JP2004129587A - Disease marker of disease accompanying accumulation of neutral lipid and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断に有用な疾患マーカー及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、肥満症、脂肪肝、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、又は虚血性心疾患等の中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断においてプライマー又は検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカー、かかる疾患マーカーを利用した当該疾患の検出方法（診断方法）、当該疾患の改善剤又は治療剤として有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法によって得られる改善剤又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満症、脂肪肝、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、虚血性心疾患等の生活習慣病患者の増加が著しく、大きな問題となっている。トリグリセリドやコレステロールなどの中性脂質の肝臓等の内臓や血液中におけるレベルの上昇が生活習慣病の主要な原因となることが知られており、中性脂質のレベルを抑制する薬剤が求められている。
中性脂質は脂肪細胞、肝細胞、及びマクロファージ等に細胞内脂質顆粒として蓄積されるが、エネルギーの備蓄という生理的意義を持つ反面、その過剰備蓄が生活習慣病の原因となっている。すなわち、細胞内脂質顆粒の増大を抑制することができれば、生活習慣病の改善につながると期待される。
脂質顆粒は「油滴」であり、脂質顆粒中に含まれるタンパク質については、ＡＤＲＰ（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（非特許文献１）等が報告されているものの、ほとんど知られていない。
【０００３】
一方、プロテインキナーゼＣは、細胞の増殖、分化、癌化及びアポトーシス等に関係する酵素であり、神経、免疫系等の情報伝達等で重要な働きをしているタンパク質をリン酸化する。プロテインキナーゼＣ ミュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｍｕ；配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、プロテインキナーゼＣ デルタ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ；配列番号：２１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）及びプロテインキナーゼＣ ニュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｎｕ；配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）はプロテインキナーゼＣのアイソフォームであり、このうちプロテインキナーゼＣ デルタは、脂肪細胞に発現することが知られている（非特許文献２）。
また、Ｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ３（以下ＰＲＧ３と略する。；配列番号：２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）はガン抑制蛋白ｐ５３依存的細胞死の際発現誘導され、通常は細胞質に局在している（非特許文献３）。Ｃａｒｇｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＰ４７（配列番号：２９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）はエンドソームからトランスゴルジネットワークへの輸送担体のレセプタータンパク質である。ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ； Ｈ１０５Ｅ３（ＮＡＤ（Ｐ） ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； Ｈ１０５Ｅ３）（配列番号：３１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）及び１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１１（１７βＨＳＤ１１；配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、ステロイドの代謝酵素の一種である。グリセロアルデヒド ３−ホスフェ−トデヒドロゲナーゼ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、脂質代謝酵素の一種である。アネクシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ；配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、ホスホリパーゼＡ２の阻害活性を有する膜蛋白質である。Ｒａｂ ５Ｃ（配列番号：３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）及びＲａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｐ １Ｂ（配列番号：３７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）はＲａｓ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅの一種である。膜ＩｇＤ結合タンパク質３１（ｍｅｍｂｒａｎｅＩｇＤ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３１；配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、Ｂ細胞受容体を構成している膜タンパク質の一つであり、その機能については不明である。
【０００４】
また、ラノステロール合成酵素（配列番号：２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、アシル−ＣｏＡ合成酵素３（配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、アシル−ＣｏＡ合成酵素４ｖａｒｉａｎｔ１（配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、及びＮＡＤＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂ５ 還元酵素（配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は脂肪酸の合成に関与する酵素である。
しかしながら、上記のタンパク質が脂質顆粒中に存在すること、及び上記のタンパク質が生活習慣病等の中性脂質の蓄積を伴う疾患に関係することは、全く知られていなかった。
【０００５】
更に、ＫＩＡＡ０７４７で表される配列番号：４に記載の塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号：２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）は、ヒト脳の新規ｃＤＮＡの１種として公知のＤＮＡであり（非特許文献４）、Ｐ６３で表される配列番号：９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ）、及びＣＧＩ４９で表される配列番号：１１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号：３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）もいずれも公知ＤＮＡであるが、その機能については不明である。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｂｒａｓａｅｍｌｅ， Ｄ． Ｌ．， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３８， ２２４９−２２６３ （１９９７）
【非特許文献２】
Ｆｒｅｖｅｒｔ Ｅ． Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ． ３１６ （ Ｐｔ ３）：８６５−７１ （１９９６）
【非特許文献３】
Ｈｉｒｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５２４（１−３）， １６３−７１， （２００２）
【非特許文献４】
Ｎａｇａｓｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ５：２７７−２８６（１９９８）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用した中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善又は治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善又は治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、脂質顆粒に含まれるタンパク質の同定を試みた。
本発明者らは、既に、中性脂質の蓄積を伴う疾患における、細胞内脂質顆粒形成のメカニズム解明の一環として、脂質顆粒を蓄積する細胞系を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞レベルでの脂質顆粒の調製方法を確立した。すなわち、自発的に脂質顆粒の蓄積を起すという特徴を有し、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルと考えられるヒト肝由来培養細胞ＨｕＨ７等を用いて、上記疾患と同様に脂質顆粒が蓄積された状態の細胞を調製した。該細胞を培養後に破砕し、平衡密度勾配遠心分離を行うことで、脂質二重膜からなるオルガネラ、可溶性タンパク質、及び比重が非常に軽い画分（油滴を含む軽比重画分）を分離精製することができる。細胞由来タンパク質のほとんどは高比重画分に含まれるが、前記軽比重画分に、脂質顆粒に局在することが知られているＡＤＲＰが存在し、脂質顆粒画分であることが確認された。
【０００９】
更に、本発明者らは、該脂質顆粒画分に含まれるタンパク質を単離し、構造決定を行った。その結果、従来は中性脂質の蓄積を伴う疾患との関連が明らかではなかった、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８（配列番号：２０〜３８）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が脂質顆粒に存在していることがわかった。
更に、配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４（配列番号：２０〜２４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒト脂肪組織で、特異的に発現していることがわかった。
【００１０】
従って、本発明者らは、中性脂質の蓄積を伴う疾患において、配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及びこれらをコードする遺伝子（配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド）が、優れた疾患マーカーであるとの知見を得た。さらに、これらの遺伝子の発現、又はこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現もしくは機能（活性）の制御を指標としたスクリーニング系は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の予防、改善又は治療剤の探索に有効であるとの知見を得た。
本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
（１） 配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、中性脂質の蓄積を伴う疾患の疾患マーカー、
（２） 中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出においてプローブ又はプライマーとして使用される請求項１に記載の疾患マーカー、
（３） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、（１）又は（２）に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程、
（４） 配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を含有する、中性脂質の蓄積を伴う疾患の疾患マーカー、
（５） 中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出においてプローブとして使用される請求項４に記載の疾患マーカー、
（６） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と（４）又は（５）に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質又はその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程、
（７） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（８） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（９） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質又はそのホモログの発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（１０） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質又はそのホモログの発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（１１） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質を配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログに接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を測定し、該機能又は活性を被験物質を接触させない場合の配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程、
（１２） 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質を配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログに接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を測定し、該機能又は活性を被験物質を接触させない場合の配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程、
（１３） 中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤の有効成分を探索するための方法である、（７）〜（１２）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（１４） 配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（１５） 配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（１６） 配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現を制御する物質が（７）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（１３）に記載の中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（１７） 配列番号：１、２、３、４、及び５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現を制御する物質が（８）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（１４）に記載の中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（１８） 配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（１９） 配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（２０） 配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量、機能又は活性を制御する物質が、（９）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（１８）に記載の、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（２０） 配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量、機能又は活性を制御する物質が、（１０）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（１９）に記載の、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（２１） 配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（２２） 配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質を有効成分とする、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、
（２３） 配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質が、（１１）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（２１）に記載の、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤、及び
（２４） 配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を制御する物質が、（１２）に記載のスクリーニング法により得られるものである、（２２）に記載の、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８： ９ （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、及び当該分野における慣用記号に従う。
【００１３】
本明細書において「遺伝子」又は「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれもが含まれる。
【００１４】
また、当該「遺伝子」又は「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」又は「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体、誘導体など）をコードする「遺伝子」又は「ＤＮＡ」が包含される（本明細書においては、これらを総括して上記特定の塩基配列で示される「遺伝子」又は「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。）。かかるホモログとしては、具体的には、後述する（１−１）項に記載のストリンジェントな条件で、前記特定塩基配列で示される「遺伝子」又は「ＤＮＡ」とハイブリダイズするものを挙げることができる。
【００１５】
例えば同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、ヒト遺伝子に対応するマウスやラットなどの他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ９０： ５８７３−５８７７， １９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、ヒト遺伝子に該当するマウスやラットなどの他生物種の遺伝子を選抜することができる。なお、遺伝子又はＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、又はイントロンを含むことができる。
【００１６】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００１７】
本明細書において「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等である「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」（例えば、同族体、変異体、誘導体など）が包含される。なお、本明細書において、これらを上記特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」又は「（ポリ）ペプチド」の「ホモログ」ともいう。例えば、上記同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に該当するマウスやラットなどの他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子（ホモログ）の塩基配列から演繹的に同定することができる。また、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加及び挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、かかる変異体としては、変異のないタンパク質又は（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
【００１８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１９】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患の有無若しくは罹患の程度を診断するために、また、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善、治療などに有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものであり、例えば、中性脂質の蓄積の亢進に関連して生体内での発現が変動する遺伝子又はタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチド及び抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチド及び抗体は、上記性質に基づいて、生体内、特に脂肪組織などで発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内、特に脂肪組織などで発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
すなわち、本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、中性脂質の蓄積を伴う疾患に伴い本発明の遺伝子が発現上昇する組織を指し、具体的には脂肪組織又は血液などを指す。
【００２０】
本発明は、前述するように、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８（配列番号：２０〜３８）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、これらのタンパク質を総称して本タンパク質ともいう。）が、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなり得るＨｕＨ７細胞において特異的に発現が増加していることを見出したこと、及びヒト脂肪組織において他のヒト組織に比べて特異的に発現が増加していることを見出したことに基づくものである。
【００２１】
従って、これらのタンパク質及びそれらをコードする遺伝子（配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９（配列番号：１〜１９）のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、これらのポリヌクレオチドを総称して本遺伝子ともいう。）は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、本タンパク質及び本遺伝子並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記中性脂質の蓄積を伴う疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体又は脂肪組織における、本タンパク質や本遺伝子の発現の検出、又は該遺伝子の変異又はその発現不全の検出は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の解明や診断に有効に利用することができる。
以下、本タンパク質及び本遺伝子について、具体的な用途を説明する。
【００２２】
（１）中性脂質の蓄積を伴う疾患の疾患マーカー及びその応用
（１−１） ポリヌクレオチド
本発明は、前述するように、配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなり得るＨｕＨ７細胞において特異的に発現が増加しているという知見、及び配列番号：２０〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質がヒト脂肪組織において他のヒト組織に比べて特異的に発現が増加しているという知見を発端に、これらをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）の発現の有無や発現の程度を検出することによって上記中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患の有無や罹患の程度が検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。すなわち、本発明は、被験者における上記遺伝子の発現の有無又はその程度を検出することによって、被験者について中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患の有無又は罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用なポリヌクレオチドを提供するものである。
【００２３】
本発明における配列番号：１〜１９に記載の塩基配列を有する遺伝子は、公知であり、当業者にとって公知の方法で取得することができる。
すなわち配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子は、プロテインキナーゼＣ ミュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｍｕ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２７４２に記載されている。
配列番号：２に記載の塩基配列からなる遺伝子は、プロテインキナーゼＣ デルタ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００６２５４に記載されている。
配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子は、プロテインキナーゼＣ ニュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｎｕ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５８１３に記載されている。
配列番号：４に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ヒト脳の新規ｃＤＮＡの１種としてとして公知であり、その取得方法及び配列はＮａｇａｓｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ５：２７７−２８６（１９９８）、又はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５２９２に記載されている。該遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、ラットＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列と８７．６％のホモロジーを有し、ヒトＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎであると考えられる。ＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎはｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎを有し、カルシウム依存的なリン脂質結合に関与する（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｎ．Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４３１：５２５−５３０ （１９９９））。
配列番号：５に記載の塩基配列からなる遺伝子は、Ｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ３（ＰＲＧ３）として公知であり、その取得方法及び配列は、Ｈｉｒｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５２４（１−３）， １６３−７１， （２００２）又はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０３２７９７に記載されている。
配列番号：６に記載の塩基配列からなる遺伝子は、アシル−ＣｏＡ合成酵素４ｖａｒｉａｎｔ１遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４４５８に記載されている。
配列番号：７に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ラノステロール合成酵素遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２３４０に記載されている。
配列番号：８に記載の塩基配列からなる遺伝子は、アシル−ＣｏＡ合成酵素３遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４４５７に記載されている。
配列番号：９に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ｐ６３として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００６８２５に記載されている。
配列番号：１０に記載の塩基配列からなる遺伝子は、Ｃａｒｇｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＰ４７として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５８１７に記載されている。
配列番号：１１に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ＣＧＩ４９として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１６００２に記載されている。
配列番号：１２に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ； Ｈ１０５Ｅ３（ＮＡＤ（Ｐ） ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； Ｈ１０５Ｅ３）遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５９２２に記載されている。
配列番号：１３に記載の塩基配列からなる遺伝子は、グリセロアルデヒド ３−ホスフェ−トデヒドロゲナーゼ遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２０４６に記載されている。
配列番号：１４に記載の塩基配列からなる遺伝子は、ＮＡＤＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂ５ 還元酵素として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０００３９８に記載されている。
配列番号：１５に記載の塩基配列からなる遺伝子は、アネクシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４０３９に記載されている。
配列番号：１６に記載の塩基配列からなる遺伝子は、Ｒａｓ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｒａｂ５Ｃとして公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４５８３に記載されている。
配列番号：１７に記載の塩基配列からなる遺伝子は、膜ＩｇＤ結合タンパク質遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５７４５に記載されている。
配列番号：１８に記載の塩基配列からなる遺伝子は、Ｒａｓ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅＲａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｐ １Ｂ遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５６４６に記載されている。
配列番号：１９に記載の塩基配列からなる遺伝子は、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１１（１７βＨＳＤ１１）遺伝子として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＢＣ０２１６７３に記載されている。
【００２４】
また、本発明のポリヌクレオチドは、後述の（３）項に記載するような中性脂質の蓄積を伴う疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００２５】
本発明の疾患マーカーは、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の１又は複数の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
【００２６】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、上記各配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又は上記各塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：Ｔ及びＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８７， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ） に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該正鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２７】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列又はその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２８】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２９】
本発明の中性脂質の蓄積を伴う疾患の疾患マーカーは、具体的には配列番号：１〜１９のいずれかに記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列若しくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される、少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３０】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法においては配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物又は生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００３１】
そのような本発明の疾患マーカーは、検出（認識）する対象の遺伝子（配列番号：１〜１９）に応じて、配列番号：１〜１９のいずれかに示される塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ ３（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。具体的には配列番号：１〜１９のいずれかに示される塩基配列をｐｒｉｍｅｒ ３又はベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマー又はプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマー又はプローブとして使用することができる。
【００３２】
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３３】
（１−２）プローブ又はプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明の疾患マーカーは、上記各遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、又は該ＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００３４】
上記疾患マーカーを中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
【００３５】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができ、これによって中性脂質の蓄積を伴う疾患に関連する配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００３６】
測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて適宜選択することができる。該試料は、例えば、被験者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３７】
また、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の生体組織における発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該ＤＮＡチップのプローブとして使用することができる（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ａ， Ｂ， Ｃ， Ｄ， Ｅの場合、２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。本発明の疾患マーカーをプローブとするＤＮＡチップを、生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせることにより、本発明の疾患マーカー（プローブ）と標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体が形成される。該複合体を該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の生体組織中での発現の有無又は発現レベル（発現量）が評価できる。
【００３８】
なお、上記ＤＮＡチップは、配列番号：１〜１９のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子と結合し得る１種又は２種以上の本発明疾患マーカーを含んでいればよい。複数の疾患マーカーを含むＤＮＡチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の、発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
【００３９】
本発明の疾患マーカーは、中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断は、被験者の脂肪組織と正常者の脂肪組織における配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。
【００４０】
