【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチニンの測定に使用する試験片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床医療の分野において、腎機能の指標として優れることからクレアチニンの測定が行われている。
【０００３】
前記クレアチニンの測定方法としては、例えば、化学法や酵素法が一般的であり、前記化学法としては、例えば、クレアチニンがアルカリ条件下でピクリン酸と反応して、橙赤色に呈色する性質を利用したヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）法（例えば、非特許文献１参照。）や、ピクリン酸の代りに３，５−ジニトロ安息香酸を使用する Ｂｅｎｅｄｉｃｔ・Ｂｅｈｒｅ 法（例えば、非特許文献２参照。）等が採用されている。一方、前記酵素法としては、クレアチニンに酵素を作用させてアンモニアを生成し、これを比色法で測定するクレアチニンデアミナーゼ法や、クレアチニナーゼでクレアチニンをクレアチンに変換し、このクレアチンをサルコシンオキシダーゼやペルオキシダーゼで処理し、比色法で測定するクレアチニンアミドヒドロラーゼ法（クレアチニナーゼ法）（例えば、非特許文献３参照。）等が採用されている。
【０００４】
【非特許文献１】
ホ゛ンスネスおよびタウスキイ（Ｂｏｎｓｎｅｓ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｋｙ）、シ゛ャーナルオフ゛ハ゛イオロシ゛カルケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ）、１９４５年、１５８、ｐ．５８１
【非特許文献２】
ヘ゛ネテ゛ィクトおよびヘ゛ーレ（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ａｎｄ Ｂｅｈｒｅ）、シ゛ャーナルオフ゛ハ゛イオロシ゛カルケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ）、１９３６年、１１３、ｐ．５１５
【非特許文献３】
タンカ゛ネリら（Ｔａｎｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．）、クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ）、１９８２年、２８、ｐ．１４６１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記ヤッフェ法や Ｂｅｎｅｄｉｃｔ 法は、化学的縮合反応を用いているため、使用する試薬コストは非常に安い。しかし、その反応が、反応温度を、例えば、３５℃以上に上げなければ反応し難いことから、高温で長時間（例えば、１０分以上）の反応を必要とする。さらに、強アルカリ条件（ｐＨ１１以上）で反応させるために、強アルカリ試薬を使用するので、測定のために特別な装置や冶具等が必要となり、測定後の廃液処理も大きな問題であった。
【０００６】
一方、前記酵素法は、前述の化学法に比べて、例えば、中性付近の温和な条件で反応が進み、クレアチニンに対する特異性も高く、化学法の欠点の大部分が解決されている。しかし、例えば、使用する酵素の価格が非常に高く、また、使用する酵素の種類も多いために、試薬コストが高く、微量測定ができる特殊な施設以外での測定が困難な状況にある。
【０００７】
特に近年においては、生活習慣病である糖尿病が世界的に増加しており、これに伴なって、その合併症の一つである糖尿病性腎症や、ひいては重篤な腎不全が増加している。このような疾患に対しては、例えば、腎透析や腎移植が必要となるという問題がある。したがって、このような腎症、特に糖尿病性腎症を、早期に防止するためにも、腎機能の指標であるクレアチニンを、安全で、しかも迅速かつ簡便に測定する新たな測定方法が望まれている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、クレアチニン測定に使用する試験片の提供である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のクレアチニン測定用試験片は、多孔質材に、少なくとも下記式（１）で表わされる化合物を含有させた試験片である。
【化２】
前記式（１）において、Ｘは、Ｈ、ＣＯＯＹまたはＳＯ３Ｙであり、Ｙは、Ｈ、ＮａまたはＫである。
【００１０】
本発明者らは、クレアチニンの新たな測定方法を開発すべく、錯体生成剤と金属との呈色錯体生成反応において、クレアチニンの共存により、競合的に錯体生成反応をおこさせ、前記呈色錯体の退色を利用して、クレアチニン量を測定することを試みた。この結果、前記式に表わされる化合物によれば、クレアチニン非存在の場合は遷移金属との呈色錯体を形成するが、クレアチニンが存在すると、クレアチニンによって前記呈色錯体の形成が阻害され、クレアチニンと前記遷移金属とが非呈色錯体を形成することを、本発明者らが初めて見出したのである。したがって、このような化合物を含有させた本発明の試験片によれば、例えば、前記多孔質材内における前記呈色錯体の形成の有無や程度を測定することによって、クレアチニンによる前記呈色錯体の形成阻害の程度がわかり、これによって試料中のクレアチニン量を求めることが可能になる。また、本発明の試験片を用いた測定は、例えば、室温での反応が可能であることから、従来の酵素法のように、酵素の至適温度に温度を調節する必要もなく、かつ短時間での反応が可能であるため、迅速かつ容易に行うことができる。このため、腎機能の指標としてのクレアチニンの測定方法として、臨床医療の分野等に有用である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の試験片は、前述のように多孔質材に、少なくとも前記式（１）で表わされる化合物を含有させた試験片である。
【００１２】
前記化合物としては、中でも、下記式（２）、下記式（３）および下記式（４）の化合物が好ましい。
【００１３】
【化３】
【００１４】
なお、前記式（２）の化合物名は、フェニルフルオロン（Ｐｈｅｎｙｌ ｆｌｕｏｒｏｎｅ；以下「ＰＦ」という）であり、前記式（３）の化合物名は、ｏ−ヒドロキシヒドロキノンフタレイン（ｏ−Ｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ｐｈｔｈａｌｅｉｎ；以下「Ｑｎｐｈ」という）、前記式（４）の化合物名は、スルフォフェニルフルオロン（Ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌｕｏｒｏｎｅ；以下「ＳＰＦ」という）である。
【００１５】
前記各化合物の製造方法は、特に制限されず、従来公知の合成方法によって製造できる。前記ＰＦは、例えば、公知方法によって合成してもよいし、市販の製品（例えば、ナカライ社製）を使用してもよい。前記Ｑｎｐｈは、例えば、「 Ｈ． Ｇｉｌｍａｎ， Ｒ． Ａｄａｍｓ， Ｃ． Ｓ． Ｍａｒｖｅｌ， Ｈ． Ｔ． Ｃｌａｒｋｅ， Ｃ． Ｒ． Ｎｏｌｌｅｒ， Ｊ． Ｂ． Ｃｏｎａｎｔ， Ｆ． Ｃ． Ｗｈｉｔｍｏｒｅ， Ｃ． Ｆ． Ｈ． Ａｌｌｅｎ， ”Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ， ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅ １”， １９６７， ｐ．３１７， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）」、「Ｃ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ， Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ．， ３４， ２２９９ （１９０１）」、「Ｊ． Ｔｈｉｅｌｅ ａｎｄ Ｃ． Ｊａｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ．， ３４， ２６１７ （１９０１）」、「Ｗ． Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍ． Ｄｕｔｏｉｔ， Ｃｈｅｍ． Ｂｅｒ．， ３４， ２６３７ （１９０１）」、「Ｊ． Ｖｒｂｓｋｙ ａｎｄ Ｊ． Ｆｏｇｌ， Ｃｌｌｅｃｔ． Ｃｚｅｃｈ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３５， ２４９７ （１９７０）」等の文献の記載に基づいて合成できる。また、前記ＳＰＦは、例えば、Ｓａｎｏの方法（Ｈ． Ｓａｎｏ、 Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， ３１， ９７４ （１９５８））等によって製造できる。
【００１６】
本発明の試験片において、前記多孔質材は、さらに前記化合物と呈色錯体を形成する金属またはその塩（以下、「金属」ともいう）を含有することが好ましい。
【００１７】
