JP2004129608A

JP2004129608A - New protein having cell recognition and/or cytoclastic activity

Info

Publication number: JP2004129608A
Application number: JP2002299342A
Authority: JP
Inventors: Akio Ito; 伊藤　明夫; Sakae Kitada; 北田　栄; Michio Oba; 大庭　道夫; Yoshitomo Kusaka; 日下　芳友; Kenjiro Masutomi; 桝富　賢二朗; Kiyouko Kuwano; 桑野　今日子; Yutaka Sakai; 酒井　裕; Masashi Yamagiwa; 山際　雅詩; Hidekazu Mizushiro; 水城　英一; Tetsuyuki Akao; 赤尾　哲之
Original assignee: Kyushu University NUC; Fukuoka Prefecture
Current assignee: Kyushu University NUC; Fukuoka Prefecture
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2004-04-30

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a protein capable of specifically recognizing and/or destructing a specific cell, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a transformed host cell containing the vector and a pharmaceutical composition containing the above substances as active component. <P>SOLUTION: A protein has an amino acid sequence expressed by a specific sequence and a protein containing amino acids of the above sequence wherein one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the sequence and having cell recognition activity and/or cytoclastic activity (in activated state). Further, a DNA has a nucleotide sequence encoding the specific amino acid sequence, and a DNA hybridizing with a DNA composed of a nucleotide sequence complimentary to the former DNA under stringent condition and having cell recognition activity and/or cytoclastic activity (in activated state). <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物由来の有用なタンパク質に関し、詳細すれば、バチルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：以下、ＢＴと略称することがある）Ａ１５４７株由来である、細胞認識及び細胞破壊能を持った新規タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードしている遺伝子配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バチルス・チューリンジエンシスは、１９０１年に日本人研究者の石渡繁胤氏によって蚕の病原細菌として発見された。以来、本細菌が生産する殺虫活性を持つ結晶タンパク質は、微生物殺虫剤として幅広く農業害虫、衛生害虫の防除に利用されてきた。
【０００３】
これまでの研究によって、殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、アルカリによる可溶化後、必要に応じてプロテアーゼ処理によって活性化され、昆虫に対する毒性を発揮することが知られている。殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、（１）プロテアーゼによって活性化された状態において昆虫細胞に選択的な破壊活性を示すＣｒｙタンパク質（通常、活性化形態では分子量６０〜７５ｋＤａ）、及び（２）昆虫の細胞に対して非選択的な破壊活性を有し、かつ赤血球の溶血活性を有するＣｙｔタンパク質（通常、活性化形態では分子量２２〜３０ｋＤａ）に分類されることが明らかになっている。
【０００４】
細胞認識タンパク質としてのバチルス・チューリンジエンシスの結晶性タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質に代表される選択性の高さ、数十の遺伝子型に基づく多様性の豊富さ、及び原核生物由来のタンパク質であるが故の遺伝子改変のし易さという、抗体等他の細胞認識タンパク質にない優れた特徴を持っている。しかし、その用途は、昆虫細胞を標的とした殺虫剤としての利用に限定されている。また、殺虫活性を有する結晶性タンパク質を発現している菌株は、ＢＴのうちわずか３０〜４０％にすぎず、ＢＴ菌株が生産する殺虫活性を有しない結晶性タンパク質の持つ性質については、これまで不明であった。
【０００５】
本発明者らは、土壌、耕地土壌、森林土壌，養蚕農家塵埃、貯穀塵埃、病死昆虫、植物、淡水等から分離された、５０種のＨ血清型と未知の血清型に属する約２０００株のバチルス・チューリンジエンシス菌株を用いて、そしてバチルス・チューリンジエンシス菌株に由来する活性が不明であった毒素タンパク質の中に、アルカリによる可溶化後にプロテアーゼによって活性化されると、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）を選択的に認識及び破壊する一群の新規タンパク質が存在することを世界に先駆けて明らかにした（例えば、特許文献１及び２を参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−２２２４９８号公報
【特許文献２】
特開２０００−２８１７００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）に対して選択的な認識活性及び障害活性を有する、一群のバチルス・チューリンジエンシス菌に由来する新規タンパク質のうち、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株の生産する毒素タンパク質についてアミノ酸配列及びそれをコードしている遺伝子配列を明らかにした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、以下に示される通りである。
（１）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（３）記載のＤＮＡ。
（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（５）記載のＤＮＡ。
（７）配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（８）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（９）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（９）記載のＤＮＡ。
（１１）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１２）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１１）記載のＤＮＡ。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１記載のＤＮＡを含有するベクター。
（１４）上記（１３）記載のベクターを含有する形質転換体。
（１５）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１６）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質。
（１７）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１６）記載のタンパク質。
（１８）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質。
（１９）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１８）記載のタンパク質。
（２０）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２１）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞認識活性を有するタンパク質。
（２２）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（２１）記載のタンパク質。
（２３）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞障害活性を有するタンパク質。
（２４）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（２３）記載のタンパク質。
（２５）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
（２６）上記（１５）〜（１７）及び（２０）〜（２２）のいずれか１記載のタンパク質を含有する細胞標識剤。
（２７）上記（１５）、（１８）〜（２０）及び（２３）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を含有する抗癌剤。
（２８）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質に対する抗体。
（２９）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質を発現する細胞を培養する工程；及び
（ｂ）該タンパク質を回収する工程；
を包含する、方法。
（３０）上記（１５）〜（１７）及び（２０）〜（２２）のいずれか１記載のタンパク質が認識する細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞認識活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（３１）上記（１５）、（１８）〜（２０）及び（２３）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞障害活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（３２）（ｃ）該タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含する、上記（３０）又は（３１）記載の方法。
（３３）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質に対して親和性を有する物質を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質と被験物質とを接触させる工程；
（ｂ）該被験物質が、該タンパク質に対して親和性を有するか否かを決定する工程；
を包含する方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質を提供する。本発明はさらに、配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質を提供する。好ましくは、本発明の上記タンパク質は、溶血活性を有しない。さらに、本発明は、上記タンパク質のうち少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも１５個、さらに好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸からなるペプチドを提供する。
【００１０】
「細胞障害活性」とは、特定の細胞を特異的に破壊する能力をいう。例えば、ＭＴＴアッセイ等の方法によって測定する場合に、特定の細胞に対する細胞障害活性が、ネガティブコントロールに対する細胞障害活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞障害活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示さない任意の細胞が挙げられる。
【００１１】
また、本発明のタンパク質は、特定の細胞を特異的に認識し、かつ破壊することによって、特定の細胞に対して特異的な細胞障害活性を示す。従って、本発明のタンパク質は、特異的な「細胞認識活性」を有する。例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析により測定した場合に、特定の細胞に対する細胞認識活性が、ネガティブコントロールに対する細胞認識活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞認識活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示さない任意の細胞が挙げられる。当業者は、ネガティブコントロールとして使用し得る細胞を適宜選択することができる。
【００１２】
細胞認識活性は、例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析などによって測定される。免疫沈降アッセイでは、細胞の溶解液（リガンドの標的を含む）にリガンド（本発明の場合には、Ａ１５４７タンパク質）とその抗体及びプロテインＡビーズを加え、標的−リガンド−抗体−プロテインＡビーズ複合体を形成させて、遠心して分離する。この複合体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットを行い、標的を同定する。当業者は、これら一連の実験条件を適切に設定可能である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析では、細胞上の標的を含む膜画分又は標的自体をセンサー表面に固定化し、これに作用する試料（本発明の場合にはＡ１５４７タンパク質）を、マイクロ流量系を介して添加して、センサー表面で起こる分子の結合及び解離により生じる微量な質量変化を、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）シグナルの変化としてリアルタイムに検出する。得られたデータから反応速度論の解析を行なう。免疫沈降アッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析の詳細については、細胞工学別冊　実験プロトコールシリーズ　タンパク質実験プロトコール１（１）機能解析編（秀潤社、１９９７年）を参照のこと。細胞障害活性を測定するアッセイの例示として免疫沈降アッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析を挙げたが、当業者は、これら以外のアッセイを使用して、細胞認識活性を測定することが可能である。
【００１３】
「活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質」とは、特定の条件下で処理される場合に（例えば、アルカリ条件下、並びにアルカリ条件下及びプロテアーゼによって処理される場合に）、上記の活性を有する形態（活性形態）に変換される不活性形態（前駆体）のタンパク質、並びに特定の条件下で処理されなくとも上記の活性を有するタンパク質（即ち、最初から活性形態で存在するタンパク質）をいう。例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、特定の処理に付されない限り通常は不活性形態で存在するが、アルカリ条件下、又はアルカリ条件下及びプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）によって処理されると活性形態のタンパク質（約３０〜３１ｋＤａ）に変換され、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するようになる。従って、配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質は、活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質である。しかし、特定の処理を施さずとも、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質は、その状態で活性形態であるとされる。尚、本発明においては、「細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質」は、特定の処理に付されることを必要としない。
【００１４】
