JP2004132796A - Fluorescence measuring method - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光性物質および該蛍光性物質により標識された核酸の高感度な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的高分子の非アイソトープ標識におけるランタノイド金属イオンキレートの使用は、基礎研究の分野および診断の分野において大きな関心を集めている。この技術は、目的のシグナルを圧倒する通常の蛍光バックグラウンドに比較して長く持続するランタノイド元素の蛍光の利益を受けることができる。特に、バックグラウンド蛍光の蛍光崩壊時間がナノ秒オーダーであるのに対して、三価ランタノイドイオンであるユウロピウム〔Ｅｕ（ＩＩＩ）〕、テルビウム〔Ｔｂ（ＩＩＩ）〕およびサマリウム〔Ｓｍ（ＩＩＩ）〕は実にミリ秒オーダーの蛍光崩壊時間を有する。
【０００３】
適切な波長およびエネルギーレベルにおいて、サンプルに照射することによりバックグラウンド蛍光は既に崩壊しているが、ランタノイドを利用した標本はなお発光しているというタイムラグを利用して当該蛍光を測定することができる。この技術は、時間分解分光法として知られている。この技術の原理については、特許文献１および２ならびに非特許文献１に詳述されている。
【０００４】
本発明者らは、このランタノイドイオンの蛍光性を核酸プローブアッセイに利用すべく種々検討を行ってきた。ランタノイドイオンの蛍光性は、一般にそれらがキレート剤によって捕獲される時に増強される。これは、水溶液中イオンの水和が放出エネルギーを劇的に消失するからである。キレート化はまた、当該イオンを検出すべき標的の近傍へ運ぶためにも必要である。従って、ランタノイド金属イオンキレートを用いてＤＮＡ／ＲＮＡあるいは遺伝子プローブの直接標識を行うことができれば、核酸プローブアッセイの検出にランタノイドイオンの蛍光性を利用することができる。
【０００５】
本発明者らは、先に特定のキレート構造を選択することにより、蛍光強度が強く安定性の高い遺伝子プローブを調製し得る蛍光性物質が得られることを見出し、その利用方法を確立した（特許文献３参照）。その蛍光性物質とは、一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ （Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）で表されるものである。
【０００６】
この蛍光性物質は従来の蛍光物質よりも蛍光強度が高く、なお且つ蛍光安定性に優れていることから、従来よりも蛍光強度が強く、安定性の高い遺伝子プローブの作製、高感度の核酸プローブアッセイが可能になった。
【０００７】
しかしながら、核酸プローブアッセイ、中でもＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等の染色体診断用途においては、蛍光強度が強ければ強いほどより高感度な検出が可能となるため、更なる高感度化が望まれる。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第４，１５０，２９５号公報
【特許文献２】
米国特許第４，０５８，７３２号公報
【特許文献３】
特開２００１−２４７８５７号公報
【非特許文献１】
Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （１９７８： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、蛍光性物質および該蛍光性物質により標識された核酸の検出感度を上げ、それにより遺伝子の高感度な解析方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の試薬組成を選択することにより、蛍光強度がより強く高感度となる遺伝子プローブの検出方法を見出し、その利用方法を確立して本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ （Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定する方法において、測定時に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光測定方法。
（２）界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記（１）記載の蛍光測定方法。
（３）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである上記（２）記載の蛍光測定方法。
（４）界面活性剤の濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ以上である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の蛍光測定方法。
（５）測定時にさらにトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドを共存させることを特徴とする上記（１）記載の蛍光測定方法。
（６）トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドの濃度が０．００２ｍＭ以上である上記（５）記載の蛍光測定方法。
【００１２】
（７）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ （Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖に取り込ませることにより標識された標識核酸に、ランタノイド金属イオンを配位させ、発する蛍光を測定する方法において、測定時に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光測定方法。
（８）界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記（７）記載の蛍光測定方法。
（９）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである上記（８）記載の蛍光測定方法。
（１０）界面活性剤の濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ以上である上記（７）〜（９）のいずれかに記載の蛍光測定方法。
（１１）測定時にさらにトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドを共存させることを特徴とする上記（７）記載の蛍光測定方法。
（１２）トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドの濃度が０．００２ｍＭ以上である上記（１１）記載の蛍光測定方法。
【００１３】
本発明において「蛍光性物質」とは、金属イオンに配位して錯体となったときに錯体由来の蛍光を発することのできる化合物をいう。
【００１４】
本発明において、「誘導体」とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味する。より具体的には４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニル〔４，４’−ｂｉｓ（１”，１”， １”， ２”， ２”， ３”， ３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”， ６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ο−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ；以下ＢＨＨＣＴとも略す〕の誘導体としては、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）テルフェニルや４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ｐ−テルフェニル等が挙げられる。
【００１５】
本発明において「スペーサー分子」とは、一般式（Ｉ）で表される蛍光性物質においてＬｎ、すなわち、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”， ２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体、およびＮ、すなわちヌクレオチドの両者に結合可能であり、当該結合によりそれらをつなぐことができる二価の基であれば特に限定されない。好適なスペーサー分子として、炭素と炭素の間に７以下のアミド結合を有していてもよい炭素数５以上２５以下の二価の脂肪族炭化水素基が挙げられる。さらに具体的には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−等が挙げられる。
【００１６】
本発明の蛍光性物質に含められるヌクレオチドとしては、種々のデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）、種々のリボヌクレオチド（ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＴＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）およびそれらの誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味し、具体的にはｄＩＴＰ、ＩＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ等が挙げられる。
【００１７】
本発明で使用可能なランタノイド金属イオンとしては、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム、ジスプロシウム等が挙げられる。一般的には塩化物の形で使用されるが、測定に支障のない範囲で他の塩類の形態として使用することができる。本発明においてはこれらのランタノイド金属イオンを単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。
【００１８】
本発明の蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体は、蛍光性物質にランタノイド金属イオンを配位させることによって調製される。当該配位工程としては、蛍光性物質を含む水溶液（緩衝液等）にランタノイド金属イオン、例えば適当な濃度のユウロピウムイオンの水溶液（緩衝液）を加える方法が例示される。添加するランタノイド金属イオンの濃度は特に限定されないが、好ましくは１０−７〜１０−１Ｍ、さらに好ましくは１０−６〜１０−２Ｍである。
【００１９】
本発明の蛍光測定方法においては、ランタノイド金属イオンから水分子へのエネルギーの漏れが減少する等の推定される原因により、蛍光強度が増強されることから界面活性剤を共存させる。本発明に用いられる界面活性剤としては、非イオン性またはイオン性のいずれでもよいが、ｐＨ等の測定条件変動への影響が少ないことから、非イオン性界面活性剤の方がより好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水疎水比（ＨＬＢ）価が高いことから、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが特に好ましい。具体例としてはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０等が挙げられる。これらの界面活性剤を単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。用いられる界面活性剤の反応液中の濃度は０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌであるが、この濃度は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）には直接関係しない。
【００２０】
本発明において、ランタノイド金属イオンから水分子へのエネルギーの漏れがさらに減少する等の推定される原因により、蛍光強度がより増強されることから測定時にトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（以下、ＴＯＰＯと略すこともある）を共存させるのが好ましい。測定時にトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドを共存させる工程は、ランタノイド金属イオンの配位と同時あるいは配位の前または後のいずれの段階で行ってもよいが、配位の効率がより高くなるため、ランタノイド金属イオンの配位後に行うのがより好ましい。共存させる濃度は０．００２〜１ｍＭであり、好ましくは０．０１〜０．１ｍＭである。
【００２１】
請求項７以降の発明におけるヌクレオチド鎖の蛍光標識方法において、本発明に用いられる蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませる工程は、試験管内酵素触媒ポリメリゼーションを利用することにより為される。具体的には、鋳型となる遺伝子ＤＮＡを基に、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す場合もある）またはポリメラーゼ・チェーン・リアクション・キットを用いて取り込ませる方法、市販のＤＮＡポリメラーゼを用いたランダムプライマー法を用いて取り込ませる方法、市販のＤＮＡポリメラーゼを用いたニックトランスレーションまたは市販のニックトランスレーションキットを用いて取り込ませる方法等がある。
【００２２】
本発明に用いられる蛍光性物質を取り込ませるヌクレオチド鎖としては、上記種々のヌクレオチドが連続したヌクレオチド鎖（ＤＮＡやＲＮＡ）を使用することができる。具体的には、当該ヌクレオチド鎖としては、細胞内に発現するｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成し得るｃＤＮＡあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、細胞内の核酸あるいは染色体の一部の特異的配列と相補的なヌクレオチド鎖を使用することができる。
【００２３】
ヌクレオチド鎖の蛍光標識方法において、ランタノイド金属イオンの蛍光性物質への配位は、当該蛍光性物質をヌクレオチド鎖に取り込ませる前であっても後であってもかまわない。すなわち、上述の如く錯体を形成させた後、当該錯体をニックトランスレーション法等を用いてヌクレオチド鎖に取り込んでも、当該蛍光性物質をニックトランスレーション法等を用いてヌクレオチド鎖に取り込ませた後で、ランタノイド金属イオンを含む水溶液（緩衝液）等に浸漬することによって、当該金属イオンを配位させてもよい。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
以下の実施例において、ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰとはＢＨＨＣＴが、炭素と窒素の合計の原子数が１１のスペーサー分子を介してｄＵＴＰと結合している蛍光性物質を意味し、特開２００１−２４７８５７号公報に従って合成した。
【００２５】
実施例１
ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ溶液（１．２５μＭ ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ＝７．４）９６μｌに、３種類の界面活性剤（０．１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）のいずれか１つまたは蒸留水を１２μｌ添加混合し、４種類の溶液を調製した。次にそれぞれの溶液に０．１ｍＭ ＥｕＣｌ３水溶液を１２μｌ添加混合した。調製した４種類の溶液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬 フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表１）。界面活性剤を添加した溶液の方が添加していない溶液に比べて蛍光強度が高くなった。
【００２６】
【表１】
実施例２
ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ溶液（６．２５μＭ ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ＝７．４）１３６μｌに、ＴＯＰＯの濃度の異なる（０ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ）水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有）をそれぞれ１７μｌ添加混合し、４種類の溶液を調製した。次にそれぞれの溶液に０．０５ｍＭ ＥｕＣｌ３水溶液を１７μｌ添加混合した。調製した４種類の溶液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬 フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表２）。ＴＯＰＯを添加した溶液の方が添加していない溶液に比べて蛍光強度が高くなった。
【００２８】
【表２】
実施例３
（１）ＰＣＲ法によるＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識ＤＮＡの調製
ＰＣＲ反応を用いＤＮＡをＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰにより標識した。鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ１９（東洋紡）、プライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ７（東洋紡）、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ８（東洋紡）を用い、以下の組成で試薬（５０μｌ）を調製した。ＰＣＲ用酵素としては、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いた。
１０ｎｇ ｐＵＣ１９
０．３μＭ 各Ｐｒｉｍｅｒ
５μｌ １０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ
３ｍＭ ＭｇＳＯ４
０．２ｍＭ ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ
０．２ｍＭ ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ ｄＣＴＰ
１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１Ｕ ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−
調製した試薬を以下の条件で反応させた。
９４℃，２分間の後、以下の３ステップを３０サイクル繰り返した。
９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、６８℃，２分３０秒間。
【００３０】
（２） ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識ＤＮＡ溶液の蛍光強度測定
反応終了後の標識反応液３０μｌからエタノール沈澱により未反応のＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰを除去した。エタノール沈澱による沈澱を７０％エタノールで洗浄して乾燥した後、９６μｌの６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）で溶解した。この溶液に３種類の界面活性剤（１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）のいずれか１つまたは蒸留水を１２μｌ添加混合し、４種類の溶液を調製した。次にそれぞれの溶液に０．１ｍＭ ＥｕＣｌ３水溶液を１２μｌ添加混合した。調製した４種類の溶液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬 フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表３）。界面活性剤を添加した溶液の方が添加していない溶液に比べて蛍光強度が高くなった。
【００３１】
【表３】
実施例４
（１）ランダムプライマー法によるＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識ＤＮＡの調製
ランダムプライマー法を用いＤＮＡをＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰにより標識した。鋳型ＤＮＡとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡）、プライマーとして５’末端をビオチン化した６ｍｅｒのランダムプライマーを用い、以下の組成で試薬（１２５μｌ）を調製した。
１１ｍｇ λ／ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ
０．２ｍＭ ５’ビオチン化ランダムプライマー
１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）
２４ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．２４ｍＭ ＤＴＴ
この調製液を９４℃で５分間熱処理を行い、処理後ただちに氷上で冷却した。氷冷後の溶液に、以下の組成となるように試薬を添加混合し、反応液（３００μｌ）を調製した。反応酵素としてＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡）を用いた。
０．０３５ｍＭ ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ
０．１ｍＭ ｄＧＴＰ
０．１ｍＭ ｄＡＴＰ
０．０６５ｍＭ ｄＴＴＰ
０．１ｍＭ ｄＣＴＰ
１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
４５Ｕ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
調製した試薬を１６℃で３時間反応させ、７０℃、１０分間の熱処理を行い、反応を停止させた。
【００３３】
（２） ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識ＤＮＡの蛍光強度測定
