【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子導入技術に係るベクターと、このベクターを用いた核酸含有複合体及びその形成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３−７４１７， １９８７）がある。これに引き続いて更に多くのカチオン性脂質が合成され、幾つかは、実験室用のトランスフェクション試薬として市販されている。例えば、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標））、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ（登録商標））である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なベクターと、このベクターを用いた核酸含有複合体及びその形成方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明のベクターは、カチオン性ポリマーを担持した磁性粒子よりなるものである。
【０００６】
本発明のベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与し、体外から又は体内へ挿入したデバイスから印加する磁力によって疾患部位へ集合させることができるので、効率的に遺伝子治療を行うことができる。
【０００７】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、患部付近にて磁力を印加することが可能な血管カテーテルや、ステントグラフトのように血管内へ留置するものであって磁気をもつものなどがあるが、この限りではない。
【０００８】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の核酸含有複合体では核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて酵素から保護しているので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。
【０００９】
本発明の核酸含有複合体及びその形成方法では、かかる本発明のベクターと核酸凝集体とを混合して該複合体を形成する。
【００１０】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドとくにＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるカチオン性ポリマーとしては、好ましくは長鎖状のポリマーを母体とし、このポリマーに活性基（イオン基）を結合させたもの、例えば陰イオン交換ポリマーを用いることができる。活性基としては、第１級ないし３級アミノ基や第４級アンモニウム基を含む基、例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル基）、ＱＡＥ〔ジエチル（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基〕、Ｑ（又はＴＥＡＥ）（トリエチルアミノエチル基）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アミノメチル基、ＰＡＢ（パラアミノベンジル基）、ＡＥ（アミノエチル基）、ＧＥ（グアニドエチル基）等が例示される。長鎖状のポリマーとしては、モノビニルモノマー（例えばスチレン）とポリビニルモノマー（例えばジビニルベンゼン）との架橋共重合体が例示される。ポリビニルピロリジン、ポリアリールアミン及びポリビニルピロリドンの４級化体などの窒素含有ポリマーも例示される。金属付で架橋したカチオン性ポリマーであってもよい。カチオン性ポリマーの分子量は１〜２０万（１万〜２０万）程度が好ましい。
【００１２】
磁性粒子としてはＦｅ３Ｏ４粒子が好適である。磁性粒子の粒径は血管内で異物として認識されやすく、毛細血管の閉塞などの危険性が生じる４００ｎｍよりも小さく、かつ、核酸などと複合体を形成させることを考慮すれば、例えば２〜２００ｎｍが好ましい。このナノメートルオーダーの微細なＦｅ３Ｏ４粒子は、例えば、界面活性剤の存在のもと塩化鉄（ＩＩ）から水酸化鉄（ＩＩ）のコロイド溶液を調製し、水溶液中で攪拌しながら系のｐＨを上げ、溶存酸素などによって水酸化鉄（ＩＩ）を酸化させることにより製造することができる。
【００１３】
磁性粒子にカチオン性ポリマーを担持させるには、カチオン性ポリマーをアルコール、アセトン、エーテル、ベンゼン又はトルエン等の溶媒に溶解させた濃度０．１〜１０．０ｗｔ％程度の溶液中に磁性粒子を分散させ、次いで固液分離して乾燥させるのが好ましい。この乾燥は常温でもよく、減圧下でもよい。
【００１４】
磁性粒子とカチオン性ポリマーとは、静電結合、疎水結合などにより結合される。磁性粒子にシランカップリング材をコーティングしておき、その官能基を足場として化学結合させることも可能である。
【００１５】
カチオン性ポリマーの担持量は、ＥＳＣＡ（Ｘ線光電子分光法）測定による推定値ではあるが、磁性粒子１粒子に対して１〜１００分子のカチオン性ポリマーを担持させるのが好適であり、この範囲内であれば、ベクターが核酸凝集体を包囲することによって生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００１６】
カチオン性ポリマーを担持した磁性粒子よりなるベクターと核酸凝集体とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１，０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて粒径５０〜４００ｎｍ程度の核酸凝集体を添加し、混合すればよい。カチオン性ポリマー量に対して核酸凝集体を過剰量添加し、核酸凝集体をカチオン性ポリマーに対し飽和状に複合させるのが好ましい。
【００１７】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００１８】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００１９】