本発明のタンパク質が特異的に認識及び／又は破壊する細胞としては、脊椎動物由来の細胞、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル等）に由来する細胞が挙げられる。例えば、ヒトに由来する細胞として、Ｔ細胞（例えば、正常Ｔ細胞、白血病Ｔ細胞（好ましくはＭＯＬＴ−４及びＪｕｒｋａｔ細胞）、前骨髄性白血病細胞（好ましくはＨＬ６０細胞））、子宮細胞（好ましくは、子宮頸癌細胞を除く子宮癌細胞及び子宮由来の正常平滑筋細胞、より好ましくはＳａｗａｎｏ細胞及びＵｔＳＭＣ細胞）、肝細胞（好ましくは肝癌細胞、より好ましくはＨｅｐＧ２細胞）、肺細胞（好ましくは正常胎児繊維芽細胞、より好ましくはＭＲＣ−５細胞）、及び結腸細胞（好ましくは結腸腺癌細胞、より好ましくはＣＡＣＯ−２細胞）が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、例えば、ヒト以外の哺乳動物の細胞では、マウス由来の繊維芽細胞（好ましくはＮＩＨ３Ｔ３細胞）を認識及び／又は破壊することができる。しかし、当業者は、上に挙げた以外の細胞に対しても、本発明のタンパク質が細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有することを理解する。また本発明のタンパク質は、これら活性を単独で、又は複数組み合わせて有していてもよい。例えば、本発明のタンパク質は、前骨髄性白血病細胞及び肝癌細胞の障害活性、又は前骨髄性白血病細胞の障害活性及び肝癌細胞の認識活性を有する。本発明のタンパク質には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる不活性形態のタンパク質に加え、当該タンパク質をアルカリ処理して得られるタンパク質、及びアルカリ処理に加えてプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）処理することによって得られる活性形態のタンパク質（約３０〜３１ｋＤａ）（例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質）も含まれる。これらアルカリ処理及びプロテアーゼ処理の条件及び手順は、当業者が適宜設定し得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等によって活性形態（約３０〜３１ｋＤａ）タンパク質（例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質）が得られたか否かを確認することができる。より具体的には、これら処理条件及び手順は、実施例に記載の方法に従う。
【００１５】
また、「溶血活性を有しない」とは、哺乳動物（例えば、ウサギ、ヒツジ及びヒト等、好ましくはヒト）の赤血球に対して実質的に溶血活性を有しないことをいい、具体的には、実施例４に記載の方法を使用した場合に、対照実験との吸光度と比較して吸光度差が０．５以下の場合に溶血活性がないものとされる。本発明のタンパク質としては、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有し、かつ溶血活性を有しないタンパク質が好ましい。好ましくは、本発明のタンパク質は、バチルス属に由来するタンパク質であり、より好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスに由来するタンパク質であり、さらに好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０４６；当該株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１　中央第６）に寄託されている、原寄託日平成１４年９月２６日）に由来するタンパク質である。
【００１６】
本発明のタンパク質以外の他の細胞認識タンパク質としては、例えば、免疫グロブリンが挙げられる。しかし本発明のタンパク質は、免疫グロブリンと比較して非常に低分子量であり、かつ原核生物由来のタンパク質であるため改変し易い等の利点を有する。上記特徴に加え、本発明のタンパク質は、非常に選択性が高いため薬物送達システムにも利用され得る。例えば、本発明のタンパク質は、他の物質との融合によって、特異的な指向性をその物質に付与し得る。本発明のタンパク質は優れた選択性を有することから、免疫グロブリン（抗体）と同様にターゲッティング療法に使用され得ることが理解される。
【００１７】
本発明のタンパク質は、抗癌剤として使用され得る。抗癌剤としての使用において、本発明のタンパク質は単独でも有効であるが、効果を増強するために、他の抗癌剤との複合体（共有結合性でも非共有結合性でもよい）又は併用剤としても使用され得る。例えば、免疫グロブリンと抗癌剤との複合体が報告されているが、本発明のタンパク質も同様に、他の抗癌剤との複合体として使用され得る。また、本発明のタンパク質は、放射性同位体（例えば、^１３１Ｉ）で標識され得る。例えば、^１３１Ｉで標識された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体での治療によって、Ｂ細胞リンパ腫患者において非常に良好な結果が得られたことが報告されている。本発明のタンパク質も同様に、^１３１Ｉで標識されると癌細胞に対する破壊効果が増強され得る。また、本発明のタンパク質は、毒素（例えば、リシン）との複合体として使用され得る。例えば、抗ＣＤ５抗体とリシンＡ鎖との複合体によって、Ｔ細胞リンパ腫の患者において顕著な効果が確認されたとの報告がある。本発明のタンパク質も同様に、リシンＡ鎖との複合体として使用され得る。本発明の抗癌剤は、本発明のタンパク質が特異的に破壊する癌細胞から構成される癌に対して治療効果を発揮する。
【００１８】
また、本発明のタンパク質は、細胞標識剤としても使用され得る。例えば、インビボでの適用において、本発明のタンパク質は、適切な画像化物質（例えば、核磁気共鳴により検出される物質）で標識することによって、腫瘍（特定の癌細胞からなる）を画像化し得る。腫瘍の画像化に使用される放射性同位体としては、例えば、イットリウム、インジウム、テクネチウム等が挙げられる。当業者は、被験体に注射する放射線量を適宜設定することができる。インビトロでの適用においては、本発明のタンパク質は、例えば、特定の細胞に対するマーカーとして使用される。本発明の細胞標識剤は、本発明のタンパク質が特異的に認識する細胞に対して用いられる。
【００１９】
本発明は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、好ましくは、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを提供する。本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡは、溶血活性を有しないタンパク質をコードする。
【００２０】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡのうち少なくとも約２０個、好ましくは約１８個、より好ましくは少なくとも約１６個、最も好ましくは少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを提供する。これらオリゴヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明により提供される。また、本発明は、本発明のＤＮＡを増幅するためのプライマー対を提供する。このプライマー対は各々、センス鎖又はアンチセンス鎖に相補的である、少なくとも２０個以上、好ましくは少なくとも１５個以上のオリゴヌクレオチドの対からなる。
【００２１】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。例えば、「ストリンジェントな条件」におけるハイブリダイゼーション反応や洗浄の条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄する条件が挙げられる。尚、相同性の程度は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ検索をデフォルトで使用することによって算定される。
【００２２】
本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞は、（ａ）培養培地中で、任意の細胞と上記タンパク質とをインキュベートする工程；及び（ｂ）上記タンパク質が上記細胞に対する細胞障害活性を有するか否かを決定する工程を包含する方法によって同定される。好ましくは、この同定方法は、上記タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含していてもよい。例えば、ＭＴＴアッセイ等の方法によって測定する場合に、ネガティブコントロールよりも有意に破壊される細胞を、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞とみなす。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示さない任意の細胞が挙げられる。また、ポジティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す任意の細胞が挙げられ、ポジティブコントロールと同程度又はそれよりも破壊される細胞が、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞としてより好ましい。本発明のタンパク質は、例えば、医学的な目的のために、この方法によって同定された細胞に関連する疾患に対して適用される。
【００２３】
本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞は、（ａ）培養培地中で、任意の細胞と上記タンパク質とをインキュベートする工程；及び（ｂ）上記タンパク質が上記細胞に対する細胞認識活性を有するか否かを決定する工程を包含する方法によって同定される。好ましくは、この同定方法は、上記タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含していてもよい。例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析により測定した場合に、ネガティブコントロールよりも有意に認識される細胞を、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞とみなす。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示さない任意の細胞が挙げられる。当業者は、ネガティブコントロールとして使用し得る細胞を適宜選択することができる。また、ポジティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す任意の細胞が挙げられ、ポジティブコントロールと同程度又はそれよりも認識される細胞が、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞としてより好ましい。本発明のタンパク質は、例えば、医学的な目的のために、この方法によって同定された細胞に関連する疾患に対して適用される。
【００２４】
本発明はまた、本発明のタンパク質に対して親和性を有する物質を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記タンパク質と被験物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記被験物質が、上記タンパク質に対して親和性を有するか否かを決定する工程を包含する。本発明のタンパク質と接触される被験物質の例としては、糖類、脂質、タンパク質、核酸、合成化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。また、好ましい親和性としては、１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満又は１０^−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）を有する親和性が挙げられる。かかる親和性は、例えば、本発明のタンパク質を放射性同位体で標識し、次いで被験物質との結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）に供することにより測定される。本発明のタンパク質と親和性を有する物質は、例えば、本発明のタンパク質を精製する場合に利用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明のタンパク質に対して特異的親和性を有する抗体を提供する。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。この抗体は、完全な抗体分子だけでなく、本発明のタンパク質に対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるフラグメントであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ等で標識されて、本発明のタンパク質が特定の細胞に結合しているか否かを検出するために使用される。
【００２６】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明の蛋白質あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００２７】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，　Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
【００２８】
本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を使用して、コンピュータ上で処理する方法をも包含する。本発明は、例えば、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を使用して、相同性のあるＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を検索すること（例えば、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡプログラムの使用）を提供する。また、本発明は、分子モデリング及び遺伝子シャッフリング等において、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を利用して、より最適な配列情報を入手することを提供する。本発明はさらに、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を利用して得られた配列からなるＤＮＡ及びタンパク質に関する。
【００２９】
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター及び発現ベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２，　ｐＢＲ３２５，　ｐＵＣ１８，　ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９，　ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０，　ｐＴＰ５，　ｐＣ１９４　などが挙げられる。バチルス・チューリンジエンシス由来プラスミドとして、ｐＨＴ３１０１、ｐＨＴ３１５などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００３０】
特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが配置された発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
【００３１】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
【００３２】
また、形質転換体の培地中に本発明のタンパク質を分泌させる場合において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターが好ましく使用される。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがゲノミックＤＮＡから単離され、本来のプロモーターおよびターミネーター領域を含む形態で得られる場合には、本発明の発現ベクターは、目的の宿主細胞内で複製保持または自律増殖できる公知のクローニングベクターの適当な部位に該ＤＮＡを挿入することにより調製することができる。
【００３４】
本発明はまた、上記の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供する。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞など種々の細胞（例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌、バチルス・チューリンジエンシスまたはその変異株等（好ましくは、毒素タンパク質（即ち、細胞障害活性を有するタンパク質）を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株））、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属、クリベロマイセス属等）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示されるが、原核生物細胞がより好ましい。また、本発明のタンパク質を発現するのに適したバチルス・チューリンジエンシス変異株を、当業者は自ら作製することができる。例えば、毒素タンパク質を生産するバチルス・チューリンジエンシス株からキュアリングを行い、プラスミドＤＮＡを除くことによって、毒素タンパク質を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株が得られる。当業者は、上記手法を用いて、毒素タンパク質を生産せずに本発明のタンパク質を生産する任意のバチルス・チューリンジエンシス株を取得することができる。詳細については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　ＰＬＡＳＭＩＤ　５，　３５１−３６５（１９８１）を参照のこと。
【００３５】