この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の脂肪組織と正常者の脂肪組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。
【００４１】
例えば、配列番号：１〜１９に記載の塩基配列を有する遺伝子は、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなるＨｕＨ７細胞において、脂質顆粒組織で発現していた。従って、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が、被験者の脂肪組織で特異的に発現しているか、或いは、該発現量が正常者の脂肪組織の発現量と比べて２倍以上、より好ましくは３倍以上増大していれば、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患が疑われる。この場合の中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出（診断）には、上記遺伝子に対応するいずれかに記載の塩基配列（配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが有用である。
【００４２】
中でも、配列番号：１〜５のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常なヒト組織において、他の組織に比べて脂肪組織における発現量が大きく、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドからなく本発明の疾患マーカーは特に有用である。
【００４３】
本発明において中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に脂肪組織における配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記遺伝子群の２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群のすべての遺伝子について、その発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。
【００４４】
（１−３）抗体
本発明は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の疾患マーカーとして、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現産物（タンパク質）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００４５】
なお、配列番号：１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：４に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：６に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：８に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１０に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：２９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１２に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１３に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１４に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１５に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１６に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１７に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、例示することができる。
【００４６】
本発明における配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、公知であり、当業者にとって公知の方法で取得することができる。
すなわち配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、プロテインキナーゼＣ ミュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｍｕ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２７４２に記載されている。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列からなる遺伝子タンパク質は、プロテインキナーゼＣ デルタ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｄｅｌｔａ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００６２５４に記載されている。
。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、プロテインキナーゼＣ ニュー（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｎｕ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５８１３に記載されている。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒト脳の新規ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質として公知で有り、その取得方法及び配列はＮａｇａｓｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． ５：２７７−２８６（１９９８）、又はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５２９２に記載されている。該タンパク質は、ラットＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列と８７．６％のホモロジーを有し、ヒトＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎであると考えられる。ＧＬＵＴ４ ｖｅｓｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎはｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎを有し、カルシウム依存的なリン脂質結合に関与する（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｎ．Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４３１：５２５−５３０ （１９９９））。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ３（ＰＲＧ３）として公知であり、その取得方法及び配列は、Ｈｉｒｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５２４（１−３）， １６３−７１， （２００２）、又はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０３２７９７に記載されている。
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、アシル−ＣｏＡ合成酵素４ｖａｒｉａｎｔ１として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４４５８に記載されている。
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ラノステロール合成酵素として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２３４０に記載されている。
配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、アシル−ＣｏＡ合成酵素３として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４４５７に記載されている。
配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ｐ６３として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００６８２５に記載されている。
配列番号：２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｃａｒｇｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＰ４７として公知でありその配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５８１７に記載されている。
配列番号：３０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＣＧＩ４９として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００１６００２に記載されている。
配列番号：３１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＮＡＤ（Ｐ）依存性ステロイドデヒドロゲナーゼ； Ｈ１０５Ｅ３（ＮＡＤ（Ｐ） ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； Ｈ１０５Ｅ３）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５９２２に記載されている。
配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、グリセロアルデヒド ３−ホスフェ−トデヒドロゲナーゼとして公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００２０４６に記載されている。
配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＮＡＤＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢ５ 還元酵素として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０００３９８に記載されている。
配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、アネクシンＩＩ（ａｎｎｅｘｉｎ ＩＩ）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４０３９に記載されている。
配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｒａｓ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅの一種であるｒａｂ５Ｃとして公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００４５８３に記載されている。
配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、膜ＩｇＤ結合タンパク質３１（ｍｅｍｂｒａｎｅ ＩｇＤ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３１）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿００５７４５に記載されている
配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｒａｓ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅの一種であるＲａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｐ １Ｂとして公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．：ＮＭ＿０１５６４６に記載されている。
配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１１（１７βＨＳＤ１１）として公知であり、その配列はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．： ＢＣ０２１６７３に記載されている。
【００４７】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、上記タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、更に好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００４８】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ． Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２〜１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ． Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４〜１１．１１）。
【００４９】
抗体の作製に免疫抗原として使用される配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：１〜１９）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８３）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＤＭ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ （１９８５））などに準じて行うことができる。
【００５０】
具体的には、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これら配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：２０〜３８）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５１】
なお、本発明の配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質には、配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号２０〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ改変前の元のタンパク質と免疫学的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００５２】
なお、ここで配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、各々対応するタンパク質と生化学的又は薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができる。また配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ各対応するタンパク質に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００５３】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／又は免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が、置換前のタンパク質（配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の生物学的機能及び／又は免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００５４】
また本発明の抗体は、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）（又は当該タンパク質の相同物）の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、各々対応する上記のタンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、配列番号：１〜１９のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２０〜３８のいずれかに示されるアミノ酸配列）において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
【００５５】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００５６】
本発明の抗体は配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）（又は当該タンパク質の相同物）に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質（その相同物を含む）を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内における上記タンパク質（その相同物を含む）発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無又はその程度を検出することによって、該被験者が中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患しているか否か又はその疾患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記抗体は、後述の（３−２）項に記載するような中性脂質の蓄積を伴う疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００５７】
具体的には、患者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製して、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、上記タンパク質を検出することができる。
【００５８】
中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断に際しては、被験者の脂肪組織における配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）のいずれか少なくとも１つの量と、正常な脂肪組織における当該タンパク質の量との違いを判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タンパク質のある／なし、あるいはタンパク量の違いが２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。
【００５９】
具体的には、配列番号：２０〜３８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなり得るＨｕＨ７細胞において発現誘導（増大）を示したので、被験者の脂肪組織における該遺伝子の発現産物（配列番号：１〜１９のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質））の量が正常な脂肪組織の発現産物量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多いことが判定されれば、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患が疑われる。
更に、配列番号：２０〜２４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１〜５に記載の塩基配列を有する遺伝子）は、ヒト脂肪組織において他の組織に比べて特異的に発現しており、疾患マーカーとしてより好ましい。
【００６０】
（２）中性脂肪の蓄積を伴う疾患の検出方法（診断方法）
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した中性脂肪の蓄積を伴う疾患の検出方法（診断方法）を提供するものである。
【００６１】
具体的には、本発明の検出方法は、被験者の生体組織、特に脂肪組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれる中性脂質の蓄積を伴う疾患に関連する配列番号：１〜１９のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル（発現量）、又はこれらの遺伝子に由来するタンパク質を検出し、その発現量又はそのタンパク質量を測定することにより、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患の有無又はその程度を検出（診断）するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えば中性脂質の蓄積を伴う疾患患者において、該疾患の改善のために治療剤を投与した場合における、該疾患の改善の有無又はその程度を検出（診断）することもできる。
【００６２】
本発明の診断方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ） 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ） 生体試料中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、又は配列番号：１〜１９のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の量、具体的には配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ） （ｂ）の結果をもとに、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程。
【００６３】
ここで用いられる生体試料は、被験者の生体組織、特に海馬組織、該組織から調製されるＲＮＡ若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、又は上記組織から調製されるタンパク質である。かかるＲＮＡ、ポリヌクレオチド又はタンパク質は、被験者の生体組織、特に海馬組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００６４】
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００６５】
（２−１） 測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用する場合
診断に用いる生体試料としてＲＮＡを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は該ＲＮＡ中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。
【００６６】
この場合、本発明の検出方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ） 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ） 上記工程によって本発明の疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡ又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ） （ｂ）の結果をもとに、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程。
【００６７】
本発明の中性脂質の蓄積を伴う疾患の検出方法（診断方法）は、特に測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用して、該ＲＮＡ中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、上記検出する遺伝子の塩基配列に応じて、前述する本発明の疾患マーカー（配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマー又はプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００６８】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された標識疾患マーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖について、該疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質など）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）又は蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、予めＲＩや蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＭＥ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００７０】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖又は２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡをハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記ＤＮＡチップとして、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ａ， Ｂ，Ｃ， Ｄ， Ｅを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者ＲＮＡ中の配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
【００７１】
（２−２） 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の検出方法（診断方法）は生体試料中に存在する、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を検出し、その量（レベル）を測定することによって実施される。より詳しくは、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を認識する抗体を疾患マーカーとして用いて、ウェスタンブロット法などの公知方法で、上記タンパク質を検出、定量する方法を挙げることができる。
【００７２】
ウェスタンブロット法は、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質などで標識した標識抗体（一次抗体に結合する標識抗体）を用いて、標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製）で測定することもできる。
【００７３】
なお、上記において測定対象とする配列番号：２０〜２２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、キナーゼとして公知であり、該タンパク質の量と機能乃至活性とは一定の相関関係を有している。従って、上記タンパク質の量の測定に代えて、該タンパク質のキナーゼとしての機能又は活性の測定を行うことによっても、本発明の中性脂肪の蓄積を伴う疾患の検出（診断）を実施することができる。すなわち本発明は、配列番号：２０〜２２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の公知の機能又は活性を指標として、これを公知の方法（具体的には後述の（３−３）項を参照）に従って測定、評価することからなる、中性脂肪の蓄積を伴う疾患の検出（診断）方法をも包含する。
【００７４】
（２−３）中性脂肪の蓄積を伴う疾患の診断
中性脂質の蓄積を伴う疾患の診断は、具体的には、被験者の生体組織、特に脂肪組織における配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、又は配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現産物であるタンパク質の量（レベル）を、上記と対応する正常な生体組織（特に、正常な脂肪組織における当該遺伝子発現レベル又は当該タンパク質の量（レベル）と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００７５】
この場合、正常な生体組織、特に脂肪組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡ又はタンパク質）が必要であるが、これらは中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患していない人の生体組織、特に脂肪組織をバイオプシ等で採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患していない人」とは、例えば、肥満指数（ＢＭＩ：Ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）が２５未満である、肥満ではないと診断された人をいう。なお、当該「中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。以下、具体的な診断方法について、脂肪組織から採取調製した生体試料を例として記載する。
【００７６】
被験者の脂肪組織と正常な脂肪組織（中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患していない人の脂肪組織）との遺伝子発現レベル又はその発現産物（タンパク質）量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な海馬組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた上記遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質の量（レベル）の平均値又は統計的中間値を予め求めておき、これを正常者の遺伝子発現レベル又はその発現産物（タンパク質）の量（正常値）として、これらを被験者における測定レベル又は測定値と比較することができる。
【００７７】
被験者が、中性脂質の蓄積を伴う疾患に罹患しているかどうかの判断は、該被験者の脂肪組織における配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、又はその発現産物（タンパク質）の量（レベル）、より具体的には配列番号：２０〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）が、正常者のそれらと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上の変動があるか（多いか又は少ないか）否かを指標として行うことができる。
【００７８】
具体的には、被験者において、上記遺伝子のうち配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、又はその発現産物（タンパク質）の量（レベル）が、正常者の上記に対応する遺伝子の遺伝子発現レベル又は発現産物の量（レベル）に比べて多い場合には、該被験者について中性脂質の蓄積を伴う疾患への罹患が疑われる。
【００７９】
なお、上記方法のうち、（２−１）生体試料としてＲＮＡを利用して中性脂質の蓄積を伴う疾患を検出（診断）する場合、すなわち遺伝子の発現の有無又は遺伝子発現レベル（発現量）から中性脂質の蓄積を伴う疾患を検出（診断）する場合は、検出（診断）の精度や正確性を高めるために、配列番号：１〜１９に示される遺伝子のうち２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群のすべてについて、発現の有無又は発現のレベル（発現量）を評価し、その結果から中性脂質の蓄積を伴う疾患を検出（診断）することが望ましい。
【００８０】
また、前記（２−２）測定対象物としてタンパク質を利用して中性脂質の蓄積を伴う疾患を検出（診断）する場合も、上記と同様に、生体試料について、配列番号：１〜１９に示される遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（具体的には配列番号：２０〜３８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）のうちの２以上、好ましくは複数個のレベルを評価し、その結果から中性脂質の蓄積を伴う疾患を検出（診断）することが望ましい。
【００８１】
複数個の遺伝子又はタンパク質について評価を行う場合には、個々の遺伝子又はタンパク質での評価をスコア化し、総合的に中性脂質の蓄積を伴う疾患を診断することが可能である。すなわち、上記の遺伝子又はタンパク質４個の遺伝子又はタンパク質について評価を行い、うち２個以上の遺伝子又はタンパク質について上記基準に基づいて中性脂質の蓄積を伴う疾患の病態が疑われると評価される場合は、該疾患である可能性が高いと診断できる。なお、この場合、評価する遺伝子又はタンパク質の数、スコアあるいは診断基準は限定されない。
【００８２】
（３）候補薬のスクリーニング方法
（３−１）遺伝子の発現を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ） 被験物質と、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ） 被験物質を接触させた細胞について、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ） 上記の比較結果に基づいて、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの遺伝子発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【００８４】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子を発現し得る細胞を挙げることができる。かかる細胞としては、具体的には、ヒトＨｕＨ７細胞、マウスマクロファージ細胞株（Ｊ７７４）、マウス３Ｔ３Ｌ１細胞、又はマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ から入手可能）などを挙げることができる。好ましくはヒトＨｕＨ７細胞である。また、かかる細胞としては、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のホモログ、すなわち当該遺伝子のヒト以外の生物種における同族体又は変異体をコードする遺伝子を発現し得る細胞を用いることもできる。例えば、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有するヒト遺伝子に対応するラットホモログ（遺伝子）やマウスホモログ（遺伝子）を内在的に発現している細胞を用いることができる。また、かかる細胞は、変性ＬＤＬ（アセチル化処理）など、マクロファージの泡沫化の亢進を惹起しうる物質を添加したマクロファージ細胞株の形でスクリーニングに用いることもできる。さらに本発明のスクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
また、細胞として、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子を導入した遺伝子導入細胞を用いることもできる。該遺伝子導入に用いられる宿主細胞、すなわちＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、ＨｅＬａ、２９３等のヒト由来細胞、及びＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
【００８５】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織及び／又は細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、及びこれらの混合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００８６】
本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ所望遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００８７】
実施例に示すように、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなり得るＨｕＨ７細胞では、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が、脂質顆粒に発現している。この知見から、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルの上昇（遺伝子発現の誘導・増大）は、中性脂質の蓄積を伴う疾患と関連していると考えられる。本発明のスクリーニング方法には、これら遺伝子の発現レベルの上昇（遺伝子発現の誘導・増大）を指標として、当該遺伝子の発現を制御する物質（発現量を変動させる物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、中性脂質の蓄積を伴う疾患の予防、改善ないし治療剤の有効成分となる候補物質が提供できる。
【００８８】
すなわち、本発明スクリーニング方法は、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルの上昇（発現誘導）が、中性脂質の蓄積を伴う疾患と関連することを利用するものである。よって、該中性脂質の蓄積を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（中性脂質の蓄積を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルの変動が指標とされる。
【００８９】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを制御（発現誘導・抑制）する物質を探索するものであり、斯くして得られる物質を中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補化合物として提供するものである。
【００９０】
本発明スクリーニング方法に従う候補物質の選別は、具体的には配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログを発現している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における上記各遺伝子の発現レベルが被験物質（候補物質）を添加しない細胞における同遺伝子の発現レベルに比して低くなること／高くなることをもって、行うことができる。また、本遺伝子又はそのホモログの発現に発現誘導物質［例えば変性ＬＤＬ（アセチル処理）等］を刺激剤として必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質によって誘導される発現が候補物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなること／高くなることをもって行うことができる。
【００９１】
上記いずれかの遺伝子の発現を制御する物質のうち、発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞の配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることを指標にして行うことができる。また、これら配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子遺伝子のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００９２】
また、上記いずれかの遺伝子の発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞の配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して高くなることをもって、行うことができる。また、これら配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子遺伝子のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００９３】
このような遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前述した細胞から調製したＲＮＡ又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと本発明疾患マーカーとを用いて、前記（２−１）項に記述したように、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法や、ＤＮＡチップなどを利用して実施できる。指標とする遺伝子発現レベルの変動（発現の抑制・減少又は誘導・増大）の程度としては、被験物質（候補物質）を添加した細胞における本遺伝子又はこれらのホモログの発現が、被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の変動（減少又は増大）を例示することができる。
