【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｍＧｌｕＲ１（メタボトロピックグルタメート受容体１）の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法や、かかるモノクローナル抗体を含有するｍＧｌｕＲ１の検出試薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとするものであって、このファージシステム（例えば、非特許文献１参照。）によるとヒトの抗体の抗原を同定することが可能となる。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗原を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング法についても既に数多く報告されている（例えば、非特許文献２、３参照。）。
【０００３】
その他、膜分子のクローニング方法として、例えばＣＯＳ７細胞とＳＶ４０の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性発現を利用して、動物細胞発現ベクターで作製されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ７細胞に導入し、細胞表面上にｃＤＮＡライブラリー由来の膜蛋白質を発現させ、目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガンドを用いてパニングあるいはＦＡＣＳで濃縮し、プラスミドＤＮＡを回収して再びＣＯＳ７細胞にトランスフェクションし、濃縮操作を繰り返す方法や、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーをいくつかの小さなプールに分け、ＣＯＳ７細胞に導入し、アイソトープで標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさらに少数のプラスミドからなるプールに分けてトランスフェクションを繰り返しクローン化する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、ヒト細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて２本鎖ｃＤＮＡを作り、この２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターで宿主をトランスフォームして前記抗原を発現させ、リューマチ性関節炎患者の血清からの抗体を用いて、前記抗体が前記発現抗原に結合することを、抗ヒトＩｇＭ抗体−アルカリホフファターゼ複合体とアルカリホスファターゼ顕色基質とによって検出することによりトランスフォームされた宿主を選択する、リューマチ性関節炎関連抗体に対して反応性を有するリューマチ性関節炎の診断用抗原をコードする組換えＤＮＡの作製方法も知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
他方、神経軸索の成長等に関して以下の知見が知られていた。
神経系の発達過程において軸策は、迷うことなく特定の経路を正確に選んで伸長することが知られている（例えば、特許文献５、６参照。）。軸策が正しく進むためには、成長中の軸策と、その経路に存在する特殊化細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ）との一時的な相互作用が重要である（例えば、非特許文献７参照。）。例えば、嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長し（例えば、非特許文献８、９参照。）、この軸索の道標となる神経細胞（道標細胞）を特異的に標識するマーカー抗体としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｌｏｔ１が知られている（例えば、非特許文献１０参照。）。道標細胞は、軸索の伸長に先だって、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導するが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１がどのような抗原分子を認識しているのかは不明であった。この抗原分子は、少なくとも発生期の終脳においては道標細胞のみで発現されており、道標細胞特有の何らかの機能と関係する可能性が考えられている。
【０００６】
また、グルタミン酸は、神経終末より放出され、シナプス後膜あるいは神経終末に存在するグルタミン酸受容体を介して神経細胞活性あるいは神経伝達物質の放出を調節するなど、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であると考えられており、グルタミン酸受容体は、中枢における興奮性シナプス伝達に中心的役割を担っている。グルタミン酸受容体は、シグナル伝達機構等から、イオンチャネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチャネル型グルタミン酸の受容体と、Ｇタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）とに大別され、遺伝子のクローニングによりｍＧｌｕＲには異なる８種類のサブタイプｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８が存在することも知られている。ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８はそれぞれ異なる脳内分布を示し、ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５はＧタンパク質を介してホスホリパーゼ、イノシトール３リン酸、カルシウムと情報を伝える受容体とされ、ｍＧｌｕＲ１は長い細胞該ドメインをもつ７回膜貫通タンパク質で、神経伝達物質グルタミン酸のレセプターとして機能すると考えられている（例えば、非特許文献１１、１２参照。）。
【０００７】
さらに、ｍＧｌｕＲのアゴニストである（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸の投与により、てんかんが誘発されることが報告されている（例えば、特許文献１３、１４参照。）。（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸や（ＲＳ）３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（以下３，５−ＤＨＰＧという）はマウスやラット脳実質に微量投与、又は全身投与すると痙攣を伴って、神経細胞死を引き起こすことが報告されている（例えば、非特許文献１４、１５参照。）。また、ｍＧｌｕＲ１のアンタゴニストで、かつｍＧｌｕＲ２のアゴニストである（Ｓ）−４−カルボキシ−３−ヒドロキシフェニルグリシンの種々のてんかんモデルでの有効性が報告されている（例えば、非特許文献１６参照。）。
【０００８】
【特許文献１】
特表平１０−５１３２５７号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０， １１９４−１１９８， １９８３
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ３８６−３９０ １９９０
【非特許文献３】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２１７， ２２８−２５７ １９９３
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５−３３６９ １９８７
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ６９４−６９９， １９８８
【非特許文献６】
Ｎｅｕｒｏｎ １０， ７７−９８， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， １１２３−１１３１， １９９６
【非特許文献７】
Ｎａｔｕｒｅ ３８５， ２３−２４， １９９７
【非特許文献８】
Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２， １９８４
【非特許文献９】
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８
【非特許文献１１】
Ｎａｔｕｒｅ ３４９， ７６０−７６５， １９９１
【非特許文献１２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２， １３１８−１３２１， １９９１
【非特許文献１３】
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ．， １６２， １２−１６， １９９３
【非特許文献１４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １３， ４４４５−４４５５， １９９３
【非特許文献１５】
Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ３４， １０６３−３０６７， １９９５
【非特許文献１６】
Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２７６， ５１６−５２２， １９９６
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体やその製造方法、該モノクローナル抗体を含有するｍＧｌｕＲ１の検出試薬、診断薬、治療薬を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の認識する抗原は、免疫染色のパターンから膜タンパク質であると予想されたが、ウエスタンブロットでも免疫沈降でも、この抗原分子を検出することはできなかった。このことは、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原決定部位が、膜からの抽出や可溶性にともなって破壊されたためであると考えられていた。このような性質の抗原決定部位をもつモノクローナル抗体の場合、その抗原分子を同定することは極めて困難である。免疫沈降により抗原タンパク質を精製することはもちろん不可能であるし、ファージライブラリーを用いた発現検索系でも抗原を同定できる可能性は極めて低い。そこで発想を変えて、タンパク質をなるべく本来の立体構造に近い形で発現することにより、抗原分子を検索しようと考えた。具体的には、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを哺乳類用発現ベクターに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養株細胞（ＣＯＳ細胞）に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。この方法であれば、たとえそのｃＤＮＡに膜タンパク質がコードされていたとしても、その産物は通常どおり細胞膜に組み込まれていて本来の立体構造を取りうるはずである。このように考えて、ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索した。上記の発現検索系を用いてｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローンを単離し、このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。