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場合は、Ｃｏｈｅｎ　らの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　６９，２１１０　（１９７２））、プロトプラスト法、コンピテント法等によって、酵母の場合は、Ｈｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　７５，　１９２７　（１９７８））、リチウム法等によって、動物細胞の場合は、Ｇｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　５２，　４５６　（１９７３））等によって、また昆虫細胞の場合は、Ｓｕｍｍｅｒｓ　らの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．３，２１５６−２１６５　（１９８３）　）等によって、それぞれ形質転換することができる。
【００３６】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を発現する細胞から得られる。本発明のタンパク質を発現する細胞としては、例えば、本発明のタンパク質を天然で発現する細胞（好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株）、及び本発明のタンパク質を発現するＤＮＡをコードする発現ベクターを含有する形質転換体が挙げられる。本発明のタンパク質は、上記のようにして調製される発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって製造することができる。また、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を天然で発現する細胞（好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株）を培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって得られる。好ましくは、本発明のタンパク質は、アルカリ緩衝液での可溶化後に、必要に応じてプロテアーゼによって処理されて、活性化されてもよい。
【００３７】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
【００３８】
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ．　Ｊ．，　Ｅｘｐ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ，　ｐ．４３１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２））等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主がバチルス・チューリンジエンシス又はその変異株（好ましくはバチルス・チューリンジエンシスＢＦＲ１）の場合、好ましい培地としては、ＣＹＳ培地（Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．，　ＡＣＳ　Ｓｙｍｐ．　Ｓｅｒ．　４３２，　４６−６０（１９９０））が挙げられる（この場合、培養は、例えば、寒天平板上で２０℃で９６時間行なわれる）。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地（Ｂｏｓｔｉａｎ．　Ｋ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４５０５　（１９８０））が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４０】
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１２２，　５０１　（１９５２））、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　８，　３９６　（１９５９）　）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．　Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．，　１９９，　５１９　（１９６７）　）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．，　７３，　１　（１９５０））等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４１】
本タンパク質の精製は、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。本発明のタンパク質は、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
【００４２】
本発明の組換えタンパク質を迅速且つ簡便に取得する手段として、本発明のタンパク質のコード配列のある部分（好ましくはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物の上記活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーにより本発明のタンパク質を分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする過程で、このタンパク質のＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターに本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、コード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
【００４３】
本発明は、本発明のタンパク質、発現ベクターまたは形質転換体を有効成分とする医薬組成物、具体的には、抗癌剤及び細胞標識剤を提供する。本発明はまた、免疫異常疾患治療剤、好ましくは白血病治療剤を提供する。本発明のタンパク質は、正常な免疫系細胞よりも異常な免疫系細胞（好ましくは白血病Ｔ細胞及び前骨髄性細胞）に対して、より低用量で細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を示すため、これらに起因する疾患の治療に有用である。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「組成物」又は「剤」とは、特定の物質を有効成分として含有することを特徴とするものをいう。例えば、本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のタンパク質を含有し、特定の疾患の治療効果を奏する。このような医薬組成物は、有効成分としての本発明のタンパク質を、経口又は非経口適用に適した有機または無機の担体又は賦形剤との混合物として含有する固体、半固体又は液体形態の医薬製剤の形で使用できる。該有効成分は、例えば、散剤、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル剤、スプレー剤、その他の使用に適した形態用の、通常の、無毒性で、医薬として許容しうる担体と混ぜ合わせることができる。更に、必要ならば、助剤、安定剤、増粘剤等を使用してもよい。これらの担体、賦形剤は、必要に応じて無菌化処理を施したものを使用してもよく、また製剤化した後に無菌化処理を行なうこともできる。有効成分である本発明のタンパク質の治療上有効な用量は、その精製度、活性及び投与法、並びに処置すべき個々の患者の年齢、健康状態、体重、性別及び疾患の種類によっても相違するが、当業者は、それらの因子を考慮して、用量を適宜決定することができる。
【００４５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４６】
［材料］
実験に用いた細胞を以下から購入した。ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部癌細胞）、Ｓａｗａｎｏ細胞（ヒト子宮内膜腺癌細胞）、ＴＣＳ細胞（ヒト角化型扁平上皮癌細胞）、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、Ｔ−ｃｅｌｌ（正常Ｔ細胞）、ＭＯＬＴ−４細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）、ＣＡＣＯ−２細胞（ヒト結腸癌細胞）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞）を理化学研究所から購入した。ＵｔＳＭＣ細胞（ヒト正常子宮平滑筋細胞）を宝酒造株式会社から購入した。ＨＣ細胞（ヒト正常肝細胞）をセルシステムズ社から購入した。ヒツジ血液を、日本バイオテスト研究所から購入した。
【００４７】
［実施例１：毒素タンパク質の同定］
１．１．菌株の培養
土壌から単離されたＡ１５４７株（鞭毛抗原血清型：ｄａｋｏｔａ（Ｈ１５））（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０４６）を培養した。具体的には、栄養培地（１％肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で３７℃にて７日間培養後、４℃にて３日間さらに培養した。
【００４８】
１．２．結晶タンパク質の調製と活性化
上述のように培養された菌株を集菌し、洗浄した後に、純水に懸濁した。凍結融解により菌体を破壊後、デキストラン／ポリエチレングリコールを用いた２層分離法により結晶タンパク質を調製した。結晶タンパク質が１ｍｇ／ｍｌになるよう純水に懸濁させ、−２０℃で保存した。
次いで、調製した結晶タンパク質を１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下に５０ｍＭ　Ｎａ_２ＣＯ_３（ｐＨ１０．０）で３７℃にて１時間処理し可溶化した。遠心分離（１，３００×ｇ、１５分間）により不溶物を除いた上清に、種々の濃度のプロテイナーゼＫを加えプロセシング（３７℃、３０分間）を行なった後、ＰＭＳＦ（終濃度１ｍＭ）により反応を停止し、この結晶タンパク質を活性化させた。（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンとＭＯＬＴ−４細胞に対する毒性との関係を図１に示す。尚、ＭＯＬＴ−４細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ胎児血清添加）にて３７℃で培養したものを用いた。また、細胞生存率の測定は、ＭＴＴ法による細胞呼吸活性測定により評価した。具体的には、ＭＯＬＴ−４細胞を２×１０^４個含んだ懸濁液９０μｌを９６穴プレートで１２時間培養したものに、上記の結晶タンパク質を添加した後、ＭＴＴ　１５μｌを添加して３７℃、２時間インキュベートし不溶性のホルマザン色素を溶かし、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
図１に示される結果から、結晶タンパク質は極めて多種類のタンパク質から構成されているが、アルカリでの可溶化により数種類のタンパク質が主成分となることが理解される。また、これらのタンパク質は細胞障害活性を有しないが、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）での消化によって細胞障害活性を示すようになることが確認された。
【００４９】
１．３．ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
上記の結果は、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）処理の画分中に、細胞障害活性を有するタンパク質（即ち、毒素タンパク質）が含まれることを示す。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、この画分は、数種類のタンパク質の混合物からなることが理解される。従って、毒素タンパク質を同定するため、さらなる精製を試みた。まず、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）処理画分をセルロファインＧＣ−７００のゲルろ過クロマトグラフィーにかけた（図２）。その結果、細胞障害活性はフラクション２０前後が最も高いことが明らかとなった。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンに着目すると、見かけの分子量約３０ｋＤａのタンパク質（図２において＊で示す）が、フラクション２０前後において最も多量に存在した。さらに、図２の結果により、このタンパク質の量と細胞障害活性との間に相関関係があることが示された。以上の結果より、約３０ｋＤａ（見かけの分子量）のタンパク質が、細胞障害活性を有することが示唆された。
【００５０】
１．４．陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ゲルろ過後の標品においても混入タンパク質が認められたので、単一のタンパク質として得るため、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なった（図３）。具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィー精製後の活性画分をＤＥ５２カラムにかけ、０ｍＭから５００ｍＭまでの濃度のＮａＣｌを用いてステップワイズ溶出を行なった。その結果、２０ｍＭ　ＮａＣｌ溶出画分のみに細胞障害活性が認められた。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を参照すると、約３０ｋＤａのタンパク質が、この画分にのみ含まれることが明らかとなった。従って、以上の結果から、約３０ｋＤａのタンパク質が細胞障害活性を有することが明らかとなった。なお、６０ｋＤａ付近にバンドが見られるが、このバンドはＳＤＳ電気泳動上のアーティファクトと考えられる。
【００５１】
１．５．毒素タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の決定
次いで、このタンパク質のｃＤＮＡをクローニングするため、アミノ末端部のアミノ酸配列を決定した。初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ブロッティングした後、目的タンパク質を切り取り、アミノ酸シーケンサーにアプライした。その結果、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−（配列番号６）の配列が得られた。この配列はこれまでのデータベースには見当たらず、新規タンパク質であると考えられた。
【００５２】
〔実施例２：毒素タンパク質をコードする遺伝子のクローニング〕
実施例１に記載されるように、このタンパク質のｃＤＮＡをクローニングするため、アミノ末端部のアミノ酸配列を決定した。初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ブロッティングした後、目的タンパク質を切り取り、アミノ酸シーケンサーにアプライした。その結果、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−（配列番号６）の配列が得られた。この配列はこれまでのデータベースには見当たらず、新規タンパク質であると考えられた。
上記のアミノ末端アミノ酸配列に基づき、以下に示される２種類の縮退オリゴヌクレオチドを作成した。設計の概要については図４に示す。
５’−ＧＡＹＧＴＮＡＴＨＹＧＮＧＡＲＴＡ−３’（配列番号７）
５’−ＴＴＲＡＡＣＡＴＮＡＲＲＴＡＹＴＣＮＣ−３’（配列番号８）
【００５３】
次いで、プラークハイブリダイゼーション法において、これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、Ａ１５４７株由来の遺伝子ライブラリーから目的遺伝子のスクリーニングを行なった。
プラークハイブリダイゼーションを行なった結果、１次スクリーニングにおいてポジティブと思われた１０個のプラークのうち、２次スクリーニングにおいてシグナルが検出されたプラークは３個であった。従って、それらのうちの１個について詳細な解析を進めた。
【００５４】
得られたＤＮＡの制限酵素マップに従いサブクローニングした断片の中で、ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩの断片が、用いたオリゴプローブに対しサザンハイブリダイゼーションでポジティブな結果を示した。よって、この部分にアミノ末端があると考え、この部分を中心に塩基配列を決定した。得られた塩基配列及びアミノ酸配列を図５に示す。活性化タンパク質（プロテイナーゼＫ処理により切断されたもの）のアミノ末端から８６４塩基下流に終止コドンが、１５３塩基上流に開始メチオニンコドンが確認され、また、開始メチオニンの１２塩基上流にＳＤ配列と思われる塩基配列ＧＧＡＧＧも確認された（図５（Ａ）及び（Ｂ））。今回同定されたタンパク質のコード領域は３３８個のアミノ酸からなり、それらから推定される分子量は３７ｋＤａであった。また、活性化後のタンパク質は、２８７個のアミノ酸からなり、その分子量は３１ｋＤａと推定された。従って、ＳＤＳ電気泳動上での見かけの分子量（約３０ｋＤａ）を支持する結果が得られた。
【００５５】
上記のアミノ酸配列について、データベースにより相同性検索を行なったところ、チョウやガ等の鱗翅目に毒性を示す約３４ｋＤａのタンパク質であるｃｒｙ１５Ａタンパク質と高い相同性が認められた（図６）。特に、その前半部約１５０アミノ酸部と２４％の相同性、４１％の類似性が認められた。
【００５６】
［実施例３：種々の細胞株に対する活性化タンパク質の効果］
次いで、種々の細胞株を表１に示される条件で培養し、それら培養された各細胞について、活性化タンパク質の細胞障害活性を、ＭＴＴ法による細胞生存率で測定した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】