前記金属としては、例えば、遷移金属またはこれらの塩が好ましく、前記遷移金属としては、例えば、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｕ（ＶＩ）、Ｚｒ（ＩＶ）、Ｔｉ（ＩＶ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｏ（ＶＩ）、Ｓｎ（ＩＶ）等またはこれらの塩があげられ、この中でも好ましくはＣｕ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）であり、より好ましくはＰｄ（ＩＩ）である。また、これらの塩としては、ハロゲン化物、硫酸塩のような水溶性の高いものが好ましい。
【００１８】
前記化合物と金属との組み合わせとしては、例えば、ＱｎｐｈとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、ＰＦとＣｕ（ＩＩ）との組み合わせ、ＳＰＦとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ等があげられ、この中でも好ましくは、ＱｎｐｈとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせ、ＳＰＦとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせであり、より好ましくはＱｎｐｈとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせである。
【００１９】
本発明の試験片において、前記多孔質材は、さらに緩衝剤を含有することが好ましい。前記緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が使用でき、好ましくは、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩であり、より好ましくはリン酸塩である。
【００２０】
本発明の試験片において、例えば、前記式（１）に表わされる化合物と金属とから形成される呈色錯体の安定性を制御できることから、前記多孔質材は、さらに、界面活性剤を含有することが好ましい。つまり、界面活性剤の存在によって、前記呈色錯体の安定性を調整できるということは、クレアチニンが存在する場合に、金属と前記化合物との呈色錯体形成よりも、金属とクレアチニンとが錯体を形成する競合反応を起し易くなるため、金属とクレアチニンとの反応性を向上できるということである。このため、クレアチニンの測定をより一層精度良く行うことができる。
【００２１】
前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、およびカチオン系界面活性剤等が使用でき、これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２２】
前記ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、Ｔｒｉｔｏｎ系、Ｔｗｅｅｎ系、Ｂｒｉｊ系等が使用でき、この中でも好ましくはＰＶＡ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ８０であり、より好ましくはＰＶＡである。
【００２３】
前記アニオン系界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が使用でき、この中でも好ましくはＳＤＳ、コール酸ナトリウムであり、より好ましくはＳＤＳである。
【００２４】
前記カチオン系界面活性剤としては、例えば、臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ゼフィラミン等が使用でき、この中でも好ましくは臭化ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、より好ましくは臭化ベンジルトリメチルアンモニウムである。
【００２５】
前述のように界面活性剤は、いずれか一種類でもよいが、二種以上を併用してもよい。その組み合わせとしては、例えば、ノニオン系とアニオン系との組み合わせ、具体的にはＰＶＡとＳＤＳの組み合わせ、Ｔｗｅｅｎ８０とコール酸ナトリウムとの組み合わせ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００とＳＤＳとの組み合わせ等があげられる。また、ノニオン系とカチオン系との組み合わせとしては、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０と臭化ベンジルトリメチルアンモニウムとの組み合わせ、ＰＶＰと臭化セチルトリメチルアンモニウムとの組み合わせ等があげられる。
【００２６】
また、界面活性剤は、例えば、前述のように前記式（１）の化合物と金属とから形成される呈色錯体の安定性や、発色性に影響するため、前記化合物および金属の種類に応じて適宜決定することが好ましい。
【００２７】
本発明の試験片において、前記多孔質材の種類は、特に制限されず、例えば、ろ紙、ガラスフィルター、樹脂製の多孔質膜等の多孔質材が使用できる。このなかで、コストや取り扱い性等の理由から、濾紙が好ましい。また、前記樹脂製多孔質膜の材料としては、例えば、ポリスルホン、ポリエステル、ナイロン、ニトロセルロース、ポリカーボネート等があげられる。そして、この多孔質材の平均孔径は、例えば、液体試料が浸透し、保持されればよく、例えば、３〜１０μｍの範囲である。
【００２８】
（実施形態１）
つぎに、本発明について、前記多孔質材に、前記式（１）の化合物、前記金属および緩衝剤を含有させた試験片の一例を示す。
【００２９】
前記多孔質材における各種試薬の含有量は、特に制限されず、試料の量等によって適宜決定できる。具体的な例としては、前記多孔質材の体積１ｃｍ３当たり、例えば、前記化合物が３×１０−３〜０．０３μｍｏｌの範囲、金属が０．０１５〜０．３μｍｏｌの範囲、緩衝剤が９〜４５μｍｏｌの範囲であり、好ましくは、前記化合物が６×１０−３〜０．０１５μｍｏｌの範囲、金属が０．０３〜０．１５μｍｏｌの範囲、緩衝剤が１２〜３０μｍｏｌの範囲の範囲である。なお、前記多孔質材１ｃｍ３当たりに添加する試料の体積は、通常、２０〜４０μｌの範囲である。
【００３０】
また、さらに界面活性剤を含有する場合は、前記多孔質材の体積１ｃｍ３当たり、例えば、３〜３００μｇの範囲であり、好ましくは１５〜１５０μｇの範囲である。
【００３１】
このような試験片は、例えば、前記各種試薬を混合した溶液を準備して、前記溶液を前記多孔質材に含浸させ、乾燥することによって調製できる。なお、前記混合溶液のｐＨは、前記緩衝剤の種類等によって調製でき、例えば、ｐＨ５〜９の範囲であることが好ましく、より好ましくは６〜８の範囲である。このように中性付近に設定できるため、例えば、塩基性物質や酸性物質を含有させる試験片とは異なり、多孔質材が損傷を受けることを防止できる。このため、安定性にも優れた試験片となる。
【００３２】
前記混合溶液における各種試薬の濃度は、例えば、前記多孔質材に保持させる前記各種試薬の設定量に応じて決定できる。例えば、前記化合物が０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、金属が０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤が０．３〜１．５ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、前記化合物が０．２〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、金属が１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、緩衝剤が０．４〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、さらに界面活性剤を含有する場合は、例えば、０．０１〜１重量％の範囲であり、好ましくは０．０５〜０．５重量％の範囲である。なお、前記多孔質材に対する前記混合溶液の含浸および乾燥を繰り返し、保持させる量を調整してもよい。
【００３３】
前記混合溶液の溶媒としては、特に制限されないが、水、緩衝液等が使用できるが、前述のように試薬として緩衝剤を含むため、前記緩衝剤を含む緩衝液を溶媒とすることが好ましい。また、例えば、エタノール、メタノール、アセトン等の有機溶媒を含むことも好ましい。
【００３４】
なお、予め、前記化合物と金属とを混合した場合、前記両者が反応して呈色錯体が形成されるが、前記混合溶液を多孔質材に含浸させても、クレアチニン含有試料を添加することによる、クレアチニンと金属との錯体形成には問題はない。なぜなら、クレアチニンは、前記両者の呈色錯体の形成阻害のみならず、すでに呈色錯体が形成されていても、この呈色錯体から前記金属を奪い、前記金属と錯体を形成する能力を有すると推測されるからである。
【００３５】