【００９４】
また、本遺伝子又はこれらのホモログの、発現レベルの検出及び定量は、各遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。この意味において、本発明でいう配列番号：１〜１９のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの概念には、該遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【００９５】
上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。ここで遺伝子又は又はそのホモログ遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。融合遺伝子の作成、及びマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの精度や正確性を高めるためには、前記特定遺伝子の２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群のすべての遺伝子について被験物質による遺伝子発現レベルを評価し、候補物質を選別することが望ましい。複数個の遺伝子について評価する場合には、個々の遺伝子での評価をスコア化し、総合的に候補物質を選別することが可能である。例えば、一つの被験物質を用いて、上記の遺伝子のすべての遺伝子について評価を行い、該被験物質がそのうちの２個以上の遺伝子に関して中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補化合物であると上記基準から評価される場合、該被験物質は候補化合物である可能性が高いと判断できる。この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは判断基準は限定されない。
【００９７】
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質は、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現制御剤として位置づけることができる。これらの物質は、生体内において配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御することによって、脂質顆粒の蓄積の亢進を抑制し、中性脂質の蓄積を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）し得ると考えられる。よって、これらの物質は、中性脂質の蓄積を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００９８】
斯くして選抜取得される被験物質は、中性脂質の蓄積を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００９９】
上記に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに中性脂質の蓄積を伴う疾患モデル動物を用いた薬効試験、モデル動物及び正常動物を用いた安全性／体内動態試験、さらに中性脂質の蓄積を伴う疾患患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な中性脂質の蓄積を伴う疾患改善又は治療剤を選別することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）又は遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１００】
（３−２）タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：２０〜３８のいずれか記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御する（減少させる／増大させる）物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
【０１０１】
（ａ）被験物質と配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１０２】
本発明スクリーニングに用いられる細胞は、内在性及び外来性を問わず、配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のいずれかを発現し、発現産物としての配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質を有する培養細胞全般を挙げることができる。ここで配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の発現は、遺伝子産物であるタンパク質を公知のウエスタン法にて検出することにより、容易に確認することができる。該細胞としては、具体的には、前記（３−１）項の（１）〜（３）に記載したような、ＨｕＨ７細胞等の脂質顆粒を含む細胞や、種々の刺激剤で処理したマクロファージ系細胞、又は本遺伝子のいずれかを導入した株化細胞などが挙げられる。また当該細胞の範疇には、その細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分なども含まれる。
【０１０３】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質又はこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞や細胞膜画分と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１０４】
実施例に示すように、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルとなり得るＨｕＨ７細胞において、特異的に配列番号：２０〜３８のいずれかのアミノ酸配列を含む遺伝子が発現上昇している。この知見から、これら本遺伝子及び本タンパク質の発現亢進は中性脂質の蓄積を伴う疾患と関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これら配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の発現レベルを指標として、その発現量を変動させる物質を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、中性脂質の蓄積を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（中性脂質の蓄積を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
【０１０５】
すなわち本発明のスクリーニング方法は、配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現量を変動させる物質を探索することによって、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【０１０６】
候補物質の選別は、具体的には配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における前記本発明タンパク質のタンパク量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の発現・産生に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばインシュリン、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、プロスタグランジンＪ２活性を有する物質等］によって誘導される当該タンパクの産生が被験物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１０７】
用いられる細胞としては、例えば結腸由来細胞であるＣａｃｏ−２細胞、ＨＴ−２９細胞又はＣＯＬＯ ２０５ 細胞等が挙げられる。
【０１０８】
上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を低下（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する候補物質の選別は、具体的には配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の蛋白量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して低くなることを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１０９】
上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する候補物質の選別は、具体的には配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の蛋白量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して高くなることを指標として、行うことができる。また、これら配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１１０】
本発明のスクリーニング方法にかかる配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の産生量は、前述したように、例えば抗体に関する本発明疾患マーカー（例えば配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを認識する抗体）を用いたウェスタンブロット法などの公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （アマシャム ファルマシアバイオテク社製）を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【０１１１】
（３−３） タンパク質の機能（活性）を指標とするスクリーニング方法
本発明は、配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の機能（活性）をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
【０１１２】
（ａ）被験物質を 配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性を測定し、該機能又は活性を被験物質を接触させない場合の配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法おいては、配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の公知の機能・活性に基づく如何なる機能・活性測定方法をも利用することができる。すなわち、配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の公知の機能・活性測定系に被験物質を添加し、当該配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の公知の機能・活性を制御（亢進・抑制・促進・阻害）する被験物質を、中性脂質の蓄積を伴う疾患に対して改善／治療効果を有する候補物質として選択するスクリーニング方法であれば、本発明のスクリーニング方法の範疇に含まれる。
【０１１４】
前記本発明のスクリーニングは、配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させることにより行うことができる。すなわち、配列番号：２０〜３８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む水溶液としては、通常の水溶液の他、これらのタンパク質を含む細胞溶解液、細胞破砕液、核抽出液あるいは細胞の培養上清などを例示することができる。
【０１１５】
また、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、配列番号：２０〜３８に記載のタンパク質を発現し得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、ＨｕＨ７細胞、又は配列番号：２０〜３８に記載の遺伝子を導入した株化細胞などを用いることができる。
また本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例えば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
前記スクリーニングにおいて用いられる配列番号：２０〜３８に記載のタンパク質は公知のタンパク質であり、前記（１−３）に記述したように、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養、及び必要に応じて培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８３）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＤＭ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ （１９８５））などに準じて行うことができる。
【０１１６】
実施例に示すように、中性脂質の蓄積を伴う疾患のモデルであるＨｕＨ７細胞中の脂肪顆粒で、特異的に配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が発現上昇している。この知見から、本タンパク質の機能（活性）亢進は、中性脂質の蓄積を伴う疾患と関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これら配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の機能（活性）を指標として、該タンパク質の機能（活性）を制御する物質を探索する方法が包含される。本発明スクリーニング方法によれば、配列番号：２０〜３８のいずれか記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性を制御する物質を探索でき、かくして中性脂質の蓄積を伴う疾患の緩和／抑制作用を有する（中性脂質の蓄積を伴う疾患に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質が提供される。
【０１１７】
本発明タンパク質の機能（活性）制御の１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を抑制（低下）させる方向に制御する物質の探索は、例えば配列番号：１〜１９のいずれかの塩基配列を含む遺伝子を含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞又は細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して低くなることを指標として行うことができる。
【０１１８】
また本発明タンパク質の機能（活性）制御のもう１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を亢進（上昇、増加）させる方向に制御する物質の探索は、例えば配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む水溶液、細胞又は該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞又は細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して高くなることを指標として行うことができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質の機能又は活性を制御する物質を探索することによって、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分となる候補物質を提供するものである。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質（配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質又はこれらを含む試料（被験試料）を上記水溶液、細胞又は細胞画分と接触させることにより行われる。被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１１９】
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、プロテインキナーゼＣ ミュー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｍｕ）であり、その活性は公知である。配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、プロテインキナーゼＣ デルタ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｅｌｔａ）であり、その活性は公知である。配列番号：２３に記載のタンパク質は、プロテインキナーゼＣ ニュー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ Ｎｕ）であり、その活性は公知である。従って、配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能（活性）の測定方法としては、プロテインキナーゼＣ活性を測定する方法が挙げられる。
【０１２０】
配列番号：２０〜２２に記載のタンパク質の機能又は活性に基づくスクリーニング方法としては、以下の方法が例示される。
【０１２１】
すなわち、プロテインキナーゼＣによる、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰから基質タンパク質への放射性リン酸の転移活性を測定することができる。基質としては、通常ヒストンタンパク質を用い、プロテインキナーゼＣと反応後、カルシウム−リン脂質依存性に増加するリン酸転移活性を、基質タンパク質に取り込まれた３２Ｐの放射活性を測定することにより求め、これをプロテインキナーゼＣの活性とする。表１に標準的な反応液の組成例を示す。
【表１】
プロテインキナーゼＣは自己リン酸化能をもつためＡＴＰとプロテインキナーゼＣは、反応中以外は共存させず、いずれか一方を加えることで酵素反応を開始させる。反応は、３０℃でおこない、一定時間後２０％トリクロロ酢酸１ｍｌを加えて反応を停止させる。遠心操作で酸不溶性タンパク質をチューブの底に固着させ、１Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌにて可溶化し、チェフレンコ効果を利用して放射能を測定する。ヒストンタンパク質の代わりに合成ペプチドを基質として用いる場合は、上記の反応組成の容量を全て１／４に縮小した実験系にすればよく、この場合、反応の停止は、３００ｍＭのリン酸で行い、全量を直径２ｃｍのホスホセルロースディスクに吸着させ、７５ｍＭのリン酸溶液にて洗浄後、風乾し、放射能を測定する。
被験物質のプロテインキナーゼＣ阻害活性を測定する場合には、反応液中に阻害物質を加え、一定時間反応後、酵素反応により基質に取り込まれた放射活性を、被験物質を加えない場合と比較することにより、被験物質のプロテインキナーゼＣ阻害活性を測定することができる。
上記アッセイに用いられる基質としては、前記ヒストンタンパク質のほかに、プロタミン、グリコーゲンホスホリラーゼキナーゼ、フィブリノーゲン、リボソームタンパク質Ｓ６、トロポニン、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ２、ビンキュリン、フィラミン、ホスホランバン、又はミオシンＬ鎖キナーゼ等が挙げられる。
【０１２３】
かくして選抜取得される被験物質は、中性脂質の蓄積を伴う疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補となる。
【０１２４】
なお、上記（３−１）〜（３−３）に記載するスクリーニング方法は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤の候補物質を選別するのみならず、中性脂質の蓄積を伴う疾患の既存の若しくは新規な改善又は治療剤（候補薬）が、配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子のいずれかの発現を制御するか否か、あるいは配列番号：２０〜３８に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの発現若しくは機能・活性を制御するか否かを評価、確認するためにも用いることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法の範疇には、候補物質の探索のみならず、このような評価あるいは確認を目的とするものも含まれる。
【０１２５】
また、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、上記に掲げる各本発明タンパク質をコードする遺伝子について、あらかじめ実験により、該遺伝子の発現を抑制する物質が中性脂肪の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分（候補物質）として有用なのか、また発現を誘導する物質が中性脂肪の蓄積を伴う疾患の改善剤又は治療剤の有効成分（候補物質）として有用なのかを判断することは可能であり、その具体的な方法については前述の通りである。当該実験によって本発明遺伝子の発現抑制物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の抑制を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができ、また当該実験によって本発明遺伝子の発現誘導物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の亢進を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができる。
【０１２６】
上記（３−１）又は（３−２）に記載する本発明のスクリーニング方法によって選択された制御物質又は候補物質は、さらに中性脂質の蓄積を伴う疾患の動物モデルとして周知である動物モデルなどを用いた薬効試験、安全性試験、さらに中性脂肪の蓄積を伴う疾患に罹患した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な中性脂肪の蓄積を伴う疾患の改善又は治療剤を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）又は遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１２７】
（４）中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善・治療剤
本発明は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善・治療剤を提供するものである。
【０１２８】
本発明は配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質（配列番号：２０〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の発現が中性脂質の蓄積を伴う疾患と関連しているという新たな知見から、（１）配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を変動させる物質が、上記疾患の改善又は治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明の中性脂質の蓄積を伴う疾患の改善・治療剤は配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を変動させる物質を有効成分とするものである。
【０１２９】
当該有効成分となる配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現制御物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って化学・生化学的手法により、若しくは工業的に製造されたものであってもよい。
【０１３０】
かかる発現制御物質（発現抑制（減少）物質、あるいは発現誘導（増大）物質）は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与又は非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１回ないし数回に分けて投与することができる。
【０１３１】
上記有効成分とする物質がＤＮＡによりコードされるものの場合、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分が配列番号：１〜１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１３２】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【０１３３】
実施例１ プロテオーム解析
（１）脂質顆粒画分の調製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＨｕＨ７は、自発的な脂質顆粒蓄積をおこす細胞株である。ＨｕＨ７細胞の培養は１０％ＦＣＳ（血清）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ 培地を用いて３７℃でおこない、培地を３−５日ごとに交換した。脂質顆粒を単離するために、細胞を６０ｍｍのディシュ２０枚を用いて１ディシュあたり１，０００，０００個の細胞をまいて７日間培養した。Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ 及びヘマトキシリンにて染色した結果を図１に示した。図１より、ＨｕＨ７細胞が脂肪顆粒を蓄積していることがわかる。細胞をトリプシンではがし、１０００ｇで遠心することにより細胞を集めて脂質顆粒を単離した。
１．７３ ｍｌのＨｕＨ７細胞に８．５５％ ショ糖含有の可溶化バッファー（２０μｇ／ｍｌ になるようにＰＭＳＦを添加）を細胞と同量加えてホモゲナイザーでホモゲナイズした。ホモゲナイズ後、１０００ｇで２回遠心して脱核した溶液（３．３４ｍｌ）に７０％ ショ糖含有の可溶化バッファーを１．５ｍｌ加え、ショ糖の終濃度を２６％に調整した。１６ＰＡチューブ（日立）に３５％、４３％、５１％ ショ糖含有の可溶化バッファー（１０μｇ／ｍｌ になるようにロイペプチン、ペプスタチン、キモスタチン、アンチパインを添加）を段階的に重層し、その上にショ糖濃度を２６％に調整した脱核後上清を重層した。さらに、その上に２％、１０％、１８％ ショ糖含有の可溶化バッファーを段階的に重層した。液量は２％ ショ糖含有の可溶化バッファーが３．６ ｍｌ、１０％、１８％、３５％、４３ショ糖含有の可溶化バッファーが１．６ ｍｌ、５１％ ショ糖含有の可溶化バッファーが１．０ ｍｌ、脱核後上清（２６％ ショ糖含有）は４．８５ ｍｌであった。重層した試料を超遠心機６５Ｐ−７（日立）、ローターＲＰＳ−２８ＳＡ−１（日立）を用いて２℃で２４０００ｒｐｍ 、３時間 超遠心し、遠心後にチューブの溶液を上から０．８ｍｌずつ、１９のフラクションに分けて回収した。
各フラクションに含まれている蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９．５％ アクリルアミドゲル）を用いて分離し、クマシーブルー染色により検出した。泳動サンプルの調製は、各フラクション３μｌにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用 サンプル処理バッファー ５μｌとＤＤＷ ５μｌを混合し、７５℃ で２０ ｍｉｎ熱処理することによりおこなった。
また、各フラクション中のトリアシルグリセロール含量を薄層クロマトグラフィーにより解析した。ショ糖密度勾配遠心の各画分７．５μｌをエーテル、クロロホルムで抽出し、ＴＬＣ プレート （Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０、ＭＥＲＣＫ） にスポットし、ヘキサン／クロロホルム／酢酸 ＝ ８０／２０／１にて展開した。展開後、風乾したＴＬＣ プレートを３％ Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯ２）２、８％ リン酸で染色し、１３０℃で加熱してトリアシルグリセロールのスポットを検出した。結果を図２に示した。脂質二重膜からなるオルガネラや可溶性蛋白は、中性脂質に富む脂質顆粒に比べ重いため、チューブの底に沈み、脂質顆粒は最上部から回収される（図２中フラクション１）。ショ糖密度勾配遠心分画によって得られた１９個のフラクションのうち、最も比重の小さいフラクション１にのみ顕著な白濁が見られた。また、トリアシルグリセロールはフラクション１にのみ検出され、フラクション１が細胞内脂質顆粒画分であることを支持していた。大量に細胞内脂質顆粒画分を調製し、回収されたＨｕＨ７細胞株脂肪顆粒画分１５０μｇを用いＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこない、クマ−シーブルーでタンパク質染色をおこなった。レーン１に細胞の総抽出液をレーン２に精製した脂肪顆粒画分をアプライした。結果を図３に示した。
【０１３４】
（２）タンパク質バンドのトリプシン消化
次に、脂肪顆粒画分をアプライしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから目的とするタンパク質バンドを切り出し、エッペンドルフチューブに移し、５０％アセトニトリル／５０ｍＭ炭酸水素アンモニア溶液で洗浄後、スピードバックで乾燥させた。乾燥後、１０ｍＭ ＤＴＴ／５０ｍＭ炭酸水素アンモニア溶液を添加し、５６℃で１時間反応後、５０ｍＭヨウ化アセトアミド／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を加え、３０分間室温で反応させることにより、還元アルキル化をおこなった。次に、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液とアセトニトリルで交互に数回ゲルの洗浄をおこない、スピードバックで乾燥させた。乾燥させたゲルに１２．５ｎｇ／μｌのトリプシン／２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を添加し、３７℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで酵素消化を実施した。酵素消化後、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液とアセトニトリルでゲルからペプチドを抽出し、スピードバックで乾燥後、１０μｌの０．１％ＴＦＡで再溶解した。再溶解後、サンプルは分析するまで、−２０℃で凍結保存した。
（３）マススペクトロメーターによるタンパク質の同定
サンプルの分析は、イオントラップ型ＬＣ−ＭＳ（ＬＣＱ；サーモクエスト）でおこなった。上記サンプルを全量、ＨＰＬＣ（ＨＰ１１００；アジレント）にアプライし、ＰｅｐＭａｐＣ１８（内径７５μｍ、長さ１５ｃｍ；ＬＣパッキング）で分離しながら、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析をおこないＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。ＨＰＬＣの条件は、流速０．２μｌ／ｍｉｎ、Ａ液；０．１％酢酸、Ｂ液；０．１％酢酸／エタノールでおこなった。
ＭＳ／ＭＳスペクトルからのタンパク質同定には、検索ソフトとしてＭａｓｃｏｔ（マトリクスサイエンス）を用い、ＮＣＢＩのデータベースに対し検索をおこうことにより実施した。
（４）脂肪顆粒に細胞内局在を持つ蛋白の抽出
３７のタンパク質バンドのＭＳ解析をおこない、蛋白を同定した。同定された蛋白についてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ等の公共のデータベースを使い細胞内局在を調べた。その結果、これまで脂質顆粒に存在することが報告されていなかったタンパク質（配列番号：２０〜３８で表される配列からなるタンパク質）を同定することができた。
同定したタンパク質のリストを以下に示した。
【表２】
実施例２ ヒト組織サンプルからトータルＲＮＡの調製
ヒトの正常な脂肪組織１サンプル、及び正常な肝組織１サンプルから、それぞれ常法に従いトータル ＲＮＡ を調製し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを用いて行った。具体的には、解析は、（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製、（２） 該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、及び（７） 遺伝子発現解析、の手順で行った。
【０１３６】
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製
ヒトの正常な脂肪組織１サンプル、及び正常な肝組織１サンプルから常法に従って調製した各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製） １００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製、滅菌蒸留水）９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３μＬ、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ４μＬ（４０Ｕ）、及び該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むペレットを得た。
【０１３７】
その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。
【０１３８】
以上の操作によって、ヒトの正常な脂肪組織１サンプル、及び正常な肝組織１サンプルから調製した各ｔｏｔａｌ ＲＮＡから、各ｃＤＮＡを取得した。
【０１３９】
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、及び該キットに含まれる２０×Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
【０１４０】
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、 ５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
【０１４１】
（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ ４０μＬに、５ｎＭ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｌｉｇｏ Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ ｃＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ ［Ｎａ＋］， ４０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７） ２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０１４２】
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０１４３】
（５） プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ及びＳｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、 ２次染色液（１００μｇ／ｍＬ Ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）により染色した。
【０１４４】
（６） プローブアレイのスキャン、 及び （７） 遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、遺伝子発現の比較解析を行った。
【０１４５】
実施例３ 脂肪組織特異的に発現している遺伝子の解析
実施例２で行ったＤＮＡチップ解析による遺伝子発現の比較解析結果から、ヒトの正常な脂肪組織において、正常な肝組織に比べて４倍以上の発現増大を示したプローブを選抜した。さらにこの結果を実施例１の結果と比較し、脂肪組織特異的に発現しており、かつＨｕＨ７細胞の脂質顆粒で特異的に発言が認められたプローブ（配列番号：２０、２１、２２、２３、及び２４のいずれか記載のアミノ酸配列を有する、計５タンパク質）を選抜した結果を表３に示した。
【０１４６】
【表３】
表中、Ｈｕｍａｎ Ｕ９５プローブ名は Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ｃｈｉｐ におけるプローブ名を示す。また表中 Ａｃｃ Ｎｏは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるアクセッション番号を示す。また表中、変動倍率は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ｃｈｉｐで解析した正常肝組織の遺伝子発現量を１とした場合における脂肪組織における遺伝子発現量を示す。また各遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す後記配列表の配列番号も合わせて示す。
【０１４８】
【発明の効果】
本発明によって、中性脂肪の蓄積を伴う疾患のモデルであるＨｕＨ７細胞の脂肪顆粒に特異的に存在しているタンパク質（配列番号：２０〜３８のアミノ酸配列を有するタンパク質）が明らかになった。かかるタンパク質・及びこれをコードする遺伝子は動脈硬化症、肥満、脂肪肝等の中性脂肪の蓄積を伴う疾患の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。かかるマーカー遺伝子によれば前記疾患に罹患しているかどうか、及びその罹患の原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによってより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、本発明のマーカー遺伝子は中性脂肪の蓄積を伴う疾患の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
【０１４９】
また、上記遺伝子の発現増大と上記疾患との関連性から、該遺伝子の発現を抑制／誘導する物質は、上記中性脂質の蓄積を伴う疾患の治療剤として有用であると考えられる。従って、本発明の遺伝子によれば、その発現の抑制／誘導を指標とすることによって、中性脂質の蓄積を伴う疾患の予防、改善ないし治療剤となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。すなわち、本発明は、中性脂質の蓄積を伴う疾患の治療剤などの開発技術をも提供する。
【０１５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｕＨ７細胞の脂質顆粒を観察した図である。ヒト肝臓細胞株ＨｕＨ７をオイルレッドＯ試薬及びヘマトキシリン染色試薬による染色し、顕微鏡下で観察した。脂質顆粒は赤く染色され、核は青く染色された。
【図２】シュークロースグラジェント分画法による脂質顆粒タンパク質の精製結果を示した図である。上図：各精製画分についてＳＤＳ−電気泳動法により精製し、タンパク質をクーマシーブルー試薬でタンパク質染色した。下図：各精製画分についてＳＤＳ−電気泳動法により精製し、ＡＤＲＰタンパク質に対する抗体を用いて免疫染色法により分析した。ＡＤＲＰタンパク質はＦｒ．１に検出された。
各精製画分についてＴＬＣ法によりトリアシルグリセロール及びコレステロールを検出した。いずれもＦｒ．１に検出された。
【図３】脂質顆粒タンパク質のＳＤＳ−電気泳動法による分析結果を示した。
１．シュークロースグラジェント分画法による精製前のタンパク質の分析結果である。左に分子量を示した。
２．シュークロースグラジェント分画法による精製後のタンパク質の分析結果。右に本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列番号を記載した。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a disease marker useful for diagnosing a disease associated with accumulation of neutral lipids, and use thereof. More particularly, the present invention provides a primer or a method for diagnosing diseases associated with the accumulation of neutral lipids, such as obesity, fatty liver, type II diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, or ischemic heart disease. Disease markers that can be effectively used as detection probes, methods for detecting (diagnosing) the disease using such disease markers, methods for screening substances effective as ameliorating or therapeutic agents for the disease, and improvements obtained by the method Agent or therapeutic agent.