【００５８】
【表２】

【００５９】
この表２に示される結果から、本発明の活性化タンパク質は、特定の細胞を特異的に認識することが明らかとなった。また、本発明の活性化タンパク質は、これらの認識した細胞に対して細胞障害性を示すことが明らかになった。
【００６０】
［実施例４：溶血活性の測定］
ヒツジ血液を、赤血球濃度２％（ｖ／ｖ）になるよう２０ｍＭトリス緩衝液で調製した。この２％（ｖ／ｖ）赤血球溶液４０μｌに対し実施例１で調製した活性化タンパク質溶液を２０μｌずつ添加し、２７℃で１８時間放置した。さらに８００×ｇで１０分間遠心した上清の吸光度（５４０ｎｍ）を測定した。対照実験では、タンパク質溶液の代わりに２０ｍＭトリス緩衝液を添加した。対照実験での吸光度と比較して吸光度差が０．５以下の場合に、溶血活性がないものとした。その結果、上記活性化タンパク質は、ヒツジ赤血球に対する溶血活性を有しないことが明らかになった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質について遺伝子レベル、分子レベルでの研究開発を可能にする。本発明はまた、それらのタンパク質の大量生産技術も確立することができる。従って、本発明は、薬学分野におけるＤＤＳ技術の開発、診断薬の開発、農林水産分野における特定の細胞の開発、組織の選択的破壊による動植物の育種、さらに化学工業分野における新規有害生物制御剤の開発等、幅広い分野の技術に関して大いに貢献するものと考えられる。本発明のタンパク質はまた、選択性が非常に高いため、特定の細胞を特異的に認識及び／又は破壊するために有用である。また、本発明のタンパク質は、特定の癌細胞に対する特異性が高いことから、医薬組成物（具体的には、抗癌剤及び細胞標識剤）として有用である。
【００６２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７：配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号８：配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
【００６３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）は、（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示す。
図１（Ｂ）は、（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質についてのＭＯＬＴ−４細胞に対する毒性を示す。
【図２】図２（Ａ）は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製における各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを示す。
図２（Ｂ）は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製における各フラクションの細胞障害活性を示す。
【図３】図３（Ａ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製における各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを示す。
図３（Ｂ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製における各フラクションの細胞障害活性を示す。
【図４】図４は、毒素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の概要を示す。
【図５】図５（Ａ）は、毒素タンパク質をコードする遺伝子の構成を示す。
図５（Ｂ）は、毒素タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。ここで、配列番号１は、図５Ｂに示される３３８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対応し、配列番号２は、該タンパク質のアミノ酸配列に対応する。また、配列番号３は、活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列（下線部）に対応し、配列番号４は、該活性化タンパク質のアミノ酸配列（下線部）に対応する。一方、配列番号５は、図５Ｂに示される全ヌクレオチド配列に対応する。
【図６】図６は、毒素タンパク質とＣｒｙ１５Ａタンパク質との間のアミノ酸配列の比較を示す。なお、図中のＣｒｙ３０Ｋは、本発明の毒素タンパク質を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to useful proteins derived from microorganisms, and more particularly to Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensisThe present invention relates to an amino acid sequence of a novel protein derived from the A1547 strain and having cell recognition and cell destruction ability, and a gene sequence encoding the same.
[0002]
[Prior art]
Bacillus thuringiensis was discovered in 1901 by a Japanese researcher Shigenori Ishiwatari as a pathogenic bacterium of silkworms. Since then, the crystalline protein having insecticidal activity produced by this bacterium has been widely used as a microbial insecticide for controlling agricultural pests and sanitary pests.
[0003]
According to previous studies, it is known that crystalline proteins having insecticidal activity are activated by protease treatment as required after solubilization with alkali, and exhibit toxicity to insects. The crystalline proteins having insecticidal activity include (1) Cry protein (usually having a molecular weight of 60 to 75 kDa in an activated form) which exhibits selective destruction activity for insect cells when activated by a protease; It has been revealed that Cyt protein is classified as a Cyt protein having a non-selective destructive activity against cells of the same type and a hemolytic activity of erythrocytes (usually, the activated form has a molecular weight of 22 to 30 kDa).
[0004]
Bacillus thuringiensis crystalline protein as a cell recognition protein has high selectivity represented by Cry protein, abundant diversity based on tens of genotypes, and a protein derived from prokaryote. Therefore, it has an excellent feature that other cell recognition proteins such as antibodies do not easily modify genes. However, its use is limited to its use as an insecticide targeting insect cells. In addition, only 30 to 40% of BT strains express crystalline proteins having insecticidal activity. Regarding the properties of crystalline proteins having no insecticidal activity produced by BT strains, It was unknown.
[0005]
The present inventors have determined that about 2,000 strains of 50 H serotypes and unknown serotypes isolated from soil, arable soil, forest soil, sericulture farm dust, stored grain dust, dead insects, plants, fresh water, etc. Using Bacillus thuringiensis strains, and among toxin proteins of unknown activity derived from Bacillus thuringiensis strains, when activated by proteases after solubilization with alkali, vertebrate cells (cancer The world's first clarification of the existence of a group of novel proteins that selectively recognize and destroy cells (including cells) (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-11-222498
[Patent Document 2]
JP 2000-281700 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have developed a group of novel proteins derived from Bacillus thuringiensis having a selective recognition activity and a damaging activity on vertebrate cells (including cancer cells), among Bacillus thuringiensis. The amino acid sequence of the toxin protein produced by the A1547 strain and the gene sequence encoding the same were clarified.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is as shown below.
(1) DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having a cell recognition activity in an active form.
(4) The DNA according to the above (3), wherein the protein has no hemolytic activity.
(5) A DNA which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and encodes a protein having a cytotoxic activity in an active form.
(6) The DNA according to the above (5), wherein the protein has no hemolytic activity.
(7) DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(8) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(9) A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and encodes a protein having cell recognition activity.
(10) The DNA according to the above (9), wherein the protein has no hemolytic activity.
(11) a DNA which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and encodes a protein having cytotoxic activity.
(12) The DNA according to the above (11), wherein the protein has no hemolytic activity.
(13) A vector containing the DNA according to any one of the above (1) to (12).
(14) A transformant containing the vector according to (13).
(15) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(16) A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added, or inserted, and has a cell recognition activity in an active form.
(17) The protein according to the above (16), wherein the protein has no hemolytic activity.
(18) A protein comprising one or more amino acids deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having a cytotoxic activity in an active form.
(19) The protein according to (18), wherein the protein has no hemolytic activity.
(20) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(21) A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added, or inserted, and has a cell recognition activity.
(22) The protein according to the above (21), wherein the protein has no hemolytic activity.
(23) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids are deleted, substituted, added, or inserted, and has cytotoxic activity.
(24) The protein according to (23) above, wherein the protein has no hemolytic activity.
(25) A pharmaceutical composition comprising the protein according to any one of (15) to (24).
(26) A cell labeling agent containing the protein according to any one of (15) to (17) and (20) to (22).
(27) An anticancer agent comprising the protein according to any one of (15), (18) to (20), and (23) to (24).
(28) An antibody against the protein according to any one of (15) to (24).
(29) A method for producing the protein according to any one of the above (15) to (24), comprising the following steps:
(A) culturing cells expressing the protein; and
(B) recovering the protein;
A method comprising:
(30) A method for identifying a cell recognized by the protein according to any one of the above (15) to (17) and (20) to (22), comprising the following steps:
(A) incubating any cell with the protein in a culture medium; and
(B) determining whether the protein has a cell recognition activity for the cell;
A method comprising:
(31) A method for identifying a cell in which the protein according to any one of the above (15), (18) to (20) and (23) to (24) exhibits cytotoxic activity, comprising the following steps: :
(A) incubating any cell with the protein in a culture medium; and
(B) determining whether the protein has cytotoxic activity on the cell;
A method comprising:
(32) The method according to (30) or (31), further comprising (c) determining whether the protein has hemolytic activity.
(33) A method for identifying a substance having affinity for the protein according to any one of the above (15) to (24), comprising the following steps:
(A) contacting the protein with a test substance;
(B) determining whether the test substance has an affinity for the protein;
A method that includes:
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4. The present invention also relates to a protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity in an active form. I will provide a. The present invention further provides a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and has a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity. . Preferably, the protein of the present invention has no hemolytic activity. Furthermore, the present invention provides a peptide consisting of at least 20, more preferably at least 15, and even more preferably at least 10 contiguous amino acids of the above proteins.
[0010]
“Cytotoxic activity” refers to the ability to specifically destroy a particular cell. For example, when measured by a method such as the MTT assay, if the cytotoxic activity on a specific cell is significantly higher than the cytotoxic activity on a negative control, the cell is considered to have cytotoxic activity on that cell. . Negative controls include any cells in which the protein of the present invention does not show cytotoxic activity.
[0011]
In addition, the protein of the present invention exhibits specific cytotoxic activity against specific cells by specifically recognizing and destroying specific cells. Therefore, the protein of the present invention has a specific “cell recognition activity”. For example, when the cell recognition activity for a specific cell is significantly higher than the cell recognition activity for a negative control as measured by an immunoprecipitation assay or interaction analysis using BIAcore, Are considered to have Negative controls include any cells in which the protein of the present invention does not show cell recognition activity. Those skilled in the art can appropriately select cells that can be used as a negative control.
[0012]
The cell recognition activity is measured by, for example, an immunoprecipitation assay, an interaction analysis using BIAcore, or the like. In the immunoprecipitation assay, a ligand (A1547 protein in the case of the present invention), its antibody and protein A beads are added to a cell lysate (containing a ligand target), and a target-ligand-antibody-protein A bead complex is added. And centrifuged to separate. For this complex, SDS-PAGE and Western blot are performed to identify the target. Those skilled in the art can appropriately set these experimental conditions. In the interaction analysis using BIAcore, a membrane fraction containing a target on a cell or the target itself is immobilized on the sensor surface, and a sample (A1547 protein in the case of the present invention) acting on the target is passed through a micro flow system. And a small change in mass caused by binding and dissociation of molecules occurring on the sensor surface is detected in real time as a change in SPR (surface plasmon resonance) signal. The reaction kinetics is analyzed from the obtained data. For details of the immunoprecipitation assay and the analysis of the interaction using BIAcore, see Cell Engineering Separate Volume Experiment Protocol Series Protein Experiment Protocol 1 (1) Functional Analysis (Shujunsha, 1997). Although examples of assays for measuring cytotoxicity include immunoprecipitation assays and interaction analysis using BIAcore, those skilled in the art can use other assays to measure cell recognition activity. .
[0013]