本発明は上記知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち本発明は、嗅球で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とするｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項１）や、ｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｍＧｌｕＲ１を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるｍＧｌｕＲ１を発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することを特徴とする請求項１記載のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項２記載のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項３）や、嗅球で免疫したラットの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）や、モノクローナル抗体が、ｍＧｌｕＲ１−ａ、ｍＧｌｕＲ１−ｂ、ｍＧｌｕＲ１−ｃ及びｍＧｌｕＲ１−ｄの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体（請求項６）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするｍＧｌｕＲ１の検出試薬（請求項７）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするｍＧｌｕＲ１の過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするｍＧｌｕＲ１の過剰発現に起因する疾病の診断薬（請求項９）や、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有することを特徴とするハイブリドーマ（請求項１０）や、ハイブリドーマが、Ｒａｔ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｌｏｔ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６４）であることを特徴とする請求項１０記載のハイブリドーマ（請求項１１）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法としては、嗅球で免疫した非ヒト動物（例えばラット）の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種（例えばマウス）のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体であれば特に制限されるものではないが、ｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｍＧｌｕＲ１を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるｍＧｌｕＲ１を発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体、すなわち、嗅球で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。また、本発明のハイブリドーマとしては、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有するものであれば特に制限されないが、Ｒａｔ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｌｏｔ１を具体的に例示することができる。このＲａｔ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｌｏｔ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６４として寄託されている。
【００１４】
上記モノクローナル抗体での免疫染色方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等で酵素標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、前記酵素の基質及び発色剤の添加によって色素を生成させ、呈色した色素を観察する酵素免疫染色方法や、ＦＩＴＣ等で蛍光標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する蛍光免疫染色方法を挙げることができる。
【００１５】
ｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｍＧｌｕＲ１を哺乳類培養細胞上に発現させるには、哺乳類培養細胞用発現ベクターを好適に用いることができる。かかる哺乳類培養細胞用発現ベクターとしては、真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換することができるプラスミドベクターやトランスフェクションすることができるファージベクターであればどのようなものでもよく、発現ベクターの複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモーター、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤選択マーカー、エンハンサー等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができる。発現ベクターの複製を可能とする複製オリジンとしては、ＳＶ４０ウィルス、パピローマウィルス、ＥＢウィルス等を挙げることができ、また発現のためのプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター等を挙げることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、クローン選択を効率化するための薬剤選択マーカー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。具体的には、上記プラスミドベクターとしてｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ； １０８， １９３−２００， １９９１）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ８， ４６６−４７２， １９８８）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ； １８， ５３２２，１９９０）等を好適に例示することができるが、これらの中でも、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン３’スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン３’隣接領域、ＳＶ４０複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現することができるｐＣＡＧＧＳが特に好ましい。
【００１６】
また、上記哺乳類培養細胞としては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを組み込んだ、抗原タンパク質ｍＧｌｕＲ１をトランジェントに、あるいはステイブルに細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現させることができる、哺乳類由来の培養細胞であれば特に制限されるものではなく、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ｎｅｕｒｏ２ａ細胞等を例示することができるが、上記抗原タンパク質ｍＧｌｕＲ１を効率よくトランジェントに発現させうる点でＣＯＳ細胞が好ましい。
【００１７】
本発明のｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体としては、ｍＧｌｕＲ１−ａ、ｍＧｌｕＲ１−ｂ、ｍＧｌｕＲ１−ｃ及びｍＧｌｕＲ１−ｄの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体であるｌｏｔ１を好適に例示することができる。そして、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体は、ｍＧｌｕＲ１の検出試薬として有利に用いることができる。
【００１８】
本発明のｍＧｌｕＲ１の過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬としては、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合する抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体を含有する薬剤であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のｍＧｌｕＲ１の過剰発現に起因する疾病の診断薬としては、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合する抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体を含有する試薬であれば特に制限されるものではない。上記ｍＧｌｕＲ１の過剰発現に起因する疾病としては、脳虚血、脊髄外傷、頭部外傷、アルツハイマー病、ハンチングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、低血糖性ニューロン損傷、視力障害と網膜症、パーキンソン病等の神経変性疾患、精神分裂病、てんかん、過敏性腸症候群等のストレス性疾患、脳梗塞、痙攣、偏頭痛、尿失禁、慢性疼痛、小脳疾患、神経細胞死、自己免疫疾患などが考えられる。
【００１９】
また、本発明の上記予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定］
実施例１Ａ（実験材料と方法）
（動物等）
中部科学資材社（日本国、名古屋）からＩＣＲ系統マウス及びＷｉｓｔａｒ系ラットを購入した。膣栓が検出された日をＥ０．５とした。エーテル深麻酔下で雌親の胚をＨＢＳＳ中で解離した。次に、全ての胚の発達段階をＴｈｅｉｌｅｒの定義に従って決定した（ＴＨＥ ＨＯＵＳＥ ＭＯＵＳＥ： ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ， ｓｐｒｉｎｇｅｒ， １９８９）。また、抗ｍＧｌｕＲ１抗体は、フナコシ社から購入したラビットポリｍＧｌｕＲ１αの他、生理学研究所の重本隆一博士から供与を受けた抗ｍＧｌｕＲ１抗体を用いた。
【００２１】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５のマウス胚から得た約３０個の嗅球を、０．１ｍｌのＨＢＳＳ中に懸濁し、２７ゲージ針を用いて粉砕し、ラットの左後足に注入した。３週間おきに４回、ラットを免疫した。追加抗原を用いて最終免疫を行なってから３日間経過後に、既知の方法（ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＰＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ３５１−３７２， Ｆｒｅｅｍａｎ， １９８１， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２２， ９０−１００， １９９６）を用いて、左鼠径リンパ節及び左膝窩リンパ節をミエローマ細胞と融合させた（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）。ハイブリドーマ培養物の上清をＥ１４．５マウス終脳の切片上で免疫組織化学的方法を用いてスクリーニングした。先端が尖ったガラス製キャピラリーを用いて細胞を１個ずつ回収し、１０％のウシ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）及び１０％のハイブリドーマ細胞・クローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を加えたＤＭＥＭ（日水社製、東京、日本国）を加えた９６ウェル培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに移して、クローニングした。
【００２２】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）で凍結した。クリオスタットで冠状切片を１４μｍ厚さに切り分け、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたグラススライド（Ｓｉｇｍａ社製）上に置いた。かかる切片を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）共存下で１０分間インキュベートしてＯＣＴ化合物を除去し、その後さらにハイブリドーマ培養物上清共存下で１時間培養した。結合抗体をＣｙ３で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、視覚化した。
ホールマウント免疫染色は、文献（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２９， １２７−１３７， １９９６）記載の手法に従って行った。簡潔に説明すると、終脳及び培養物を、４％ＰＦＡを含むＰＢＳに４℃下で１２時間固定し、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴにおいて１時間インキュベートして抗体の非特異的結合を阻害した。プロテインＡカラム（Ａｆｆｉｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰｓ ｋｉｔ、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を通過させることにより親和精製したモノクローナル抗体ｌｏｔ１（１０μｇ／ｍｌ）共存下において上記標本をインキュベートした。結合抗体をＣｙ３又はＣｙ２で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて視覚化した。
