
[Wherein, R ¹ And R ² Independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group; ³ Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, Represents an integer of 1 or 2, and X ⁻ Represents a pharmaceutically acceptable anion. ], Wherein the rhodacyanine dye compound is accumulated in the organelles of the malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence. The malaria parasite staining agent according to claim 7, wherein A and B are independently unsubstituted or substituted 5- or 6-membered ones in general formula (I). 9. The malaria parasite stain according to claim 7 or claim 8, wherein A represents a nitrogen-containing heterocyclic ring containing an oxygen group atom. 10. The malaria parasite stain according to claim 9 (claim 10), and X in the general formula (I). ⁻ Represents a p-toluenesulfonic acid ion, a chloride ion, or a hydroxide ion, and the malaria parasite stain (Claim 11) according to any one of claims 7 to 9 or the general formula (I) )) The rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV) is a rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV). ).
[0022]
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[0023]
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[0024]
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[0025]
The present invention provides a compound represented by the general formula (I):
[0026]
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[0027]
[Wherein, R ¹ And R ² Independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group; ³ Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, Represents an integer of 1 or 2, and X ⁻ Represents a pharmaceutically acceptable anion. A method for diagnosing malaria infection, characterized in that malaria parasites in blood are selectively stained using a malaria infection diagnostic agent containing a rhodacyanine dye compound represented by the formula (Claim 13): 14. The method for determining malaria infection according to claim 13, wherein the rhodacyanine dye compound accumulates in organelles of malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence to determine malaria infection (claim 14). The malaria infection according to claim 13 or 14, wherein in the general formula (I), A and B independently represent a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring having an unsubstituted or substituted group. The malaria infectious disease judgment method according to claim 15, wherein A represents a nitrogen-containing heterocycle containing an oxygen group atom in the method for judging disease (claim 15) or in the general formula (I). The method (Claim 16) and, in general formula (I), X ⁻ Represents any one of p-toluenesulfonic acid ion, chloride ion, and hydroxide ion, and the method for determining malaria infection according to any one of claims 13 to 16 (claim 17); 14. The method for determining malaria infection according to claim 13, wherein the rhodacyanine dye compound represented by (I) is a rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV). (Claim 18).
[0028]
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[0029]
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[0030]
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[0031]
The present invention provides a compound represented by the general formula (I):
[0032]
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[0033]
[Wherein, R ¹ And R ² Independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group; ³ Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, Represents an integer of 1 or 2, and X ⁻ Represents a pharmaceutically acceptable anion. A method for staining malaria parasites in a blood, wherein the malaria parasite is selectively stained with a malaria parasite staining agent containing the rhodacyanine dye compound represented by the formula (19). 