“A protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity in an active form” is defined as being treated under specific conditions (for example, under alkaline conditions, and under alkaline conditions and when treated with a protease). An inactive form (precursor) of a protein which is converted to a form having the above-mentioned activity (active form), and a protein having the above-mentioned activity without being treated under specific conditions (ie, present in an active form from the beginning) Protein). For example, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 normally exists in an inactive form unless subjected to a particular treatment, but is treated under alkaline conditions or under alkaline conditions and with a protease (eg, proteinase K). And an active form of the protein (about 30 to 31 kDa), and has a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity. Therefore, the protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 2 is a protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity in an active form. However, a protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity without any specific treatment is considered to be in an active form in that state. In the present invention, the “protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity” does not need to be subjected to a specific treatment.
[0014]
The cells specifically recognized and / or destroyed by the protein of the present invention include cells derived from vertebrates, preferably cells derived from mammals (eg, human, mouse, rat, monkey, etc.). For example, as cells derived from humans, T cells (eg, normal T cells, leukemic T cells (preferably MOLT-4 and Jurkat cells), promyelocytic leukemia cells (preferably HL60 cells)), uterine cells (preferably Uterine cancer cells excluding cervical cancer cells and normal smooth muscle cells derived from the uterus, more preferably Sawano cells and UtSMC cells), hepatocytes (preferably hepatoma cells, more preferably HepG2 cells), lung cells (preferably normal Fetal fibroblasts, more preferably MRC-5 cells, and colon cells (preferably colon adenocarcinoma cells, more preferably CACO-2 cells). In addition, the protein of the present invention can recognize and / or destroy mouse-derived fibroblasts (preferably, NIH3T3 cells) in non-human mammalian cells. However, those skilled in the art understand that the protein of the present invention has cell recognition activity and / or cytotoxic activity even for cells other than those listed above. Further, the protein of the present invention may have these activities alone or in combination. For example, the protein of the present invention has an inhibitory activity on promyelocytic leukemia cells and liver cancer cells, or an inhibitory activity on promyelocytic leukemia cells and a recognition activity on liver cancer cells. The protein of the present invention includes, in addition to an inactive form of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a protein obtained by treating the protein with alkali, and a protease (eg, proteinase K) treatment in addition to the alkali treatment (For example, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) in an active form (about 30 to 31 kDa). The conditions and procedures of these alkali treatment and protease treatment can be appropriately set by those skilled in the art, and an active form (about 30 to 31 kDa) protein (for example, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) can be obtained by SDS-PAGE or the like. Can be confirmed. More specifically, these processing conditions and procedures follow the methods described in the examples.
[0015]
Further, "having no hemolytic activity" refers to substantially not having hemolytic activity on erythrocytes of mammals (for example, rabbits, sheep and humans, preferably humans). When the method described in Example 4 is used, if the absorbance difference is 0.5 or less compared to the absorbance in the control experiment, it is determined that there is no hemolytic activity. As the protein of the present invention, a protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity and having no hemolytic activity is preferable. Preferably, the protein of the present invention is a protein derived from the genus Bacillus, more preferably a protein derived from Bacillus thuringiensis, even more preferably a Bacillus thuringiensis A1547 strain (Accession No. FERM P -19046; The strain was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on the original deposit date September 26, 2002. D).
[0016]
Other cell recognition proteins other than the protein of the present invention include, for example, immunoglobulins. However, the protein of the present invention has an advantage that it has a very low molecular weight compared to immunoglobulins and is easily modified since it is a prokaryotic protein. In addition to the above features, the proteins of the present invention can be used in drug delivery systems due to their very high selectivity. For example, the protein of the present invention can impart specific directivity to another substance by fusion with the substance. It is understood that the proteins of the present invention have excellent selectivity and can be used for targeting therapy, like immunoglobulins (antibodies).
[0017]
The protein of the present invention can be used as an anticancer agent. In use as an anticancer agent, the protein of the present invention is effective alone, but in order to enhance the effect, it is used as a complex (covalent or noncovalent) with other anticancer agents or as a concomitant agent. Can be done. For example, a complex of an immunoglobulin and an anticancer agent has been reported, but the protein of the present invention can also be used as a complex with another anticancer agent. Further, the protein of the present invention may be a radioisotope (for example,¹³¹I). For example,¹³¹It has been reported that treatment with an I-labeled anti-CD20 monoclonal antibody yielded very good results in B cell lymphoma patients. Similarly, the protein of the present invention¹³¹Labeling with I can enhance the destructive effect on cancer cells. Also, the protein of the present invention can be used as a complex with a toxin (eg, ricin). For example, it has been reported that a complex of an anti-CD5 antibody and a ricin A chain confirmed a remarkable effect in patients with T-cell lymphoma. The protein of the present invention can also be used as a complex with ricin A chain. The anticancer agent of the present invention exerts a therapeutic effect on cancer composed of cancer cells specifically destroyed by the protein of the present invention.
[0018]
Further, the protein of the present invention can also be used as a cell labeling agent. For example, for in vivo applications, the proteins of the invention may image a tumor (consisting of specific cancer cells) by labeling with a suitable imaging substance (eg, a substance detected by nuclear magnetic resonance). . Radioisotopes used for tumor imaging include, for example, yttrium, indium, technetium, and the like. Those skilled in the art can appropriately set the radiation dose to be injected into the subject. For in vitro applications, the proteins of the invention are used, for example, as markers for particular cells. The cell labeling agent of the present invention is used for cells specifically recognized by the protein of the present invention.
[0019]
The present invention provides a DNA encoding a protein consisting of the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 or 4, preferably a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3. The present invention also relates to a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which hybridizes under stringent conditions to a DNA comprising a nucleotide recognition sequence and / or a cytotoxic activity. DNAs encoding proteins having the same are provided. The present invention further provides a protein that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and has a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity. DNA encoding is provided. Preferably, the DNA of the present invention encodes a protein having no hemolytic activity.
[0020]
Further, the present invention provides oligonucleotides consisting of at least about 20, preferably about 18, more preferably at least about 16, and most preferably at least about 15 contiguous nucleotides of the above DNA. Antisense oligonucleotides to these oligonucleotides are also provided by the present invention. The present invention also provides a primer pair for amplifying the DNA of the present invention. Each of the primer pairs consists of at least 20 or more, preferably at least 15 or more oligonucleotide pairs that are complementary to the sense or antisense strand.
[0021]
In the present invention, “stringent conditions” refers to about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 75% or more, further preferably about 80% or more, even more preferably about 85% or more in the nucleotide sequence. % Or more, about 90% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, most preferably about 99% or more. Stringency can be adjusted by appropriately changing the salt concentration, temperature, and the like during the hybridization reaction and washing. For example, examples of hybridization conditions and washing conditions under “stringent conditions” include 50% formamide, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and overnight incubation at 42 ° C. in a solution containing 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters in 0.1 × SSC at about 65 ° C. Conditions. The degree of homology is calculated, for example, by using the default BLAST search of National \ Center \ Biotechnology \ Information (NCBI).
[0022]
Cells in which the protein of the present invention exhibits cytotoxic activity include: (a) incubating any protein with the protein in a culture medium; and (b) determining whether the protein has cytotoxic activity against the cell. The method comprises the step of determining Preferably, the identification method may further include the step of determining whether the protein has hemolytic activity. For example, a cell that is more significantly destroyed than a negative control when measured by a method such as an MTT assay is regarded as a cell in which the protein of the present invention exhibits cytotoxic activity. Negative controls include any cells in which the protein of the present invention does not show cytotoxic activity. Examples of the positive control include any cell in which the protein of the present invention exhibits cytotoxic activity, and cells in which the protein of the present invention exhibits cytotoxic activity in the same degree or more than the positive control. Is more preferable. The proteins of the invention are applied, for example, for medical purposes, to diseases associated with the cells identified by this method.
[0023]
Cells in which the protein of the present invention exhibits cell recognition activity include: (a) incubating any cell with the protein in a culture medium; and (b) determining whether the protein has a cell recognition activity on the cell. The method comprises the step of determining Preferably, the identification method may further include the step of determining whether the protein has hemolytic activity. For example, a cell that is more significantly recognized than a negative control as measured by an immunoprecipitation assay or an interaction analysis using BIAcore is regarded as a cell in which the protein of the present invention exhibits cell recognition activity. Negative controls include any cells in which the protein of the present invention does not show cell recognition activity. Those skilled in the art can appropriately select cells that can be used as a negative control. Examples of the positive control include any cell in which the protein of the present invention exhibits a cell recognition activity, and cells in which the protein of the present invention exhibits a cell recognition activity in the same or higher degree as the positive control. Is more preferable. The proteins of the invention are applied, for example, for medical purposes, to diseases associated with the cells identified by this method.
[0024]
The present invention also provides a method for identifying a substance having an affinity for the protein of the present invention. The method includes (a) contacting the protein with a test substance, and (b) determining whether the test substance has an affinity for the protein. Examples of test substances that come into contact with the protein of the present invention include, but are not limited to, saccharides, lipids, proteins, nucleic acids, synthetic compounds, and the like. The preferred affinity is 10^-6Less than M, 10^-7Less than M, 10^-8Less than M, 10^-9Less than M, 10^-10Less than M, 10^-11Less than M or 10^-12Dissociation constants (K_d). Such affinity is measured, for example, by labeling the protein of the present invention with a radioisotope and then subjecting the protein to a binding assay with a test substance. The substance having an affinity for the protein of the present invention is used, for example, when purifying the protein of the present invention.
[0025]