【００２３】
免疫染色処理には以下の抗体も用いた。ウサギ抗ニューロピリン−１抗体（２μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＭＡＰ２抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ社製）、マウス抗リーリンモノクローナル抗体ＣＲ−５０（２μｇ／ｍｌ；Ｎｅｕｒｏｎ １４， ８９９−９１２， １９９５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ２３−３１， １９９７）、マウス抗ニューロフィラメントモノクローナル抗体２Ｈ３（１：１００ハイブリドーマ上清、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ Ｂａｎｋ）、ウサギ抗カルレチニン抗体（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ウサギ抗ネスチン抗体（１：５００、大阪大学吉川博士から供与）。二次抗体として、ＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）又はＦＩＴＣ標識化抗ウサギＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用した。
【００２４】
（器官型培養）
既知の方法（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２９， １２７−１３７）を用いて、器官型培養を行った。具体的には、Ｅ１２．５マウスから得た終脳半球を切片に分け、軟膜を除去し、表面がコラーゲンで覆われている膜フィルター（Ｔｒａｎｓｗａｌｌ−ＣＯＬ ３４１８、Ｃｏｓｔａｒ社製）上に、心室側を下にして置いた。Ｅ１３．５終脳から嗅球を分離し、Ｅ１２．５終脳片のＬＯＴ部位と結合させて共培養を行った。１０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ミディアム（混合比１：１、日水社製）において、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃で２〜３日間外植片を培養した。また、文献（Ｈｉｒａｔａａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ １９９７）記載の方法で、嗅球を培養した（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ３２， ４１５−４２５， １９９７）。
【００２５】
実施例１Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１の作製）
免疫処理したマウス３匹から得たリンパ球とマウスミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマ細胞株を得た。Ｅ１４．５マウス終脳の切片を免疫染色し、約２０００個のハイブリドーマ細胞株を含有している培養上清をスクリーニングした。なお、ＬＯＴ周辺にある細胞サブセットを特異的に染色するモノクローナル抗体ｌｏｔ１を単離した。他のハイブリドーマ細胞株では、同様の染色パターンはみられなかった。かかるモノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００２６】
（道標細胞の起源）
嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長する（図１Ａ、Ｊ．Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２ １９８４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７ １９９６）。この軸索の道標となるのが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する神経細胞である（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８）この道標細胞は、軸索の伸長に先立って、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導する。Ｅ１２．５の終脳をモノクローナル抗体ｌｏｔ１でホールマウント免疫染色した結果、道標細胞のマーカーであるモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色された道標細胞がつくる帯の上を嗅球の軸索が伸長していた（図１Ｂ）。そこで、道標細胞の起源を探索するため、道標細胞が分裂をしているＥ１０．５の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養し、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、終脳新皮質と呼ばれる領域を培養したときに限って、分化してくることが示された（図２Ａ）。さらに、終脳新皮質領域の神経幹細胞を１つ１つ単離して、クローン増殖させても、その中から一定の確率で道標細胞が分化してくることがわかった（図２Ｂ）。したがって、道標細胞を生み出す能力は、終脳新皮質の幹細胞に自律的に備わっていると考えられた。新皮質と隣接する線状体原基の幹細胞を、同様にしてクローン培養しても、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、決して現れてこなかった。
【００２７】
（道標細胞の移動）
終脳新皮質は、将来道標細胞が並ぶ軸索経路に比較すると、はるかに背側に位置する、かなり広い領域であるが、この中ではどこの領域をとっても、道標細胞は同じように分化してくる（図２Ｂ）。もし実際の生体内でも、新皮質全体から道標細胞が発生してくるとすれば、これらの細胞は、将来の軸索経路に並ぶために、かなりの距離にわたって終脳半球を腹側方向に移動しなければならない。しかし、このような方向の細胞移動は、これまで報告されていなかった。そこで、この時期の終脳における実際の細胞移動の様子を、マウス胚全体を子宮外で培養する全胚培養法を用いて解析した。Ｅ１０．５の胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し、その胚を２日間全胚培養した。その結果、終脳新皮質で生まれた細胞が確かに腹側方向へと選択的に移動し、将来の軸索経路に並ぶことが確かめられた（図３Ａ）。このようにして移動した細胞の少なくとも一部は、モノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞へと分化することも示された（図３Ｂ、Ｃ）。以上の結果を総合すると、道標細胞は終脳新皮質全体で発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に並ぶという興味深い発生過程をたどると考えられる。
【００２８】
（Ｘｔ突然変異マウスにおける道標細胞の分布異常）
道標細胞発生の分子機構の手がかりを得るために、終脳の発生に異常を示す様々な突然変異マウスを入手して、これらのマウス脳における道標細胞の動態を観察した。その結果、Ｅｘｔｒａ−ｔｏｅｓ（Ｘｔ）と呼ばれる突然変異マウスにおいて、道標細胞が終脳新皮質全体に散在していることを見い出した。すなわち、野生型マウス（＋／＋）胚において、道標細胞は、終脳新皮質の広い領域から発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に配列するが、Ｘｔ突然変異マウス（Ｘｔ／Ｘｔ）においては、終脳の細胞が移動せず、道標細胞が新皮質全体に散在する（図４）。この突然変異マウスの終脳では、腹側方向に向かう細胞移動も観察されず、この細胞移動の異常が道標細胞の分布異常の直接の原因であると考えられた。なお、Ｘｔ突然変異の原因遺伝子は転写制御因子Ｇｌｉ３であることが明らかにされており（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６， ７９９−８０４， １９９２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３， ２４１−２４５， １９９３）、またこの変異により脳の背腹軸に乱れが生じるといわれている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２５， ２３１５−２３２５， １９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６， ３５６１−３５７１， １９９９）。
【００２９】
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する発生期の終脳領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを図６に示される哺乳類用発現ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ細胞に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索し、約２００，０００のｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローン♯６−２Ｅ１０を単離することができた。このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入し、ｍＧｌｕＲ１タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図５Ａ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図５Ｂ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。また、細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図５Ｃ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図５Ｄ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。これらの結果から、モノクローナル抗体ｌｏｔ１はｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合することが示された。また、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体は、ｍＧｌｕＲ１の細胞内ドメインの一部を認識すると考えられた。さらに、このｍＧｌｕＲ１が本当にモノクローナル抗体の抗原分子であるのかを確かめるために、ｍＧｌｕＲＩ遺伝子欠損マウス（Ｃｅｌｌ ７９， ３６５−３７５， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２， ２３７−２４３， １９９４）を入手して、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において染色性が完全に欠失していることが示された。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において、染色性が完全に欠失していることが示された。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により製造される抗ｍＧｌｕＲ１モノクローナル抗体は、神経機能の研究に広く利用できるのみならず、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインを認識するため、このレセプターのレセプターとしての活性を阻害できる可能性が高く、様々な神経疾患に応用できる可能性があり、またｍＧｌｕＲ１−ａ、ｍＧｌｕＲ１−ｂ、ｍＧｌｕＲ１−ｃ及びｍＧｌｕＲ１−ｄの全ての型に結合する点で汎用性が高い。これに対して、現在市販されているｍＧｌｕＲ１抗体は細胞内ドメインの一部を認識する抗体で、このレセプターの機能を阻害することはできない。また市販の抗体はｍＧｌｕＲ１のなかでも特定のスプライシング型ｍＧｌｕＲ１−ａだけを認識するため、その他の型のｍＧｌｕＲ１を検出することはできない。
【図面の簡単な説明】
【図１】嗅球軸索と道標細胞の様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１２日目頃のマウス終脳の外側図。左が吻側、上が背側を示す。嗅球の軸索（緑）は、道標細胞（赤）がつくる帯の上を伸長する。