核酸凝集体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、凝集体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００２０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００２１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００２２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００２３】
本発明の核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができ、投与後には生体外部又は生体内へ挿入したデバイスからの磁力印加によって目的とする特定部位へ集合させ，その部位での核酸の持続的且つ局所的な放出が可能であるので，血管壁そのものへの遺伝子導入、さらに末梢領域に対する選択的遺伝子治療（癌に対する遺伝子治療、例えば抗血管新生療法、あるいは循環障害に対する遺伝子治療、例えば血管新生療法等）が可能となる。
【００２４】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００２５】
本発明の核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００２６】
また、本発明の核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００２７】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００２８】
本発明の核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｇａｕｃｈｅｒ病等）等が挙げられる。
【００２９】
【実施例】
（磁性粒子の調製）
塩化鉄（ＩＩ）四水和物（関東化学社製，ＪＩＳ特級試薬）及びポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（花王社製，エマルゲン９２０）を精製水（日局，注射用水）へ溶解して０．０１Ｍ溶液を調製した。この溶液をホモジナイザー（特殊機化工業社製，ホモディスパーｆ）にて攪拌しながら滴定用ビュレットを使用して２Ｍ水酸化ナトリウム（関東化学社製，特級試薬）水溶液を滴下してＦｅ３Ｏ４の懸濁液を調製した。得られた懸濁液をスパチュラで分取し、精製水１０ｍＬ中に２滴加えて攪拌し、電子顕微鏡用マイクログリッド上へ滴下して室温で２４時間乾燥させた。乾燥後、ポリビニルエチルエーテル（関東化学社製，試薬）の０．０２％イソプロピルアルコール（関東化学社製，ＪＩＳ特級）溶液を滴下して室温下で２４時間乾燥させて固定化した。透過型電子顕微鏡（日本電子社製ＪＥＭ−２００ＣＸ，加速電圧２００ｋＶ）にて観察した結果、平均２０ｎｍの立方体形のナノ粒子が生成していることが確認された。
【００３０】
（核酸含有複合体の形成）
実施例１で調製した磁性粒子を終濃度１ｗｔ％となるように、１ｗｔ％ポリアリールアミンの水溶液と混合した後、１０分間放置、遠心分離によって磁性粒子沈殿させた。上澄を除去した後、水で洗浄し、ここに０．１ｗｔ％グルタアルデヒド水溶液を混合して１０分間放置し、溶液を０．４ＮのＨＣｌにて酸性とした。上澄みのデカンテーションと洗浄を繰返して担持されていないポリアリールアミンなどを除去した後、常温、常圧にて乾燥させることにより、ポリアリールアミン４級塩の架橋体を担持した磁性粒子よりなるベクターを得た。
【００３１】
このベクターを水へ１ｍｇ／ｍＬ濃度で分散させた。ここに平均粒径２００ｎｍのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子凝集体の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッフアー（ｐＨ＝８．０）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ分散液を混合し、動的光散乱法により粒径分布を測定した結果、５０〜３５０ｎｍの範囲の粒子が観測され、ほぼ正規分布をとった。平均粒子径は約２００ｎｍでありベクターと遺伝子の複合体化が示唆された。
【００３２】
【発明の効果】
以上の通り、本発明によると、カチオン性ポリマーを担持した磁性粒子よりなるベクターと、このベクターを用いた核酸含有複合体及びその形成方法が提供される。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a vector related to a gene transfer technique, a nucleic acid-containing complex using the vector, and a method for forming the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, gene therapy research has become increasingly important as the molecular genetic factors of human disease become evident. The purpose of gene therapy is to express DNA at a target site, and how to reach the target site and how to efficiently introduce DNA into the target site and functionally express the target site. It becomes important. As a vector for the introduction of foreign DNA, many viruses, including retroviruses, adenoviruses or herpes viruses, have been modified to carry therapeutic genes and have been used in human clinical trials of gene therapy. However, the risks of infection and immune response remain.