前述のように、前記混合溶液において、前記化合物と金属とが呈色錯体を形成しても、クレアチニンと金属との錯体形成には影響ない。しかし、予め呈色錯体が形成されることを抑制する場合には、例えば、前記化合物を含む溶液と、金属および緩衝剤を含む溶液を調製し、前記多孔質材への含浸および乾燥を、各溶液についてそれぞれ行えばよい。具体的には、例えば、クレアチニン測定用化合物を、金属が溶解し難い有機溶媒に溶解し、一方、金属と緩衝剤を水に溶解して水溶液を調製する。そして、前記水溶液を含浸乾燥させた後、前記有機溶媒のクレアチニン測定用化合物溶液を含浸させる。そうすれば、前記化合物と金属とが反応することなく、多孔質材中へ保持させることができる。そして、試料を添加することによって前記両者の反応が起こる。なお、試料の添加により、クレアチニン測定用化合物が溶解し易いことから、界面活性剤が共存することが好ましい。
【００３６】
また、取扱性に優れることから、各種試薬を含有する前記多孔質材を、支持体上に積層してもよい。この場合、前記支持体の材料としては、特に制限されないが、例えば、透明樹脂等が好ましい。
【００３７】
つぎに、前記試験片を用いて、液体試料のクレアチニン量を測定する一例を説明する。
【００３８】
まず、前記試験片に前記液体試料を滴下して、一定時間反応させる。前記液体試料は、前記多孔質材内部に浸透し、これによって、前記多孔質材中の前記化合物と金属とが接触し、呈色錯体を形成する。一方、前記液体試料にクレアチニンが含まれる場合には、前記クレアチニンが、前記呈色錯体の形成を阻害する。このように、前記液体試料におけるクレアチニンの有無および含有量に応じて、多孔質膜内部における前記呈色錯体の形成量は異なるため、この呈色錯体の形成の程度が、すなわちクレアチニンの有無または含有量を示すことになるのである。
【００３９】
前記反応条件は、特に限定されないが、例えば、反応温度は、１０〜４０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、反応時間は、３０秒〜５分の範囲が好ましく、より好ましくは１〜３分の範囲である。なお、室温以上の温度で反応させる場合は、測定前に、試料をさらに室温に放置しておくことが好ましい。
【００４０】
前記反応を行った後、前記呈色錯体の形成の程度、すなわち、クレアチニンによる前記呈色錯体の形成阻害の程度を測定する。これは、例えば、前記試験片を光学的に測定することによって行うことができる。一方、予め、既知濃度のクレアチニン標準溶液について、本発明の試験片により、同様にして光学的測定を行い、前記測定値とクレアチニン濃度とをプロットすることによって検量線を作成しておく。そして、前記液体試料についての測定値を前記検量線に代入することによって、試料のクレアチニン濃度を求めることができる。
【００４１】
前記試験片の光学的な測定方法としては、例えば、反射率の測定や吸光度の測定があげられる。
【００４２】
前記反射率や吸光度の測定波長は、前記化合物と金属とから形成される呈色錯体の種類によって異なるため、例えば、使用する化合物と金属との組合わせによって適宜決定できる。例えば、ＱｎｐｈとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせの場合、測定波長は、５２０〜６２０ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは５４０〜５８０ｎｍ、特に好ましくは５６０〜５７０ｎｍの範囲である。また、ＳＰＦとＰｄ（ＩＩ）との組み合わせの場合は、測定波長は、５３０〜６００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは５４０〜５８０ｎｍ、特に好ましくは５６０〜５７０ｎｍの範囲である。
【００４３】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。なお、クレアチニン測定用化合物としては、前記式（３）に示すＱｎｐｈおよび前記式（４）に示すＳＰＦを合成し、前記式（２）に示すＰＦは市販品を使用した。
【００４４】
（実施例１および２）
Ａ．ｏ−ヒドロキシヒドロキノンフタレイン（Ｑｎｐｈ）の合成
（１）１，２，４−ベンゼントリオールトリアセテート（Ｔｒｉ−Ａｃｅ）の合成
文献「Ｈ． Ｇｉｌｍａｎ， Ｒ． Ａｄａｍｓ， Ｃ． Ｓ． Ｍａｒｖｅｌ， Ｈ． Ｔ． Ｃｌａｒｋｅ， Ｃ． Ｒ． Ｎｏｌｌｅｒ， Ｊ． Ｂ． Ｃｏｎａｎｔ， Ｆ． Ｃ． Ｗｈｉｔｍｏｒｅ， Ｃ． Ｆ． Ｈ． Ａｌｌｅｎ， ”Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ， ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅ １”， １９６７， ｐ．３１７， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）．」に記載の方法に従って、下記式の反応によりＴｒｉ−Ａｃｅを合成した。
【化４】
【００４５】
まず、無水酢酸２０ｍｌと硫酸１ｍｌとの混液に、３０℃〜５０℃で、１，４−ベンゾキノン１０ｇをよく攪拌しながら添加した後、室温で３０分〜１時間放置した。ついで、さらに１０００ｍｌの水を加えて、析出した乳白色沈殿物を回収し、これを十分水洗して濾過した。得られた白色沈殿物をデシケータ中で約５時間減圧乾燥して、Ｔｒｉ−Ａｃｅを得た（収率７７．２％）。
【００４６】
（２）Ｑｎｐｈの合成
文献「Ｃ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｃｈｅｍ， Ｂｅｒ．， ３４， １９０１， ２２９９．」に記載の方法に従って、下記式の反応によりＱｎｐｈを合成した。
【化５】
【００４７】
まず、得られたＴｒｉ−Ａｃｅ １５ｇと無水フタル酸４．４ｇを混合し、これをナスフラスコ中、１４０℃〜１６０℃で、前記混合物の色調が黄黒色になるまで加熱した。ついで、この反応物に無水塩化亜鉛を約４ｇ加え、さらに蛍光性のある赤黒色となるまで加熱を続けた。そして、放冷した反応物を、５重量％の水酸化ナトリウム水溶液で溶解した後、これを濾過し、得られた濾液に３０重量％の酢酸を加えて、ｐＨ４．０付近に調整した。この溶液を冷暗所に数週間静置し、沈殿した粗生成物を濾取した。この粗生成物を、エタノール２００ｍｌと濃塩酸１ｍｌとの混合液に加えて、沸騰水浴中で、還流させながら溶解した後、濾過した。そして、得られた濾液をほぼ半量（体積）になるまで減圧濃縮した。 ついで、この濃縮液に、１／５倍量（体積）程度の水を加えてから、生じた再沈殿物を回収し、これを、さらにメタノール：エタノール：水 （５：５：２）の混合液１２０ｍｌに溶解して、数日間冷暗所に放置した。放置後、赤茶色沈殿物を採取し、これを恒量になるまで十分減圧乾燥し、３．４ｇの精製Ｑｎｐｈを得た（収率３３．７％）。
【００４８】
元素分析値（Ｃ２０Ｈ１２Ｏ７） 計算値（％） ： Ｃ ６５．９４， Ｈ ３．３２
実測値（％） ： Ｃ ６５．９４， Ｈ ３．３４
ＳＩＭＳ ： ｍ／ｚ ＝ ３６５
Ｈ１−ＮＭＲ ： ９．００ｂｒｓ， δ８．０９ｄ（１Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， δ７．７９ｔ（１Ｈ， Ｊ＝７．６Ｈｚ）， δ７．７１ｔ（１Ｈ， Ｊ＝７．６Ｈｚ）， δ７．３１ｄ（１Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， δ６．６８ｓ（２Ｈ）， δ６．１２ｓ（１Ｈ）
【００４９】
Ｂ．スルフォフェニルフルオロン（ＳＰＦ）の合成
文献「Ｈ． Ｓａｎｏ， Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ３１， １９５８， ９７４．」の記載に従って、下記式の反応によりＳＰＦを合成した。
【化６】
【００５０】
まず、前述のようにして得られたＴｒｉ−Ａｃｅ １５ｇと２−スルホベンズアルデヒドナトリウム６．０ｇとをナスフラスコに入れ、さらに、２０重量％エタノール１５０ｍｌと濃塩酸１０ｍｌとの混合液を添加し、沸騰水浴中で還流しながら、前記混合液が黒赤色になるまで加温反応させた。反応後、 数週間程度冷暗所に静置し、沈殿した粗生成物を濾取した。この粗生成物を、エタノール２００ｍｌと濃塩酸１ｍｌとの混合液に加えて、沸騰水浴中で、還流させながら溶解した後、濾過した。そして、得られた濾液をほぼ半量（体積）になるまで減圧濃縮した。 ついで、この濃縮液に、１／５倍量（体積）程度の水を加えてから、生じた再沈殿物を回収し、これを、さらにメタノール：エタノール：水 （５：５：２）の混合液１２０ｍｌに溶解して、数日間冷暗所に放置した。放置後、赤茶色沈殿物を採取し、これを恒量になるまで十分減圧乾燥し、３．８ｇの精製ＳＰＦを得た（収率３２．９％）。
【００５１】
【００５２】
Ｃ．試験片の作製
下記組成１および組成２の混合液５０ｍＬを調製し、これにろ紙（厚み０．３４ｍｍ、商品名 Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ：ワットマン社製）を含浸させた。前記ろ紙を５０℃で約１０分間乾燥した後、長さ５ｍｍ×幅５ｍｍに裁断し、ＰＥＴフィルム上に両面テープで貼り付け、これを試験片とした。組成１の混合液を含浸させた試験片を実施例１とし、組成２の混合液を含浸させた試験片を実施例２とした。