（Ｂ）：胎生１２．５日目の終脳。嗅球から最初に伸び出す軸索を、緑の色素で標識した（矢印）。道標細胞はモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色されている。
スケールバーは１００μｍを表す。
【図２】培養下における道標細胞の発生の様子を示す図である。
（Ａ）：道標細胞が分裂をしている胎生１０．５日目の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される道標細胞が分化している（赤）。そのうち半数以上の細胞は、ＢｒｄＵ（緑）を核に取り込んでおり、培養下で分裂したことがわかる（矢頭）。
（Ｂ）：培養下で道標細胞を生み出す終脳領域。数字は、その領域を培養したときにモノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞が分化した確率（％）を示す。赤字が終脳新皮質領域、黒字が線状体原基領域。赤の斜線は予想される将来の嗅球軸索経路の位置を示す。
【図３】道標細胞が終脳新皮質から腹側方向に移動する様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１０．５日目胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し（星印）、その胚を２日間全胚培養した。色素標識された細胞が、腹側方向に移動し（矢印）、逆Ｔ字を描いて将来の軸索経路に配列している（矢頭）。
（Ｂ）：終脳新皮質から移動し、軸索領域に並んだ標識細胞（矢頭）。長い突起を将来の軸索経路の方向に伸長している。
（Ｃ）：（Ｂ）の標本をモノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した写真。標識細胞は道標細胞と入り交じって、細胞の帯を形成している。
スケールバーは、（Ａ）５００μｍ、（Ｂ）（Ｃ）１００μｍを表す。
【図４】野生型およびＸｔ突然変異マウスにおける道標細胞の誕生と移動の様子を示す図である。
【図５】モノクローナル抗体ｌｏｔ１がｍＧｌｕＲ１を認識する様子を示す図である。
（Ａ）（Ｂ）：ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入したＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ａ）と抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｂ）による二重免疫染色像。
（Ｃ）（Ｄ）：細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ｃ）も抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｄ）もよく似た染色を示す。
【図６】発現ベクターｐＣＡＧＧＳを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 (metabotropic glutamate receptor 1), a detection reagent for mGluR1 containing such a monoclonal antibody, and the like.
[0002]
[Prior art]
Obtaining antibodies against the target protein occupies an important position in its identification and functional analysis.However, conventional methods of administering and immunizing animals with a target antigen require a large amount of various antigens and a long time. Since a great deal of labor is required, a method for producing an antibody using a phage antibody library has recently been established. This method applies a system that displays (displays) an antibody on the surface of a phage by fusing the antibody to the coat protein of a filamentous phage. Is prepared as a phage display library by displaying the library on a phage. According to this phage system (for example, see Non-patent Document 1), the antigen of a human antibody is identified. It is possible to do. This screening method using a phage antibody library is called a phage display method, and has conventionally been used to identify ligands and various antigens that specifically bind to various cell surface receptors. Many methods for preparing a phage antibody library and screening methods using the same, such as an immunotube method and a magnetic bead method, have already been reported (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3).
[0003]
In addition, as a cloning method of a membrane molecule, for example, a cDNA library prepared with an animal cell expression vector is introduced into COS7 cells by utilizing transient expression using an expression vector containing an origin of replication of COS7 cells and SV40, Expression of a membrane protein derived from a cDNA library on the cell surface, concentration of cells expressing the target membrane molecule by panning or FACS using an antibody or ligand against the membrane molecule, and collection of plasmid DNA Transfection into COS7 cells again and repetition of the enrichment procedure, expression vector cDNA library is divided into several small pools, introduced into COS7 cells, and the expression of membrane molecules is carried out using isotope-labeled antibodies and ligands. Detect and turn positive pools into pools with fewer plasmids Only way to clone repeated transfection it is known (e.g., see Non-Patent Document 4.).
[0004]
Further, a polyadenylated RNA was isolated from human cells, a double-stranded cDNA was prepared using the isolated polyadenylated RNA, and the double-stranded cDNA was inserted into a cloning vector to prepare a recombinant expression vector. Transforming the host with a recombinant expression vector to express the antigen and using an antibody from the serum of a rheumatoid arthritis patient to bind the antibody to the expressed antigen using an anti-human IgM antibody-alkaline phosphatase Preparation of a recombinant DNA encoding a rheumatoid arthritis diagnostic antigen reactive to a rheumatoid arthritis-related antibody, selecting a transformed host by detection with the complex and an alkaline phosphatase developing substrate A method is also known (for example, see Patent Document 1).
[0005]
On the other hand, the following findings regarding the growth of nerve axons and the like have been known.
It is known that, in the course of development of the nervous system, an axon selects and elongates a specific path accurately without hesitation (for example, see Patent Documents 5 and 6). In order for the axon to proceed properly, the temporary interaction between the growing axon and the specialized cells existing in the pathway is important (see, for example, Non-Patent Document 7). For example, axons of nerve cells of the olfactory bulb selectively elongate a specific region of the telencephalon (see, for example, Non-Patent Documents 8 and 9), and specifically identify nerve cells (signpost cells) that serve as guideposts for the axons. Monoclonal antibody (mAb) lot1 is known as a marker antibody for labeling (for example, see Non-Patent Document 10). Signpost cells align with future axon outgrowth pathways and guide axons into this pathway prior to axon outgrowth, but it is unclear what antigen molecule lot1 recognizes. Was. This antigen molecule is expressed only in signpost cells at least in the developing telencephalon, and it is thought that it may be related to some function unique to signpost cells.
[0006]
Glutamate is also released from nerve endings and regulates major excitability in the central nervous system of higher animals, such as regulating neuronal activity or release of neurotransmitters via glutamate receptors located in the postsynaptic membrane or nerve endings. Glutamate receptors are thought to be sexual neurotransmitters and play a central role in central excitatory synaptic transmission. Glutamate receptor is a metabotropic glutamate receptor that transmits signals indirectly by coupling with G protein and a receptor for ion channel-type glutamate, which incorporates ion channels and plays a key role in synaptic transmission, due to signal transduction mechanism. mGluR), and it is also known that there are eight different subtypes of mGluR1 to mGluR8 in mGluR due to gene cloning. mGluR1 to mGluR8 show different distributions in the brain, mGluR1 and mGluR5 are receptors that transmit information to phospholipase, inositol triphosphate, and calcium via G protein, and mGluR1 is a seven-cell transmembrane having a long cell domain. It is a protein that is thought to function as a receptor for the neurotransmitter glutamate (see, for example, Non-Patent Documents 11 and 12).
[0007]
Furthermore, it has been reported that epilepsy is induced by administration of (1S, 3R) -1-aminocyclopentane-1,3-dicarboxylic acid, which is an agonist of mGluR (see, for example, Patent Documents 13 and 14). ). (1S, 3R) -1-aminocyclopentane-1,3-dicarboxylic acid and (RS) 3,5-dihydroxyphenylglycine (hereinafter, referred to as 3,5-DHPG) are administered in a small amount to mouse or rat brain parenchyma, or whole body. It has been reported that when administered, it causes nerve cell death with convulsions (for example, see Non-Patent Documents 14 and 15). In addition, the effectiveness of (S) -4-carboxy-3-hydroxyphenylglycine, an antagonist of mGluR1 and an agonist of mGluR2, in various epilepsy models has been reported (for example, see Non-Patent Document 16). .
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 10-513257
[Non-patent document 1]
Proc. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198, 1983.
[Non-patent document 2]
Science, 249, 386-390 1990
[Non-Patent Document 3]
Methods in Enzymology, 217, 228-257 1993
[Non-patent document 4]
Proc. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 1987.
[Non-Patent Document 5]
Science 242, 694-699, 1988
[Non-Patent Document 6]
Neuron 10, 77-98, 1993, Science 274, 1123-11131, 1996.
[Non-Patent Document 7]
Nature 385, 23-24, 1997
[Non-Patent Document 8]
Neurol. 223, 177-202, 1984
[Non-Patent Document 9]
J. Neurobiol. 29, 127-137, 1996
[Non-Patent Document 10]
J. Neurosci. 18, 7800-7810, 1998
[Non-Patent Document 11]
Nature 349, 760-765, 1991
[Non-Patent Document 12]
Science 252, 1318-1321, 1991
[Non-patent document 13]
Neurosci. Lett. , 162, 12-16, 1993
[Non-patent document 14]
J. Neurosci. , 13, 4445-4455, 1993.
[Non-Patent Document 15]
Neuropharmacology, 34, 1063-3067, 1995.
[Non-Patent Document 16]
J. Pharmacol. Exp. Ther. , 276, 516-522, 1996.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1, a method for producing the same, a detection reagent, a diagnostic agent, and a therapeutic agent for mGluR1 containing the monoclonal antibody.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The antigen recognized by the monoclonal antibody lot1 was predicted to be a membrane protein based on the pattern of immunostaining, but neither the Western blot nor the immunoprecipitation could detect this antigen molecule. This was thought to be due to the fact that the antigen-determining site of the monoclonal antibody lot1 was destroyed due to extraction from the membrane and solubility. In the case of a monoclonal antibody having an antigenic determinant having such properties, it is extremely difficult to identify the antigen molecule. It is of course impossible to purify the antigen protein by immunoprecipitation, and it is extremely unlikely that the antigen can be identified even by an expression search system using a phage library. Therefore, I changed my idea and tried to search for antigen molecules by expressing proteins as close as possible to their original three-dimensional structure. Specifically, mRNA was prepared from a region that abundantly expresses the antigenic substance of the monoclonal antibody lot1, a full-length cDNA was synthesized, and this was inserted into a mammalian expression vector to prepare a library. This cDNA library was introduced into a cultured mammalian cell line (COS cell), and the encoded protein was forcibly expressed. According to this method, even if the cDNA encodes a membrane protein, the product should be incorporated into the cell membrane as usual, and can assume the original three-dimensional structure. With this in mind, COS cells into which the cDNA library had been introduced were immunostained using the monoclonal antibody lot1, and cells to be stained were searched under a microscope. When a cDNA clone was searched using the above expression search system, a cDNA clone that produced cells that stained strongly with the monoclonal antibody lot1 was isolated. The nucleotide sequence of this clone was determined, and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) was determined. It became clear that it was coding. The present invention has been completed based on the above findings.
[0011]
That is, the present invention provides a method for culturing a hybridoma obtained by fusing a spleen cell of a non-human animal immunized with an olfactory bulb with the non-human animal and a heterologous myeloma cell, and culturing a hybridoma culture supernatant to the non-human animal. A method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1, characterized by screening by immunohistochemical method, which is performed on a telencephalic section that is different from the above. The method according to claim 1, wherein the mGluR1 is introduced into a cultured cell, the mGluR1 is expressed on the cultured mammalian cell, and the cultured mammalian cell expressing the mGluR1 is immunostained with a monoclonal antibody screened by an immunohistochemical method. Production of Monoclonal Antibody that Binds to Extracellular Domain of mGluR1 The method (claim 2), the method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 according to claim 2, wherein the cultured mammalian cells are COS cells (claim 3), or immunization with the olfactory bulb 4. A method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 according to any one of claims 1 to 3, wherein the isolated rat spleen cells are fused with mouse myeloma cells. The antibody is a monoclonal antibody that binds to the extracellular domains of mGluR1-a, mGluR1-b, mGluR1-c and mGluR1-d, wherein the mGluR1 extracellular domain according to any one of claims 1 to 4, The method for producing a monoclonal antibody to be bound (Claim 5) or the method according to any one of Claims 1 to 5 Ri resulting mGluR1 extracellular domain monoclonal antibody that binds about (claim 6).
[0012]
Further, the present invention provides a detection reagent for mGluR1 containing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 obtained by the production method according to any one of claims 1 to 5 (claim 7). Item 6. A preventive / therapeutic agent for a disease caused by overexpression of mGluR1, comprising a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 obtained by the production method according to any one of items 1 to 5 (claim 8). And a diagnostic agent for a disease caused by overexpression of mGluR1, which comprises a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 obtained by the production method according to any one of claims 1 to 5. ) And a hive having the ability to produce a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1. Dormer and (Claim 10), hybridoma relates Rat-Mouse hybridoma lot1 (FERM BP-8264) hybridoma of claim 10, characterized in that (claim 11).
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As a method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 of the present invention, a spleen cell of a non-human animal (eg, rat) immunized with the olfactory bulb and a myeloma cell of the non-human animal and a xenogeneic (eg, mouse) are used. An anti-mGluR1 monoclonal characterized by screening by an immunohistochemical method, in which a hybridoma obtained by the fusion is cultured, and a culture supernatant of the hybridoma is allowed to react on a section of a telencephalon different from the non-human animal. The antibody is not particularly limited as long as it is an antibody, but mGluR1 cDNA is introduced into cultured mammalian cells, the mGluR1 is expressed on cultured mammalian cells, and the cultured mammalian cells expressing mGluR1 are subjected to immunohistochemical methods. Monoclonal antibody screened by A spleen cell of the non-human animal that has been infected is cultured with a hybridoma obtained by fusing the non-human animal with a heterologous myeloma cell, and the culture supernatant of the hybridoma is subjected to a section of a telencephalon that is heterologous to the non-human animal. By immunostaining with the monoclonal antibody screened by the immunohistochemical method reacted above, a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 can be produced with good reproducibility. The hybridoma of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to produce a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1, but Rat-Mouse hybridoma lot1 can be specifically exemplified. The Rat-Mouse hybridoma lot 1 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8264.
[0014]
As the immunostaining method using the above monoclonal antibody, for example, a monoclonal antibody labeled with an enzyme such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase or the like is expressed in a state where a three-dimensional structure is formed on the cell surface by an antigen-antibody reaction. After reacting with the membrane protein, a dye is formed by adding a substrate of the enzyme and a coloring agent, and an enzyme immunostaining method for observing the colored dye, or a monoclonal antibody fluorescently labeled with FITC or the like is used for antigen-antibody reaction. After reacting with a membrane protein expressed in a state where a three-dimensional structure has been formed on the cell surface, a fluorescent immunostaining method of observing with a fluorescence microscope can be mentioned.
[0015]
In order to introduce the cDNA of mGluR1 into cultured mammalian cells and to express the mGluR1 on cultured mammalian cells, an expression vector for cultured mammalian cells can be suitably used. Examples of such an expression vector for cultured mammalian cells include any plasmid vector capable of efficiently expressing a protein in a eukaryotic cell and capable of transforming a competent cell or a phage vector capable of transfection. Such a construct may be used to select and construct a replication origin that enables replication of an expression vector, a promoter for expression, a splice signal, a polyA addition signal, a drug selection marker, an enhancer, and the like, as necessary. Can be. Examples of the replication origin that enables the replication of the expression vector include SV40 virus, papilloma virus, and EB virus. Examples of the promoter for expression are a β-actin promoter, a thymidine kinase promoter, an SV40 promoter, and an adenovirus. Major late promoters, cytomegalovirus promoters and the like can be mentioned. Further, in addition to a splice signal, a polyA addition signal, a drug selection marker for improving clone selection efficiency, an enhancer that works cell-specifically, a transcription control gene for controlling the expression of a transgene, and the like may be added. Specifically, pCAGGS (Gene; 108, 193-200, 1991), pcDL-SRα296 (Molecular and Cellular Biology; 8, 466-472, 1988) and pEF-BOS (Nucleic Acid Research 22; And the cytomegalovirus enhancer, chicken β-actin promoter, rabbit β-globin 3 ′ splice signal, rabbit β-globin 3 ′ flanking region, and SV40 replication. Particularly preferred is pCAGGS, which has an origin and can express the integrated gene in mammalian cells with high efficiency.
[0016]
In addition, as the cultured mammalian cells, the antigen protein mGluR1 in which mGluR1 cDNA is incorporated into an expression vector for cultured mammalian cells can be expressed transiently or stably in a state where a three-dimensional structure is formed on the cell surface. There is no particular limitation on cultured cells derived from mammals, and examples include COS cells, BHK21 cells, HeLa cells, L cells, NIH3T3 cells, neuro2a cells, and the like. The antigen protein mGluR1 can be efficiently transiently used. COS cells are preferred in that they can be expressed in E. coli.
[0017]
The anti-mGluR1 monoclonal antibodies obtained by the method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 of the present invention include monoclonal antibodies that bind to the extracellular domains of mGluR1-a, mGluR1-b, mGluR1-c and mGluR1-d. Can be suitably exemplified. The anti-mGluR1 monoclonal antibody obtained by the method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 can be advantageously used as a reagent for detecting mGluR1.
[0018]
The preventive / therapeutic agent for diseases caused by overexpression of mGluR1 of the present invention contains an anti-mGluR1 monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 obtained by the method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1. The drug is not particularly limited as long as it is a drug, and the diagnostic agent for a disease caused by overexpression of mGluR1 of the present invention includes mGluR1 cells obtained by a method for producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1. There is no particular limitation as long as the reagent contains an anti-mGluR1 monoclonal antibody that binds to the ectodomain. Diseases caused by the overexpression of mGluR1 include cerebral ischemia, spinal cord injury, head injury, Alzheimer's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, hypoglycemic neuron damage, visual impairment and retinopathy. , Neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, schizophrenia, epilepsy, stress-related diseases such as irritable bowel syndrome, cerebral infarction, convulsions, migraine, urinary incontinence, chronic pain, cerebellar disease, nerve cell death, autoimmune disease, etc. Can be considered.
[0019]
When the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent of the present invention is used as a pharmaceutical, a pharmaceutically acceptable usual carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent, pH buffer, disintegrant, solubilization Formulation components for various preparations such as agents, solubilizing agents, and isotonic agents can be added. In the prophylactic / therapeutic method using these prophylactic / therapeutic agents, the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents can be administered orally or parenterally at an appropriate dose according to the sex, weight, and symptoms of the patient. That is, it can be orally administered in a commonly used dosage form, for example, a powder, granule, capsule, syrup, suspension or the like, or, for example, a solution, emulsion, suspension or the like. The preparation can be administered parenterally in the form of an injection, or can be administered intranasally in the form of a spray.
[0020]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 [Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody lot1]
Example 1A (Experimental materials and methods)
(Animals, etc.)
ICR strain mice and Wistar strain rats were purchased from Chubu Scientific Materials (Nagoya, Japan). The day when the vaginal plug was detected was defined as E0.5. Embryos of female parents were dissociated in HBSS under deep ether anesthesia. Next, the developmental stage of all embryos was determined according to Theiler's definition (THE HOUSE MOUSE: ATLAS OF EMBRYONIC DEVELOPMENT, springer, 1989). The anti-mGluR1 antibody used was rabbit poly-mGluR1α purchased from Funakoshi, and an anti-mGluR1 antibody provided by Dr. Ryuichi Shigemoto of the National Institute for Physiological Sciences.