[0002]
[Prior art]
In recent years, due to westernization of dietary habits and increase in social stress, etc., the number of lifestyle-related diseases such as obesity, fatty liver, type II diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, and ischemic heart disease has increased. This is a significant and significant problem. It is known that elevated levels of neutral lipids such as triglycerides and cholesterol in the internal organs such as the liver and blood are a major cause of lifestyle-related diseases, and drugs that suppress the levels of neutral lipids are being sought. I have.
Neutral lipids are accumulated as intracellular lipid granules in fat cells, hepatocytes, macrophages, and the like. However, while having the physiological significance of storing energy, the excess storage causes lifestyle-related diseases. That is, if the increase in intracellular lipid granules can be suppressed, it is expected that lifestyle-related diseases will be improved.
Lipid granules are "oil droplets", and ADRP (Adipocyte differentially related protein) (Non-Patent Document 1) and the like have been reported as to proteins contained in the lipid granules, but little is known.
[0003]
On the other hand, protein kinase C is an enzyme involved in cell growth, differentiation, carcinogenesis, apoptosis, and the like, and phosphorylates a protein that plays an important role in signaling of nerves, the immune system, and the like. Protein Kinase C Mu (Protein Kinase C Mu; a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20), Protein Kinase C Delta (Protein kinase C delta; a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21), and protein kinase C kinase (Protein kinase C Nu; a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22) is an isoform of protein kinase C, of which protein kinase C delta is known to be expressed in adipocytes. (Non-Patent Document 2).
In addition, P53-responsive gene 3 (hereinafter abbreviated as PRG3; a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24) is induced to express during cancer-suppressing protein p53-dependent cell death, and is normally localized in the cytoplasm. (Non-Patent Document 3). Cargo selection protein TIP47 (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29) is a receptor protein of a transport carrier from endosome to trans-Golgi network. NAD (P) -dependent steroid dehydrogenase; H105E3 (NAD (P) dependent steroid dehydrogenase; H105E3) (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31) and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 11 (17βHSD11; SEQ ID NO: 38) The protein having the described amino acid sequence) is a kind of steroid metabolizing enzyme. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32) is a kind of lipid metabolizing enzyme. Annexin II (annexin II; a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34) is a membrane protein having an inhibitory activity on phospholipase A2. Rab 5C (a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35) and Ras related protein Rap 1B (a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37) are one type of Ras family small GTPase. Membrane IgD binding protein 31 (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36) is one of the membrane proteins constituting the B cell receptor, and its function is unknown. .
[0004]
In addition, lanosterol synthase (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26), acyl-CoA synthase 3 (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27), acyl-CoA synthase 4 variant 1 (SEQ ID NO: 26) : A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25), and NADH-cytochrome B5 reductase (a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33) are enzymes involved in the synthesis of fatty acids.
However, it was not known at all that the protein was present in the lipid granules and that the protein was involved in diseases involving accumulation of neutral lipids, such as lifestyle-related diseases.
[0005]
Furthermore, DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 represented by KIAA0747 (DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23) is known as one of novel human brain cDNAs. DNA (Non-patent Document 4), having the base sequence of SEQ ID NO: 9 represented by P63 (DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28), and represented by CGI49 The DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30) is also a known DNA, but its function is unknown.
[0006]
[Non-patent document 1]
Brasaemle, D.C. L. J. et al. Lipid Res. , 38, 2249-2263 (1997).
[Non-patent document 2]
Frevert E. U. , Et al. , Biochemical Journal. 316 (Pt3): 865-71 (1996)
[Non-Patent Document 3]
Hiro Y. , Et al. , FEBS Lett. , 524 (1-3), 163-71, (2002)
[Non-patent document 4]
Nagase, T .; , Et al. , DNA Res. 5: 277-286 (1998)
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a disease marker useful for diagnosis and treatment of a disease associated with accumulation of neutral lipids. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting a disease associated with the accumulation of neutral lipids using the disease marker (gene diagnosis method), a method for screening a drug useful for the improvement or treatment of the disease, and a method for improving or treating the disease. The purpose is to provide useful drugs.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have attempted to identify proteins contained in lipid granules in order to solve the above problems.
The present inventors have already used a cell line that accumulates lipid granules as a part of elucidating the mechanism of intracellular lipid granule formation in diseases involving the accumulation of neutral lipids, and in vitro use of lipid granules at the cellular level in vitro. The preparation method of was established. That is, lipid granules are accumulated in a similar manner to the above-mentioned diseases using human liver-derived cultured cells such as HuH7, which has the characteristic of spontaneously accumulating lipid granules and is considered to be a model of a disease accompanied by accumulation of neutral lipids. The prepared cells were prepared. The cells are crushed after culturing and subjected to equilibrium density gradient centrifugation to separate and purify an organelle comprising a lipid bilayer, a soluble protein, and a fraction having a very low specific gravity (a fraction having a low specific gravity including oil droplets). can do. Almost all cell-derived proteins are contained in the high specific gravity fraction, but the light specific gravity fraction contains ADRP, which is known to be localized in lipid granules, and was confirmed to be a lipid granule fraction. .
[0009]
Furthermore, the present inventors isolated the protein contained in the lipid granule fraction and determined the structure. As a result, the association with a disease associated with accumulation of neutral lipids was not evident conventionally. SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37, and 38 (SEQ ID NOs: 20 to 38) were found to be present in the lipid granules.
Furthermore, a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 (SEQ ID NOs: 20 to 24) may be specifically expressed in human adipose tissue. all right.
[0010]
Therefore, the present inventors, in a disease associated with the accumulation of neutral lipids, a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 20 to 38, and a gene encoding the same (SEQ ID NOS: 1 to 19). Polynucleotides having any one of the nucleotide sequences described above) were found to be excellent disease markers. Furthermore, a screening system using the expression of these genes or the control of the expression or function (activity) of the proteins encoded by these genes as an index is a preventive, ameliorating, or therapeutic agent for diseases associated with the accumulation of neutral lipids. We found that it is effective for search.
The present invention has been completed based on such findings.
[0011]
That is, the present invention is as follows:
(1) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 A disease marker for a disease associated with the accumulation of neutral lipids, comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive bases in a nucleotide sequence and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide;
(2) The disease marker according to
(3) A method for detecting a disease associated with the accumulation of neutral lipid, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to (1) or (2),
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA, using the disease marker as an index,
(C) The measurement results of the subject obtained in the above (b) indicate that the accumulation of neutral lipids is based on the fact that the amount of binding to the disease marker is increased as compared with the results obtained for normal biological samples. A step of determining the presence of the accompanying disease,
(4) SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, or 38 A disease marker for a disease associated with accumulation of neutral lipids, comprising an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence,
(5) The disease marker according to claim 4, which is used as a probe in detecting a disease associated with accumulation of neutral lipid.
(6) A method for detecting a disease associated with the accumulation of neutral lipid, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a subject's biological sample to the disease marker according to (4) or (5),
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker, using the disease marker as an index,
(C) The measurement results of the subject obtained in the above (b) indicate that the accumulation of neutral lipids is based on the fact that the amount of binding to the disease marker is increased as compared with the results obtained for normal biological samples. A step of determining the presence of the accompanying disease,
(7) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 including the following steps (a), (b) and (c): , 15, 16, 17, 18, and 19, a method for screening a substance that regulates the expression of a gene having the nucleotide sequence according to any of:
(A) Test substance and SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 Contacting a gene having the nucleotide sequence according to the above or a cell capable of expressing a homolog thereof,
(B) SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, And measuring the expression level of the gene having the nucleotide sequence according to any one of 19 or a homologue thereof, and comparing the expression level with the expression level of the corresponding gene in a control cell not contacted with the test substance,
(C) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 based on the comparison result of (b) above. , 18, and 19, a step of selecting a test substance that changes the expression level of the gene having the nucleotide sequence or the homologue thereof,
(8) A substance that controls the expression of a gene having the nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5, including the following steps (a), (b), and (c): Screening method:
(A) contacting a test substance with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5 or a homolog thereof;
(B) measuring the expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5 or the homolog thereof in the cells contacted with the test substance, and testing the expression level; Comparing the expression level of the corresponding gene in a control cell not contacted with the substance,
(C) A test substance that changes the expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5, or a homolog thereof based on the comparison result of (b) above The process of choosing,
(9) SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, including the following steps (a), (b) and (c): , 34, 35, 36, 37, and 38, a method for screening for a substance that controls the expression of a protein having the amino acid sequence or a homolog thereof:
(A) Test substance and any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 Contacting a protein capable of expressing a protein or a homolog thereof having the amino acid sequence according to
(B) SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 in cells contacted with the test substance And the expression level of the protein having the amino acid sequence according to any one of the above and 38 or a homolog thereof is measured, and the expression level is compared with the expression level of the corresponding protein or the homolog thereof in a control cell not contacted with the test substance. Process,
(C) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 Selecting a test substance that changes the expression level of a protein having the amino acid sequence according to any one of, 37, and 38 or a homolog thereof,
(10) Expression of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a homolog thereof comprising the following steps (a), (b), and (c): How to screen for controlled substances:
(A) contacting a test substance with a cell capable of expressing a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a homolog thereof;
(B) measuring the expression level of the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a homolog thereof in cells contacted with the test substance; A step of comparing the expression level of the corresponding protein or a homolog thereof in a control cell not contacted with the test substance,
(C) A test substance that changes the expression level of a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a homolog thereof based on the comparison result of (b). The process of choosing,
(11) Screening for a substance that controls the function or activity of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof, comprising the following steps (a), (b) and (c): Method:
(A) contacting the test substance with a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof;
(B) measuring the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homologue thereof resulting from the step (a), and determining the function or activity of the test substance; A step of comparing the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof when not contacting,
(C) selecting a test substance that causes a change in the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof based on the comparison result of (b) above;
(12) Screening for a substance having the following steps (a), (b) and (c), which controls the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof. Method:
(A) contacting the test substance with a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof;
(B) The function or activity of the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof resulting from the step (a) is measured, and the function or activity is determined using the test substance. A step of comparing the function or activity of the protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof when not contacted,
(C) selecting a test substance that causes a change in the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof based on the comparison result of (b) above;
(13) The screening method according to any one of (7) to (12), which is a method for ameliorating a disease associated with accumulation of neutral lipids or searching for an active ingredient of a therapeutic agent.
(14) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 A substance having a base sequence or a substance that controls the expression of a homolog thereof as an active ingredient, an agent for ameliorating or treating a disease involving accumulation of neutral lipids,
(15) A disease associated with the accumulation of neutral lipids, which comprises, as an active ingredient, a substance that controls the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5, or a homolog thereof. Improvement or therapeutic agent,
(16) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 The agent for improving or treating a disease associated with the accumulation of neutral lipid according to (13), wherein the substance that controls the expression of a gene having a nucleotide sequence or a homolog thereof is obtained by the screening method according to (7).
(17) A substance which controls the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, and 5, or a homolog thereof, obtained by the screening method of (8). An agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipid according to (14),
(18) SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, or 38 A protein having an amino acid sequence or a substance that controls the expression level of a homolog thereof as an active ingredient, an agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipids,
(19) With accumulation of neutral lipid, a substance having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a substance that controls the expression level of a homolog thereof is used as an active ingredient. An agent for improving or treating a disease,
(20) SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, or 38 The substance that regulates the expression level, function, or activity of a protein having an amino acid sequence or a homolog thereof is obtained by the screening method described in (9), and is associated with accumulation of neutral lipid according to (18). An agent for improving or treating a disease,
(20) The screening method according to (10), wherein the substance that controls the expression level, function, or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, and 24 or a homolog thereof is used. The agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipid according to (19), which is obtained by the method of (19).
(21) An agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipids, comprising, as an active ingredient, a substance having the function of controlling the function or activity of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof. ,
(22) An agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipids, comprising, as an active ingredient, a substance having the function of controlling the function or activity of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof. ,
(23) A substance that controls the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 or a homolog thereof, which is obtained by the screening method of (11), (21) ), The agent for ameliorating or treating a disease associated with the accumulation of neutral lipids, and
(24) A substance that controls the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof, which is obtained by the screening method of (12). ) The agent for ameliorating or treating a disease associated with the accumulation of neutral lipids according to the above.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, in the present specification, the abbreviations of amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, and the like are referred to by the IUPAC-IUB regulations [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138: 9 (1984)], "Guidelines for Preparation of Specifications and the like Containing Base Sequence or Amino Acid Sequence" (edited by the Japan Patent Office) and conventional symbols in the art.
[0013]
In the present specification, "gene" or "DNA" is used to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNAs such as a sense strand and an antisense strand that constitute the double-stranded DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in the present specification, a gene (DNA) means a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA (positive strand) containing cDNA and a sequence complementary to the positive strand, unless otherwise specified. This includes a main-stranded DNA (complementary strand) and any of these fragments.
[0014]
In addition, the “gene” or “DNA” includes not only “gene” or “DNA” represented by a specific nucleotide sequence, but also a protein having a biological function equivalent to the protein encoded by these (for example, "Genes" or "DNAs" encoding homologues, variants, derivatives, etc. are included (in the present specification, these are collectively referred to as "genes" or "DNAs" represented by the above specific nucleotide sequences) Of "homolog".). Specific examples of such homologs include those that hybridize with the “gene” or “DNA” represented by the specific base sequence under the stringent conditions described in (1-1) below. it can.
[0015]
For example, as a gene (homolog) encoding a homolog, a gene of another species such as mouse or rat corresponding to a human gene can be exemplified. These genes (homologs) can be identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Homologene/). Specifically, the specific human base sequence is matched with BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). (The highest score, E-value is 0 and Identity is 100%). The accession number is input to UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) and the UniGene Cluster ID (the number indicated by Hs.) Obtained is input to HomoloGene. From the resulting list showing the correlation between the gene homologs of other species genes and human genes, genes of other species such as mice and rats corresponding to the human genes can be selected. The gene or DNA does not matter which functional region is used, but may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
[0016]
As used herein, the term "polynucleotide" is used to include both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. In addition, the above-mentioned RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
[0017]
As used herein, the term “protein” or “(poly) peptide” includes not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific base sequence, but also “protein” having a biological function equivalent to these. Or "(poly) peptides" (eg, homologs, variants, derivatives, etc.). In the present specification, these are also referred to as “homologs” of “protein” or “(poly) peptide” represented by the above specific amino acid sequence. For example, examples of the homologues include homologues, such as proteins of other species, such as mouse and rat, which are human proteins. These are homologene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene). It can be determined a priori from the base sequence of the gene (homolog) identified by /). In addition, the above mutants include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having an amino acid sequence modified by artificial deletion, substitution, addition and insertion. Is done. Examples of such mutants include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide having no mutation.
[0018]
As used herein, the term "antibody" includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, or the above-mentioned antibodies having antigen-binding properties such as Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Some are included.
[0019]
Further, the term "disease marker" in the present specification is used for diagnosing the presence or absence of a disease associated with accumulation of neutral lipids or the degree of the disease, and for ameliorating and treating diseases associated with accumulation of neutral lipids. It is used directly or indirectly to screen useful candidate substances. For example, a gene or protein whose expression in a living body is fluctuated in association with enhancement of neutral lipid accumulation is specifically identified. Included are (poly) (oligo) nucleotides and antibodies that can recognize and bind. These (poly) (oligo) nucleotides and antibodies are used as probes for detecting the genes and proteins expressed in vivo, particularly in adipose tissue, etc., based on the above properties. In particular, it can be effectively used as a primer for amplifying the gene expressed in adipose tissue or the like.