The present invention also provides an antibody having a specific affinity for the protein of the present invention. The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique. The antibody may be not only an intact antibody molecule but also any fragment as long as it has an antigen binding site (CDR) for the protein of the present invention. For example, Fab, F (ab ')₂, ScFv, minibody and the like. For example, the antibody of the present invention is labeled with horseradish peroxidase or the like and used to detect whether or not the protein of the present invention binds to a specific cell.
[0026]
For example, a polyclonal antibody is a protein of the present invention or a fragment thereof (if necessary, bovine serum albumin, KLH (KeyeholeLimpetHconjugated with a carrier protein such as emocyanin) as an antigen together with a commercially available adjuvant (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in animals. About 4 times (the antibody titer of the partially collected serum is measured by a known antigen-antibody reaction to confirm the increase), and about 3 to 10 days after the final immunization, the whole blood is collected and the antiserum is collected. Can be obtained by purifying Animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
[0027]
In addition, a monoclonal antibody can be prepared by a cell fusion method. For example, the factor is subcutaneously or intraperitoneally administered to a mouse 2 to 4 times together with a commercially available adjuvant, three days after the final administration, the spleen or lymph node is collected, and leukocytes are collected. The leukocytes are fused with myeloma cells (eg, NS-1, ΔP3X63Ag8) to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor. Cell fusion may be a PEG method or a voltage pulse method. A hybridoma that produces a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to the antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method or the like. The culture of a hybridoma producing a monoclonal antibody can be performed in vitro or in vivo, such as in a mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and from the ascites of the animal, respectively.
[0028]
The present invention also includes a method of processing on a computer using the DNA sequence information and the amino acid sequence information of the present invention. The invention provides for searching for homologous DNA and amino acid sequences using, for example, the DNA and amino acid sequence information of the invention (eg, using the BLAST and FASTA programs). In addition, the present invention provides obtaining more optimal sequence information using the DNA sequence information and amino acid sequence information of the present invention in molecular modeling, gene shuffling, and the like. The present invention further relates to DNAs and proteins comprising sequences obtained by using the DNA sequence information and amino acid sequence information of the present invention.
[0029]
The present invention also provides a recombinant vector and an expression vector containing a DNA encoding the protein of the present invention. The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate and maintain or autonomously propagate in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes plasmid vectors and virus vectors. The recombinant vector can be obtained by simply adding a DNA encoding the protein of the present invention to a suitable cloning vector or expression vector available in the art, using appropriate restriction enzymes and ligase, or, if necessary, a linker or adapter. It can be prepared by ligation using DNA. Examples of such a vector include plasmids derived from Escherichia coli such as pBR322, pBR325, pUC18 and pUC19; plasmids derived from yeast such as pSH19 and pSH15; and plasmids derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5 and pC194. . Bacillus thuringiensis-derived plasmids include pHT3101, pHT315 and the like. Examples of the virus include bacteriophages such as λ phage, papovaviruses such as SV40 and bovine papilloma virus (BPV), retroviruses such as Moloney mouse leukemia virus (MoMuLV), adenovirus (AdV), adeno-associated virus (AAV), Examples include animal and insect viruses, such as vaccinia virus, baculovirus.
[0030]
In particular, the present invention provides an expression vector in which a DNA encoding the protein of the present invention is placed under the control of a promoter functional in a target host cell. The vector to be used includes a promoter region which functions in various host cells of prokaryotic and / or eukaryotic cells and can control transcription of a gene arranged downstream thereof (for example, a trp promoter when the host is E. coli, When the host is Bacillus subtilis, such as lac promoter, lectA promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. When the host is mammalian cells , An SV40-derived early promoter, a MoMLV-derived long terminal repeat, an adenovirus-derived early promoter, and the like, and a transcription termination signal of the gene, that is, a terminator region. The terminator region and the terminator region are not particularly limited as long as they are linked via a sequence containing at least one restriction enzyme recognition site, preferably a unique restriction site that cuts the vector only at that position. It further contains a selectable marker gene for selecting transformants (a gene that confers resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, and phosphinothricin, and a gene that complements an auxotrophic mutation). Is preferred. Further, when the DNA encoding the protein of the present invention does not contain a start codon and a stop codon, the start codon (ATG or GTG) and the stop codon (TAG, TGA, TAA) are respectively added to the downstream of the promoter region and the terminator region. Is preferably used.
[0031]
When a bacterium is used as a host cell, the expression vector generally needs to contain a replicable unit capable of autonomously replicating in the host cell, in addition to the above promoter region and terminator region. The promoter region includes an operator and a Shine-Dalgarno (SD) sequence near the promoter.
[0032]
In the case where the protein of the present invention is secreted into the medium of the transformant and the DNA encoding the protein of the present invention does not contain a signal peptide coding sequence, an appropriate signal may be used as a vector following the initiation codon. Secretory expression vectors that further include codons are preferably used.
[0033]
When the DNA encoding the protein of the present invention is isolated from genomic DNA and obtained in a form containing the original promoter and terminator region, the expression vector of the present invention can be used to maintain the replication or autonomous growth in the target host cell. It can be prepared by inserting the DNA into an appropriate site of a known cloning vector.
[0034]
The present invention also provides a transformant obtained by transforming a host cell with the above expression vector. The host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-mentioned expression vector and can be transformed.Natural cells or artificially established natural cells usually used in the technical field of the present invention are used. Various cells such as mutant cells or recombinant cells (for example, bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, Bacillus thuringiensis or mutants thereof) (preferably, a toxin protein (that is, a protein having cytotoxic activity) Non-producing Bacillus thuringiensis strains)), yeasts (such as Saccharomyces, Pichia, and Kleberomyces), animal cells and insect cells, and the like, with prokaryotic cells being more preferred. Further, those skilled in the art can produce Bacillus thuringiensis mutants suitable for expressing the protein of the present invention by themselves. For example, by curing from a Bacillus thuringiensis strain producing a toxin protein and removing the plasmid DNA, a Bacillus thuringiensis strain not producing a toxin protein can be obtained. A person skilled in the art can obtain any Bacillus thuringiensis strain that produces the protein of the present invention without producing a toxin protein using the above-described technique. For details, see Gonzalez, {J. M. {Et} al. $ PLASMID $ 5, $ 351-365 (1981).
[0035]
Introduction of an expression vector into a host cell can be performed using a conventionally known method. For example, in the case of bacteria, the method of Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)), the protoplast method, the competent method, and the like, and in the case of yeast, the method of Hinnen et al. USA, {75, {1927} (1978)), in the case of animal cells, by the Graham method (Virology, {52, {456} (1973)), etc., and in the case of insect cells. In this case, transformation can be performed by the method of Summers et al. (Mol. {Cell. {Biol. 3, 2156-2165} (1983)) or the like.
[0036]
The protein of the present invention is obtained from a cell expressing the protein of the present invention. Examples of cells that express the protein of the present invention include cells that naturally express the protein of the present invention (preferably, Bacillus thuringiensis A1547 strain) and expression vectors that encode DNA that expresses the protein of the present invention. And a transformant containing the same. The protein of the present invention can be produced by culturing a transformant containing the expression vector prepared as described above in a medium, and recovering the protein of the present invention from the resulting culture. The protein of the present invention can be obtained by culturing cells (preferably, Bacillus thuringiensis A1547) that naturally express the protein of the present invention, and recovering the protein of the present invention from the resulting culture. . Preferably, the protein of the invention may be activated, optionally after treatment with a protease, after solubilization in an alkaline buffer.
[0037]
The medium to be used preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant). Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose. Examples of the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, and the like. Examples include soybean meal and potato extract. If desired, it may contain other nutrients (eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.)). .
[0038]
The culturing is performed by a method known in the art. Specific culture media and culture conditions used according to the host cell will be described below, but the culture conditions in the present invention are not limited thereto.
[0039]
When the host is a bacterium, actinomycete, yeast, filamentous fungus or the like, for example, a liquid medium containing the above-mentioned nutrient is suitable. Preferably, the medium has a pH of 5 to 8. When the host is Escherichia coli, preferred mediums include LB medium and M9 medium (Miller. @ J., Exp. @ Mol. @ Genet, $ p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)). The cultivation can be carried out usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and stirring as required. When the host is Bacillus subtilis, the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary. When the host is Bacillus thuringiensis or a mutant thereof (preferably Bacillus thuringiensis BFR1), a preferred medium is a CYS medium (Yamamoto, @T., @ACS \ Symp. \ Ser. \ 432, \ 46-60 (1990). (In this case, the culture is performed on an agar plate at 20 ° C. for 96 hours, for example.) When the host is yeast, examples of the medium include Burkholder's minimal medium (Bostian. KLＬet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)). Desirably. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
[0040]
When the host is an animal cell, as a medium, for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Science, {122, {501} (1952)), a Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM) (Virology, 8, {396} (1959)), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)), 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)), etc. Can be used. The pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring may be performed.
[0041]
Purification of the present protein can be carried out by appropriately combining various commonly used separation techniques. The protein of the present invention can be produced, for example, by salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, non-denaturing PAGE, SDS-PAGE, ion exchange chromatography, hydroxylapatite chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography. It can be obtained by appropriately selecting a known separation method such as chromatography, isoelectric focusing and the like.
[0042]