反応終了後の標識反応液をストレプトアビジンコート・マイクロタイタープレート（ロッシュ製）の３ウェルに９５μｌ／ウェルで分注した。３７℃で１時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートから標識反応液を除き、３５０μｌ／ウェルのトリス緩衝生理食塩水で３回洗浄を行った。標識ＤＮＡを結合させた３ウェルにそれぞれ組成の異なるユウロピウム水溶液を１００μｌ／ウェルで分注した。３種類（Ａ〜Ｃ）のユウロピウム水溶液組成は以下の通りである。Ａ：［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭ ＥｕＣｌ３］、Ｂ：［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭ ＥｕＣｌ３、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］、Ｃ：［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭＥｕＣｌ３、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０１ｍＭ ＴＯＰＯ］。遮光保存３０分間経過後に、蛍光強度を蛍光光度計（大日本製薬 フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表４）。Ｃのユウロピウム水溶液を分注したウェル、Ｂのユウロピウム水溶液を分注したウェル、Ａのユウロピウム水溶液を分注したウェルの順で蛍光強度が高かった。
【００３４】
【表４】
【発明の効果】
本発明の方法を利用することにより、高感度な核酸プローブアッセイが可能になる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescent substance and a highly sensitive method for detecting a nucleic acid labeled with the fluorescent substance.
[0002]
[Prior art]
The use of lanthanide metal ion chelates in non-isotopic labeling of biological macromolecules has attracted great interest in the fields of basic research and diagnostics. This technique can benefit from the long lasting lanthanoid fluorescence compared to the normal fluorescent background that overwhelms the signal of interest. In particular, while the fluorescence decay time of background fluorescence is on the order of nanoseconds, trivalent lanthanoid ions europium [Eu (III)], terbium [Tb (III)] and samarium [Sm (III)] Indeed, it has a fluorescence decay time on the order of milliseconds.
[0003]
At the appropriate wavelength and energy level, the background fluorescence is already decayed by illuminating the sample, but the time lag that the lanthanoid-based sample is still emitting light can be used to measure the fluorescence. . This technique is known as time-resolved spectroscopy. The principle of this technique is described in detail in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1.
[0004]
The present inventors have made various studies to utilize the fluorescence of this lanthanoid ion for nucleic acid probe assays. The fluorescence of lanthanoid ions is generally enhanced when they are captured by the chelating agent. This is because the hydration of the ions in the aqueous solution dramatically reduces the energy released. Chelation is also necessary to bring the ions closer to the target to be detected. Therefore, if DNA / RNA or a gene probe can be directly labeled using a lanthanoid metal ion chelate, the fluorescence of a lanthanoid ion can be used for detection of a nucleic acid probe assay.
[0005]
The present inventors have previously found that by selecting a specific chelate structure, it is possible to obtain a fluorescent substance capable of preparing a gene probe having high fluorescence intensity and high stability, and has established a method for using the same. Reference 3). The fluorescent substance is represented by the general formula (I)
Ln-SN (I)
(Wherein Ln is 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″ -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedione-6 ″ -yl) ) Chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, S represents a spacer molecule, and N represents a nucleotide).
[0006]
Since this fluorescent substance has a higher fluorescence intensity than conventional fluorescent substances and is superior in fluorescence stability, preparation of a gene probe having higher fluorescence intensity and higher stability than in the past, and a highly sensitive nucleic acid probe Assay is enabled.
[0007]
However, in nucleic acid probe assays, in particular, in chromosome diagnostic applications such as CGH (Comparative Genomic Hybridization), the higher the fluorescence intensity, the higher the sensitivity of detection, so further higher sensitivity is desired.
[0008]
[Patent Document 1]
US Patent No. 4,150,295 [Patent Document 2]
U.S. Pat. No. 4,058,732 [Patent Document 3]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-247857 [Non-Patent Document 1]
Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Knapp et al. eds. (1978: Elsevier / North Holland Biomedical Press)
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to increase the detection sensitivity of a fluorescent substance and a nucleic acid labeled with the fluorescent substance, thereby providing a highly sensitive gene analysis method.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have assiduously studied and, as a result, have found a method for detecting a gene probe that has a higher fluorescence intensity and a higher sensitivity by selecting a specific reagent composition, and establishes a method of using the same to complete the present invention. Reached.
[0011]
That is, the present invention is as follows.
(1) General formula (I)
Ln-SN (I)
(Wherein Ln is 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″ -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedione-6 ″ -yl) ) Chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, S represents a spacer molecule, and N represents a nucleotide.)
A method for measuring the fluorescence emitted by a complex of a fluorescent substance and a lanthanoid metal ion represented by the formula: wherein a surfactant is present in the measurement.
(2) The fluorescence measurement method according to the above (1), wherein the surfactant is a nonionic surfactant.
(3) The method according to (2), wherein the nonionic surfactant is polyoxyethylene alkylphenyl ether or polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester.
(4) The fluorescence measurement method according to any one of the above (1) to (3), wherein the concentration of the surfactant is 0.01 mg / ml or more.
(5) The fluorescence measurement method according to the above (1), wherein tri-n-octylphosphine oxide is further co-present during the measurement.
(6) The method according to (5), wherein the concentration of tri-n-octylphosphine oxide is 0.002 mM or more.
[0012]
(7) General formula (I)
Ln-SN (I)
(Wherein Ln is 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″ -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedione-6 ″ -yl) ) Chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, S represents a spacer molecule, and N represents a nucleotide.)
In a method of coordinating a lanthanoid metal ion to a labeled nucleic acid labeled by incorporating a fluorescent substance represented by a nucleotide chain into a nucleotide chain, and measuring the emitted fluorescence, a surfactant is co-present during the measurement. Fluorescence measurement method.
(8) The fluorescence measurement method according to the above (7), wherein the surfactant is a nonionic surfactant.
(9) The method according to (8), wherein the nonionic surfactant is a polyoxyethylene alkylphenyl ether or a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester.
(10) The fluorescence measurement method according to any one of the above (7) to (9), wherein the concentration of the surfactant is 0.01 mg / ml or more.
(11) The fluorescence measurement method according to the above (7), wherein tri-n-octylphosphine oxide is further co-present during the measurement.
(12) The fluorescence measurement method according to (11), wherein the concentration of tri-n-octylphosphine oxide is 0.002 mM or more.
[0013]
In the present invention, the term “fluorescent substance” refers to a compound capable of emitting fluorescence derived from a complex when coordinated with a metal ion to form a complex.
[0014]
In the present invention, the “derivative” means a compound synthesized so as to substitute or add a compound such as a functional group to the basic structure. More specifically, 4,4'-bis (1 ", 1", 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4", 6 "-hexanedione-6" -yl) Chlorosulfo-o-terphenyl [4,4'-bis (1 ", 1", 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4", 6 "-hexanedion-6" -yl) -Chlorosulfo-o-terphenyl (hereinafter abbreviated as BHHCT)], 4,4'-bis (1 ", 1", 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4" , 6 "-hexanedione-6" -yl) terphenyl and 4,4'-bis (1 ", 1", 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4", 6 ""-Hexanedione-6" -yl) chlorosulfo-p-terphenyl and the like.
[0015]
In the present invention, the “spacer molecule” is Ln in the fluorescent substance represented by the general formula (I), that is, 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3). ", 3" -heptafluoro-4 ", 6" -hexanedione-6 "-yl) chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, and N, ie, a nucleotide, which can bind to both. There is no particular limitation on the divalent group that can be connected. Suitable spacer molecules include divalent aliphatic hydrocarbon groups having 5 to 25 carbon atoms which may have an amide bond of 7 or less between carbon atoms. More specifically, -CH = CH-CO-NH -CH 2 -CH 2 -NH- (CO-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NH) 2 -, - CH = CH —CH 2 —NH—CO— (CH 2 ) 5 —NH— and the like.
[0016]
The nucleotides included in the fluorescent substance of the present invention include various deoxyribonucleotides (dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP), various ribonucleotides (rATP, rGTP, rTTP, rCTP, rUTP) and derivatives thereof. Can be Here, the derivative means a compound synthesized so as to substitute or add a compound such as a functional group to the basic structure, and specific examples thereof include dITP, ITP, and 7-deaza-dGTP.
[0017]
Lanthanoid metal ions usable in the present invention include europium, samarium, terbium, dysprosium and the like. Generally, it is used in the form of chloride, but can be used in the form of other salts as long as the measurement is not hindered. In the present invention, these lanthanoid metal ions can be used alone or in combination of two or more.
[0018]
The complex of the fluorescent substance and the lanthanoid metal ion of the present invention is prepared by coordinating the fluorescent substance with the lanthanoid metal ion. An example of the coordination step is a method of adding an aqueous solution (buffer solution) of a lanthanoid metal ion, for example, europium ion at an appropriate concentration to an aqueous solution (buffer solution or the like) containing a fluorescent substance. The concentration of the lanthanoid metal ion to be added is not particularly limited, but is preferably 10 −7 to 10 −1 M, and more preferably 10 −6 to 10 −2 M.
[0019]
In the fluorescence measurement method of the present invention, a surfactant is coexisted because the fluorescence intensity is increased due to a presumed cause such as a decrease in leakage of energy from the lanthanoid metal ion to the water molecule. The surfactant used in the present invention may be either non-ionic or ionic, but non-ionic surfactants are more preferable because they have little effect on fluctuations in measurement conditions such as pH. Among the nonionic surfactants, polyoxyethylene alkylphenyl ether or polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester is particularly preferable because of its high hydrophilic-hydrophobic ratio (HLB) value. Specific examples include Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40, and the like. These surfactants can be used alone or in combination of two or more. The concentration of the surfactant used in the reaction solution is 0.01 to 50 mg / ml, preferably 0.1 to 10 mg / ml, but this concentration is not directly related to the critical micelle concentration (CMC).
[0020]
In the present invention, the fluorescence intensity is further enhanced due to a presumed cause such as a further decrease in the leakage of energy from the lanthanoid metal ion to the water molecule. Therefore, at the time of measurement, tri-n-octylphosphine oxide (hereinafter referred to as TOPO) (May be abbreviated). The step of coexisting tri-n-octylphosphine oxide at the time of measurement may be performed simultaneously with or before or after the coordination of the lanthanoid metal ion, but the coordination efficiency becomes higher. More preferably, it is performed after the coordination of the lanthanoid metal ion. The coexisting concentration is 0.002 to 1 mM, and preferably 0.01 to 0.1 mM.
[0021]
In the method for fluorescently labeling a nucleotide chain in the invention according to claim 7 or later, the step of incorporating the fluorescent substance used in the present invention into the nucleotide chain is performed by utilizing in vitro enzyme-catalyzed polymerization. Specifically, based on a gene DNA serving as a template, the gene DNA is incorporated using a commercially available polymerase chain reaction using a heat-resistant polymerase (hereinafter, sometimes abbreviated as PCR) or a polymerase chain reaction kit. And a method using a random primer method using a commercially available DNA polymerase, a method using a commercially available nick translation using a DNA polymerase, or a method using a commercially available nick translation kit.
[0022]
As the nucleotide chain for incorporating the fluorescent substance used in the present invention, a nucleotide chain (DNA or RNA) in which the above various nucleotides are continuous can be used. Specifically, the nucleotide chain includes a cDNA or an antisense oligonucleotide capable of specifically forming a hybrid with mRNA expressed in a cell. In addition, a nucleotide chain complementary to a nucleic acid in a cell or a specific sequence of a part of a chromosome can be used.
[0023]
In the fluorescent labeling method of a nucleotide chain, the lanthanoid metal ion may be coordinated with the fluorescent substance before or after incorporating the fluorescent substance into the nucleotide chain. That is, after forming a complex as described above, even if the complex is incorporated into a nucleotide chain using a nick translation method or the like, after the fluorescent substance is incorporated into the nucleotide chain using a nick translation method or the like, Alternatively, the metal ion may be coordinated by immersion in an aqueous solution (buffer solution) containing a lanthanoid metal ion.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically and in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
In the following examples, BHHCT-11-dUTP means a fluorescent substance in which BHHCT is bonded to dUTP via a spacer molecule having a total of 11 atoms of carbon and nitrogen, and is disclosed in JP-A-2001-247857. The synthesis was carried out in accordance with Japanese Patent Publication No.
[0025]
Example 1
In 96 μl of BHHCT-11-dUTP solution (1.25 μM BHHCT-11-dUTP, 62.5 mM Tris-HCl, pH = 7.4), three kinds of surfactants (0.1 mg / ml Triton X-100, 0) were added. 0.1 mg / ml Tween 20, 0.1 mg / ml Nonidet P-40) or 12 μl of distilled water was added and mixed to prepare four kinds of solutions. Was then mixed 12μl added 0.1 mM EuCl 3 solution in each solvent liquid. The fluorescence intensities of the four prepared solutions were measured with a fluorometer (Dainippon Pharmaceutical Fluoroscan II) under the conditions of an excitation wavelength of 315 nm and a fluorescence wavelength of 612 nm after 30 minutes of storage under light shielding (Table 1). The fluorescence intensity of the solution to which the surfactant was added was higher than that of the solution to which no surfactant was added.
[0026]
[Table 1]
Example 2
136 μl of a BHHCT-11-dUTP solution (6.25 μM BHHCT-11-dUTP, 62.5 mM Tris-HCl, pH = 7.4) was added with different TOPO concentrations (0 mM, 0.02 mM, 0.1 mM, 0.2 mM). 5 mM) aqueous solution (containing 10 mg / ml Triton X-100) was added and mixed in an amount of 17 μl to prepare four types of solutions. Next, 17 μl of 0.05 mM EuCl 3 aqueous solution was added to each solution and mixed. The fluorescence intensities of the four prepared solutions were measured after 30 minutes of storage under light-shielded conditions using a fluorometer (Dainippon Pharmaceutical Fluoroscan II) under the conditions of an excitation wavelength of 315 nm and a fluorescence wavelength of 612 nm (Table 2). The fluorescence intensity of the solution to which TOPO was added was higher than that of the solution to which TOPO was not added.
[0028]
[Table 2]
Example 3
(1) Preparation of BHHCT-11-dUTP-labeled DNA by PCR method DNA was labeled with BHHCT-11-dUTP using a PCR reaction. Using pUC19 (Toyobo) as a template DNA and M13 Primer P7 (Toyobo) and M13 Primer P8 (Toyobo) as primers, a reagent (50 μl) was prepared with the following composition. KOD-Plus- (Toyobo) was used as an enzyme for PCR.
10 ng pUC19
0.3 μM each Primer
5 μl 10 × PCR Buffer
3 mM MgSO 4
0.2 mM BHHCT-11-dUTP
0.2 mM dGTP
0.2 mM dATP
0.2 mM dTTP
0.2 mM dCTP
1mg / ml Triton X-100
1U KOD -Plus-
The prepared reagent was reacted under the following conditions.
After 2 minutes at 94 ° C., the following three steps were repeated for 30 cycles.
94 ° C, 15 seconds, 55 ° C, 30 seconds, 68 ° C, 2 minutes 30 seconds.
[0030]
(2) Measurement of fluorescence intensity of BHHCT-11-dUTP-labeled DNA solution After the reaction was completed, unreacted BHHCT-11-dUTP was removed from 30 μl of the labeling reaction solution by ethanol precipitation. The precipitate obtained by ethanol precipitation was washed with 70% ethanol, dried, and then dissolved in 96 μl of 62.5 mM Tris-HCl (pH = 7.4). To this solution, 12 μl of one of three kinds of surfactants (1 mg / ml Triton X-100, 1 mg / ml Tween 20, 1 mg / ml Nonidet P-40) or 12 μl of distilled water was added and mixed. Was prepared. Next, 12 μl of a 0.1 mM EuCl 3 aqueous solution was added to each solution and mixed. The fluorescence intensities of the four prepared solutions were measured after 30 minutes of light-shielding storage under a condition of an excitation wavelength of 315 nm and a fluorescence wavelength of 612 nm using a fluorometer (Dainippon Pharmaceutical Fluoroscan II) (Table 3). The fluorescence intensity of the solution to which the surfactant was added was higher than that of the solution to which no surfactant was added.
[0031]
[Table 3]
Example 4
(1) Preparation of BHHCT-11-dUTP-labeled DNA by random primer method DNA was labeled with BHHCT-11-dUTP using the random primer method. Using λ / HindIII digest (Toyobo) as a template DNA and a 6-mer random primer with a 5 ′ end biotinylated as a primer, a reagent (125 μl) was prepared with the following composition.