That is, in the present specification, the term "living tissue" to be diagnosed refers to a tissue in which the expression of the gene of the present invention is increased due to a disease associated with accumulation of neutral lipid, and specifically refers to adipose tissue or blood. .
[0020]
The present invention provides, as described above, SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38. (SEQ ID NOS: 20 to 38). A protein having an amino acid sequence described in any of the above (hereinafter, these proteins are collectively referred to as the present protein) can be used as a model for a disease associated with accumulation of neutral lipids. This is based on the finding that the expression is specifically increased in cells and that the expression is specifically increased in human adipose tissue as compared with other human tissues.
[0021]
Therefore, these proteins and the genes encoding them (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) , And 19 (SEQ ID NOS: 1 to 19) (hereinafter, these polynucleotides are collectively referred to as the present gene) are diseases associated with accumulation of neutral lipids. The present protein and the present gene and derivatives thereof can be effectively used for elucidation, diagnosis, prevention and treatment of the present invention. (Eg, antibodies) can be suitably used for the treatment of the above-mentioned diseases associated with the accumulation of neutral lipids and the development of drugs that are effectively used for the treatment. That, detection of the expression of the protein or the gene or mutated or detection of the expression deficiency of the gene, can be effectively utilized for elucidation or diagnosis of diseases involving accumulation of neutral lipids.
Hereinafter, specific uses of the present protein and the present gene will be described.
[0022]
(1) Disease markers for diseases associated with accumulation of neutral lipids and their applications
(1-1) Polynucleotide
According to the present invention, as described above, the expression of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38 is specifically increased in HuH7 cells, which can serve as a model for a disease associated with accumulation of neutral lipids. And the finding that the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 24 is specifically increased in expression in human adipose tissue as compared to other human tissues. By detecting the presence or absence and the degree of expression of the gene (polynucleotide) encoding these, the presence or absence and the degree of the disease associated with the accumulation of neutral lipids can be detected, and the diagnosis of the disease can be accurately performed. It is based on the idea that it can be done. That is, the present invention provides a tool (disease for diagnosing the presence or absence of a disease associated with accumulation of neutral lipids in a subject by detecting the presence or absence or the degree of the expression of the gene in the subject). The present invention provides a polynucleotide useful as a marker.
[0023]
The genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the present invention are known and can be obtained by a method known to those skilled in the art.
That is, the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is known as Protein Kinase C Mu, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002742.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is known as protein kinase C delta, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_006254.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is known as Protein Kinase C Nu, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_005813.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is known as a kind of novel human brain cDNA, and its obtaining method and sequence are described in Nagase, T. et al. , Et al. , DNA Res. 5: 277-286 (1998), or Genbank Acc. No. : NM_015292. The protein consisting of the amino acid sequence encoded by the gene (the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23) has 87.6% homology with the amino acid sequence of rat GLUT4 vehicle protein, and is considered to be human GLUT4 vehicle protein. Conceivable. GLUT4 vehicle protein has a membrane bound C2 domain containing protein and is involved in calcium-dependent phospholipid binding (Morris, NJ, Biochim. Biophys. Acta. 1431: 5255).
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is known as P53-responsive gene 3 (PRG3), and its obtaining method and sequence are described in Hiro Y. , Et al. , FEBS Lett. , 524 (1-3), 163-71, (2002) or Genbank Acc. No. : NM_032797.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is known as acyl-CoA synthase 4variant1 gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004458.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 is known as a lanosterol synthase gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002340.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is known as acyl-CoA synthase 3 gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004457.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 is known as p63, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_006825.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 is known as Cargo selection protein TIP47, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_005817.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 is known as CGI49, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_016002.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 is known as a NAD (P) -dependent steroid dehydrogenase; H105E3 (NAD (P) dependent steroid dehydrogenase; H105E3) gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_015922.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 is known as a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002046.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 is known as NADH-cytochrome B5 reductase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_000398.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 is known as an annexin II (annexin II) gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004039.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 is known as Ras family small GTPaserab5C, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004583.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is known as a membrane IgD binding protein gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_005745.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 is known as Ras family small GTPase Ras related protein Rap 1B gene, and its sequence is Genbank Acc. No. : NM_015646.
The gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 is known as 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 11 (17βHSD11) gene, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : BC021673.
[0024]
In addition, the polynucleotide of the present invention can be used for screening candidate substances useful for the prevention, amelioration, or treatment of diseases associated with the accumulation of neutral lipids as described in the section (3) described below. It is also useful as a screening tool (disease marker) for detecting a variation in the expression of a gene having any of the base sequences described above.
[0025]
The disease marker of the present invention is characterized in that it comprises a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary thereto in one or more base sequences of any of SEQ ID NOs: 1 to 19. And
[0026]
Here, the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) refers to the full-length polynucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in each of the above SEQ ID NOs, or a nucleotide sequence of at least 15 nucleotides continuous in each of the above nucleotide sequences. A polynucleotide having a base complementary relationship to its partial sequence (for convenience, these are also referred to as “positive chains”) based on base pairing such as A: T and G: C. To do. However, such a complementary strand is not limited to a case where it forms a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive chain, and has a complementary relationship that allows hybridization with the target positive strand under stringent conditions. You may have. Here, the stringent conditions are as follows: Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques in Enzymology, Vol. Can be determined based on the melting temperature (Tm). For example, as washing conditions after hybridization, there can be usually mentioned conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”. The complementary strand preferably maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, more severe hybridization conditions are about “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, and more severe hybridization conditions are “0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” "Washing conditions. Specifically, as such a complementary strand, a strand consisting of a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the positive strand. Can be exemplified.
[0027]
In addition, the polynucleotide on the positive strand side has not only a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a partial sequence thereof, but also a complementary relationship to the nucleotide sequence of the complementary strand. Can be included.
[0028]
Further, each of the above-described positive-chain polynucleotide and complementary-strand (reverse-strand) polynucleotide may be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.
[0029]
The disease marker of the disease associated with the accumulation of neutral lipids of the present invention may specifically be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence (full-length sequence) described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19, It may be a polynucleotide consisting of its complementary sequence. In addition, as long as it selectively (specifically) recognizes a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a polynucleotide derived from the gene, the above-described full-length sequence or its complementary sequence May be a polynucleotide consisting of the partial sequence of In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 continuous base lengths, which is arbitrarily selected from the base sequence of the above-described full-length sequence or its complementary sequence.
[0030]
Here, “selectively (specifically) recognizes” is, for example, in Northern blotting, a gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a gene derived from these genes. That the polynucleotide can be specifically detected, and that in the RT-PCR method, a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a polynucleotide derived from these genes is specifically produced However, the present invention is not limited thereto, and any method can be used as long as a person skilled in the art can judge that the above-mentioned detected substance or product is derived from these genes.
[0031]
Such a disease marker of the present invention may be, for example, based on the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 19, depending on the gene to be detected (recognized) (SEQ ID NOs: 1 to 19). It can be designed by using primer 3 (HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) or the vector NTI (manufactured by Infomax). Specifically, a primer or candidate sequence obtained by applying the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 to the software of primer 3 or vector NTI, or a sequence containing at least a part of this sequence as a primer Alternatively, it can be used as a probe.
[0032]
The disease marker of the present invention has only to have a length of at least 15 consecutive nucleotides as described above. Specifically, the length can be appropriately selected and set according to the use of the marker. .
[0033]
(1-2) Polynucleotide as probe or primer
The disease marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying RNA generated by expression of each of the above genes or a polynucleotide derived therefrom, or specifically detecting the RNA or a polynucleotide derived therefrom. Can be used as a probe.
[0034]
When the above-mentioned disease marker is used as a primer in the detection of a disease accompanied by the accumulation of neutral lipid (gene diagnosis), a marker having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp is used. Can be illustrated. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
[0035]
The disease marker of the present invention can be used as a primer or a probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene, such as a Northern blot method, an RT-PCR method, and an in situ hybridization method. Thus, the presence or absence or the expression level (expression amount) of the gene having the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 19, which is associated with a disease associated with the accumulation of neutral lipids, can be evaluated.
[0036]
The sample to be measured can be appropriately selected according to the type of detection method used. The sample may be, for example, a biological tissue of a subject, in particular, a part of adipose tissue collected by biopsy or the like, and total RNA prepared therefrom according to an ordinary method may be used, or further prepared based on the RNA. Various polynucleotides may be used.
[0037]
The expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 in living tissue can be detected or quantified using a DNA chip. In this case, the disease marker of the present invention can be used as a probe of the DNA chip (for example, in the case of Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E from Affymetrix, a polynucleotide of 25 bp in length) Used as a probe). By hybridizing a DNA chip using the disease marker of the present invention as a probe with a labeled DNA or RNA prepared based on RNA collected from a living tissue, a disease marker (probe) of the present invention and a labeled DNA or RNA can be obtained. Is formed. By detecting the complex using the label of the labeled DNA or RNA as an index, the presence or absence or the expression level (expression) of the gene consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in living tissue Quantity) can be evaluated.
[0038]
The DNA chip may include one or more disease markers of the present invention that can bind to a gene having the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 19. According to the use of a DNA chip containing a plurality of disease markers, it is possible to simultaneously evaluate the presence or absence or the expression level of a plurality of genes in one biological sample.
[0039]
The disease marker of the present invention is useful for diagnosis and detection of a disease accompanied by accumulation of neutral lipids (diagnosis of the presence or absence of disease and the degree of disease). Specifically, the diagnosis of a disease associated with the accumulation of neutral lipids using the disease marker has the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the adipose tissue of a subject and the adipose tissue of a normal subject. The determination can be performed by determining the difference in the gene expression level of the gene.
[0040]
In this case, the difference in the gene expression level includes not only the difference between the presence / absence of expression but also the difference in the expression level between the adipose tissue of the subject and the adipose tissue of the normal person even when both adipose tissue and adipose tissue have expression. It includes the case of double or more, preferably triple or more.
[0041]
For example, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 were expressed in lipid granule tissue in HuH7 cells, which serve as a model for diseases associated with accumulation of neutral lipids. Therefore, the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 is specifically expressed in adipose tissue of a subject, or the expression level is higher than that of a normal human adipose tissue. If the increase is at least two-fold, more preferably at least three-fold, a disease associated with accumulation of neutral lipid is suspected. In this case, for detection (diagnosis) of a disease accompanied by accumulation of neutral lipids, in the base sequence described in any of the above genes (the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19), The disease marker of the present invention comprising a polynucleotide having a length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto is useful.
[0042]
Among them, the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 has a higher expression level in adipose tissue in normal human tissues than in other tissues, and any of the genes corresponding to these genes In the base sequence, the disease marker of the present invention is particularly useful because there is no continuous polynucleotide having a length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto.
[0043]
In the present invention, the detection (diagnosis) of a disease associated with the accumulation of neutral lipids is performed by detecting the expression of at least one gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 19 in a living tissue of a subject, particularly an adipose tissue. It is performed by evaluating the presence or absence or the expression level (expression amount). In order to enhance the accuracy and precision of detection (diagnosis), the presence or absence or the expression level (expression level) of two or more, preferably a plurality of genes of the above gene group, more preferably all the genes of the above gene group Is desirable.
[0044]
(1-3) Antibody
The present invention provides an antibody capable of specifically recognizing an expression product (protein) of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 as a disease marker for a disease associated with accumulation of neutral lipids. I will provide a.
[0045]
As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is replaced by a protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2. Is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21; a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 is encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5. Specific protein As an embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 is used. As a specific embodiment of a protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is used. As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is replaced with the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8. As a specific embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is provided, and as a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9, the protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 1 Specific examples of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 29 include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, and specific examples of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 11 A specific example of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12 is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30; : As a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 13, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 is replaced by a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 14. As Is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, and a specific example of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15 is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34. Specific examples of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 16 include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, and a specific form of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 17 As an embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 is used. As a specific embodiment of a protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 18, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 is used. , SEQ ID NO: 19 Sequences Specific aspects of the protein encoded by the polynucleotide number indicated: a protein having an amino acid sequence represented by 38, can be exemplified.
[0046]
The protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 20 to 38 in the present invention is known and can be obtained by a method known to those skilled in the art.
That is, the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is known as Protein Kinase C Mu, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002742.
The gene protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is known as protein kinase C delta, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_006254.
.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is known as Protein Kinase C Nu, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_005813.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 is known as a protein encoded by a novel human brain cDNA, and its obtaining method and sequence are described in Nagase, T. et al. , Et al. , DNA Res. 5: 277-286 (1998), or Genbank Acc. No. : NM_015292. The protein has an 87.6% homology with the amino acid sequence of rat GLUT4 vehicle protein, and is considered to be human GLUT4 vehicle protein. GLUT4 vegetable protein has a membrane bound C2 domain containing protein and is involved in calcium-dependent phospholipid binding (Morris, NJ, Biochim. Biophys. Acta 1431: 525-530).
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 is known as P53-responsive gene 3 (PRG3), and its obtaining method and sequence are described in Hiro Y. , Et al. , FEBS Lett. , 524 (1-3), 163-71, (2002), or Genbank Acc. No. : NM_032797.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 is known as acyl-CoA synthetase 4variant1, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004458.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 is known as lanosterol synthase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002340.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 is known as acyl-CoA synthase 3, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004457.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is known as p63, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_006825.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 is known as Cargo selection protein TIP47, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_005817.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 is known as CGI49, and the sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_0016002.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 is known as NAD (P) -dependent steroid dehydrogenase; H105E3 (NAD (P) dependent steroid dehydrogenase; H105E3), and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_015922.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 is known as glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_002046.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 is known as NADH-cytochrome B5 reductase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_000398.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 is known as annexin II, and the sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004039.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 is known as rab5C which is a kind of Ras family small GTPase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_004583.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 is known as membrane IgD binding protein 31 and its sequence is described in Genbank Acc. No. : Described in NM_005745
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is known as Ras related protein Rap 1B, which is a kind of Ras family small GTPase, and its sequence is described in Genbank Acc. No. : NM_015646.
The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is known as 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 11 (17βHSD11), and its sequence is described in Genbank Acc. No. : Described in BC021673.
[0047]
The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using the above protein as an immunogen or a monoclonal antibody thereof. Further, the antibody of the present invention also includes an antibody having an antigen-binding property with respect to a polypeptide consisting of at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids, which are continuous at least in the amino acid sequence constituting the protein. It is.
[0048]
Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish John Wiley and Sonny. Section 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the protein is synthesized using the protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method. Thus, a non-human animal such as a rabbit can be immunized and obtained from serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, the above-mentioned protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins is immunized to a non-human animal such as a mouse, and the obtained spleen cells and It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. ).
[0049]
SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, used as immunizing antigens in the production of antibodies 38, based on the sequence information (SEQ ID NOs: 1 to 19) of the gene provided by the present invention, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, It can be obtained by culturing the transformant and recovering the protein from the culture. These operations are carried out according to methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done.
[0050]
Specifically, any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 A recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding a protein containing the amino acid sequence in a desired host cell is prepared, introduced into a host cell, transformed, and the transformant is cultured. By collecting the target protein from the obtained culture, a protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained. In addition, any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 A partial peptide of a protein containing an amino acid sequence can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information provided by the present invention (SEQ ID NOS: 20 to 38).
[0051]
Any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 of the present invention The protein containing the amino acid sequence includes not only the protein related to the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 20 to 38, but also homologues thereof. The homologue includes an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 20 to 38, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and the homologue is identical to the original protein before modification. Proteins having chemically equivalent activities can be mentioned.
[0052]
In addition, here, the function equivalent to the function of the protein encoded by the gene having the base sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) Examples of proteins having a biological function include proteins having functions equivalent to those of the corresponding proteins in biochemical or pharmacological functions. In addition, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) has the same immunological activity. Examples of the protein having the activity include a protein capable of inducing a specific immune response in a suitable animal or its cell and capable of specifically binding to an antibody against each corresponding protein.
[0053]
The number of amino acid mutations and the mutation site in the protein are not limited as long as their biological functions and / or immunological activities are maintained. Indicators for determining how and how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of biological function or immunological activity are computer programs well known to those skilled in the art, For example, it can be found using DNA Star software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is a protein obtained after the substitution is a protein before substitution (a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (SEQ ID NOS: 20 to 38). Is not particularly limited, as long as it retains the biological function and / or immunological activity of the protein having the amino acid sequence described in any of (1) to (3) above. Preferably, the amino acid has properties similar to the amino acid before substitution, such as hydrophobicity, hydrophilicity, amphipathic property, etc. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are non-polar to each other. Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are non-charged amino acids. Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Can be appropriately selected.
[0054]
Further, the antibody of the present invention comprises a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) (or It may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of (a homolog of the protein). The oligopeptide used for such antibody induction does not need to have a functional biological activity, but preferably has the same immunogenic properties as the corresponding proteins described above. Preferably, in the amino acid sequence of a protein having such properties and encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) A polypeptide consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids can be exemplified.
[0055]
Generation of antibodies to such polypeptides can also be performed by increasing the immunological response using various adjuvants depending on the host. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. Active substances include BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and human adjuvants such as Corynebacterium parvum.
[0056]
The antibody of the present invention is a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) (or the protein (Homolog of the subject), the above protein (including its homolog) expressed in the tissue of a subject can be specifically detected by using the antibody. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of expression of the protein (including its homolog) in the tissue of the subject.
The antibody is used to diagnose whether or not the subject is suffering from a disease associated with the accumulation of neutral lipids, or to determine the extent of the disease, by detecting the presence or absence or the degree of expression of the protein in the subject. It is useful as a tool (disease marker) that can be used.
In addition, the above-mentioned antibody is used for screening candidate substances useful for prevention, amelioration, or treatment of diseases associated with the accumulation of neutral lipids as described in the section (3-2) described below, and SEQ ID NOS: 20 to 38. It is also useful as a screening tool (disease marker) for detecting any variation in expression of a protein containing any amino acid sequence.