【００５３】
（混合液組成１）
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ０．５Ｍ
塩化パラジウム ２．５ｍＭ
ＳＰＦ ０．２７５ｍＭ
ポリビニルアルコール ０．１重量％
ラウリル硫酸ナトリウム ０．１重量％
エタノール ３０．０重量％
【００５４】
（混合液組成２）
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ０．５Ｍ
塩化パラジウム ２．５ｍＭ
Ｑｎｐｈ ０．２７５ｍＭ
臭化ベンジルトリメチルアンモニウム ０．１重量％
商品名Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１重量％
エタノール ３０．０重量％
【００５５】
Ｄ．クレアチニンの測定
生理食塩水、生理食塩水にクレアチニン（ナカライ社製）を溶解したクレアチニン溶液（１００ｍｇ／１００ｍＬおよび２００ｍｇ／ｍＬ）、および尿検体（ｎ＝１０）を、測定試料として準備した。そして、作製した実施例１および実施例２の前記試験片を、前記各種測定試料にそれぞれ約２秒間浸漬した後、引き上げて、室温で１分間放置した。そして、これらの試験片について、色差計（商品名Σ９０；村上色彩技術研究所製）を用いて、５６０ｎｍにおける反射率（単位％）を測定した。また、前記各種測定試料については、予め、ヤッフェ法の定量試薬（商品名クレアチニン−ＨＡテストワコー：和光純薬社製）と商品名 日立７０７０型自動分析装置（日立製作所製）を用いてクレアチニン濃度を測定しておいた。
【００５６】
図１および図２に、これらの結果を示す。両図において、ｘ軸は、各測定試料の自動分析装置によるクレアチニン濃度を示し、ｙ軸は、前記試験片を用いた各測定試料の反射率をそれぞれ示し、各試料における前記クレアチニン濃度と反射率の交点をプロットした。なお、図１は実施例１の試験片、図２に実施例２の試験片の結果である。
【００５７】
図１のグラフは、相関式（ｙ＝０．０７０ｘ＋２３）、相関係数（ｒ＝０．９３）であり、図２のグラフは、相関式（ｙ＝０．０７８ｘ＋２４）、相関係数（ｒ＝０．９２）であった。このように、ヤッフェ法で測定したクレアチニン濃度と、実施例の試験片から得られた反射率との間には、良好な相関関係が認められ、十分な信頼性でクレアチニン量を測定できることがわかる。
【００５８】
（実施例３）
Ａ．試験片の作製
多孔質材に含浸させる混合溶液の組成を下記組成とした以外は、前記実施例と同様にして、試験片を作成した。なお、前記式（１）に示す化合物としては、前記式（２）に示すフェニルフルオロン（ＰＦ）（商品名フェニルフルオロン：ナカライテスク社製）を使用した。
【００５９】
（混合液組成３）
リン酸緩衝液（ｐＨ５．５） ０．５Ｍ
硫酸銅 ２．５ｍＭ
ＰＦ ０．４ｍＭ
臭化ベンジルトリメチルアンモニウム ０．０５重量％
エタノール ３０．０重量％
【００６０】
Ｂ．クレアチニンの測定
生理食塩水、生理食塩水にクレアチニン（ナカライ社製）を溶解したクレアチニン溶液（５０ｍｇ／１００ｍｌ、１００ｍｇ／１００ｍＬ、１５０ｍｇ／１００ｍＬおよび２００ｍｇ／１００ｍＬ）を、測定試料として準備した。そして、作製した試験片を用いて、前記実施例１と同様にして反射率（単位％）を測定した。これらの結果を図３に示す。同図は、測定した反射率と、試料のクレアチニン濃度との関係を示すグラフである。
【００６１】
図３のグラフは、相関式（ｙ＝０．０７９ｘ＋１４）、相関係数（ｒ＝０．９９０）であった。このように、調製した測定試料のクレアチニン濃度と、実施例の試験片から得られた反射率との間には、良好な相関関係が認められ、十分な信頼性でクレアチニン量を測定できることがわかる。
【００６２】
【発明の効果】
以上のように、本発明のクレアチニン測定用試験片によれば、クレアチニンによる呈色錯体の生成阻害を利用して容易にクレアチニン量を測定することができる。このため、本発明の試験片は、前述のような臨床医療等において、腎機能の指標としてのクレアチニン測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクレアチニン測定用試験片の一実施例において、試験片における反射率とクレアチニン濃度との関係を示したグラフである。
【図２】本発明のクレアチニン測定用試験片のその他の実施例において、試験片における反射率とクレアチニン濃度との関係を示したグラフである。
【図３】本発明のクレアチニン測定用試験片のさらにその他の実施例において、試験片における反射率とクレアチニン濃度との関係を示したグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a test piece used for measuring creatinine.
[0002]
[Prior art]
In the field of clinical medicine, creatinine is measured because it is an excellent indicator of renal function.
[0003]
As a method for measuring creatinine, for example, a chemical method or an enzymatic method is generally used.As the chemical method, for example, creatinine reacts with picric acid under alkaline conditions to exhibit a property of giving orange-red color. The Jaffe method (for example, see Non-Patent Document 1) and the Benedict-Behre method using 3,5-dinitrobenzoic acid instead of picric acid (for example, see Non-Patent Document 2) are used. Has been adopted. On the other hand, as the enzymatic method, creatinine is reacted with an enzyme to produce ammonia, which is measured by a colorimetric creatinine deaminase method, or creatinine is converted to creatine by creatininase, and this creatine is converted to sarcosine oxidase or creatinine. The creatinine amidohydrolase method (creatininase method), which is treated with peroxidase and measured by a colorimetric method (for example, see Non-Patent Document 3), is used.
[0004]
[Non-patent document 1]
Horns and Taussky, Journal of Biochemistry, J. Biol. Chem., 1945, 158, p. 581
[Non-patent document 2]
Benedicte and Behre, Journal of Biochemical Chemistry (J. Biol. Chem), 1936, 113, p. 515
[Non-Patent Document 3]
Tanganelli et al., Clinical Chemistry (Clin. Chem.), 1982, 28, p. 1461
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Since the Jaffe method and the Benedict method use a chemical condensation reaction, the cost of the reagent used is very low. However, since the reaction is difficult to react unless the reaction temperature is raised to, for example, 35 ° C. or higher, a reaction at a high temperature for a long time (for example, 10 minutes or longer) is required. Furthermore, since a strong alkali reagent is used in order to react under strong alkali conditions (pH 11 or more), a special device or jig is required for the measurement, and waste liquid treatment after the measurement is also a serious problem.
[0006]
On the other hand, in the enzymatic method, for example, the reaction proceeds under mild conditions near neutrality and the specificity for creatinine is high, and most of the drawbacks of the chemical method have been solved, as compared with the above-mentioned chemical method. However, for example, since the price of the enzyme to be used is very high and the type of the enzyme to be used is large, the cost of the reagent is high, and it is difficult to perform the measurement at a facility other than a special facility capable of measuring a trace amount.
[0007]
In particular, in recent years, diabetes, which is a lifestyle-related disease, is increasing worldwide, and accompanying this, diabetic nephropathy, which is one of the complications, and consequently, severe renal failure are increasing. I have. For such a disease, for example, there is a problem that renal dialysis or renal transplantation is required. Therefore, in order to prevent such nephropathy, especially diabetic nephropathy, at an early stage, a new method for measuring creatinine, which is an indicator of renal function, safely, quickly and easily is desired. I have.
[0008]
Therefore, an object of the present invention is to provide a test piece used for creatinine measurement.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the test piece for creatinine measurement of the present invention is a test piece containing at least a compound represented by the following formula (1) in a porous material.
Embedded image
[0010]
The present inventors, in order to develop a new method for measuring creatinine, in the color complex formation reaction of a complex forming agent and a metal, by the coexistence of creatinine, to cause a complex formation reaction competitively, the color complex An attempt was made to measure the amount of creatinine by utilizing the color fading. As a result, according to the compound represented by the above formula, in the absence of creatinine, a color complex with a transition metal is formed, but in the presence of creatinine, the formation of the color complex is inhibited by creatinine, and creatinine and The present inventors have found for the first time that the transition metal forms a non-color complex. Therefore, according to the test piece of the present invention containing such a compound, for example, by measuring the presence or absence and the degree of the formation of the color complex in the porous material, the color complex of creatinine can be used. The extent of formation inhibition is known, which makes it possible to determine the amount of creatinine in the sample. In addition, the measurement using the test piece of the present invention can be performed at room temperature, for example, so that it is not necessary to adjust the temperature to the optimal temperature of the enzyme as in the conventional enzymatic method, and the measurement is short. Since the reaction can be performed in a short time, the reaction can be performed quickly and easily. Therefore, it is useful in the field of clinical medicine and the like as a method for measuring creatinine as an index of renal function.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The test piece of the present invention is a test piece containing at least the compound represented by the formula (1) in a porous material as described above.
[0012]
As the compound, compounds of the following formulas (2), (3) and (4) are preferable.
[0013]
Embedded image
[0014]
The compound name of the formula (2) is phenylfluorone (hereinafter, referred to as “PF”), and the compound name of the formula (3) is o-hydroxyhydroquinonephthalein (o-hydroxyhydroquinone phthalein; Hereinafter, the compound name of the formula (4) is sulfophenylfluorone (Sulfophenyl fluorone; hereinafter, referred to as “SPF”).
[0015]
The method for producing each of the compounds is not particularly limited, and can be produced by a conventionally known synthesis method. The PF may be synthesized, for example, by a known method, or a commercially available product (for example, manufactured by Nakarai) may be used. The Qnph is described, for example, in "H. Gilman, R. Adams, CS Marvel, H. T. Clarke, CR Noller, J. B. Conant, F. C. Whitemore, C. F. H. Allen, "Organic syntheses, collective volume 1", 1967, p. 317, John Wiley & Sons (New York), "C. Liebermann, Chem. 34, J.T.E. and C. Jager, Chem. Ber., 34, 2617 (1901), "W. Feuerstein and M. Dutoit, Chem. Ber., 34, 2637 (1901)", "J. Vrbs". Ky and J. Fogl, Clect. Czech. Chem. Commun., 35, 2497 (1970) "and the like. The SPF can be manufactured, for example, by the method of Sano (H. Sano, Bull. Chem. Soc. Jpn., 31, 974 (1958)).
[0016]
In the test piece of the present invention, the porous material preferably further contains a metal or a salt thereof (hereinafter, also referred to as “metal”) that forms a color complex with the compound.
[0017]
As the metal, for example, a transition metal or a salt thereof is preferable. As the transition metal, for example, Cu (II), Pd (II), U (VI), Zr (IV), Ti (IV), Mn (II), Fe (III), Co (II), Ni (II), Mo (VI), Sn (IV) and the like, and salts thereof. Of these, Cu (II) and Pd (II) are preferable. And more preferably Pd (II). As these salts, those having high water solubility such as halides and sulfates are preferable.
[0018]
Examples of the combination of the compound and the metal include a combination of Qnph and Pd (II), a combination of PF and Cu (II), and a combination of SPF and Pd (II). , Qnph and Pd (II), a combination of SPF and Pd (II), and more preferably a combination of Qnph and Pd (II).
[0019]
In the test piece of the present invention, the porous material preferably further contains a buffer. As the buffer, for example, phosphate, borate, acetate, citrate, succinate, tris (hydroxymethyl) aminomethane and the like can be used, and preferably phosphate, borate, Acetate, and more preferably phosphate.
[0020]
In the test strip of the present invention, for example, since the stability of the color complex formed from the compound represented by the formula (1) and a metal can be controlled, the porous material further contains a surfactant. Is preferred. That is, the fact that the stability of the color complex can be adjusted by the presence of the surfactant means that, when creatinine is present, the metal and creatinine form a complex more than the color complex formation of the metal and the compound. The reason for this is that it is easy to cause a competitive reaction to be formed, so that the reactivity between the metal and creatinine can be improved. For this reason, creatinine can be measured more accurately.
[0021]
The surfactant is not particularly limited, for example, a nonionic surfactant, an anionic surfactant, and a cationic surfactant can be used, and these may be used alone or in combination of two or more. May be.
[0022]
As the nonionic surfactant, for example, polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, Triton type, Tween type, Brij type and the like can be used, and among them, PVA is preferable. , Triton-X100 and Tween 80, and more preferably PVA.
[0023]
As the anionic surfactant, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium dodecylbenzenesulfonate, sodium cholate, sodium deoxycholate and the like can be used, and among these, SDS and sodium cholate are preferable. Preferably it is SDS.
[0024]
As the cationic surfactant, for example, benzyltrimethylammonium bromide, cetyltrimethylammonium bromide, benzalkonium chloride, zefiramine and the like can be used, and among these, benzyltrimethylammonium bromide and cetyltrimethylammonium bromide are preferable. And more preferably benzyltrimethylammonium bromide.
[0025]
As described above, any one type of surfactant may be used, or two or more types may be used in combination. Examples of the combination include a combination of a nonionic and an anionic compound, specifically, a combination of PVA and SDS, a combination of Tween 80 and sodium cholate, a combination of Triton-X100 and SDS, and the like. Examples of the combination of a nonionic type and a cationic type include a combination of Tween 80 and benzyltrimethylammonium bromide, and a combination of PVP and cetyltrimethylammonium bromide.
[0026]
Further, as described above, for example, as described above, the surfactant affects the stability of the color complex formed from the compound of the formula (1) and the metal, and the coloring property. It is preferable to determine it appropriately.
[0027]
In the test piece of the present invention, the type of the porous material is not particularly limited, and for example, a porous material such as a filter paper, a glass filter, a resin-made porous membrane, or the like can be used. Among them, filter paper is preferred from the viewpoints of cost, handleability, and the like. Examples of the material for the resin porous membrane include polysulfone, polyester, nylon, nitrocellulose, and polycarbonate. The average pore diameter of the porous material may be, for example, in a range of 3 to 10 μm, as long as the liquid sample penetrates and is retained.
[0028]
(Embodiment 1)
Next, with respect to the present invention, an example of a test piece in which the porous material contains the compound of the formula (1), the metal and a buffer will be described.
[0029]
The contents of the various reagents in the porous material are not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the amount of the sample and the like. As a specific example, the volume of the porous material is 1 cm. 3 For example, when the compound is 3 × 10 -3 ０．０0.03 μmol, metal in the range of 0.015 to 0.3 μmol, buffer in the range of 9 to 45 μmol, preferably 6 × 10 μmol of the compound. -3 ０．０１0.015 μmol, metal in the range of 0.03 to 0.15 μmol, and buffer in the range of 12 to 30 μmol. The porous material 1 cm 3 The volume of the sample added per unit is usually in the range of 20 to 40 μl.
[0030]
When a surfactant is further contained, the volume of the porous material is 1 cm. 3 Per hit, for example, in the range of 3 to 300 μg, preferably in the range of 15 to 150 μg.
[0031]
Such a test piece can be prepared, for example, by preparing a solution in which the various reagents are mixed, impregnating the solution with the porous material, and drying. The pH of the mixed solution can be adjusted depending on the type of the buffer and the like. For example, the pH is preferably in the range of 5 to 9, more preferably 6 to 8. As described above, since it can be set near neutral, for example, unlike a test piece containing a basic substance or an acidic substance, it is possible to prevent the porous material from being damaged. For this reason, the test piece has excellent stability.
[0032]
The concentrations of the various reagents in the mixed solution can be determined, for example, according to the set amounts of the various reagents to be retained on the porous material. For example, the compound is in the range of 0.1 to 1 mmol / L, the metal is in the range of 0.5 to 10 mmol / L, and the buffer is in the range of 0.3 to 1.5 mol / L. The range is 0.2 to 0.5 mmol / L, the metal is 1 to 5 mmol / L, and the buffer is 0.4 to 1 mol / L. When a surfactant is further contained, the content is, for example, in the range of 0.01 to 1% by weight, and preferably in the range of 0.05 to 0.5% by weight. The porous material may be repeatedly impregnated with the mixed solution and dried to adjust the amount to be retained.
[0033]
Although the solvent of the mixed solution is not particularly limited, water, a buffer, or the like can be used. However, since a buffer is contained as a reagent as described above, it is preferable to use a buffer containing the buffer as a solvent. Further, for example, it is also preferable to include an organic solvent such as ethanol, methanol, and acetone.
[0034]
When the compound and the metal are mixed in advance, the two react with each other to form a color complex.However, even when the mixed solution is impregnated into a porous material, the creatinine-containing sample is added. There is no problem in forming a complex between creatinine and a metal. This is because creatinine not only inhibits the formation of the two color complexes, but also has the ability to deprive the color complex of the metal and form a complex with the metal even if the color complex is already formed. It is because it is guessed.
[0035]
As described above, even if the compound and the metal form a color complex in the mixed solution, it does not affect the complex formation between creatinine and the metal. However, when suppressing the formation of the color complex in advance, for example, a solution containing the compound and a solution containing a metal and a buffer are prepared, and the porous material is impregnated and dried. It may be performed for each of the solutions. Specifically, for example, a compound for measuring creatinine is dissolved in an organic solvent in which a metal is hardly dissolved, while a metal and a buffer are dissolved in water to prepare an aqueous solution. Then, after the aqueous solution is impregnated and dried, it is impregnated with a creatinine measurement compound solution of the organic solvent. Then, the compound and the metal can be held in the porous material without reacting. The reaction between the two occurs by adding the sample. In addition, since the compound for creatinine measurement is easily dissolved by the addition of the sample, it is preferable that the surfactant coexists.
[0036]
Further, the porous material containing various reagents may be laminated on a support, because of excellent handling properties. In this case, the material of the support is not particularly limited, but, for example, a transparent resin is preferable.
[0037]
Next, an example of measuring the amount of creatinine in a liquid sample using the test piece will be described.
[0038]
First, the liquid sample is dropped on the test piece and reacted for a certain time. The liquid sample permeates into the porous material, whereby the compound in the porous material comes into contact with a metal to form a color complex. On the other hand, when creatinine is contained in the liquid sample, the creatinine inhibits the formation of the color complex. As described above, since the amount of the color complex formed inside the porous membrane varies depending on the presence or absence and the content of creatinine in the liquid sample, the degree of formation of the color complex is, It shows the quantity.
[0039]
Although the reaction conditions are not particularly limited, for example, the reaction temperature is preferably in the range of 10 to 40 ° C, more preferably in the range of 20 to 35 ° C, and the reaction time is preferably in the range of 30 seconds to 5 minutes. , More preferably in the range of 1 to 3 minutes. When the reaction is performed at a temperature higher than room temperature, it is preferable that the sample is further left at room temperature before the measurement.
[0040]
After the reaction, the degree of the formation of the color complex, that is, the degree of inhibition of the formation of the color complex by creatinine is measured. This can be done, for example, by optically measuring the test piece. On the other hand, a creatinine standard solution having a known concentration is optically measured in advance using the test piece of the present invention in the same manner, and a calibration curve is prepared by plotting the measured values and the creatinine concentration. Then, the creatinine concentration of the sample can be determined by substituting the measured values of the liquid sample into the calibration curve.
[0041]
Examples of the optical measurement method of the test piece include measurement of reflectance and measurement of absorbance.
[0042]
The measurement wavelength of the reflectance and the absorbance differs depending on the type of the color complex formed from the compound and the metal, and thus can be appropriately determined by, for example, a combination of the compound and the metal used. For example, in the case of a combination of Qnph and Pd (II), the measurement wavelength is preferably in the range of 520 to 620 nm, more preferably 540 to 580 nm, and particularly preferably 560 to 570 nm. In the case of a combination of SPF and Pd (II), the measurement wavelength is preferably in the range of 530 to 600 nm, more preferably 540 to 580 nm, and particularly preferably 560 to 570 nm.
[0043]
【Example】
Next, examples will be described together with comparative examples. As the creatinine measurement compound, Qnph represented by the formula (3) and SPF represented by the formula (4) were synthesized, and a commercially available PF represented by the formula (2) was used.
[0044]
(Examples 1 and 2)
A. Synthesis of o-hydroxyhydroquinonephthalein (Qnph)
(1) Synthesis of 1,2,4-benzenetriol triacetate (Tri-Ace)
References "H. Gilman, R. Adams, CS Marvel, H. T. Clarke, CR Noller, J. B. Conant, FC C. Whitemore, CF F. Allen," Organic. Syntheses, collective volume 1 ", 1967, p. 317, John Wiley & Sons (New York). Tri-Ace was synthesized by the reaction of the following formula.
Embedded image
[0045]
First, 10 g of 1,4-benzoquinone was added to a mixed solution of 20 ml of acetic anhydride and 1 ml of sulfuric acid at 30 ° C. to 50 ° C. with good stirring, and then left at room temperature for 30 minutes to 1 hour. Then, 1000 ml of water was further added to collect the precipitated milky white precipitate, which was sufficiently washed with water and filtered. The obtained white precipitate was dried under reduced pressure in a desiccator for about 5 hours to obtain Tri-Ace (yield: 77.2%).
[0046]
(2) Synthesis of Qnph
Reference "C. Lieberman, Chem, Ber., 34 , 1901, 2299. According to the method described in ", Qnph was synthesized by the reaction of the following formula.
Embedded image
[0047]
First, 15 g of the obtained Tri-Ace and 4.4 g of phthalic anhydride were mixed, and the mixture was heated in an eggplant flask at 140 to 160 ° C. until the color tone of the mixture became yellow-black. Then, about 4 g of anhydrous zinc chloride was added to the reaction product, and heating was continued until a fluorescent red-black color was obtained. Then, the cooled reaction product was dissolved in a 5% by weight aqueous sodium hydroxide solution, and then filtered. The obtained filtrate was adjusted to pH 4.0 by adding 30% by weight of acetic acid. This solution was allowed to stand in a cool and dark place for several weeks, and the precipitated crude product was collected by filtration. This crude product was added to a mixed solution of 200 ml of ethanol and 1 ml of concentrated hydrochloric acid, dissolved in a boiling water bath under reflux, and then filtered. Then, the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to approximately half (volume). Then, about 1/5 volume (volume) of water was added to the concentrated solution, and the resulting reprecipitate was collected. This was further mixed with methanol: ethanol: water (5: 5: 2). It was dissolved in 120 ml of the liquid and left in a cool dark place for several days. After standing, a reddish brown precipitate was collected and dried sufficiently under reduced pressure to a constant weight to obtain 3.4 g of purified Qnph (yield 33.7%).
[0048]
Elemental analysis value (C 20 H 12 O 7 ) Calculated value (%): C 65.94, H 3.32
Obtained value (%): C 65.94, H 3.34
SIMS: m / z = 365
H1-NMR: 9.00brs, δ8.09d (1H, J = 7.3Hz), δ7.79t (1H, J = 7.6Hz), δ7.71t (1H, J = 7.6Hz), δ7.31d (1H, J = 7.3 Hz), δ 6.68 s (2H), δ 6.12 s (1H)
[0049]
B. Synthesis of sulfophenylfluorone (SPF)
According to the description of the document “H. Sano, Bull. Chem. Soc., 31, 1958, 974.”, SPF was synthesized by the reaction of the following formula.
Embedded image
[0050]
First, 15 g of Tri-Ace obtained as described above and 6.0 g of sodium 2-sulfobenzaldehyde were placed in an eggplant-shaped flask, and a mixed solution of 150 ml of 20% by weight ethanol and 10 ml of concentrated hydrochloric acid was added, followed by boiling. While refluxing in a water bath, a heating reaction was performed until the mixture became black-red. After the reaction, the mixture was allowed to stand in a cool and dark place for several weeks, and the precipitated crude product was collected by filtration. This crude product was added to a mixed solution of 200 ml of ethanol and 1 ml of concentrated hydrochloric acid, dissolved in a boiling water bath under reflux, and then filtered. Then, the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to approximately half (volume). Then, about 1/5 volume (volume) of water was added to the concentrated solution, and the resulting reprecipitate was recovered. This was further mixed with methanol: ethanol: water (5: 5: 2). It was dissolved in 120 ml of the liquid and left in a cool dark place for several days. After standing, a reddish brown precipitate was collected and dried sufficiently under reduced pressure to a constant weight to obtain 3.8 g of purified SPF (yield 32.9%).
[0051]
[0052]
C. Preparation of test pieces
50 mL of a mixed solution of the following compositions 1 and 2 was prepared, and impregnated with filter paper (thickness 0.34 mm, Whatman 3MM, manufactured by Whatman). After the filter paper was dried at 50 ° C. for about 10 minutes, it was cut into a length of 5 mm × a width of 5 mm, and affixed on a PET film with a double-sided tape to obtain a test piece. A test piece impregnated with the mixture of composition 1 was referred to as Example 1, and a test piece impregnated with the mixture of composition 2 was referred to as Example 2.
[0053]
(Mixed liquid composition 1)
Phosphate buffer (pH 6.0) 0.5M
Palladium chloride 2.5mM
SPF 0.275mM
0.1% by weight of polyvinyl alcohol
Sodium lauryl sulfate 0.1% by weight
30.0% by weight of ethanol
[0054]
(Mixed liquid composition 2)
Phosphate buffer (pH 6.0) 0.5M
Palladium chloride 2.5mM
Qnph 0.275 mM
Benzyltrimethylammonium bromide 0.1% by weight
Brand name Tween80 0.1% by weight
30.0% by weight of ethanol
[0055]
D. Creatinine measurement
A physiological saline, a creatinine solution (100 mg / 100 mL and 200 mg / mL) in which creatinine (manufactured by Nakarai) was dissolved in a physiological saline, and a urine sample (n = 10) were prepared as measurement samples. Then, the prepared test pieces of Example 1 and Example 2 were immersed in each of the various measurement samples for about 2 seconds, pulled up, and left at room temperature for 1 minute. Then, the reflectance (unit%) at 560 nm of these test pieces was measured using a color difference meter (trade name: $ 90; manufactured by Murakami Color Research Laboratory). For the various measurement samples, the creatinine concentration was determined in advance using a quantitative reagent of the Jaffé method (product name: creatinine-HA test Wako: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and a product name: Hitachi 7070 automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Was measured.
[0056]
1 and 2 show these results. In both figures, the x-axis shows the creatinine concentration of each measurement sample by the automatic analyzer, the y-axis shows the reflectance of each measurement sample using the test piece, and the creatinine concentration and reflectance in each sample. Are plotted. FIG. 1 shows the results of the test piece of Example 1 and FIG. 2 shows the results of the test piece of Example 2.
[0057]
The graph of FIG. 1 shows the correlation equation (y = 0.070x + 23) and the correlation coefficient (r = 0.93), and the graph of FIG. 2 shows the correlation equation (y = 0.078x + 24) and the correlation coefficient (r = 0.92). Thus, a good correlation is observed between the creatinine concentration measured by the Jaffe method and the reflectance obtained from the test piece of the example, and it can be seen that the creatinine amount can be measured with sufficient reliability. .
[0058]
(Example 3)
A. Preparation of test pieces
A test piece was prepared in the same manner as in the above example, except that the composition of the mixed solution for impregnating the porous material was as follows. As the compound represented by the formula (1), phenylfluorone (PF) represented by the formula (2) (trade name: phenylfluorone: manufactured by Nacalai Tesque) was used.
[0059]
(Mixed liquid composition 3)
Phosphate buffer (pH 5.5) 0.5M
Copper sulfate 2.5mM
PF 0.4 mM
Benzyltrimethylammonium bromide 0.05% by weight
30.0% by weight of ethanol
[0060]
B. Creatinine measurement
A creatinine solution (50 mg / 100 ml, 100 mg / 100 mL, 150 mg / 100 mL, and 200 mg / 100 mL) in which creatinine (manufactured by Nakarai) was dissolved in physiological saline and physiological saline was prepared as a measurement sample. Then, the reflectance (unit%) was measured in the same manner as in Example 1 using the prepared test piece. These results are shown in FIG. FIG. 4 is a graph showing the relationship between the measured reflectance and the creatinine concentration of the sample.
[0061]
The graph in FIG. 3 shows the correlation equation (y = 0.079x + 14) and the correlation coefficient (r = 0.990). Thus, a good correlation is observed between the creatinine concentration of the prepared measurement sample and the reflectance obtained from the test piece of the example, and it can be seen that the creatinine amount can be measured with sufficient reliability. .
[0062]
【The invention's effect】
As described above, according to the test piece for measuring creatinine of the present invention, the amount of creatinine can be easily measured by utilizing the inhibition of the formation of a color complex by creatinine. For this reason, the test strip of the present invention is useful for creatinine measurement as an index of renal function in clinical medicine and the like as described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the reflectance and the creatinine concentration in a test piece in one example of the test piece for creatinine measurement of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the reflectance of the test piece and the creatinine concentration in another example of the test piece for creatinine measurement of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the reflectance of the test piece and the creatinine concentration in still another example of the test piece for creatinine measurement of the present invention.