[0003]
As a non-viral vector for carrying DNA into cells, for example, cationic lipid dioleoyloxypropyltrimethylammonium (Felgner et al., Proc) commercialized as Lipofectin (registered trademark). Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987). This is followed by the synthesis of more cationic lipids, some of which are commercially available as laboratory transfection reagents. For example, DOGS (Transfectam (registered trademark)), DOSPA (Lipofectamine (registered trademark)), and DOTAP (DOTAP (registered trademark)).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel vector, a nucleic acid-containing complex using the vector, and a method for forming the same.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The vector of the present invention comprises magnetic particles carrying a cationic polymer.
[0006]
Since the vector of the present invention can form a complex with a nucleic acid aggregate and administer it to a living body, and can be assembled at a disease site by a magnetic force applied from a device externally or inserted into the body, efficient gene therapy can be achieved. It can be performed.
[0007]
Devices to be inserted into the body include those that percutaneously penetrate the tissue near the affected area, those that can apply magnetic force near the affected area, and those that are placed in the blood vessel like a stent graft. There are things with magnetism, but this is not a limitation.
[0008]
Nucleic acids are generally not very stable in vivo and are degraded by certain enzymes. In the nucleic acid-containing complex of the present invention, the nucleic acid is formed into an aggregate, and a vector containing a cationic polymer is disposed around the aggregate to protect the nucleic acid from the enzyme. Can work.
[0009]
In the nucleic acid-containing complex of the present invention and the method for forming the same, the vector of the present invention and the nucleic acid aggregate are mixed to form the complex.
[0010]
The nucleic acid is preferably a polynucleotide such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA), particularly DNA, but may be ribonucleoprotein.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As the cationic polymer used in the present invention, a polymer obtained by bonding a long-chain polymer as a base and an active group (ionic group) to the polymer, for example, an anion exchange polymer can be used. As the active group, a group containing a primary to tertiary amino group or a quaternary ammonium group, for example, DEAE (diethylaminoethyl group), QAE [diethyl (2-hydroxypropyl) aminoethyl group], Q (or TEAE) (Triethylaminoethyl group), dimethyl (2-hydroxyethyl) aminomethyl group, PAB (paraaminobenzyl group), AE (aminoethyl group), GE (guanidoethyl group) and the like. Examples of the long-chain polymer include a crosslinked copolymer of a monovinyl monomer (for example, styrene) and a polyvinyl monomer (for example, divinylbenzene). Nitrogen-containing polymers such as polyvinylpyrrolidine, polyarylamines and quaternized forms of polyvinylpyrrolidone are also exemplified. It may be a cationic polymer cross-linked with a metal. The molecular weight of the cationic polymer is preferably about 1 to 200,000 (10,000 to 200,000).
[0012]
Fe 3 O 4 particles are suitable as the magnetic particles. The particle size of the magnetic particles is easily recognized as a foreign substance in a blood vessel, is smaller than 400 nm at which there is a risk of obstruction of capillaries, and in consideration of forming a complex with a nucleic acid or the like, for example, 2 to 200 nm. Is preferred. The fine Fe 3 O 4 particles on the order of nanometers can be prepared, for example, by preparing a colloidal solution of iron (II) hydroxide from iron (II) chloride in the presence of a surfactant and stirring the solution in an aqueous solution. Can be produced by raising the pH and oxidizing iron (II) hydroxide with dissolved oxygen or the like.
[0013]
In order to carry the cationic polymer on the magnetic particles, the magnetic particles are dispersed in a solution having a concentration of about 0.1 to 10.0 wt% in which the cationic polymer is dissolved in a solvent such as alcohol, acetone, ether, benzene or toluene. It is preferable to carry out solid-liquid separation and then dry. This drying may be performed at normal temperature or under reduced pressure.