[0057]
Specifically, a part of a patient's living tissue, particularly adipose tissue, is collected by biopsy or the like, and a protein is prepared therefrom in accordance with a conventional method. Can be used as a probe in a conventional manner to detect the above protein.
[0058]
When diagnosing a disease associated with accumulation of neutral lipids, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 in an adipose tissue of a subject (any of SEQ ID NOs: 20 to 38) May be determined from the amount of at least one of the proteins having the amino acid sequence described in (1) above and the amount of the protein in normal adipose tissue. In this case, the difference in the protein amount includes the presence / absence of the protein, or the case where the difference in the protein amount is twice or more, preferably three times or more.
[0059]
Specifically, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 20 to 38 showed expression induction (enhancement) in HuH7 cells, which can be a model of a disease associated with accumulation of neutral lipids. Amount of expression product of the gene (protein encoded by the gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (protein having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 20 to 38)) Is determined to be twice or more, preferably three times or more, the amount of the expression product of normal adipose tissue, it is suspected that a disease accompanied by accumulation of neutral lipids will occur.
Furthermore, the gene encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 20 to 24 (the gene having the nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 5) is more specific in human adipose tissue than other tissues. And is more preferable as a disease marker.
[0060]
(2) Method for detecting diseases accompanied by accumulation of neutral fat (diagnosis method)
The present invention provides a method for detecting (diagnosing) a disease associated with the accumulation of neutral fat using the above-described disease marker of the present invention.
[0061]
Specifically, the detection method of the present invention provides a method for collecting a part of a living tissue, particularly a fat tissue of a subject using a biopsy or the like, and relating to a disease associated with accumulation of neutral lipids contained therein. By detecting the gene expression level (expression level) of the gene having the nucleotide sequence represented by any one of 19 or proteins derived from these genes, and measuring the expression level or the protein level, the neutral lipid The purpose is to detect (diagnose) the presence or absence or the degree of a disease associated with accumulation. Further, the detection (diagnosis) method of the present invention detects, for example, the presence or absence or the degree of improvement of the disease when a therapeutic agent is administered for the improvement of the disease in a disease patient with accumulation of neutral lipids ( Diagnosis).
[0062]
The diagnostic method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a biological sample of a subject with the disease marker of the present invention;
(B) the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the biological sample, or the gene encoded by the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 Measuring the amount of the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 38 using the disease marker as an index,
(C) a step of judging the occurrence of a disease associated with accumulation of neutral lipid based on the result of (b).
[0063]
The biological sample used herein is a biological tissue of a subject, particularly hippocampal tissue, RNA prepared from the tissue or a polynucleotide further prepared therefrom, or a protein prepared from the tissue. Such RNA, polynucleotide, or protein can be prepared by collecting a part of a living tissue of a subject, particularly, a hippocampus tissue using a biopsy or the like, and then performing a usual method therefrom.
[0064]
The diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of a biological sample used as a measurement target.
[0065]
(2-1) When RNA is used as a biological sample to be measured
When RNA is used as a biological sample used for diagnosis, the detection method (diagnosis method) of the present invention detects the expression level of a gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the RNA. , By measuring.
[0066]
In this case, the detection method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a biological sample of a subject with the disease marker of the present invention;
(B) measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker of the present invention or a complementary polynucleotide transcribed therefrom using the disease marker as an index, and
(C) a step of judging the occurrence of a disease associated with accumulation of neutral lipid based on the result of (b).
[0067]
In the method for detecting (diagnosing) a disease associated with the accumulation of neutral lipids of the present invention, RNA is used as a biological sample to be measured, and the base described in any of SEQ ID NOS: 1 to 19 in the RNA is used. It is performed by detecting and measuring the expression level of a gene having a sequence. Specifically, depending on the nucleotide sequence of the gene to be detected, the aforementioned disease marker of the present invention (a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 and / or Or a complementary polynucleotide thereof) as a primer or a probe, by performing a known method such as Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, or in situ hybridization analysis.
[0068]
When the Northern blot method is used, the presence or absence of the expression of the gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19 and the expression level of the gene can be obtained by using the disease marker of the present invention as a probe. Can be detected and measured. Specifically, the disease marker (complementary strand) of the present invention is 32 P, 33 P or the like: labeled with RI) or a fluorescent substance, and hybridized with RNA derived from a living tissue of a subject, which is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and then formed with a labeled disease marker (DNA) and RNA. A method for detecting and measuring a signal derived from a label (RI or a fluorescent substance, etc.) of the disease marker with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector for the double strand of can do. A disease marker (probe DNA) was labeled using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the protocol, and the marker was hybridized with RNA derived from a biological tissue of the subject. A method of detecting and measuring a signal derived from a substance using a multi-bio imager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.
[0069]
When the RT-PCR method is used, the presence or absence and the expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the RNA can be determined by using the disease marker of the present invention as a primer. Can be detected and measured. Specifically, a pair of primers prepared from the disease marker of the present invention (the above-mentioned cDNA) are prepared by preparing a cDNA from RNA derived from a living tissue of a subject according to a conventional method, and amplifying the target gene region using the cDNA as a template. (Positive strand binding to (-strand), reverse strand binding to + strand) are hybridized with this, PCR is performed according to a conventional method, and the method for detecting the amplified double-stranded DNA obtained is exemplified. Can be. The amplified double-stranded DNA is detected by a method for detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the above-mentioned PCR using primers that have been labeled with RI or a fluorescent substance in advance. The double-stranded DNA thus obtained can be transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a method can be used in which a labeled disease marker is used as a probe, hybridized with the probe, and detected. The generated labeled double-stranded DNA product can be measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). In addition, an RT-PCR reaction solution is prepared according to the protocol using SYBR Green RT-PCR Reagents (manufactured by Applied Biosystems), and ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (the reaction of Applied Biosystems is performed using Applied Biosystems). You can also.
[0070]
When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the disease marker of the present invention is attached as a DNA probe (single-stranded or double-stranded) is prepared, and RNA from living tissue of a subject is constantly added thereto. The method includes a method in which cRNA prepared by the method is hybridized, and a double strand of the formed DNA and cRNA is detected by binding to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention. Further, as the above DNA chip, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of a gene having the base sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 can also be used. Examples of a DNA chip capable of detecting and measuring the expression level of such a gene include Gene Chip Human Genome U95A, A, B, C, D, and E from Affymetrix. The detection and measurement of the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in the subject RNA using such a DNA chip will be described in detail in Examples.
[0071]
(2-2) When using a protein as the measurement target
When a protein is used as the measurement target, the detection method (diagnosis method) of the present invention uses a protein encoded by a gene having a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 present in a biological sample ( This is carried out by detecting a protein having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 20 to 38) and measuring the amount (level) thereof. More specifically, an antibody that recognizes a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) A method for detecting and quantifying the above protein by a known method such as Western blotting using a disease marker can be exemplified.
[0072]
Western blotting uses the above antibody as the primary antibody and then 125 I is labeled using a labeled antibody (labeled antibody that binds to the primary antibody) labeled with a radioisotope such as I or a fluorescent substance, and a signal derived from the radioisotope or the fluorescent substance is measured using a radiometer (BAS- 1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector. Further, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, detection was performed using ECL Plus Western Blotting Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the protocol, and the multi-bioimager STORM860 (Amersham) was used. Can also be measured.
[0073]
The protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 22 to be measured in the above is known as a kinase, and the amount and function or activity of the protein have a certain correlation. Therefore, it is possible to detect (diagnose) a disease associated with the accumulation of triglyceride of the present invention by measuring the function or activity of the protein as a kinase instead of measuring the amount of the protein. it can. That is, the present invention uses a known function or activity of a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 22 as an index, and uses this as a known method (specifically, see section (3-3) described later). The method also includes a method for detecting (diagnosing) a disease associated with the accumulation of neutral fat, which comprises measuring and evaluating the disease according to
[0074]
(2-3) Diagnosis of disease accompanied by accumulation of neutral fat
Diagnosis of a disease associated with accumulation of neutral lipids is, specifically, the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 in a living tissue of a subject, particularly an adipose tissue, or a sequence thereof. No .: No. 1 to No. 19, the amount (level) of the protein which is the expression product of the gene having the base sequence described in any of the above-mentioned normal living tissues (particularly, the level of the gene expression in normal adipose tissue or It can be performed by comparing the amount (level) of the protein and determining the difference between the two.
[0075]
In this case, a biological sample (RNA or protein) collected and prepared from normal biological tissue, particularly adipose tissue, is required. It can be obtained by collecting the tissue with a biopsy or the like. The “person not suffering from a disease accompanied by the accumulation of neutral lipids” as used herein refers to, for example, a person diagnosed as not obese, having a body mass index (BMI) of less than 25. Say. In the following, the “person not suffering from a disease associated with accumulation of neutral lipid” may be simply referred to as a normal person in the present specification. Hereinafter, a specific diagnostic method will be described using a biological sample collected and prepared from adipose tissue as an example.
[0076]
Comparison of the gene expression level or the expression product (protein) level (level) between the adipose tissue of the subject and normal adipose tissue (adipose tissue of a person not suffering from a disease associated with accumulation of neutral lipids) It can be implemented by performing measurements on a biological sample and a biological sample of a normal person in parallel. When not performed in parallel, the gene expression levels of the above genes obtained by measuring a plurality of (at least two, preferably three or more, more preferably five or more) normal hippocampal tissues under uniform measurement conditions Alternatively, an average value or a statistical intermediate value of the amounts (levels) of the proteins which are the expression products of these genes is determined in advance, and this is calculated as the gene expression level of the normal person or the amount of the expression product (protein) (normal value). ), These can be compared to the measured levels or measurements in the subject.
[0077]
The determination as to whether or not the subject is suffering from a disease associated with the accumulation of neutral lipids is performed by determining the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 in adipose tissue of the subject, or The amount (level) of the expression product (protein), more specifically, the amount (level) of the protein having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 20 to 38 is 2 The determination can be made as to whether there is a change of more than twice, preferably more than three times (more or less).
[0078]
Specifically, in the test subject, the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or the amount (level) of the expression product (protein) among the above genes is normal. If the gene expression level or the amount (level) of the expression product of the gene corresponding to the above is large, the subject is suspected of suffering from a disease associated with the accumulation of neutral lipids.
[0079]
Among the above methods, (2-1) when detecting (diagnosing) a disease associated with accumulation of neutral lipids using RNA as a biological sample, that is, presence or absence of gene expression or gene expression level (expression amount) When detecting (diagnosing) a disease associated with the accumulation of neutral lipids from, two or more, preferably a plurality, of the genes shown in SEQ ID NOs: 1 to 19 are used in order to increase the accuracy and precision of the detection (diagnosis). It is desirable to evaluate the presence or absence or the level of expression (expression amount) of each gene, more preferably all of the above gene groups, and to detect (diagnose) a disease associated with the accumulation of neutral lipids from the results.
[0080]
In addition, in the case of detecting (diagnosing) a disease associated with the accumulation of neutral lipids using a protein as a measurement target in (2-2), similarly to the above, for a biological sample, SEQ ID NOs: 1 to 19 are used. Levels of two or more, preferably a plurality of, proteins having an amino acid sequence encoded by the indicated gene (specifically, proteins having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 20 to 38) are evaluated. It is desirable to detect (diagnose) a disease associated with the accumulation of neutral lipid from the results.
[0081]
When a plurality of genes or proteins are evaluated, it is possible to score the evaluation of each gene or protein and to diagnose a disease accompanied by the accumulation of neutral lipids comprehensively. That is, when the above genes or proteins are evaluated for four genes or proteins, and two or more genes or proteins are evaluated as suspected of the pathology of a disease associated with the accumulation of neutral lipids based on the above criteria. Can be diagnosed as having a high possibility of being the disease. In this case, the number, score, or diagnostic standard of the gene or protein to be evaluated is not limited.
[0082]
(3) Screening method for drug candidates
(3-1) Screening method using gene expression as an index
The present invention provides a method for screening a substance that regulates the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19.
[0083]
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a test substance with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a homolog thereof,
(B) For cells contacted with the test substance, the expression level of the gene having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a homolog thereof is measured, and the expression level is determined as a control without contacting the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene in the cell,
(C) a step of selecting a test substance that changes the gene expression level of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a homologue thereof based on the above comparison results.
[0084]
Examples of cells used for such screening include cells capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19, regardless of whether the cell is endogenous or exogenous. As such cells, specifically, human HuH7 cells, mouse macrophage cell lines (J774), mouse 3T3L1 cells, or mouse NIH3T3 cells (American Type Culture Collection http://www.atcc.org/SearchCatalogs.logs.Clog.org/SearchCallogs/Cloglogs.org/SearchCatlogs.org/SearchCatalogs.org/SearchCatalogs.org/SearchCatalogs.org/SearchCatalogs.org/SearchCatalogs.org/SearchCatalogs.org) And the like). Preferably, it is a human HuH7 cell. In addition, such a cell can express a homolog of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19, that is, a gene encoding a homolog or variant of the gene in an organism other than human. Cells can also be used. For example, a cell endogenously expressing a rat homolog (gene) or a mouse homolog (gene) corresponding to a human gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 can be used. Such cells can also be used for screening in the form of a macrophage cell line to which a substance capable of inducing an increase in macrophage foaming, such as denatured LDL (acetylation treatment), has been added. Furthermore, the category of cells used for the screening of the present invention also includes tissues that are aggregates of cells.
In addition, a transgenic cell into which a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 has been introduced can also be used as the cell. Host cells used for the gene transfer, ie, cells derived from mice such as COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, NIH3T3, ST2, cells derived from rats, cells derived from hamsters such as BHK, CHO, COS1, COS3, Examples include monkey-derived cells such as COS7, CV1, and Vero; human-derived cells such as HeLa and 293; and insect-derived cells such as Sf9, Sf21, and High Five.
[0085]
Examples of the candidate substance include, but are not limited to, a nucleic acid (including an antisense oligonucleotide of a gene having a base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 19), a peptide, a protein, an organic compound, an inorganic compound, and the like. Specifically, screening can be performed by bringing a sample (test sample) containing a test substance that can be a candidate substance into contact with the above-mentioned tissue and / or cell. Examples of such test samples include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low-molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and mixtures thereof containing the test substance.
[0086]
In the screening of the present invention, the conditions for contacting the test substance with the cells are not particularly limited, but it is preferable to select culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that do not kill the cells and can express the desired gene. .
[0087]
As shown in the Examples, in HuH7 cells that can serve as a model of a disease associated with accumulation of neutral lipids, a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 is expressed in lipid granules. From this finding, an increase in the expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (induction / enhancement of gene expression) is associated with a disease associated with accumulation of neutral lipids. Conceivable. The screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that regulates the expression of a gene (a substance that changes the expression level) using an increase in the expression level of the gene (induction / increase of gene expression) as an index. You. By this screening method, a candidate substance that can be an active ingredient of a preventive, ameliorating, or therapeutic agent for a disease associated with accumulation of neutral lipids can be provided.
[0088]
That is, the screening method of the present invention utilizes that an increase in the expression level (expression induction) of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 is associated with a disease associated with accumulation of neutral lipids. Is what you do. Therefore, to search for a substance having an alleviating / suppressing action on the disease accompanied by the accumulation of neutral lipid (ie, exhibiting an improvement / therapeutic effect on the disease accompanied by the accumulation of neutral lipid), SEQ ID NOS: 1 to 19 The change in the expression level of the gene having the nucleotide sequence described in any of the above is used as an index.
[0089]
As described above, the screening method of the present invention searches for a substance that controls (induces or suppresses expression of) the expression level of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19. The substance thus obtained is provided as a candidate compound to be an active ingredient of an agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipid.
[0090]
In the selection of candidate substances according to the screening method of the present invention, specifically, when a cell having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a cell expressing a homolog thereof is used, the test substance (candidate) The expression level of each of the above genes in cells to which the substance (substance) is added is lower / higher than the expression level of the same gene in cells to which the test substance (candidate substance) is not added. When cells that require an expression inducer [eg, modified LDL (acetyl treatment) or the like] as a stimulant for expression of the present gene or a homolog thereof are used, the expression induced by the expression inducer depends on the presence of the candidate substance. Being controlled, that is, the gene expression of the cells contacted with the candidate substance in the presence of the expression inducer is lower than that of control cells not contacted with the candidate substance in the presence of the expression inducer (positive control) / It can be done with getting higher.
[0091]
Among the substances that regulate the expression of any of the above genes, a substance that regulates the expression so as to suppress the expression (reduction of the expression level and suppression of the induction of the expression) is specifically searched for in the sequence of the cells to which the test substance is added. It can be carried out by using as an index that the expression level of a gene containing any of the nucleotide sequences of Nos. 1 to 19 is lower than that of cells to which the test substance is not added. When cells that require an expression inducer for the expression of any of the genes containing any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 are used, the test substance is contacted in the presence of the expression inducer. The test substance can be selected as a candidate substance by using as an index that the gene expression of the expressed cells is lower than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. .
[0092]
Further, among the substances that regulate the expression of any of the above genes, a substance that regulates the expression so as to increase the expression level (increase in the expression level and enhance the induction of the expression) is specifically searched for in the cells to which the test substance is added. Can be carried out when the expression level of a gene containing any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 is higher than that of cells to which the test substance is not added. When cells that require an expression inducer for the expression of any of the genes containing any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 are used, the test substance is contacted in the presence of the expression inducer. The test substance can be selected as a candidate substance by using as an index that the gene expression of the expressed cells is higher than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. .
[0093]
The detection and quantification of the expression level of such a gene is described in the above section (2-1) using the RNA prepared from the above-described cells or the complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker of the present invention. As described above, the method can be carried out by using a known method such as Northern blotting or RT-PCR, or using a DNA chip. The degree of fluctuation (suppression / decrease or induction / increase in expression) of the gene expression level as an index is determined by the expression of the present gene or a homolog thereof in cells to which the test substance (candidate substance) is added. ) Can be exemplified by a change (decrease or increase) of 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more as compared with the expression level in control cells to which no) is added.