[0021]
(Preparation of monoclonal antibody)
Approximately 30 olfactory bulbs from mouse embryos at E14.5 were suspended in 0.1 ml HBSS, triturated with a 27 gauge needle and injected into the left hind paw of rats. Rats were immunized four times every three weeks. Three days after the final immunization with the booster antigen, the left inguinal region was obtained using a known method (SELECTED METHPODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, 351-372, Freeman, 1981, Dev Biol 122, 90-100, 1996). Lymph node and left popliteal lymph node were fused with myeloma cells (P3X63Ag8U1). Supernatants of hybridoma cultures were screened on sections of E14.5 mouse telencephalon using immunohistochemical methods. Cells were collected one by one using a glass capillary having a sharp tip, and DMEM (10% bovine serum (JRH Bioscience, Lenexa, KS) and 10% hybridoma cell / cloning factor (Igen)) were added. The cells were transferred to each well of a 96-well culture plate (Becton Dickinson) supplemented with Nissui, Tokyo, Japan and cloned.
[0022]
(Immunohistochemistry)
The mouse embryo brain was fixed overnight in PBS containing 4% paraformaldehyde (PFA) at 4 ° C., immersed in PBS containing 20% sucrose overnight, and treated with OCT compound (Tissue-Tek, manufactured by Sakura Finetechnical). Frozen. Coronal sections were cut to a thickness of 14 μm with a cryostat and placed on glass slides (Sigma) coated with poly-L-lysine. The section was incubated for 10 minutes in the presence of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 130 mM NaCl, and 0.1% Tween 20 (TBST) to remove the OCT compound, and then further coexisted with the hybridoma culture supernatant. The cells were cultured for 1 hour under the following conditions. The bound antibody was visualized using an anti-rat Ig antibody labeled with Cy3 (1: 500, manufactured by Amersham).
Whole mount immunostaining was performed according to the method described in the literature (J Neurobiol 29, 127-137, 1996). Briefly, telencephalons and cultures were fixed in PBS containing 4% PFA at 4 ° C. for 12 hours and incubated in TBST containing 5% skim milk for 1 hour to inhibit nonspecific binding of antibodies. The sample was incubated in the presence of a monoclonal antibody lot1 (10 μg / ml), which was affinity-purified by passing through a protein A column (Affigel Protein A MAPs kit, manufactured by Bio-Rad). The bound antibody was visualized using an anti-rat Ig antibody (1: 500, Amersham) labeled with Cy3 or Cy2.
[0023]
The following antibodies were also used for the immunostaining treatment. Rabbit anti-neuropilin-1 antibody (2 μg / ml), mouse anti-MAP2 antibody (1: 500, manufactured by Sigma), mouse anti-reelin monoclonal antibody CR-50 (2 μg / ml; Neuron 14, 899-912, 1995, J. Neurosci 17, 23-31, 1997), mouse anti-neurofilament monoclonal antibody 2H3 (1: 100 hybridoma supernatant, Developmental Studies Hybrid Bank), rabbit anti-calretinin antibody (1: 100, manufactured by Chemicon International), rabbit anti-nestin (1: 500, provided by Dr. Yoshikawa, Osaka University). As the secondary antibody, a FITC-labeled anti-mouse Ig antibody (1: 100, manufactured by Amersham) or a FITC-labeled anti-rabbit Ig antibody (1: 100, manufactured by Amersham) was used.
[0024]
(Organ type culture)
Organotypic culture was performed using a known method (J Neurobiol 29, 127-137). Specifically, the telencephalic hemisphere obtained from the E12.5 mouse was divided into sections, the buffy coat was removed, and the ventricle side was placed on a membrane filter (Transwall-COL 3418, manufactured by Costar) whose surface was covered with collagen. Was laid down. The olfactory bulb was separated from the E13.5 telencephalon, and co-cultured with the LOT site of the E12.5 telencephalic piece. In DMEM / Ham's F12 medium (mixing ratio 1: 1, manufactured by Nissui) containing 10% bovine serum, CO 2 Explants were cultured at 37 ° C. for 2 to 3 days under an atmosphere of 5% concentration. The olfactory bulb was cultured (J Neurobiol 32, 415-425, 1997) according to the method described in the literature (Hirataand Fujisawa 1997).
[0025]
Example 1B (Result)
(Preparation of monoclonal antibody lot1)
Lymphocytes obtained from three immunized mice were fused with mouse myeloma cells to obtain a hybridoma cell line. Sections of the E14.5 mouse telencephalon were immunostained and a culture supernatant containing about 2000 hybridoma cell lines was screened. In addition, a monoclonal antibody lot1 that specifically stains a subset of cells around the LOT was isolated. Similar staining patterns were not seen in other hybridoma cell lines. The immunostaining pattern using the monoclonal antibody lot1 is shown below.
[0026]
(Origin of signpost cells)
Axons of nerve cells of the olfactory bulb selectively elongate specific regions of the telencephalon (FIG. 1A, J. Comp. Neurol. 223, 177-202 1984, J. Neurobiol. 29, 127-137 1996). The signpost of this axon is a nerve cell recognized by the monoclonal antibody lot1 (J. Neurosci. 18, 7800-7810, 1998). Along the elongation path, guide the axons to this path. As a result of whole mount immunostaining of the telencephalon of E12.5 with the monoclonal antibody lot1, the axon of the olfactory bulb extended over the band created by the signpost cells stained red with the monoclonal antibody lot1, which is a marker for the signpost cells ( (FIG. 1B). Therefore, in order to search for the origin of the signpost cells, the cells were dissociated from the telencephalic neocortex of E10.5 where the signpost cells were dividing, cultured in the presence of the thymidine analog BrdU for 5 days, and the monoclonal antibody lot1 Immunostaining showed that cells stained with the monoclonal antibody lot1 differentiated only when a region called telencephalic neocortex was cultured (FIG. 2A). Furthermore, it was found that even if nerve stem cells in the telencephalic neocortical region were isolated one by one and cloned and propagated, guidepost cells were differentiated from them at a certain probability (FIG. 2B). Therefore, the ability to generate guidepost cells was thought to be autonomous in the stem cells of the telencephalic neocortex. Even if the stromal primordium stem cells adjacent to the neocortex were clone-cultured in the same manner, cells stained with the monoclonal antibody lot1 never appeared.
[0027]
(Migration of signpost cells)
The telencephalic neocortex is a much larger area located farther back than the axon pathway in which future guidepost cells line up, but no matter where the guidepost cells are differentiated in the same way. (FIG. 2B). If, in real life, the signpost cells are generated from the entire neocortex, these cells will travel a significant distance ventrally through the telencephalic hemisphere to align with future axonal pathways. Must. However, cell migration in such a direction has not been reported before. Therefore, the actual state of cell migration in the telencephalon at this time was analyzed using a whole embryo culture method in which the entire mouse embryo was cultured outside the uterus. Neural stem cells of the telencephalic neocortex of the E10.5 embryo were labeled with a fluorescent dye, and the embryo was cultured for 2 days in whole embryo. As a result, it was confirmed that cells born in the telencephalic neocortex surely selectively migrated in the ventral direction and lined up with future axon pathways (FIG. 3A). It was also shown that at least some of the cells thus migrated differentiated into monoclonal antibody lot1-positive signpost cells (FIGS. 3B, C). Taken together, the results suggest that signpost cells develop throughout the telencephalic neocortex, move ventrally, and follow an interesting developmental process of lining up with future axonal pathways.