[0014]
The magnetic particles and the cationic polymer are bonded by an electrostatic bond, a hydrophobic bond, or the like. It is also possible to coat the magnetic particles with a silane coupling material, and chemically bond the functional groups as scaffolds.
[0015]
The amount of the loaded cationic polymer is an estimated value measured by ESCA (X-ray photoelectron spectroscopy), and it is preferable that 1 to 100 molecules of the cationic polymer be loaded on one magnetic particle. Within this range, the vector surrounds the nucleic acid aggregate, so that inactivation and degradation of the nucleic acid by the enzyme in the living body can be suppressed.
[0016]
In order to complex a vector consisting of magnetic particles carrying a cationic polymer with a nucleic acid aggregate, a dispersion having a particle size of about 50 to 400 nm at room temperature is added to a dispersion of the vector at a concentration of about 1 to 1,000 μg / mL. The nucleic acid aggregate may be added and mixed. It is preferable to add an excessive amount of the nucleic acid aggregate with respect to the amount of the cationic polymer and complex the nucleic acid aggregate with the cationic polymer in a saturated state.
[0017]
Preferred examples of the nucleic acid include herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV1-TK gene), p53 tumor suppressor gene, BRCA1 tumor suppressor gene and cytokine gene such as TNF-α gene, IL-2 gene, IL-4 gene and HLA- Cytokine genes such as B7 / IL-2 gene, HLA-B7 / B2M gene, IL-7 gene, GM-CSF gene, IFN-γ gene and IL-12 gene, and gp-100, MART-1 and MAGE-1 etc. Can be used for cancer treatment.
[0018]
Further, cytokine genes such as VEGF gene, HGF gene and FGF gene, and c-myc antisense, c-myb antisense, cdc2 kinase antisense, PCNA antisense, E2F decoy and p21 (sdi-1) gene are used for vascular treatment. Available. Such a series of genes is well known to those skilled in the art.
[0019]
The particle size of the nucleic acid aggregate is preferably about 50 to 400 nm. If it is smaller than this, the action of the enzyme may reach the nucleic acid inside the aggregate. On the other hand, if it is larger than this, it may be difficult to introduce it into cells.
[0020]
The nucleic acid is used in such a form that it can express a function in the cell when introduced into the cell. For example, in the case of DNA, the DNA is used as a plasmid in which the DNA is transcribed in the introduced cells and functionally expressed through production of the polypeptide encoded thereby. Preferably, a promoter region, an initiation codon, a DNA encoding a protein having a desired function, a termination codon, and a terminator region are continuously arranged.
[0021]
If desired, two or more nucleic acids can be included in one plasmid.
[0022]
In the present invention, "cells" as a target to which a nucleic acid is introduced are required to express the function of the nucleic acid. Such cells are variously selected depending on, for example, the nucleic acid to be used (that is, its function). Examples include cardiomyocytes, smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, bone marrow cells, bone cells, blood cell stem cells, blood cells, and the like. In addition, monocytes, dendritic cells, macrophages, histiocytes, Kupffer cells, osteoclasts, synovial A cells, microglia, Langerhans cells, epithelioid cells, multinucleated giant cells, etc., gastrointestinal epithelial cells and tubular epithelium Cells.
[0023]
The nucleic acid-containing complex of the present invention can be administered to a living body by any method. After administration, the nucleic acid-containing complex is collected at a target specific site by applying a magnetic force from a device inserted outside the living body or into the living body. Since continuous and local release of nucleic acid is possible, gene transfer into the blood vessel wall itself, and selective gene therapy to peripheral regions (gene therapy for cancer, such as anti-angiogenesis therapy, or gene therapy for circulatory disorders, For example, angiogenesis therapy).
[0024]
Intravenous or intraarterial injection is particularly preferred as the administration method, but intramuscular, adipose tissue, subcutaneous, intradermal, intralymphatic, intralymphatic, intralymphatic, body cavity (pericardial cavity, pleural cavity, peritoneal cavity, cerebrospinal cavity) Etc.), it is also possible to administer directly into the diseased tissue in addition to the administration into the bone marrow.