[0094]
In addition, the detection and quantification of the expression level of the present gene or homologs thereof are performed by introducing a fusion gene in which a marker gene such as a luciferase gene is linked to a gene region (expression control region) that controls the expression of each gene. It can also be carried out by measuring the activity of a marker gene-derived protein using a strain. The screening method for the expression controlling substance of the present gene also includes a method of searching for a target substance using the expression level of the marker gene as an index. In this sense, the concept of a gene having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 or a homolog thereof in the present invention includes a fusion gene of an expression control region of the gene and a marker gene.
[0095]
As the marker gene, a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction is preferable. Specifically, in addition to the luciferase gene described above, reporter genes such as chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, and aequorin gene can be exemplified. Here, as the expression control region of the gene or the homolog gene thereof, for example, about 1 kb, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the gene can be used. Preparation of the fusion gene and measurement of the activity derived from the marker gene can be performed by known methods.
[0096]
In the screening method of the present invention, in order to enhance the accuracy and precision of the screening, the gene expression level of a test substance for two or more of the specific genes, preferably a plurality of genes, more preferably all the genes of the above gene group And it is desirable to select candidate substances. When evaluating a plurality of genes, it is possible to score the evaluation of each gene and to comprehensively select candidate substances. For example, using one test substance, all of the above genes are evaluated, and the test substance is effective for an agent for ameliorating or treating a disease associated with accumulation of neutral lipids in two or more of the genes. When it is evaluated from the above criteria that the test compound is a component candidate compound, it can be determined that the test substance is highly likely to be a candidate compound. In this case, the number of genes to be evaluated, the score, or the criterion are not limited.
[0097]
The substance selected from the test substance by the above screening method can be positioned as a gene expression regulator of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19. These substances suppress the acceleration of accumulation of lipid granules and regulate the accumulation of neutral lipids by controlling the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 in vivo. It is thought that the disease can be alleviated or suppressed (improved, treated). Therefore, these substances are potent candidate substances for drugs that alleviate or suppress (improve, treat) diseases associated with the accumulation of neutral lipids.
[0098]
The test substance thus selected and obtained is a potential candidate substance for a drug that alleviates or suppresses (improves or treats) a disease associated with the accumulation of neutral lipids.
[0099]
The candidate substances selected by the above-described screening method of the present invention are further subjected to a drug efficacy test using a disease model animal with accumulation of neutral lipids, a safety / pharmacokinetic test using a model animal and a normal animal, and It may be subjected to clinical tests on disease patients with accumulation of neutral lipids, and by conducting these tests, it is possible to select more practical disease ameliorating or therapeutic agents with accumulation of neutral lipids. . The substances selected in this way can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
[0100]
(3-2) Screening method using protein expression level as an index
The present invention provides a method for screening a substance that controls (decreases / increases) the expression of a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 38.
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
[0101]
(A) Test substance and SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 Contacting a cell capable of expressing any of the proteins comprising any of the amino acid sequences,
(B) SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 in cells contacted with the test substance Measuring the expression level of any of the proteins comprising any of the amino acid sequences according to (38) and (38), and comparing the expression level with the expression level of the corresponding protein in a control cell not contacted with the test substance;
(C) Based on the comparison result of (b) above, SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 Selecting a test substance that changes the expression level of any of the proteins containing any of the amino acid sequences according to any one of claims, 37 and 38.
[0102]
The cells used in the screening of the present invention express any of the genes containing any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19, regardless of endogenous or exogenous, and have SEQ ID NOs: 20 to 38 as expression products. And cultured cells having a protein containing any of the amino acid sequences described in (1). Here, the expression of the protein containing any of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 to 38 can be easily confirmed by detecting the protein as a gene product by a known Western method. Specific examples of the cells include cells containing lipid granules such as HuH7 cells as described in the above (3-1) (1) to (3), and macrophages treated with various stimulants. Lineage cells or established cells into which any of the present genes have been introduced. The category of the cell also includes a cell membrane fraction, a cytoplasmic fraction, a cell nuclear fraction and the like.
[0103]
The test substance (candidate substance) screened by the screening method of the present invention is not limited, but includes nucleic acids (including antisense nucleotides of the gene of the present invention), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, the test is carried out by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the cells or the cell membrane fraction. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts containing test substances, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
[0104]
As shown in the Examples, in HuH7 cells that can serve as a model of a disease associated with accumulation of neutral lipids, the expression of a gene containing any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38 is specifically increased. From this finding, it is considered that the enhanced expression of the present gene and the present protein is associated with a disease accompanied by accumulation of neutral lipid. Therefore, the screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that changes the expression level using the expression level of a protein containing any of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 to 38 as an index. By this screening method, it is possible to provide a candidate substance having an alleviating / suppressing action for a disease associated with the accumulation of neutral lipids (which exhibits an effect of improving / treating a disease associated with the accumulation of neutral lipids).
[0105]
That is, the screening method of the present invention searches for a substance that alters the expression level of any of the proteins containing any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38, thereby detecting the disease associated with the accumulation of neutral lipids. It is intended to provide a candidate substance serving as an active ingredient of an improving agent or a therapeutic agent.
[0106]
The selection of the candidate substance is performed, specifically, in the case of using a cell that expresses and produces a protein containing any of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 to 38, in a cell to which a test substance (candidate substance) is added. It can be carried out using, as an index, that the protein amount (level) of the protein of the present invention fluctuates (becomes lower / higher) as compared with the amount (level) of cells to which a test substance (candidate substance) is not added. . When cells that require an expression inducing substance for expression and production of a protein containing any of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 to 38 are used, an expression inducing substance [eg, insulin, dexamethasone, 3-isobutyl -1-methylxanthine, a substance having prostaglandin J2 activity, etc.], in which the production of the protein is controlled by the presence of the test substance, that is, cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. The expression of the test substance as a candidate substance is determined by using the index that the gene expression of (a) becomes fluctuated (lower / higher) compared to a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. Can be sorted out.
[0107]
Examples of the cells to be used include Caco-2 cells, HT-29 cells, and COLO 205 cells, which are colon-derived cells.
[0108]
Among the substances that regulate the expression of any of the above proteins, selection of candidate substances that regulate the expression so as to reduce the expression (reduction of the expression level and suppression of the induction of the expression) is performed by specifically selecting SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 by expressing and producing a protein comprising any one of the amino acid sequences described above. When cells are used, SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38, the protein amount (level) of the protein containing any of the amino acid sequences is lower than the amount (level) of the cells to which the test substance (candidate substance) is not added. To become a As an index, it can be carried out. In addition, any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 When using a cell that requires an expression inducing substance for expression of any of the proteins including the amino acid sequence, the expression of the protein in the cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducing substance is reduced in the presence of the expression inducing substance. The test substance can be selected as a candidate substance by using the index as lower than that of control cells not contacted with the test substance (positive control) as an index.
[0109]
Among the substances that regulate the expression of any of the above proteins, selection of candidate substances that regulate the expression so as to increase the expression (increase in the expression level and enhance the induction of the expression) is performed by specifically selecting SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 by expressing and producing a protein comprising any one of the amino acid sequences described above. When cells are used, SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38, the protein amount (level) of the protein containing any of the amino acid sequences is higher than that of the cells to which the test substance (candidate substance) is not added. To become a As an index, it can be carried out. In addition, any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 When using a cell that requires an expression inducing substance for expression of any of the proteins including the amino acid sequence, the expression of the protein in the cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducing substance is reduced in the presence of the expression inducing substance. The test substance can be selected as a candidate substance based on the fact that the test substance is higher than control cells not contacted with the test substance (positive control).
[0110]
As described above, the production amount of the protein containing any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38 according to the screening method of the present invention may be, for example, the disease marker of the present invention relating to an antibody (for example, SEQ ID NOS: 20 to 38). Quantification according to a known method such as Western blotting using a protein having any of the amino acid sequences described above or an antibody that recognizes a homolog thereof. The Western blot method uses the disease marker of the present invention as a primary antibody, and then uses the disease marker as a secondary antibody. 125 I is labeled with an antibody that binds to a primary antibody labeled with a radioisotope such as I, a fluorescent substance, an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), and signals derived from these labeled substances are measured using a radiometer (BAS-1800II: Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector. Further, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, detection was performed according to the protocol using ECL Plus Western Blotting Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), followed by multi-bioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). It can also be measured.
[0111]
(3-3) Screening method using function (activity) of protein as index
The present invention provides a method for screening a function (activity) of a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38.
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
[0112]
(A) contacting the test substance with a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 38;
(B) The function or activity of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38, which is caused by the step (a), is measured, and the function or activity is determined without bringing a test substance into contact with the protein. : Comparing the function or activity of the protein containing the amino acid sequence described in 20 to 38,
(C) a step of selecting a test substance that causes a change in the function or activity of the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38 based on the comparison result in (b) above.
[0113]
In the screening method of the present invention, any method for measuring the function and activity based on the known function and activity of the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38 can be used. That is, a test substance is added to a known function / activity measurement system for a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 to 38, and the known function of the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 to 38 is added. The screening method of the present invention is a screening method according to the present invention, in which a test substance that controls (enhance, suppress, promote, or inhibit) the activity is selected as a candidate substance having an improvement / therapeutic effect on a disease associated with accumulation of neutral lipids. Included in the method category.
[0114]
The screening of the present invention can be performed by bringing an aqueous solution, a cell, or a cell fraction prepared from the cell, containing a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38 into contact with a test substance. That is, examples of the aqueous solution containing the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38 include a normal aqueous solution, a cell lysate, a cell lysate, a nuclear extract, or a cell culture supernatant containing these proteins. And the like.
[0115]
In addition, examples of the cells used in the screening method of the present invention include cells that can express the proteins described in SEQ ID NOs: 20 to 38 regardless of whether they are endogenous or exogenous. As the cells, HuH7 cells or established cells into which the genes described in SEQ ID NOs: 20 to 38 have been introduced can be used.
The cell fraction used in the screening method of the present invention refers to various fractions derived from the above cells, and includes, for example, a cell membrane fraction, a cytoplasmic fraction, a cell nucleus fraction, and the like.
The proteins described in SEQ ID NOs: 20 to 38 used in the screening are known proteins, and as described in the above (1-3), include the sequence information (SEQ ID NO: 1) of the gene provided by the present invention. DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culturing of transformed cells, and, if necessary, collection of proteins from the culture. These operations are carried out according to methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done.
[0116]
As shown in the Examples, a protein containing an amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 20 to 38 is specifically upregulated in fat granules in HuH7 cells, which is a model of a disease associated with accumulation of neutral lipids. are doing. From this finding, it is considered that the function (activity) enhancement of the present protein is related to a disease accompanied by accumulation of neutral lipid. Therefore, in the screening method of the present invention, a substance that controls the function (activity) of a protein containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38 is used as an index. A method of searching for is included. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the screening method of this invention, the substance which controls the function or activity of the protein containing the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 38 can be searched, and thus the mitigation / suppression of the disease accompanied by the accumulation of neutral lipids (Providing an improvement / therapeutic effect on a disease associated with accumulation of neutral lipids).
[0117]
As one embodiment of the control of the function (activity) of the protein of the present invention, the search for a substance that controls (decreases) the function (activity) of the protein is carried out, for example, by searching for any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 19 An aqueous solution containing a gene containing, a function of at least one protein obtained when the test substance is brought into contact with cells or a cell fraction prepared from the cells, a control aqueous solution to which no test substance is added, It can be carried out using, as an index, a decrease in the function (activity) of the corresponding protein in the cell or the cell fraction.
[0118]
Further, as another embodiment of the function (activity) control of the protein of the present invention, the search for a substance that controls the function (activity) of the protein in the direction of enhancing (elevating, increasing) is performed, for example, as described in SEQ ID NOs: 20 to 38. The function (activity) of at least one protein obtained when the test substance is brought into contact with an aqueous solution, a cell, or a cell fraction prepared from the cell, which contains a protein containing the amino acid sequence of any of the above, It can be carried out by using as an indicator that the function (activity) of the corresponding protein in the control aqueous solution, cell or cell fraction not added is higher.
That is, the screening method of the present invention searches for a substance that regulates the function or activity of a protein containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 38, thereby improving a disease associated with accumulation of neutral lipids. Alternatively, it provides a candidate substance to be an active ingredient of a therapeutic agent.
The test substance (candidate substance) screened by the screening method of the present invention is not limited, and nucleic acids, peptides, proteins (including antibodies against proteins containing any of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 to 38), organic compounds, Compounds, inorganic compounds, etc., and the screening of the present invention is specifically performed by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the above-mentioned aqueous solution, cells or cell fraction. The test sample includes, but is not limited to, a cell extract, a gene library expression product, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, a natural compound, etc., containing the test substance.
[0119]
The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is protein kinase C Mu and its activity is known. The protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is protein kinase C delta (protein kinase delta), and its activity is known. The protein represented by SEQ ID NO: 23 is protein kinase C Nu, and its activity is known. Therefore, as a method for measuring the function (activity) of a protein consisting of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 20 to 22, a method for measuring protein kinase C activity can be mentioned.
[0120]
The following method is exemplified as a screening method based on the function or activity of the protein described in SEQ ID NOs: 20 to 22.
[0121]
That is, the transfer activity of radioactive phosphate from [γ-32P] ATP to the substrate protein by protein kinase C can be measured. Usually, a histone protein is used as a substrate. Phosphoryl transfer activity, which increases in a calcium-phospholipid-dependent manner after reaction with protein kinase C, is determined by measuring the radioactivity of 32P incorporated into the substrate protein. Is the activity of protein kinase C. Table 1 shows a composition example of a standard reaction solution.
[Table 1]
Since protein kinase C has autophosphorylation ability, ATP and protein kinase C are not allowed to coexist except during the reaction, and the enzyme reaction is started by adding one of them. The reaction is carried out at 30 ° C., and after a certain time, 1 ml of 20% trichloroacetic acid is added to stop the reaction. The acid-insoluble protein is fixed to the bottom of the tube by centrifugation, solubilized with 2 ml of 1N sodium hydroxide, and the radioactivity is measured using the Cefrenko effect. When a synthetic peptide is used as a substrate instead of a histone protein, an experimental system may be used in which the volume of the above reaction composition is all reduced to 1/4. In this case, the reaction is stopped with 300 mM phosphoric acid, The whole amount is adsorbed on a phosphocellulose disc having a diameter of 2 cm, washed with a 75 mM phosphoric acid solution, air-dried, and the radioactivity is measured.
When measuring the protein kinase C inhibitory activity of a test substance, an inhibitor is added to the reaction solution, and after a certain period of reaction, the radioactivity incorporated into the substrate by the enzymatic reaction is compared with the case where the test substance is not added. As a result, the protein kinase C inhibitory activity of the test substance can be measured.
Examples of the substrate used in the above assay include, in addition to the histone proteins, protamine, glycogen phosphorylase kinase, fibrinogen, ribosomal protein S6, troponin,
[0123]
The test substance thus selected and obtained is a potential candidate for a drug that alleviates or suppresses (improves, treats) a disease associated with accumulation of neutral lipids.
[0124]
In addition, the screening methods described in the above (3-1) to (3-3) not only select a candidate substance for improvement or treatment of a disease associated with accumulation of neutral lipids, but also reduce the accumulation of neutral lipids. Whether an existing or novel amelioration or therapeutic agent (candidate drug) for the accompanying disease controls the expression of any of the genes containing the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19, or No .: 20-38. It can also be used to evaluate and confirm whether or not to control any expression or function / activity of a protein containing any of the amino acid sequences described in 20-38. That is, the category of the screening method of the present invention includes not only the search for candidate substances but also those for the purpose of such evaluation or confirmation.
[0125]
Before the screening method of the present invention is carried out, a substance that suppresses the expression of a gene encoding each of the proteins of the present invention listed above may be ameliorated with a substance that suppresses the expression of a neutral fat by a preliminary experiment. Or, is it useful as an active ingredient (candidate substance) of a therapeutic agent, or is a substance that induces expression useful as an active ingredient (candidate substance) of a ameliorating agent or a therapeutic agent for a disease accompanied by accumulation of neutral fat? This is possible, and the specific method is as described above. When it is determined by the experiment that the expression-suppressing substance of the gene of the present invention is likely to be a candidate substance, screening is performed by using the suppression of the function (activity) of the protein of the present invention encoded by the gene as an index, Candidate substances can be selected with higher accuracy, and when it is determined by the experiment that the expression-inducing substance of the gene of the present invention is highly likely to be a candidate substance, the function of the protein of the present invention encoded by the gene is determined. By performing screening using an increase in (activity) as an index, a candidate substance can be selected with higher accuracy.
[0126]
The control substance or candidate substance selected by the screening method of the present invention described in the above (3-1) or (3-2) is an animal model well-known as an animal model of a disease accompanied by accumulation of neutral lipids, etc. May be used for drug efficacy tests, safety tests, and clinical trials for patients suffering from diseases associated with triglyceride accumulation, and by conducting these tests, more practical neutral fats can be obtained. An agent for improving or treating a disease associated with accumulation can be obtained. The substances selected in this way can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
[0127]
(4) Improvement / therapeutic agent for diseases accompanied by accumulation of neutral lipids
The present invention provides an agent for ameliorating / treating a disease associated with accumulation of neutral lipids.
[0128]
In the present invention, the expression of a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 38) is a neutral lipid. From the new finding that it is related to a disease associated with accumulation, (1) a substance that alters the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19 is useful for ameliorating or treating the disease It is based on the idea that it is effective. That is, the agent for ameliorating or treating a disease associated with the accumulation of neutral lipids of the present invention comprises, as an active ingredient, a substance that changes the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19. .
[0129]
The expression controlling substance of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 19, which is the active ingredient, is not limited to the one selected by using the above-described screening method, but is also information on the selected substance. May be produced by a chemical / biochemical method according to a conventional method based on the method described above, or industrially.
[0130]
Such an expression controlling substance (expression suppressing (decreasing) substance or expression inducing (enhancing) substance) may be used as it is or as a pharmaceutically acceptable carrier (excipient, bulking agent, binder, lubricant, etc.) known per se. ) And conventional additives can be prepared as a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition is prepared in the form (oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, etc .; injections, drops, external preparations, nasal drops, eye drops, inhalants, Oral administration or parenteral administration can be carried out according to parenteral administration preparations such as suppositories). The dose varies depending on the type of the active ingredient, the route of administration, the subject of administration or the age, weight, and symptoms of the patient, and cannot be unconditionally defined. However, the daily dose is several mg to 2 g, preferably about several tens mg. It can be administered once or several times a day.
[0131]
When the substance as the active ingredient is encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy. Further, when the active ingredient is an antisense oligonucleotide of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 19, gene therapy can be performed as it is or by incorporating this into a vector for gene therapy. You can also. In these cases as well, the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like, but those skilled in the art can appropriately select them.
[0132]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0133]
Example 1 Proteome analysis
(1) Preparation of lipid granule fraction and SDS-PAGE
HuH7 is a cell line that causes spontaneous accumulation of lipid granules. HuH7 cells were cultured at 37 ° C. using Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with 10% FCS (serum), and the medium was replaced every 3-5 days. To isolate the lipid granules, the cells were cultured on 20 60 mm dishes at 1,000,000 cells per dish for 7 days. The results of staining with Oil red O and hematoxylin are shown in FIG. FIG. 1 shows that HuH7 cells accumulate fat granules. Cells were harvested by trypsin detachment and centrifugation at 1000 g to isolate lipid granules.
To 1.73 ml of HuH7 cells, the same amount of a solubilization buffer containing 8.55% sucrose (PMSF was added to a concentration of 20 μg / ml) was added to the cells, and the mixture was homogenized with a homogenizer. After homogenization, 1.5 ml of a solubilization buffer containing 70% sucrose was added to the solution (3.34 ml) that had been centrifuged twice at 1000 g and enucleated to adjust the final concentration of sucrose to 26%. A solubilization buffer containing 35%, 43%, and 51% sucrose (leupeptin, pepstatin, chymostatin, and antipain was added to a concentration of 10 μg / ml) in 16PA tubes (Hitachi) in a stepwise manner. The supernatant after the enucleation after adjusting the sucrose concentration to 26% was overlaid. Furthermore, a solubilization buffer containing 2%, 10% and 18% sucrose was layered thereon. The solution volume is 3.6 ml of the solubilization buffer containing 2% sucrose, 1.6 ml of the solubilization buffer containing 10%, 18%, 35%, and 43 sucrose, and the solubilization buffer containing 51% sucrose. Was 1.0 ml, and the supernatant after enucleation (containing 26% sucrose) was 4.85 ml. The layered sample was ultracentrifuged at 2 ° C. for 2 hours at 2 ° C. for 3 hours using an ultracentrifuge 65P-7 (Hitachi) and a rotor RPS-28SA-1 (Hitachi). 19 fractions were collected and collected.
The proteins contained in each fraction were separated using SDS-PAGE (9.5% acrylamide gel) and detected by Coomassie blue staining. Preparation of the electrophoresis sample was performed by mixing 3 μl of each fraction with 5 μl of a sample processing buffer for SDS-PAGE and 5 μl of DDW, and performing a heat treatment at 75 ° C. for 20 minutes.
The triacylglycerol content in each fraction was analyzed by thin-layer chromatography. 7.5 μl of each fraction of sucrose density gradient centrifugation was extracted with ether and chloroform, spotted on a TLC plate (Silica gel 60, MERCK), and developed with hexane / chloroform / acetic acid = 80/20/1. After development, the air-dried TLC plate was placed in 3% Cu (CH 3 CO 2 ) 2 , 8% phosphoric acid, and heated at 130 ° C. to detect triacylglycerol spots. The results are shown in FIG. Organelles and soluble proteins composed of lipid bilayers are heavier than lipid granules rich in neutral lipids, so they sink to the bottom of the tube, and the lipid granules are collected from the top (
[0134]
(2) Trypsin digestion of protein band
Next, the target protein band was cut out from the SDS-PAGE gel to which the fat granule fraction was applied, transferred to an Eppendorf tube, washed with a 50% acetonitrile / 50 mM ammonia hydrogen carbonate solution, and then dried with a speed bag. After drying, a 10 mM DTT / 50 mM ammonium bicarbonate solution was added, and the mixture was reacted at 56 ° C. for 1 hour. Then, a 50 mM acetamide / 50 mM ammonium bicarbonate solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes to perform reductive alkylation. Was. Next, the gel was washed several times with a 50 mM ammonium bicarbonate solution and acetonitrile alternately, and dried with a speed bag. 12.5 ng / μl of trypsin / 25 mM ammonium bicarbonate solution was added to the dried gel, and enzyme digestion was carried out at 37 ° C. and overnight. After the enzyme digestion, the peptide was extracted from the gel with a 25 mM ammonium bicarbonate solution and acetonitrile, dried with a speed bag, and then redissolved with 10 μl of 0.1% TFA. After reconstitution, the samples were stored frozen at -20 ° C until analysis.
(3) Protein identification by mass spectrometer
The analysis of the sample was performed by ion trap type LC-MS (LCQ; ThermoQuest). The entire amount of the sample was applied to HPLC (HP1100; Agilent), and subjected to LC-MS / MS analysis while separating with PepMap C18 (inner diameter 75 μm,
Protein identification from MS / MS spectra was carried out by using Mascot (matrix science) as search software and searching the NCBI database.
(4) Extraction of proteins having intracellular localization in fat granules
MS analysis of 37 protein bands was performed to identify proteins. The intracellular localization of the identified protein was examined using a public database such as SWISS-PROT. As a result, a protein (a protein consisting of the sequence represented by SEQ ID NOs: 20 to 38), which had not been reported to be present in lipid granules, could be identified.
A list of the identified proteins is shown below.
[Table 2]
Example 2 Preparation of Total RNA from Human Tissue Sample
Total RNA was prepared from one sample of normal human adipose tissue and one sample of normal liver tissue in accordance with a conventional method, and DNA chip analysis was performed using the obtained total RNA. DNA chip analysis was performed using Affymetrix Gene Chip Human Genome U95A, B, C, D, and E. Specifically, analysis includes (1) preparation of cDNA from total RNA, (2) preparation of labeled cRNA from the cDNA, (3) fragmentation of labeled cRNA, and (4) fragmentation of cRNA and probe array. , (5) Probe array staining, (6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis.
[0136]
(1) Preparation of cDNA from total RNA
A mixture of 11 μL containing 10 μg of each total RNA and 100 pmol of T7- (dT) 24 primer (manufactured by Amersham) prepared according to an ordinary method from one sample of normal human adipose tissue and one sample of normal liver tissue was used at 70 ° C. After heating for 10 minutes, it was cooled on ice. After cooling, 4 μL of the 5 × First Strand cDNA Buffer included in SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (manufactured by Gibco-BRL), 0.1 M DTT included in the kit, 0.1 M DTT contained in the kit, Was added and heated at 42 ° C. for 2 minutes. Further, 2 μL (400 U) of Super ScriptII RT included in the kit was added, heated at 42 ° C. for 1 hour, and then cooled on ice. After cooling, 91 μL of DEPC-treated water (manufactured by Nacalai Tesque, sterile distilled water), 30 μL of 5 × Second Strand Reaction Buffer included in the kit, 3 μL of 10 mM dNTP Mix, 3 μL of E. coli contained in the kit.
[0137]
Thereafter, 0.5 mL of 80% ethanol was added to the pellet, centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was discarded. After performing the same operation again, the pellet was dried and dissolved in 12 μL of DEPC-treated water.
[0138]
By the above operation, each cDNA was obtained from each total RNA prepared from one sample of normal human adipose tissue and one sample of normal liver tissue.
[0139]
(2) Preparation of labeled cRNA from cDNA
17 μL of DEPC-treated water, 4 μL of 10 × HY Reaction Buffer contained in the BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (manufactured by ENZO), 5 μL of each cDNA solution, 4 μL of 10 × Biotin Labeled Kit included in the kit, and 10 × Biotin Labeled Radio kit included in the kit 4 μL of 10 × DTT, 4 μL of 10 × RNase Inhibitor Mix included in the kit, and 2 μL of 20 × T7 RNA Polymerase included in the kit were mixed and reacted at 37 ° C. for 5 hours to prepare labeled cRNA. After the reaction, 60 μL of DEPC-treated water was added to the reaction solution, and the prepared labeled cRNA was purified using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
[0140]
(3) Fragmentation of labeled cRNA
To a solution containing 20 μg of each labeled cRNA, 8 μL of 5 × Fragmentation Buffer (200 mM Tris-acetic acid, pH 8.1 (Sigma), 500 mM potassium acetate (Sigma), 150 mM magnesium acetate (Sigma)) was added. 40 μL of the reaction was heated at 94 ° C. for 35 minutes and then placed on ice. Thereby, the labeled cRNA was fragmented.
[0141]
(4) Hybridization between fragmented cRNA and probe array
To 40 μL of each fragmented cRNA, 4 μL of 5 nM Control Oligo B2 (manufactured by Amersham), 4 μL of 100 × Control cRNA Cocktail, 40 μg of Herring sperm DNA (manufactured by Promega), 40 μg of Acetylated BSAGibRibGibSigBigRig (2) Buffer (200 mM MES, 2 M [Na + ], 40 mM EDTA, 0.02% Tween20 (Pierce), pH 6.5 to 6.7) (200 µL) and DEPC-treated water (144 µL) were mixed to obtain 400 µL of a hybrid cocktail. Each of the obtained hybrid cocktails was heated at 99 ° C. for 5 minutes, and further heated at 45 ° C. for 5 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at room temperature to obtain a hybrid cocktail supernatant.
[0142]
On the other hand, a Human genome U95 probe array (manufactured by Affymetrix) filled with 1 × MES hybridization buffer was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 10 minutes, and then the 1 × MES hybridization buffer was removed. A probe array was prepared. 200 μL of the hybrid cocktail supernatant obtained above was added to each of the probe arrays, and the mixture was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 16 hours to obtain a probe array hybridized with the fragmented cRNA.
[0143]
(5) Staining of probe array
After collecting and removing the hybrid cocktail from each of the hybridized probe arrays obtained above, Non-Stringent Wash Buffer (diluted 6 × SSPE (diluted 20 × SSPE (manufactured by Nacalai Tesque)), 0.01
[0144]
(6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis
Each stained probe array was subjected to HP GeneArray Scanner (manufactured by Affymetrix), and the staining pattern was read. Based on the staining pattern, the gene expression on the probe array was analyzed by GeneChip Workstation System (manufactured by Affymetrix). Next, according to the analysis protocol, normalization and comparative analysis of gene expression were performed.
[0145]
Example 3 Analysis of a gene specifically expressed in adipose tissue
From the results of comparative analysis of gene expression by DNA chip analysis performed in Example 2, a probe showing a 4-fold or more increase in expression in human normal adipose tissue as compared to normal liver tissue was selected. Further, the results were compared with the results of Example 1, and a probe (SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23) that was specifically expressed in adipose tissue and that was specifically expressed in the lipid granules of HuH7 cells , And 24 were selected, and the results are shown in Table 3.
[0146]
[Table 3]
In the table, the Human U95 probe name indicates the probe name in the Human Genome U95 Chip. Acc No in the table indicates an accession number in the GenBank database. In the table, the fold variation indicates the gene expression level in adipose tissue when the gene expression level in normal liver tissue analyzed by Human Genome U95 Chip is set to 1. In addition, SEQ ID NOs in the following sequence listing showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of each gene are also shown.
[0148]
【The invention's effect】
According to the present invention, a protein (a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 38) which is specifically present in fat granules of HuH7 cells, which is a model of a disease associated with accumulation of neutral fat, has been revealed. Such proteins and genes encoding them are useful as marker genes (probes and primers) used for genetic diagnosis of diseases involving accumulation of neutral fats such as arteriosclerosis, obesity, and fatty liver. According to such a marker gene, it is possible to clarify whether or not the subject is suffering from the disease and the cause of the disease (improvement in diagnostic accuracy), thereby enabling more appropriate treatment to be performed. That is, the marker gene of the present invention can be used as a tool for appropriate treatment of a disease accompanied by accumulation of neutral fat.
[0149]
Further, from the relationship between the increase in the expression of the gene and the disease, a substance that suppresses / induces the expression of the gene is considered to be useful as a therapeutic agent for the disease accompanied by the accumulation of neutral lipids. Therefore, according to the gene of the present invention, by using the suppression / induction of its expression as an index, it is possible to screen and select a candidate drug that can be a preventive, ameliorating or therapeutic agent for a disease associated with the accumulation of neutral lipids. It is. That is, the present invention also provides a technique for developing a therapeutic agent for a disease associated with accumulation of neutral lipid.
[0150]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing observation of lipid granules of HuH7 cells. Human liver cell line HuH7 was stained with Oil Red O reagent and hematoxylin staining reagent and observed under a microscope. Lipid granules stained red and nuclei stained blue.
FIG. 2 shows the results of purifying lipid granule proteins by sucrose gradient fractionation. Upper panel: Each purified fraction was purified by SDS-electrophoresis, and the protein was stained with Coomassie Blue reagent. Lower panel: Each purified fraction was purified by SDS-electrophoresis and analyzed by immunostaining using an antibody against ADRP protein. ADRP protein is available from Fr. 1 was detected.
For each purified fraction, triacylglycerol and cholesterol were detected by the TLC method. In each case, Fr. 1 was detected.
FIG. 3 shows the results of analysis of lipid granule proteins by SDS-electrophoresis.
1. 5 shows the results of analysis of a protein before purification by sucrose gradient fractionation. The molecular weight is shown on the left.
2. Analysis results of protein after purification by sucrose gradient fractionation. On the right is shown the SEQ ID NO of the gene encoding the protein of the present invention.
Claims (16)
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、請求項１又は請求項２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程。A method for detecting a disease associated with the accumulation of neutral lipid, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to claim 1 or 2;
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA, using the disease marker as an index,
(C) The measurement results of the subject obtained in the above (b) indicate that the accumulation of neutral lipids is based on the fact that the amount of binding to the disease marker is increased as compared with the results obtained for normal biological samples. A step of determining the presence of the accompanying disease.
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項４又は５に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質又はその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、中性脂質の蓄積を伴う疾患の罹患を判断する工程。A method for detecting a disease associated with the accumulation of neutral lipid, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a biological sample of a subject to the disease marker according to claim 4 or 5,
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker, using the disease marker as an index,
(C) The measurement results of the subject obtained in the above (b) indicate that the accumulation of neutral lipids is based on the fact that the amount of binding to the disease marker is increased as compared with the results obtained for normal biological samples. A step of determining the presence of the accompanying disease.
（ａ）被験物質と配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, including the following steps (a), (b) and (c): A method for screening a substance that regulates the expression of a gene having the nucleotide sequence according to any one of 16, 17, 18, and 19:
(A) Test substance and SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 Contacting a gene having the nucleotide sequence according to the above or a cell capable of expressing a homolog thereof,
(B) SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, And measuring the expression level of the gene having the nucleotide sequence according to any one of 19 or a homologue thereof, and comparing the expression level with the expression level of the corresponding gene in a control cell not contacted with the test substance,
(C) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 based on the comparison result of (b) above. Selecting a test substance that changes the expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of, 18 and 19 or a homolog thereof.
（ａ）被験物質と配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を測定し、該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質又はそのホモログの発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, including the following steps (a), (b) and (c): A method for screening a substance that controls the expression of a protein having the amino acid sequence according to any one of 35, 36, 37, and 38 or a homolog thereof:
(A) Test substance and any of SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, and 38 Contacting a protein capable of expressing a protein or a homolog thereof having the amino acid sequence according to
(B) SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 in cells contacted with the test substance And the expression level of the protein having the amino acid sequence according to any one of the above and 38 or a homolog thereof is measured, and the expression level is compared with the expression level of the corresponding protein or the homolog thereof in a control cell not contacted with the test substance. Process,
(C) SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 based on the comparison results of (b) above. Selecting a test substance that changes the expression level of a protein having the amino acid sequence of any one of, 37 and 38 or a homolog thereof.
（ａ）被験物質を配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログに接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じる配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性を測定し、該機能又は活性を被験物質を接触させない場合の配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：２０〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はそのホモログの機能又は活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程。A method for screening a substance that controls the function or activity of a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(A) contacting the test substance with a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof;
(B) The function or activity of the protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof resulting from the step (a) is measured, and the function or activity is determined using the test substance. A step of comparing the function or activity of the protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof when not contacted,
(C) a step of selecting a test substance that causes a change in the function or activity of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 20 to 22 or a homolog thereof based on the comparison result in (b) above.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002298273A JP2004129587A (en) | 2002-10-11 | 2002-10-11 | Disease marker of disease accompanying accumulation of neutral lipid and utilization thereof |
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|---|---|---|---|
| JP2002298273A JP2004129587A (en) | 2002-10-11 | 2002-10-11 | Disease marker of disease accompanying accumulation of neutral lipid and utilization thereof |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JP2004129587A true JP2004129587A (en) | 2004-04-30 |
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JP2004129587A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010520854A (en) * | 2006-11-29 | 2010-06-17 | ミトス・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | Nitroxides for use in the treatment or prevention of hypercholesterolemia |
-
2002
- 2002-10-11 JP JP2002298273A patent/JP2004129587A/en active Pending
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