[0028]
(Abnormal distribution of signpost cells in Xt mutant mice)
To gain insight into the molecular mechanism of signpost cell development, we obtained various mutant mice with abnormalities in telencephalic development and observed the behavior of signpost cells in these mouse brains. As a result, in a mutant mouse called Extra-toes (Xt), it was found that signpost cells were scattered throughout the telencephalic neocortex. That is, in wild-type mouse (+ / +) embryos, the signpost cells develop from a large area of the telencephalic neocortex, migrate ventrally, and sequence into future axonal pathways, while the Xt mutant mouse In (Xt / Xt), telencephalic cells do not migrate and guidepost cells are scattered throughout the neocortex (FIG. 4). No cell migration in the ventral direction was observed in the telencephalon of this mutant mouse, suggesting that this abnormal cell migration was directly responsible for the abnormal distribution of signpost cells. It has been clarified that the causative gene of the Xt mutation is a transcriptional regulator Gli3 (Development 116, 799-804, 1992, Nature Genet. 3, 241-245, 1993). It is said that the dorsoventral axis is disturbed (Development, 125, 2315-2325, 1998, Development 126, 3561-3571, 1999).
[0029]
(Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody lot1)
MRNA was prepared from the nascent telencephalic region, which abundantly expresses the antigenic substance of the monoclonal antibody lot1, to synthesize full-length cDNA, which was incorporated into the mammalian expression vector pCAGGS shown in FIG. 6 to prepare a library. This cDNA library was introduced into COS cells, and the encoded protein was forcibly expressed. The COS cells into which the cDNA library was introduced were immunostained with the monoclonal antibody lot1, and the cells to be stained were searched under a microscope. About 200,000 cDNA clones were searched. CDNA clone # 6-2E10, which gives rise to the same cells, could be isolated. Determination of the nucleotide sequence of this clone revealed that it encodes metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1). The cDNA clone # 6-2E10 was introduced, and COS cells expressing the mGluR1 protein were immunostained with the monoclonal antibody lot1 and two kinds of anti-mGluR1 antibodies. Immunostaining was observed with the monoclonal antibody lot1 (FIG. 5A) and the anti-mGluR1 antibody (FIG. 5B) provided by Dr. Shigemoto, but no immunostaining was observed with the commercially available anti-mGluR1 antibody. In addition, COS cells expressing the mGluR1 mutant protein in which the intracellular domain was deleted were immunostained with the monoclonal antibody lot1 and two kinds of anti-mGluR1 antibodies. Immunostaining was observed with the monoclonal antibody lot1 (FIG. 5C) and the anti-mGluR1 antibody provided by Dr. Shigemoto (FIG. 5D), but no immunostaining was observed with the commercially available anti-mGluR1 antibody. These results indicated that the monoclonal antibody lot1 binds to the extracellular domain of mGluR1. Further, it was considered that a commercially available anti-mGluR1 antibody recognizes a part of the intracellular domain of mGluR1. Furthermore, in order to confirm that this mGluR1 is indeed an antigen molecule of a monoclonal antibody, an mGluRI gene-deficient mouse (Cell 79, 365-375, 1994, Nature 372, 237-243, 1994) was obtained and the monoclonal antibody lot1 was obtained. For immunostaining. As a result, it was shown that the stainability was completely deleted in the brain of the homo-deficient mouse embryo. As a result, it was shown that the staining of the brain of the homo-deficient mouse embryo was completely deleted.
[0030]
【The invention's effect】
The anti-mGluR1 monoclonal antibody produced according to the present invention can be widely used not only for studying neuronal function but also for recognizing the extracellular domain of mGluR1, and thus has a high possibility of inhibiting the activity of this receptor as a receptor. It is highly versatile in that it binds to all types of mGluR1-a, mGluR1-b, mGluR1-c and mGluR1-d. In contrast, currently marketed mGluR1 antibodies recognize part of the intracellular domain and cannot inhibit the function of this receptor. In addition, since commercially available antibodies recognize only a specific spliced type mGluR1-a among mGluR1, other types of mGluR1 cannot be detected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a state of an olfactory bulb axon and a signpost cell.
(A): lateral view of the mouse telencephalon around day 12 of embryo. The left side is rostral and the upper side is dorsal. The axon of the olfactory bulb (green) extends above the band created by the signpost cells (red).
(B): Telencephalon on day 12.5 of embryo. Axons that initially extend from the olfactory bulb were labeled with a green dye (arrow). The signpost cells are stained red with the monoclonal antibody lot1.
Scale bar represents 100 μm.
FIG. 2 is a diagram showing the appearance of signpost cells in culture.
(A): Cells were dissociated from the telencephalic neocortex on day 10.5 of embryonic division of guidepost cells and cultured for 5 days in the presence of the thymidine analog BrdU. The signpost cells stained with the monoclonal antibody lot1 are differentiated (red). Among them, more than half of the cells incorporated BrdU (green) into the nucleus, indicating that they had divided in culture (arrowhead).
(B): telencephalic region that produces signpost cells in culture. The numbers indicate the probability (%) of differentiation of monoclonal antibody lot1 positive signpost cells when the region was cultured. Red letters indicate telencephalic neocortex area, and black letters indicate striatum primordium area. The red shaded lines indicate the location of the expected future olfactory bulb axon pathway.
FIG. 3 is a diagram showing a manner in which guidepost cells move in a ventral direction from the telencephalic neocortex.
(A): Neural stem cells of the telencephalic neocortex of the embryo 10.5 day embryo were labeled with a fluorescent dye (star), and the embryo was cultured for 2 days in whole embryo. The dye-labeled cells migrate in the ventral direction (arrows) and are arranged in a future axonal pathway in an inverted T-shape (arrowhead).
(B): Labeled cells (arrowheads) that migrated from the telencephalic neocortex and lined up in the axon region. Long protrusions extend in the direction of future axonal pathways.
(C): Photograph of the specimen of (B) immunostained with monoclonal antibody lot1. The labeled cells intermingle with the signpost cells to form a band of cells.
The scale bar represents (A) 500 μm and (B) and (C) 100 μm.
FIG. 4 is a diagram showing the appearance and migration of signpost cells in wild-type and Xt mutant mice.
FIG. 5 is a view showing a state in which monoclonal antibody lot1 recognizes mGluR1.
(A) and (B): COS cells into which cDNA clone # 6-2E10 has been introduced. Double immunostained image with monoclonal antibody lot1 (A) and anti-mGluR1 antibody (B).
(C) and (D): COS cells expressing mGluR1 mutant protein in which the intracellular domain has been deleted. Both monoclonal antibody lot1 (C) and anti-mGluR1 antibody (D) show similar staining.
FIG. 6 shows the expression vector pCAGGS.