As a means for obtaining the recombinant protein of the present invention quickly and easily, an amino acid sequence capable of adsorbing to a metal ion chelate (for example, histidine, arginine, A DNA sequence encoding a sequence consisting of a basic amino acid such as lysine, preferably a sequence consisting of histidine) is added by gene manipulation and expressed in a host cell. From the above-mentioned active fraction of the culture of the cell, the metal ion A preferred example is a method of separating and recovering the protein of the present invention by affinity with a carrier on which a chelate is immobilized. For example, a DNA sequence encoding an amino acid sequence capable of adsorbing to a metal ion chelate is obtained by linking the DNA sequence to a base sequence encoding the C-terminal amino acid sequence of the protein in the process of cloning the DNA encoding the protein of the present invention. PCR amplification using the hybrid primers described above, or insertion of the DNA encoding the protein of the present invention in-frame into an expression vector containing the DNA sequence before the stop codon can be introduced into the coding sequence. it can. In addition, the metal ion chelate adsorbent used for purification contains transition metals such as divalent ions of cobalt, copper, nickel and iron, or trivalent ions of iron and aluminum, and preferably contains divalent ions of cobalt or nickel. The solution is prepared by contacting a ligand, for example, an iminodiacetic acid (IDA) group, a nitrilotriacetic acid (NTA) group, a tris (carboxymethyl) ethylenediamine (TED) group, or the like, and binding to the ligand. The matrix portion of the chelate adsorbent is not particularly limited as long as it is a usual insoluble carrier.
[0043]
The present invention provides a pharmaceutical composition comprising the protein, expression vector or transformant of the present invention as an active ingredient, specifically, an anticancer agent and a cell labeling agent. The present invention also provides an agent for treating an immunological disorder, preferably an agent for treating leukemia. The protein of the present invention exhibits cell recognition activity and / or cytotoxicity at a lower dose on abnormal immune system cells (preferably leukemia T cells and promyelocytic cells) than normal immune system cells. It is useful for treating diseases caused by these.
[0044]
As used herein, the term "composition" or "agent" refers to a substance characterized by containing a specific substance as an active ingredient. For example, the pharmaceutical composition of the present invention contains the protein of the present invention as an active ingredient and has a therapeutic effect on a specific disease. Such a pharmaceutical composition is a solid, semi-solid or liquid form of a pharmaceutical composition containing the protein of the present invention as an active ingredient as a mixture with an organic or inorganic carrier or excipient suitable for oral or parenteral application. It can be used in the form of a formulation. The active ingredient may be a conventional, non-toxic, e.g., powder, tablet, pellet, capsule, suppository, solution, emulsion, suspension, aerosol, spray, or other suitable form for use. And can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier. Further, if necessary, auxiliaries, stabilizers, thickeners and the like may be used. These carriers and excipients may be those subjected to a sterilization treatment if necessary, or may be subjected to a sterilization treatment after being formulated. The therapeutically effective dose of the protein of the invention, which is the active ingredient, will also depend on its purity, activity and mode of administration, as well as the age, health, weight, sex and type of disease of the individual patient to be treated. Those skilled in the art can appropriately determine the dose in consideration of those factors.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, these are merely examples, and do not limit the scope of the present invention.
[0046]
[material]
Cells used for the experiment were purchased from the following. HeLa cells (human cervical cancer cells), Sawano cells (human endometrial adenocarcinoma cells), TCS cells (human keratinized squamous cell carcinoma cells), HepG2 cells (liver cancer cells), T-cell (normal T cells) Cells), MOLT-4 cells (human leukemia T cells), Jurkat cells (human leukemia T cells), HL60 cells (human promyelocytic leukemia cells), MRC-5 cells (human fetal lung-derived normal fibroblasts), A549 Cells (human lung cancer cells), CACO-2 cells (human colon cancer cells), COS-7 cells (African green monkey kidney-derived cells), Vero cells (African green monkey kidney-derived cells), and NIH3T3 cells (mouse embryonic fibroblasts) Was purchased from RIKEN. UtSMC cells (human normal uterine smooth muscle cells) were purchased from Takara Shuzo. HC cells (human normal hepatocytes) were purchased from Cell Systems. Sheep blood was purchased from Japan Biotest Laboratory.
[0047]
[Example 1: Identification of toxin protein]
1.1. Culture of strain
A1547 strain (flagella antigen serotype: dakota (H15)) (accession number FERM @ P-19046) isolated from soil was cultured. Specifically, the cells were cultured in a nutrient medium (1% meat extract, 1% polypeptone, 0.2% NaCl, pH 7.6) at 37 ° C for 7 days, and further cultured at 4 ° C for 3 days.
[0048]
1.2. Preparation and activation of crystalline protein
The strain cultured as described above was collected, washed, and then suspended in pure water. After disrupting the cells by freeze-thawing, crystalline proteins were prepared by a two-layer separation method using dextran / polyethylene glycol. The crystal protein was suspended in pure water so as to have a concentration of 1 mg / ml, and stored at -20 ° C.
Next, the prepared crystal protein was subjected to 50 mM Na in the presence of 10 mM dithiothreitol (DTT) and 1 mM EDTA.₂CO₃(PH 10.0) at 37 ° C. for 1 hour to solubilize. Various concentrations of proteinase K were added to the supernatant from which insolubles had been removed by centrifugation (1,300 × g, 15 minutes), processed (37 ° C., 30 minutes), and then treated with PMSF (final concentration 1 mM). The reaction was stopped and the crystalline protein was activated. For (i) the prepared crystal protein, (ii) the solubilized crystal protein, and (iii) the crystal protein further treated with proteinase K at various concentrations after solubilization, SDS-PAGE electrophoresis pattern and MOLT-4 cells FIG. 1 shows the relationship between the toxicity and the toxicity. The MOLT-4 cells used were cultured at 37 ° C. in an RPMI-1640 medium (10% fetal bovine serum added). The cell viability was evaluated by measuring cell respiratory activity by the MTT method. Specifically, MOLT-4 cells were 2 × 10⁴The above-mentioned crystal protein was added to 90 μl of the suspension containing 90 μl in a 96-well plate, and then MTT (15 μl) was added. The mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours to dissolve the insoluble formazan dye. The absorbance was measured.
From the results shown in FIG. 1, it is understood that the crystal protein is composed of an extremely large number of types of proteins, but several types of proteins become main components by solubilization with alkali. In addition, it was confirmed that these proteins do not have cytotoxic activity, but show cytotoxic activity by digestion with proteinase K (10 μg / ml).
[0049]
1.3. Purification by gel filtration chromatography
The above results indicate that the proteinase K (10 μg / ml) -treated fraction contains a protein having cytotoxic activity (ie, a toxin protein). Also, the result of SDS-PAGE indicates that this fraction consists of a mixture of several proteins. Therefore, further purification was attempted to identify the toxin protein. First, the fraction treated with proteinase K (10 μg / ml) was subjected to gel filtration chromatography using Cellulofine GC-700 (FIG. 2). As a result, it was revealed that the cytotoxic activity was highest around fraction 20. On the other hand, focusing on the SDS-PAGE electrophoresis pattern, a protein having an apparent molecular weight of about 30 kDa (indicated by * in FIG. 2) was present in the largest amount before and after fraction 20. Furthermore, the results in FIG. 2 indicated that there was a correlation between the amount of this protein and the cytotoxic activity. From the above results, it was suggested that a protein of about 30 kDa (apparent molecular weight) has cytotoxic activity.
[0050]
1.4. Purification by anion exchange chromatography
Since contaminating proteins were also observed in the sample after gel filtration, further purification by anion exchange chromatography was performed to obtain a single protein (FIG. 3). Specifically, the active fraction after gel filtration chromatography purification was applied to a DE52 column, and stepwise elution was performed using NaCl at a concentration of 0 mM to 500 mM. As a result, cytotoxic activity was observed only in the fraction eluted with 20 mM NaCl. Furthermore, referring to the results of SDS-PAGE, it was revealed that a protein of about 30 kDa was contained only in this fraction. Therefore, the above results revealed that a protein of about 30 kDa had cytotoxic activity. A band is observed around 60 kDa, and this band is considered to be an artifact on SDS electrophoresis.
[0051]
1.5. Determination of amino-terminal amino acid sequence of toxin protein
Next, to clone the cDNA of this protein, the amino-terminal amino acid sequence was determined. First, SDS-PAGE was performed, and after blotting, the target protein was cut out and applied to an amino acid sequencer. As a result, a sequence of Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Tyr-Leu-Met-Phe-Asn- (SEQ ID NO: 6) was obtained. This sequence was not found in previous databases and was considered to be a novel protein.
[0052]
[Example 2: Cloning of gene encoding toxin protein]
As described in Example 1, the amino-terminal amino acid sequence was determined to clone the cDNA for this protein. First, SDS-PAGE was performed, and after blotting, the target protein was cut out and applied to an amino acid sequencer. As a result, a sequence of Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Tyr-Leu-Met-Phe-Asn- (SEQ ID NO: 6) was obtained. This sequence was not found in previous databases and was considered to be a novel protein.
Based on the above amino terminal amino acid sequence, the following two kinds of degenerate oligonucleotides were prepared. An outline of the design is shown in FIG.
5'-GAYGTNATHYNGGARTA-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-TTRAACATNARRTAYTCNC-3 '(SEQ ID NO: 8)
[0053]
Next, in the plaque hybridization method, a target gene was screened from a gene library derived from the A1547 strain using these oligonucleotides as probes.
As a result of plaque hybridization, three of the plaques in which a signal was detected in the secondary screening were found out of ten plaques which appeared to be positive in the primary screening. Therefore, detailed analysis was advanced for one of them.
[0054]
Among the fragments subcloned according to the obtained restriction enzyme map of the DNA, the BamHI-SpeI fragment showed a positive result in the Southern hybridization to the oligo probe used. Therefore, it was considered that this portion had an amino terminal, and the nucleotide sequence was determined centering on this portion. The obtained base sequence and amino acid sequence are shown in FIG. A stop codon 864 bases downstream from the amino terminus of the activated protein (cut by proteinase K treatment), an initiation methionine codon 153 bases upstream, and an SD sequence 12 bases upstream from the initiation methionine are considered. The nucleotide sequence GGAGG was also confirmed (FIGS. 5A and 5B). The coding region of the protein identified this time consisted of 338 amino acids, and the molecular weight estimated therefrom was 37 kDa. The protein after activation was composed of 287 amino acids, and its molecular weight was estimated to be 31 kDa. Therefore, a result supporting the apparent molecular weight (about 30 kDa) on SDS electrophoresis was obtained.
[0055]
When a homology search was performed for the above amino acid sequence using a database, high homology was observed with the cry15A protein, which is a protein of about 34 kDa that is toxic to lepidoptera of butterflies and moths (FIG. 6). In particular, a homology of 24% and a similarity of 41% were found in the first half, about 150 amino acids.
[0056]
[Example 3: Effect of activating protein on various cell lines]
Next, various cell lines were cultured under the conditions shown in Table 1, and for each of the cultured cells, the cytotoxic activity of the activating protein was measured by the cell viability by the MTT method. Table 2 shows the results.
[0057]
[Table 1]