20. The method for staining malaria parasite according to claim 19, wherein the system pigment compound accumulates in the organelles of malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence. And B is a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocycle independently having an unsubstituted or substituted group, wherein the method for staining malaria parasite according to claim 19 or 20 (claim 21), In the general formula (I), A represents a nitrogen-containing heterocyclic ring containing an oxygen group atom. The method for staining a malaria parasite according to claim 21 (claim 22); X ⁻ Represents a p-toluenesulfonic acid ion, a chloride ion, or a hydroxide ion, the method for staining malaria parasites according to any one of claims 19 to 22 (claim 23), and a general formula ( The method for staining malaria parasites according to claim 19, wherein the rhodacyanine dye compound represented by I) is a rhodacyanine dye compound represented by any of formulas (II) to (IV). Regarding item 24).
[0034]
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[0035]
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[0036]
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[0037]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The malaria infection diagnostic agent and the malaria parasite staining agent of the present invention are not particularly limited as long as they contain the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I). In the general formula (I), R ¹ And R ² Independently represents a hydrogen atom, a C1 to C8 alkyl group which may be unsubstituted or substituted, or a C6 to C8 aryl group which may be unsubstituted or substituted. The C1-C8 alkyl group may have not only a straight chain but also a branched chain, and may be a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an s-butyl group. , T-butyl group, isobutyl group, n-pentyl group, s-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, 2-methyl-n-pentyl group, n-heptyl group, 2-methyl-n- A hexyl group, an n-octyl group and the like can be exemplified. As the C6 to C8 aryl group, a phenyl group, a p-tolyl group, a 4-xyl group and the like can be exemplified. Examples of the substituent bonded to the C1 to C8 alkyl group or the C6 to C8 aryl group include a halogen atom, a hydroxyl group, an oxo group, an alkyl group, an alkoxy group, an alkoxycarbonyl group, a carboxyl group, an alkylcarbonyl group, and an aryl group. Examples thereof include a carbonyl group, an aryl group, an aralkyl group, an amino group, and an alkenyl group.
[0038]
In the general formula (I), R ³ Represents an unsubstituted or optionally substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or optionally substituted C6 to C8 aryl group, such a C1 to C8 alkyl group or As the C6-C8 aryl group, specifically, R in formula (I) ¹ And R ² And the same as the C1 to C8 alkyl group and the C6 to C8 aryl group in the above, and a methyl group, an allyl group, a benzyl group, a (2-tetrahydrofuranyl) methyl group and the like are particularly preferable.
[0039]
In the general formula (I), A is a nitrogen-containing heterocycle in which a nitrogen atom is bonded at the α-position to the carbon atom bonded to the rhodanine ring, and is the same as or different from the nitrogen-containing heterocycle represented by B. It is preferably a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring which may be optionally bonded, and further, an oxygen group atom such as sulfur, oxygen, or selenium is bonded at the α-position to the carbon atom bonded to the rhodanine ring. It is preferably a nitrogen-containing heterocyclic ring, and particularly preferably a nitrogen-containing heterocyclic ring to which a sulfur atom and an oxygen atom are bonded. Specific examples of the nitrogen-containing heterocycle represented by A in the general formula (I) include pyrrolidine, pyrrole, pyrazole, imidazole, thiazolidine, thiazole, isothiazole, 2-thiazoline, isoxazole, oxazole, 2,5-oxadiazole and the like, and piperidine, pyridine, piperazine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, 2H-1,4-thiazine, 4H-1,4-thiazine, morpholine, 4H-1,4-oxazine and the like. And those excluding two hydrogen atoms. Examples of the substituent bonded to the carbon atom constituting the 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring include an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group and a butyl group, a phenyl group and a p-tolyl group. An aryl group such as a group, a 2,3-xylyl group and a 2,4-xylyl group, an alkoxy group such as a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group and a butoxy group; a carboxyl group; a methoxycarbonyl group; Examples thereof include an alkoxycarbonyl group such as an ethoxycarbonyl group, a cyano group, a hydroxyl group, an amino group, and a halogen atom such as chlorine, bromine, and iodine. A condensed ring may be formed. When the substituent forms an ortho-condensed ring with the nitrogen-containing heterocyclic ring, the nitrogen-containing heterocyclic ring represented by A in the general formula (I) specifically includes indoline, isoindoline, indole, isoindole, Examples thereof include those obtained by removing one hydrogen from indazole, 2H-indazole, benzimidazole, benzothiazole, benzothiazoline, quinoline, isoquinoline, cinnoline, quinazoline, quinoxaline, phthalazine, 1,8-naphthyridine, and the like.
[0040]
In the general formula (I), the nitrogen-containing heterocyclic ring represented by B is a conjugated system in which n is an integer of 0, 1 or 2, and a nitrogen-containing heterocyclic ring represented by A It is preferably a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring which may be the same or different. Specific examples of the nitrogen-containing heterocyclic ring represented by B in the general formula (I) include the same nitrogen-containing heterocyclic ring as the nitrogen-containing heterocyclic ring represented by A in the general formula (I). And heterocyclic rings such as pyrrolidine, pyrrole, pyrazole, imidazole and the like, and piperidine, pyridine, piperazine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine and the like, in which one hydrogen atom is removed, and the like. Specific examples of the substituent bonded to the carbon atom constituting the 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring include the same substituents as those described above for the nitrogen-containing heterocyclic ring represented by A. The substituent of the nitrogen-containing heterocyclic ring may form an ortho-fused ring with the nitrogen-containing heterocyclic ring. When such a substituent forms an ortho-condensed ring with the nitrogen-containing heterocycle, the nitrogen-containing heterocycle represented by B in the general formula (I) is specifically exemplified by indoline, isoindoline, indole, isoindole, indazole Examples thereof include those obtained by removing one hydrogen from 2,2H-indazole, benzimidazole, quinoline, isoquinoline, cinnoline, quinazoline, quinoxaline, phthalazine, 1,8-naphthyridine, and the like.
[0041]
In the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) of the present invention, X ⁻ Represents a pharmaceutically acceptable anion and includes a halogen ion, a sulfonate ion, a sulfamate ion, a hydroxide ion, and the like. Specifically, examples of the halogen ion include a chloride ion, a bromine ion, and an iodine ion. Examples of the sulfonic acid ion include methanesulfonic acid ion, ethanesulfonic acid ion, trifluoromethanesulfonic acid ion, p-toluenesulfonic acid ion, naphthalenesulfonic acid ion, and 2-hydroxyethanesulfonic acid ion. And the like.Examples of the sulfamic acid ion include cyclohexanesulfamate ion, and other sulfate ions such as methyl sulfate ion and ethyl sulfate ion, and sulfate ions. Hydrogen ion, borate ion, Kill and dialkyl phosphate ions, may be mentioned carboxylic acid ion, a carbonate ion. Preferred specific examples of pharmaceutically acceptable anions include chloride, bromide, iodine, acetate, propionate, valerate, citrate, maleate, fumarate, lactate, succinate. Ion, tartrate ion, benzoate ion, methanesulfonate ion, ethanesulfonate ion, p-toluenesulfonate ion, hydroxide ion and the like. Among these, p-toluenesulfonate ion, chloride ion, Any of the hydroxide ions is preferred.
[0042]