[0025]
The medicament containing the nucleic acid-containing complex of the present invention as an active ingredient may further contain a pharmaceutically acceptable carrier (an osmotic pressure adjusting agent, a stabilizing agent, a preservative, a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a thickening agent, if necessary). Etc.). Known carriers can be used as these carriers.
[0026]
In addition, the medicine containing the nucleic acid-containing complex of the present invention as an active ingredient includes those containing two or more nucleic acid-containing complexes containing different types of nucleic acids. Such a drug having multiple therapeutic purposes is particularly useful in the field of diversifying gene therapy.
[0027]
The dose to be administered to an animal, particularly a human, varies depending on various factors such as the nucleic acid of interest, the method of administration, and the specific site to be treated. However, the dosage should be sufficient to produce a therapeutic response.
[0028]
The nucleic acid-containing complex of the present invention is preferably applied to gene therapy. Applicable diseases vary depending on the type of nucleic acid included in the complex, but include diseases in the circulatory region that cause lesions such as peripheral artery disease, coronary artery disease, restenosis after arterial dilatation, and cancer (malignant). Melanoma, brain tumor, metastatic malignant tumor, breast cancer, etc., infectious disease (HIV, etc.), single genetic disease (cystic fibrosis, chronic granuloma, α1-antitrypsin deficiency, Gaucher disease, etc.) and the like. .
[0029]
【Example】
(Preparation of magnetic particles)
Iron (II) chloride tetrahydrate (Kanto Chemical Co., Ltd., JIS special grade reagent) and polyoxyethylene nonyl phenyl ether (Kao Co., Ltd., Emulgen 920) were dissolved in purified water (JP, water for injection). A 01M solution was prepared. While stirring this solution with a homogenizer (Homodisper f, manufactured by Tokushu Kika Kogyo Co., Ltd.), a 2M aqueous solution of sodium hydroxide (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd., special grade reagent) was added dropwise using a burette for titration, and Fe 3 O 4 was added. Was prepared. The obtained suspension was fractionated with a spatula, and two drops were added to 10 mL of purified water, stirred, dropped on a microgrid for an electron microscope, and dried at room temperature for 24 hours. After drying, a 0.02% solution of polyvinyl ethyl ether (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd., reagent) in isopropyl alcohol (manufactured by Kanto Kagaku Co., Ltd., JIS special grade) was added dropwise, followed by drying at room temperature for 24 hours for immobilization. As a result of observation with a transmission electron microscope (JEM-200CX, manufactured by JEOL Ltd., acceleration voltage: 200 kV), it was confirmed that cubic nanoparticles having an average of 20 nm were generated.
[0030]
(Formation of nucleic acid-containing complex)
The magnetic particles prepared in Example 1 were mixed with an aqueous solution of 1 wt% polyarylamine so as to have a final concentration of 1 wt%, then left for 10 minutes, and centrifuged to precipitate magnetic particles. After removing the supernatant, the mixture was washed with water, mixed with a 0.1 wt% aqueous solution of glutaldehyde and allowed to stand for 10 minutes, and the solution was acidified with 0.4N HCl. A vector consisting of magnetic particles carrying a cross-linked polyarylamine quaternary salt is obtained by removing unsupported polyarylamine and the like by repeating decantation and washing of the supernatant and drying at normal temperature and normal pressure. Got.
[0031]
This vector was dispersed in water at a concentration of 1 mg / mL. A 10 mM Tris-HCl buffer (pH = 8.0) + 1 mM EDTA dispersion of a pGL3-Control gene aggregate having an average particle size of 200 nm was mixed here, and the particle size distribution was measured by dynamic light scattering. Particles were observed, and the distribution was almost normal. The average particle size was about 200 nm, suggesting that the vector was complexed with the gene.
[0032]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a vector comprising magnetic particles carrying a cationic polymer, a nucleic acid-containing complex using the vector, and a method for forming the same are provided.