11mg λ / HindIII digest
0.2 mM 5 'biotinylated random primer 120 mM Tris-HCl (pH 7.4)
24 mM MgCl 2
0.24 mM DTT
This preparation was heat-treated at 94 ° C. for 5 minutes, and immediately cooled on ice after the treatment. A reagent was added to the solution after ice cooling so as to have the following composition and mixed to prepare a reaction solution (300 μl). Klenow Fragment (Toyobo) was used as a reaction enzyme.
0.035 mM BHHCT-11-dUTP
0.1 mM dGTP
0.1 mM dATP
0.065 mM dTTP
0.1 mM dCTP
1mg / ml Triton X-100
45U Klenow Fragment
The prepared reagent was reacted at 16 ° C. for 3 hours, and heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes to stop the reaction.
[0033]
(2) Measurement of fluorescence intensity of BHHCT-11-dUTP-labeled DNA After completion of the reaction, the labeling reaction solution was dispensed at 95 μl / well into three wells of a streptavidin-coated microtiter plate (Roche). After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the labeling reaction solution was removed from the microtiter plate, and the plate was washed three times with 350 μl / well of Tris-buffered saline. An aqueous europium solution having a different composition was dispensed at 100 μl / well into each of the three wells to which the labeled DNA was bound. The compositions of the three (A to C) europium aqueous solutions are as follows. A: [50 mM Tris-HCl, pH = 7.4, 0.1 mM EuCl 3 ], B: [50 mM Tris-HCl, pH = 7.4, 0.1 mM EuCl 3 , 0.1 mg / ml Triton X-100 ], C: [50 mM Tris-HCl, pH = 7.4, 0.1 mM MEuCl 3 , 0.1 mg / ml Triton X-100, 0.01 mM TOPO]. After 30 minutes from the light-shielded storage, the fluorescence intensity was measured with a fluorometer (Dainippon Pharmaceutical Fluoroscan II) under the conditions of an excitation wavelength of 315 nm and a fluorescence wavelength of 612 nm (Table 4). The fluorescence intensity was higher in the order of the well to which the aqueous solution of europium C was dispensed, the well to which the aqueous solution of europium B was dispensed, and the well to which the aqueous solution of europium A was dispensed.
[0034]
[Table 4]
【The invention's effect】
By utilizing the method of the present invention, a highly sensitive nucleic acid probe assay can be performed.
Claims (12)
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ （Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定する方法において、測定時に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光測定方法。General formula (I)
Ln-SN (I)
(Wherein Ln is 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″ -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedione-6 ″ -yl) ) Chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, S represents a spacer molecule, and N represents a nucleotide.)
A method for measuring the fluorescence emitted by a complex of a fluorescent substance and a lanthanoid metal ion represented by the formula: wherein a surfactant is present in the measurement.
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ （Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖に取り込ませることにより標識された標識核酸に、ランタノイド金属イオンを配位させ、発する蛍光を測定する方法において、測定時に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光測定方法。General formula (I)
Ln-SN (I)
(Wherein Ln is 4,4′-bis (1 ″, 1 ″, 1 ″, 2 ″, 2 ″, 3 ″, 3 ″ -heptafluoro-4 ″, 6 ″ -hexanedione-6 ″ -yl) ) Chlorosulfo-o-terphenyl or a derivative thereof, S represents a spacer molecule, and N represents a nucleotide.)
In a method of coordinating a lanthanoid metal ion to a labeled nucleic acid labeled by incorporating a fluorescent substance represented by a nucleotide chain into a nucleotide chain, and measuring the emitted fluorescence, a surfactant is co-present during the measurement. Fluorescence measurement method.
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN104694117A (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Ratio-type fluorescent probe based on carbon dot as well as preparation method and application thereof |
| CN113667469A (en) * | 2021-10-21 | 2021-11-19 | 中国计量大学 | Preparation method for improving X-ray detection performance of scintillator |
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| CN113667469A (en) * | 2021-10-21 | 2021-11-19 | 中国计量大学 | Preparation method for improving X-ray detection performance of scintillator |
| CN113667469B (en) * | 2021-10-21 | 2024-03-01 | 中国计量大学 | Preparation method for improving X-ray detection performance of scintillator |
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