As the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) as described above, a rhodacyanine dye compound represented by any of the formulas (II) to (IV) can be mentioned as a preferable specific example. That is, as the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I), 2-[{5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene) -4-oxo-3- (2-propenyl)] is used. -2-thiazolidinylidene @ methyl] -1-methylpyridinium = p-toluenesulfonate (formula (II)), 2-[{5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene)- 4-oxo-3-ethyl-2-thiazolidinylidene {methyl] -1-ethylpyridinium chloride (formula (III)), 4-[{5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazoli) Ridene) -4-oxo-3-ethyl) -2-thiazolidinylidene {methyl] -1-methylquinolium = p-toluenesulfonate (formula (IV)).
[0043]
The method for producing the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) is not particularly limited, and can be produced by a known method. For example, a derivative in which a leaving group such as a methylthio group is introduced into a nitrogen-containing heterocyclic compound represented by A in the general formula (I), such as 2 -(Methylthio) benzothiazoline (2- (methylthio) benzothiazole) (a) was converted to N-methylated derivative (b) using methyl p-toluenesulfonate in an anisole solvent, and then in the presence of triethylamine or the like. The compound is reacted with a rhodanine ring compound, for example, 3-ethylrhodanine (c) to convert to a merocyanine compound (d) into which a rhodanine ring is introduced. Further, after merocyanine compound (d) is thiomethylated with methyl p-toluenesulfonate and converted into derivative (e), nitrogen-containing heterocyclic ring which is a conjugated compound represented by B in general formula (I) For example, condensing with N-methylpicolinium p-toluenesulfonate (N-methylpicolininium p-toluenesulfonate) (f) or the like and finally performing ion exchange to obtain a rhodacyanine compound (g) in a total yield of 38%. Can be.
[0044]
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[0045]
The malaria infection diagnostic agent and the malaria parasite staining agent of the present invention are not particularly limited as long as they contain the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I). The rhodacyanine dye compound represented by I) can be made into a solution prepared by dissolving the rhodocyanine dye compound in a solution of water, DMSО, DMF, olive oil, or the like, or a tablet that can be appropriately dissolved in water or the like at the time of use. The preparation can be usually produced by adding a pharmaceutically acceptable carrier and other known additives.
[0046]
The method for determining malaria infection of the present invention can be performed using a malaria infection diagnostic agent containing the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) of the present invention. The method for determining malaria infection of the present invention comprises the steps of: ^-7 ~ 1.0 × 10 ^-5 Molarity, preferably 2.0 × 10 ^-6 After adding the malaria infection diagnostic agent so as to have a molar concentration of about 10 minutes to 5 hours, preferably about 1 hour, and culturing (lightly shaking or leaving), the mixture is contacted with an optical microscope. Observation through a 480 nm polarizing filter can be performed. The rhodacyanine dye compound specifically accumulates in the organelle other than the cell nucleus of the malaria parasite parasitizing the blood, particularly the erythrocytes, and emits orange to red fluorescence. Particularly, in human malaria parasites and murine malaria parasites (P. berghei) in blood, fluorescence emission can be easily detected. Moreover, since the rhodacyanine dye compound does not accumulate in other blood cells such as erythrocytes parasitized by malaria parasites and leukocytes in peripheral blood, malaria parasites parasites in erythrocytes can be easily and reliably detected.
[0047]
In addition, since the staining with the rhodacyanine dye compound stains the organelles of the malaria parasite with red fluorescence, a dye that selectively stains the cell nucleus with a color other than red, for example, DAPI (4 ′, 6- By using (diamidino-2-phenylindole) and the like for the malaria infection diagnostic agent of the present invention, the cell nucleus of malaria parasite and the organelle can be stained with different colors.
[0048]
In addition, the method for staining malaria parasites of the present invention can be diagnosed using a malaria parasite staining agent containing the rhodacyanine pigment compound represented by the general formula (I) of the present invention. The method for staining malaria parasites of the present invention can be performed by contacting the collected blood with the malaria parasite stain of the present invention in the same manner as in the above-described method for determining malaria infection.
[0049]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these exemplifications.
Example 1: Synthesis of compound (II)
A solution of 4.0 g of 2-methylthiobenzothiazole and 5.0 mL of an anisole solution of methyl p-toluenesulfonate in 5.5 mL was stirred at 130 ° C. for 1.5 hours. After the mixture was cooled to room temperature, 74 mL of acetonitrile was added, and 3.83 g of 3- (2-propenyl) -2-thioxo-4-thiazolidinone was further added. After the mixture was cooled to 0 ° C., 4.9 mL of triethylamine was gradually added dropwise, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour. The obtained precipitate was separated by suction filtration and washed with acetonitrile to obtain 5.51 g of crude crystals. 7.5 mL of dimethylformamide was added to a mixture of 2.1 g of the crude crystals and 9.0 mL of methyl p-toluenesulfonate to form a suspension. After stirring at 120 ° C. for 1.5 hours, the mixture was cooled to room temperature. Acetone was added, the precipitate was filtered off with suction, washed with acetone and dried, yielding 8.64 g of crude crystals. A mixture of 8.64 g of the crude crystals, 4.71 g of 1-methyl-4-methylpyridinium = p-toluenesulfonate and 85.0 mL of acetonitrile was stirred. 7.0 mL of triethylamine was added dropwise to the mixture at 70 ° C, and the mixture was stirred at 70 ° C for 1 hour. After cooling the resulting mixture to room temperature, ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off with suction and washed with cold ethyl acetate. The crude crystals were recrystallized from a mixed solvent of methanol / ethyl acetate, and 3.94 g of 2-[{5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene) -4-oxo-3- (2- Propenyl) -2-thiazolidinylidene {methyl] -1-methylpyridinium = p-toluenesulfonate was obtained. Yield was 32%.
m. p. 249-251 ° C; IR (KBr) cm ^-1 1038, 1189, 1057, 1539, 1636, 3471; ¹ H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ): Δ 2.27 (3H, s), 4.04 (6H, s), 4.69 (2H, d, J = 4.9 Hz), 5.27-5.33 (2H, m), 5.81-5.92 (1H, m), 5.85 (1H, s), 7.09 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.28 (1H, dd, J = 7. 4, 7.7 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 6.5, 7.6 Hz), 7.45-7.49 (3H, m), 7.60 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.85 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.98 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.25 (1H, dd, J = 7.2 Hz). 6, 8.2 Hz), 8.63 (1H, d, J = 6.5 Hz); Anal Calcd for C ₂₉ H ₂₇ N ₃ O ₄ S ₃ : C, 59.45; H, 4.81; N, 7.43: Found: C, 59.25, H, 4.80; N, 7.29.
[0050]
Example 2: Synthesis of compound (III)
2.98 g of 2-methylthiobenzothiazole and 3.74 mL of a methyl anisole solution of p-toluenesulfonate (4.1 mL) were stirred at 120 ° C. for 4 hours. After cooling to room temperature, 60 mL of acetonitrile was added to the mixture, and 2.67 g of 3-ethyl-2-thioxo-4-thiazolidinone was further added. After the mixture was cooled to 0 ° C, 4.9 mL of triethylamine was gradually added dropwise, and the mixture was stirred at 10 ° C for 4 hours. The resulting precipitate was filtered off with suction and washed with acetonitrile to obtain 4.52 g of crude crystals. 1.0 mL of dimethylformamide was added to a mixture of 1.02 g of the crude crystals and 1.47 mL of methyl p-toluenesulfonate to form a suspension. This was stirred at 130 ° C. for 2.5 hours. After cooling the resulting mixture to room temperature, acetone was added and the precipitate was filtered off with suction. The precipitate was washed with acetone and dried to obtain 1.47 g of crude crystals.
A mixture of 0.50 g of the crude crystals, 1.22 g of 1-ethyl-4-methylpyridinium = p-toluenesulfonate and 20 mL of acetonitrile was stirred. 1.7 mL of triethylamine was added dropwise to the mixture at 70 ° C., and the mixture was stirred at 70 ° C. for 1.5 hours. After cooling the resulting mixture to room temperature, ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off with suction and washed with cold ethyl acetate. The crude crystals were recrystallized from a mixed solvent of methanol / ethyl acetate to obtain 0.28 g of p-toluenesulfonate salt.
The solution was transferred to an ion exchange column packed with a strong basic anion exchange resin (Aldrich Amberlite IRA-400 (Cl). The eluate was collected by passing 40 mg of a methanol / dichloromethane solution of the above compound through the column. Ethyl acetate was added to a residue obtained by heating and dissolving the residue in methanol, and the obtained precipitate was separated by suction filtration, washed with ethyl acetate, and washed with 25 mg of 2-[｛5- (3-methyl-2). (3H) -Benzothiazolylidene) -4-oxo-3-ethyl-2-thiazolidinylidene {methyl] -1-ethylpyridinium chloride was obtained in a yield of 30% and m.p. .253-257 ° C.
[0051]
Example 3: Synthesis of compound (IV)
A mixture of 1.0 ml of 4-methylquinoline and 1.8 ml of methyl p-toluenesulfonate was stirred at 70 ° C. for 1.5 hours. After cooling the resulting mixture to room temperature, ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off with suction, washed with cold ethyl acetate, and dried to obtain 2.3 g of 1-methyl-4-methylquinolium = p-toluenesulfonate. The yield was 91%. Next, 0.17 g of this 1-methyl-4-methylquinolinium = p-toluenesulfonate was mixed with 3-ethyl 4,5-dihydro-5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene. ) -2-Methylthio-4-oxothiazolium = A mixture of 0.25 g of p-toluenesulfonate and 2.6 mL of acetonitrile was stirred, and 0.21 mL of triethylamine was added dropwise at 70 ° C. Stirred at C for 1 hour. After cooling the resulting mixture to room temperature, ethyl acetate was added. The precipitate was filtered off with suction, washed with cold ethyl acetate and dried, yielding 0.29 g of 4-[{5- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene) -4-oxo-3. -Ethyl-2-thiazolidinylidene {methyl] -1-methylquinolium = p-toluenesulfonate. The yield was 93%.
m. p. 267-269 ° C; IR (KBr) cm ^-1 : 1208, 1507, 1616, 3396; ¹ H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) Δ: 1.29 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.27 (3H, s), 4.11 (3H, s), 4.25 (3H, s), 4.25− 4.29 (2H, q, J = 7.1 Hz), 6.85 (1H, s), 7.10 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.27 (1H, t, J) = 7.7 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.51-7.55 (1H, m), 7.64 (1H, d, J = 8.2 Hz). ), 7.76-7.85 (2H, m), 8.00 (1H, t, J = 7.8 Hz), 8.10 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.66. (1H, d, J = 6.9 Hz), 8.74 (1H, d, J = 8.5 Hz), Anal Calcd for C ₃₁ H ₂₉ N ₃ O ₄ S ₃ ・ 2H ₂ O: C, 58.19; H, 5.20; N, 6.57. Found: C, 58.31; H, 4.99; N, 6.62.
[0052]
Example 4: Staining of human malaria infected specimen
As test malaria parasites, Falciparum FCR-3 strain (ATCC30932) was used. The medium used in the experiment was a filter-sterilized RPMI 1640 medium, the pH was adjusted to 7.4, and human serum was added to 10%. The culture of malaria parasite is O ₂ Concentration 5%, CO ₂ 5% concentration, N ₂ The test was performed under the conditions of a concentration of 90% and a temperature of 36.5 ° C. The hematocrit value (the ratio of the volume of red blood cells in the red blood cell suspension) was 5%. The initial infection rate of P. falciparum at the start of the culture was 0.1%. The cells were cultured using a 24-well culture plate, the medium was changed every day, and subculture was performed at an infection rate of 4%. The test sample used was infected blood having a malaria infection rate of 30 to 50%. The infection rate was measured using a microscope (oil immersion, 1,000 ×) after preparing a thin-layer smear and performing Giemsa staining or Diff-Qick staining, and the malaria parasite infection rate was calculated from the following equation. .
Malaria parasite infection rate (%) = {(number of infected red blood cells) / (total number of red blood cells)} × 100
To 99 μL of the obtained human malaria-infected blood sample, 1 μL of a 0.005% by weight solution of the compound obtained in Example 1 in DMS 血液 was added, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 1 hour for staining. Thereafter, the thin-layer smear prepared as a preparation was observed under an optical microscope (oil immersion, 1,000 ×) (Olympus). The stained malaria parasite is shown in FIG. 1 (see Reference Photo 1), and an enlarged view of the malaria parasite is shown in FIG. 2 (see Reference Photo 2). In FIG. 1, the tissue of malaria parasite (organelle) can be confirmed as red fluorescent spots (reference photograph 1), and in FIG. A specific tissue (organelle) was confirmed as red fluorescence (Reference Photo 2).
[0053]
As a comparative example, a human malaria infected specimen was stained by Giemsa staining. A thin smear of human malaria-infected blood was prepared, immersed in Diff-Quik solution (Sigma) and dried, and observed under an optical microscope (oil immersion, 1,000 ×) (Olympus). . FIG. 3 (see Reference Photo 3) shows the stained malaria parasite. In FIG. 3, a circle surrounded by gray indicates erythrocytes, black spots (reference photograph 3) indicate metabolites (hemosoin) of malaria parasite, and a white portion surrounding it indicates a unicellular malaria parasite. .
From the results, it was found that the rhodocyanine dye compound caused P. Falciparum emitted red fluorescence, was easily and reliably stained, and was found to be applicable to the diagnosis of malaria infection.
[0054]
Example 5: Staining of murine malaria infected specimen
As test malaria parasites, berghei was used. P. Heparin (10 μL) is added to 1.0 mL of murine serum obtained by cardiac blood sampling from ICR mice infected with berghei malaria (infection rate: 30 to 60%), and shaken gently. 1 μL of a 0.005% by weight solution of the compound obtained in Example 1 in DMSＤＭ was added to 99 μL of the obtained blood sample, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 30 minutes to perform staining. Thereafter, the prepared thin layer smear was prepared and observed under an optical microscope (oil immersion 1,000 ×) (Olympus). The stained malaria parasite is shown in FIG. 4 (see Reference Photo 4). In FIG. 4, dark green circles indicate red blood cells, light green circles indicate malaria parasites, and red (yellow colored) fluorescent spots in the malaria parasite (Reference Photo 4). ), A tissue in which the dye was accumulated was confirmed, and the cell nucleus was confirmed as a blue dot.
[0055]
As a comparative example, a mouse malaria infected specimen was stained by Giemsa staining. A thin-layered smear of murine malaria-infected blood was prepared, immersed in Diff-Quik solution (Sigma) and dried, and observed under an optical microscope (oil immersion 1,000 ×) (Olympus). The stained malaria parasite is shown in FIG. 5 (see Reference Photo 5). In FIG. 5, a circle surrounded by light yellow indicates red blood cells, and malaria parasites were confirmed as brown spots in the red blood cells.
From the results, it was found that the malaria parasite in erythrocytes emitted red fluorescence by the rhodacyanine dye compound, which was easily and reliably stained, and can be applied to the diagnosis of malaria infection.
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, the rhodacyanine dye compound specifically accumulates in malaria parasites in blood and emits red fluorescence, so that malaria parasites can be easily and reliably detected, and the diagnosis of malaria infection can be easily and easily performed. It can be performed reliably.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing human malaria parasites stained with the malaria infection diagnostic agent of the present invention.
FIG. 2 is an enlarged view of the human malaria parasite shown in FIG.
FIG. 3 is a view showing a human malaria parasite stained with a conventional malaria infection diagnostic agent.
FIG. 4 is a diagram showing a murine malaria parasite stained with the malaria infection diagnostic agent of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing a murine malaria parasite stained with a conventional malaria infection diagnostic agent.

Claims

General formula (I)

[In the formula, ^{R 1} and ^{R 2} independently represent a C6~C8 aryl groups having C1~C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted group having a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted group, ^{R 3} Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, 1 or an integer 2, X ^- represents an anion pharmaceutically acceptable. A diagnostic agent for malaria infection, comprising the rhodacyanine dye compound represented by the formula:

The malaria infection diagnostic agent according to claim 1, wherein the rhodacyanine dye compound accumulates in the organelles of malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence to enable diagnosis of malaria infection.

The diagnostic agent for malaria infection according to claim 1 or 2, wherein, in the general formula (I), A and B independently represent a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring having an unsubstituted or substituted group. .

The malaria infection diagnostic agent according to claim 3, wherein in the general formula (I), A represents a nitrogen-containing heterocyclic ring containing an oxygen group atom.

In the general formula (I), X ^- is, p- toluenesulfonate ion, chloride ion, malaria diagnostic agent according to any one of claims 1 to 4, characterized in that represent either a hydroxide ion.

The malaria infection diagnostic agent according to claim 1, wherein the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) is a rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV). .

General formula (I)

[In the formula, ^{R 1} and ^{R 2} independently represent a C6~C8 aryl groups having C1~C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted group having a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted group, ^{R 3} Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, 1 or an integer 2, X ^- represents an anion pharmaceutically acceptable. A malaria parasite staining agent comprising the rhodacyanine dye compound represented by the formula:

The malaria parasite staining agent according to claim 7, wherein the rhodacyanine dye compound accumulates in organelles of the malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence.

The malaria parasite dye according to claim 7 or 8, wherein in the general formula (I), A and B independently represent a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring having an unsubstituted or substituted group. .

The malaria parasite staining agent according to claim 9, wherein in the general formula (I), A represents a nitrogen-containing heterocyclic ring containing an oxygen group atom.

In the general formula (I), X ^- is, p- toluenesulfonate ion, chloride ion, Plasmodium stain according to any one of claims 7-9, characterized in that represents either a hydroxide ion.

8. The malaria parasite staining agent according to claim 7, wherein the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) is a rhodacyanine dye compound represented by any of the formulas (II) to (IV). .

General formula (I)

[In the formula, ^{R 1} and ^{R 2} independently represent a C6~C8 aryl groups having C1~C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted group having a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted group, ^{R 3} Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, 1 or an integer 2, X ^- represents an anion pharmaceutically acceptable. ] A method for determining malaria infection, which comprises selectively staining malaria parasites in blood using the malaria infection diagnostic agent containing the rhodacyanine dye compound shown in [1].

14. The method for determining malaria infection according to claim 13, wherein the rhodacyanine dye compound accumulates in organelles of malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence to determine malaria infection.

15. The malaria infectious disease according to claim 13 or 14, wherein in the general formula (I), A and B independently represent a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocycle having an unsubstituted or substituted group. Judgment method.

The method for determining malaria infection according to claim 15, wherein in the general formula (I), A represents a nitrogen-containing heterocyclic ring containing an oxygen group atom.

In the general formula (I), X ^- is, p- toluenesulfonate ion, a chlorine ion, a determination method of malaria infection according to claim 13 to 16, characterized in that it represents either hydroxide ions .

14. The malaria infectious disease according to claim 13, wherein the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) is a rhodacyanine dye compound represented by any one of formulas (II) to (IV). Judgment method.

General formula (I)

[In the formula, ^{R 1} and ^{R 2} independently represent a C6~C8 aryl groups having C1~C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted group having a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted group, ^{R 3} Represents an unsubstituted or substituted C1 to C8 alkyl group, or an unsubstituted or substituted C6 to C8 aryl group, A and B independently represent a nitrogen-containing heterocyclic ring, n is 0, 1 or an integer 2, X ^- represents an anion pharmaceutically acceptable. A method for staining malaria parasites, comprising selectively staining malaria parasites in blood using the malaria parasite staining agent containing a rhodacyanine dye compound represented by the formula:

The method for staining a malaria parasite according to claim 19, wherein the rhodacyanine pigment compound accumulates in the organelles of the malaria parasite in erythrocytes and emits fluorescence.

21. The malaria parasite dye according to claim 19 or 20, wherein in the general formula (I), A and B independently represent a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocycle having an unsubstituted or substituted group. Method.

22. The method for staining malaria parasite according to claim 21, wherein in the general formula (I), A represents a nitrogen-containing heterocycle containing an oxygen group atom.

In the general formula (I), X ^- is, p- toluenesulfonate ion, a chlorine ion, a method of dyeing malaria parasites according to any one of claims 19 to 22, characterized in that represents either a hydroxide ion.

20. Staining of malaria parasite according to claim 19, wherein the rhodacyanine dye compound represented by the general formula (I) is a rhodacyanine dye compound represented by any of the formulas (II) to (IV). Method.