[0058]
[Table 2]

[0059]
From the results shown in Table 2, it became clear that the activating protein of the present invention specifically recognizes specific cells. Further, it has been revealed that the activating protein of the present invention exhibits cytotoxicity to these recognized cells.
[0060]
[Example 4: Measurement of hemolytic activity]
Sheep blood was prepared with 20 mM Tris buffer to a red blood cell concentration of 2% (v / v). 20 μl of the activated protein solution prepared in Example 1 was added to 40 μl of the 2% (v / v) erythrocyte solution, and the mixture was allowed to stand at 27 ° C. for 18 hours. Furthermore, the absorbance (540 nm) of the supernatant centrifuged at 800 × g for 10 minutes was measured. In control experiments, 20 mM Tris buffer was added instead of protein solution. When the absorbance difference was 0.5 or less compared to the absorbance in the control experiment, it was determined that there was no hemolytic activity. As a result, it was revealed that the activated protein had no hemolytic activity on sheep erythrocytes.
[0061]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention enables research and development of a protein having a cell recognition activity and / or a cytotoxic activity at a gene level and a molecular level. The present invention can also establish a technique for mass production of those proteins. Therefore, the present invention relates to the development of DDS technology in the field of pharmacy, the development of diagnostic agents, the development of specific cells in the field of agriculture, forestry and fisheries, the breeding of animals and plants by selective destruction of tissues, and the development of new pest control agents in the field of chemical industry. It is expected to greatly contribute to technologies in a wide range of fields such as development. The proteins of the invention are also very selective, and are therefore useful for specifically recognizing and / or destroying specific cells. In addition, the protein of the present invention has high specificity for specific cancer cells, and thus is useful as a pharmaceutical composition (specifically, an anticancer agent and a cell labeling agent).
[0062]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 7: oligonucleotide probe for detecting nucleotide sequence encoding protein having amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 8: oligonucleotide probe for detecting nucleotide sequence encoding protein having amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
[0063]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (A) shows SDS for (i) the prepared crystal protein, (ii) the solubilized crystal protein, and (iii) the crystal protein further treated after solubilization with various concentrations of proteinase K. 1 shows an electrophoresis pattern of PAGE.
FIG. 1 (B) shows MOLT-4 cells for (i) the prepared crystal protein, (ii) the solubilized crystal protein, and (iii) the crystal protein treated with various concentrations of proteinase K after solubilization. Shows toxicity.
FIG. 2 (A) shows an SDS-PAGE electrophoresis pattern of each fraction in purification by gel filtration chromatography.
FIG. 2 (B) shows the cytotoxic activity of each fraction in the purification by gel filtration chromatography.
FIG. 3 (A) shows an SDS-PAGE electrophoresis pattern of each fraction in purification by anion exchange chromatography.
FIG. 3 (B) shows the cytotoxic activity of each fraction in purification by anion exchange chromatography.
FIG. 4 shows an overview of an oligonucleotide probe design for detecting a nucleotide sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of a toxin protein.
FIG. 5 (A) shows the structure of a gene encoding a toxin protein.
FIG. 5 (B) shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding the toxin protein. Here, SEQ ID NO: 1 corresponds to the nucleotide sequence encoding the protein consisting of 338 amino acids shown in FIG. 5B, and SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of the protein. SEQ ID NO: 3 corresponds to the nucleotide sequence encoding the activation protein (underlined), and SEQ ID NO: 4 corresponds to the amino acid sequence of the activation protein (underlined). On the other hand, SEQ ID NO: 5 corresponds to the entire nucleotide sequence shown in FIG. 5B.
FIG. 6 shows a comparison of the amino acid sequence between the toxin protein and the Cry15A protein. Cry30K in the figure indicates the toxin protein of the present invention.

Claims

DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and encodes a protein having a cell recognition activity in an active form.

The DNA according to claim 3, wherein the protein has no hemolytic activity.

A DNA which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and encodes a protein having cytotoxic activity in an active form.

The DNA according to claim 5, wherein the protein has no hemolytic activity.

DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.

DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and encodes a protein having cell recognition activity.

The DNA according to claim 9, wherein the protein has no hemolytic activity.

A DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and encodes a protein having cytotoxic activity.

The DNA according to claim 11, wherein the protein has no hemolytic activity.

A vector containing the DNA according to any one of claims 1 to 12.

A transformant containing the vector according to claim 13.

A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and having a cell recognition activity in an active form.

17. The protein of claim 16, wherein said protein has no hemolytic activity.

A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and having cytotoxic activity in an active form.

19. The protein of claim 18, wherein said protein has no hemolytic activity.

A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and having cell recognition activity.

22. The protein of claim 21, wherein said protein has no hemolytic activity.

A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added or inserted, and having cytotoxic activity.

24. The protein of claim 23, wherein said protein has no hemolytic activity.

A pharmaceutical composition comprising the protein according to any one of claims 15 to 24.

A cell labeling agent containing the protein according to any one of claims 15 to 17 and 20 to 22.

An anticancer agent comprising the protein according to any one of claims 15, 18 to 20, and 23 to 24.

An antibody against the protein according to any one of claims 15 to 24.

A method for producing a protein according to any one of claims 15 to 24, comprising the following steps:
(A) culturing cells expressing the protein; and (b) recovering the protein;
A method comprising:

A method for identifying a cell recognized by a protein according to any one of claims 15 to 17 and 20 to 22, comprising the following steps:
(A) incubating any protein with the protein in a culture medium; and (b) determining whether the protein has cell recognition activity on the cell;
A method comprising:

A method for identifying a cell in which the protein according to any one of claims 15, 18 to 20, and 23 to 24 exhibits cytotoxic activity, comprising the following steps:
(A) incubating the protein with the cell in a culture medium; and (b) determining whether the protein has cytotoxic activity against the cell;
A method comprising:

32. The method according to claim 30 or 31, further comprising (c) determining whether the protein has hemolytic activity.

A method for identifying a substance having an affinity for a protein according to any one of claims 15 to 24, comprising the following steps:
(A) contacting the protein with a test substance;
(B) determining whether the test substance has an affinity for the protein;
A method that includes: