【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵幹様細胞からインスリン産生細胞に分化誘導させる方法、膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法、、およびスクリーニングにより得られる膵幹様細胞分化誘導物質に関する。さらに詳しくは、膵幹様細胞からインスリン産生細胞に分化誘導させる際に、安価な非タンパク性の化合物を用いることによって、優れた分化誘導能を有する非タンパク性の化合物を取得する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、日本のみならず世界的に広がっている深刻な疾病である。１９９７年に旧厚生省が行った調査では、「糖尿病が強く疑われる人」約６９０万人、この値に「糖尿病の可能性を否定できない人」６８０万人を加えると、約１３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で１億５千万人あまりであり、２０２５年では約３億人に達すると予測されている。
【０００３】
近年、糖尿病の根治的治療法として、膵島移植が注目を浴びるようになってきている。膵島移植は、生理的な血糖コントロールを可能とし、手技も簡単で、ハイリスク例にも応用できる優れた糖尿病治療法として期待されている。膵島移植は糖代謝の改善による糖尿病性二次病変の進行阻止または改善を目的としているが、強化インスリン療法やインスリン持続皮下注入療法でも血糖コントロールの難しいインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、まさに膵島移植の良い適応であると考えられている。
【０００４】
膵島移植は、局所麻酔で可能なほどで、手術侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管吻合の必要がないため、血管病変の進行により膵（臓器）移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるバンキング（ｂａｎｋｉｎｇ）も可能である等膵（臓器）移植と比較して多くの利点を有している。
【０００５】
また、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）臨床の実際では、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより、患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年積極的に導入され好結果が報告されている。このことは、ＮＩＤＤＭにおいても、膵島移植によって治療可能であることを示しており、ＮＩＤＤＭ例のβ細胞機能が低下してきている時期に膵島を移植すれば、再びβ細胞機能が回復し、ＮＩＤＤＭの悪化を防止できる可能性も考えられている。
【０００６】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初成績が芳しくなかったが、１９９９年３月よりカナダのエドモントンにあるアルバータ大学において、新しい画期的なエドモントンプロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が実施され、膵島移植施行７例全例が ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔとなったということが報告され（非特許文献１参照。）、このプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）による多施設共同トライアルも準備されている。
【０００７】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、大動物膵よりの大量膵島分離法の研究がなされ、１９８４年Ｒｉｃｏｒｄｉらは独自の自動膵島分離装置を考案しブタ、ヒト膵よりの大量膵島分離に成功したことが大きい。しかしながら、臓器ドナー不足からくる移植用膵島細胞の絶対的不足が指摘されている。
そこで、幹細胞を大量に取得しインスリン産生細胞に分化させるという試みがなされている。インスリン産生細胞に分化させる方法としては、サイトカイン類や成長因子類による刺激による分化方法が試みられているが、今、なお、満足のいくものがないのが現状である。
【０００８】
例えば、非特許文献２および特許文献１には、グルカゴンライクペプチド−１（ＧＬＰ−１）やエキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）のようなタンパク性の物質を膵幹様細胞であるＡＲ４２Ｊ細胞に作用させて、インスリンを産生させる細胞に分化させることが報告されている。しかしながら、ＧＬＰ−１やＥｘｅｎｄｉｎ−４は、アミノ酸残基が１０個以上結合したペプチドタンパクであり、そのため細胞培養中に分解したり、長期保存安定性が悪く、さらに調製のために非常にコストがかかるという欠点があった。
【０００９】
したがって、これらの欠点を解消するために、サイトカイン類や成長因子類の代替物質として、細胞培養中でも安定で長期保存性がよく、かつ、安価に作製できるものとして非タンパク性の化合物を利用することが考えられる。
膵幹細胞の分化を促進する非タンパク性の化合物としては、非特許文献３に、ラット膵腫瘍細胞ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３に対して、植物や微生物の二次代謝産物や既知の伝達阻害剤を添加した結果、ＨＧＦとビンカアルカロイドである非タンパク性の化合物のコノフィリンを併用することによって、該細胞が形態変化を起こし、インスリンを発現することが報告されている。
【００１０】
細胞の分化や増殖は、細胞への刺激が細胞に存在する受容体に作用することによって誘導されると考えられるが、上記の報告では、試験された生理活性物質は、植物や微生物の二次代謝産物や既知のシグナル伝達物質阻害剤である、との記載があるのみで、受容体への作用を有するアゴニストやアンタゴニストやそれを示唆する記載は一切ない。また、コノフィリンは、市販品として安価に入手することができないという問題点があった。
【００１１】
すなわち、これまで膵幹様細胞を安定、容易、かつ、安価にインスリン産生細胞に分化誘導する優れた方法はなく、さらに、膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導させるための物質で、細胞培養中に安定で、かつ、長期保存安定性がよい、安価な非タンパク性の化合物はなかった。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ，Ｌａｋｅｙ ＪＲＴ，Ｒｙａｎ ＥＡ，Ｋｏｒｂｕｔｔ ＧＳ，Ｔｏｔｈ Ｅ，Ｗａｒｎｏｃｋ ＧＬ，Ｋｎｅｔｅｍａｎ ＮＭ，Ｒａｊｏｔｔｅ ＲＶ： Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ
，３４３，２３０−２３８（２０００）
【非特許文献２】
Ｊｉｅ Ｚｈｏｕ，Ｘｉａｏｌｉｎ Ｗａｎｇ，Ｍａｒｃｏ Ａ．Ｐｉｎｅｙｒｏ，ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ Ｍ．Ｅｇａｎ： Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ，４８，２３５８−２３６６（１９９９）
【特許文献１】
特公表２００２−５２２０６８号公報
【非特許文献３】
廣木彩乃、小島至、畠山裕康、武井泉、梅澤一夫、第４４回日本糖尿病学会学術集会、Ｖｏｌ．４４，Ｓ−２１３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１
，２００１．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞の移植に用いる細胞を調製するために、膵幹様細胞を安定、容易、かつ、安価にインスリン産生細胞に分化誘導させる方法、およびその方法によって見出された、細胞培養中において安定で、かつ、長期保存安定性がよい、安価な非タンパク性の化合物を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、膵幹様細胞に非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびその類縁体からなる群から選ばれる化合物を添加した後、この細胞の分化を検出することによって、膵幹様細胞を分化させる物質を見出せることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１） 膵幹様細胞を、非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびそれらの類縁体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物が添加された培地で培養して、膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法。
（２） 成長因子が、さらに、添加された培地で培養する（１）に記載の膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法。
（３） 膵幹様細胞がＡＲ４２Ｊ細胞株である（１）または（２）に記載の膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法。
（４） 成長因子がＨＧＦである（２）または（３）に記載の膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法。
（５） 非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびそれらの類縁体からなる群から選ばれる化合物がパクリタキセルである（１）〜（４）のいずれか１つに記載の膵幹様細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法。
【００１６】
（６） 膵幹様細胞を、非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびそれらの類縁体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物が添加された培地で培養して、前記の細胞の分化を検出することからなる膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
（７） 成長因子が、さらに、添加された培地で培養する（６）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
（８） 膵幹様細胞がＡＲ４２Ｊ細胞株である（６）または（７）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
（９） 成長因子がＨＧＦである（７）または（８）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
（１０） 細胞の分化を、細胞の形態変化により検出する（６）〜（９）のいずれか１つに記載の膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
【００１７】
（１１） 細胞の分化を、細胞内に産生されたインスリンの分析により検出する（６）〜（９）のいずれか１つに記載の膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法。
（１２） （６）〜（１１）のいずれか１つに記載された膵幹様細胞分化誘導物質のスクリーニング方法によって得られる膵幹様細胞分化誘導物質。
（１３） （１２）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質をリード物質として用いて合成された前記膵幹様細胞分化誘導物質の誘導体。
（１４） （１２）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質を膵幹様細胞分化誘導剤として使用する方法。
（１５） （１３）に記載の膵幹様細胞分化誘導物質の誘導体を膵幹様細胞分化誘導剤として使用する方法。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の分化誘導方法は、膵幹様細胞を、非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびそれらの類縁体からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物（以下、受容体化合物、と略す）が添加された培地で培養することが必要である。インスリン産生細胞等の特定の細胞に効率よく分化させることを考慮すると、膵幹様細胞を、前記の化合物と、さらに成長因子が添加された培地で培養することが好ましい。
【００１９】
膵幹様細胞とは、膵臓を形成する細胞に分化する能力を有した幹細胞のことを指し、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、胎児組織由来幹細胞、それらを癌化させた継代可能な細胞株等が挙げられる。
本発明の方法においては、上記の膵幹様細胞のいずれも用いることができるが、インスリン産生型の細胞に分化させる化合物のスクリーニングを実施することを考慮すると、好ましくは成体幹細胞および胎児組織由来の幹細胞、より好ましくは膵臓由来の幹細胞である。また、大量のスクリーニングを実施することを考慮すると、膵臓由来の細胞で癌化させた継代可能な細胞株が最も好ましい。
【００２０】
癌化させた継代可能な細胞株としては、ラット膵腫瘍から樹立されたＡＲ４２Ｊ細胞株（Ｍａｓｈｉｍａ Ｈ， Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｈ， Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ Ｋ， Ｍｉｎｅ Ｔ， Ｍｉｙａｇａｗａ Ｊ， Ｈａｎａｆｕｓａ Ｔ， Ｓｅｎｏ Ｍ， Ｙａｍａｄａ Ｈ ａｎｄ Ｋｏｊｉｍａ Ｉ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９７：１６４７−１６５４，１９９６）、マウスの膵管や膵島から樹立した細胞株であるＩＭ Ｄ−１， ＩＭ Ｉ−１細胞株（Ｓｈａｒｍａ Ａ， Ｔａｎｅｊａ Ｍ， Ｒｉｅｔｚ Ｐ， Ｗｅｉｔｅｋａｍｐ Ｊ ａｎｄ Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ Ｓ： Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０，Ｓ４２−４３，２００１）等が挙げられる。
受容体化合物、または受容体化合物と成長因子が添加された培地を用いて、インスリン産生細胞へと分化させるのに用いる膵幹様細胞としては、細胞培養の簡便さを考慮すると、ＡＲ４２Ｊ細胞株が好ましく、より好ましくはＡＲ４２Ｊ細胞株からサブクローニングされたＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３株である。
【００２１】
成長因子とは、一般的には、細胞・組織・臓器・個体を問わず、数・重量・体積等を増加させる作用を持つ物質のことをいい、その細胞に対する働きとしては、形態を変化させ、肥大化させたり、細胞分裂を促進させたりする働きがある。成長因子の具体例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング グロースファクターα（ＴＧＦ−α；ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、シュワンノーマデライブド グロースファクター（ＳＤＧＦ；Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヘパリン−バインディング ＥＧＦ−ライク グロースファクター（ＨＢ−ＥＧＦ；ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ニューレグリンズ（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ；ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヘパリン−バインディング グロースファクター−１（ＨＢＧＦ−１；ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１）、ヘパリン−バインディング グロースファクター−２（ＨＢＧＦ−２；ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２）、ｉｎｔ−２、ｈｓｔ−１／Ｋ−ｆｇｆ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ．６／ｈｓｔ−２、ケラチノサイト グロースファクター（ＫＧＦ；ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アンドロゲンインデュースド グロースファクター（ＡＩＧＦ；ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ファイブロブラスト グロースファクター−９（ＦＧＦ−９、ファイブロブラスト グロースファクター−１，２（ＦＧＦ−１，２；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１，２）、インスリン−ライク グロースファクターＩ，ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ，ＩＩ；ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ，ＩＩ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、インスリン−ライク グロースファクター（ＩＧＦＢＰ；ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、胎盤由来増殖因子（ＰＩＧＦ；ｐｌａｓｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ）、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）等が挙げられる。
【００２２】
本発明の方法において、細胞の増殖能を高めた上で分化の状態を調べることを考慮すると、上記成長因子を用いることが好ましい。その際、上記成長因子のいずれも用いることができるが、インスリン産生細胞に効率よく分化させることを考慮するとベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）やＨＧＦを用いることが好ましく、より好ましくはＨＧＦである。
本発明に用いられる、非タンパク性の受容体アゴニスト、非タンパク性の受容体アンタゴニストおよびその類縁体について、説明する。
【００２３】
非タンパク性の化合物とは、アミノ酸がペプチド結合によって繋がったアミノ酸残基１０個以上のペプチドやタンパク質を除く化合物のことをいう。したがって、例えば、インスリンやアルブミンは、アミノ酸残基１０個以上からなるペプチドおよびタンパク質であるので、タンパク性の化合物である。一方、細胞接着性のペプチドであるＲＧＤペプチドは、Ｒ（アルギニン残基）、Ｇ（グリシン残基）およびＤ（アスパラギン酸残基）の３つのアミノ酸残基、すなわち１０個未満のアミノ酸残基からペプチドであるので、非タンパク性の化合物である。当然のことながら、アミノ酸残基を含まない化合物も非タンパク性の化合物である。
【００２４】
受容体は、レセプターとも呼ばれ、細胞に存在し、外来性の物質または物理的刺激を認識して、細胞に応答を誘起する構造体のことをいう。
例えば、代表的な受容体としては、アドレナージック（Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ）受容体、ドパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）受容体、ムスカリン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｅ）受容体、ギャバ（ＧＡＢＡ）受容体、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）受容体、オピエート（Ｏｐｉａｔｅ）受容体、グルタメート（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）受容体、ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）受容体、セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）受容体、ニコチニック（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ）受容体、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）受容体、エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）受容体、プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）受容体、ＡＴＰおよびアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）受容体、ＬＰＳ受容体等が挙げられる。
【００２５】
受容体アゴニストとは、受容体（レセプター）との結合により受容体の構造変化をもたらし、ついで種々の生理作用を示す物質のことをいう。受容体アゴニストとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ受容体に作用するものとして、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、フェニルエピネフリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ），メトキサミン（ｍｅｔｈｏｘａｍｉｎｅ），クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ），アプラクロニジン（ａｐｒａｃｌｏｎｉｄｉｎｅ），グアンファシン（ｇｕａｎｆａｃｉｎｅ），イソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ），ドブタミン（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ），サルブタノール（ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ），ターブタリン（ｔｅｒｂｕｔａｌｉｎｅ），ＣＬ３１６，ＣＬ２４３等が挙げられる。
【００２６】
ドパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ＳＫＦ−３８３９３，ＳＣＨ２３３９０，ブタクラモル（ｂｕｔａｃｌａｍｏｌ），フルペンティキソール（ｆｌｕｐｅｎｔｈｉｘｏｌ），ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ），クインピロール（ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ），アモモルフィン（ａｍｏｍｏｒｐｈｉｎｅ），アポモルフィン（ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ），ＬＹ−１４１８６５，スピペロン（ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ），スルピリド（ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ），ＴＬ９９，ペルゴリド（ｐｅｒｇｏｌｉｄｅ）等が挙げられる。
【００２７】
ムスカリン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、Ａｃｈ，ムスカリン（ｍｕｓｃａｒｉｎｅ），オキソトレモリン（ｏｘｏｔｒｅｍｏｒｉｎｅ），ベサネコール（ｂｅｔｈａｎｅｃｈｏｌ）等が挙げられる。ギャバ（ＧＡＢＡ）受容体に作用するものとしては、ムスキモル（ｍｕｓｃｉｍｏｌ），バクロフェン（ｂａｃｌｏｆｅｎ）等が挙げられる。
グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、タウリン（ｔａｕｒｉｎｅ），ベータアラニン（β−ａｌａｎｉｎｅ）等が挙げられる。
【００２８】
オピエート（Ｏｐｉａｔｅ）受容体に作用するものとしては、モルフィン（ｍｏｒｐｈｉｎｅ），Ｄ−アラニル−Ｄ−ロイシル−エンケファリン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ｌｅｕ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ），メトケパミド（ｍｅｔｋｅｐａｍｉｄ），ロイシル−エンケファリン（ｌｅｕ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ），ディノルフィン（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ），ケタサイクラゾシン（ｋｅｔａｃｙｃｌａｚｏｃｉｎｅ），Ｎ−アリルノルメタゾシン（Ｎ−ａｌｌｙｌｎｏｒｍｅｔａｚｏｃｉｎｅ），フェンサイクリディン（ｐｈｅｎｃｙｃｌｉｄｉｎｅ），ナロルフィン（ｎａｌｏｒｐｈｉｎｅ），ベータエンドルフィン（β−ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）等が挙げられる。
【００２９】
グルタメート（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）受容体に作用するものとしては、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−２−アミノ−５−Ｄ−アスパルテート；Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−２−ａｍｉｎｏ−５−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ），ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ハイドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオネート； α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｅ−４−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ），クインスカレート（ｑｕｉｓｑａｌａｔｅ），イボテネート（ｉｂｏｔｅｎａｔｅ），カイネート（ｋａｉｎａｔｅ），ドモイックアシッド（ｄｏｍｏｉｃ ａｃｉｄ），ＡＣＰＤ等が挙げられる。
【００３０】
ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ），α−メチルヒスタミン（α−ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔａｍｉｎｅ）等が挙げられる。
セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）受容体に作用するものとしては、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ，５−ＣＴ，イプサピロン（ｉｐｓａｐｉｒｏｎｅ），ＣＰ９３１２９，スマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｉｐｔａｎ），α−メチル−５−ＨＴ（α−ｍｅｔｈｙｌ−５−ＨＴ），ｍ−クロロフェニル−ビグアニド（ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｉｇｕａｎｉｄｅ），シサプリド（ｃｉｓａｐｒｉｄｅ），５−メトキシトリプタミン（５−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）等が挙げられる。
ニコチニック（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ）受容体に作用するものとしては、Ａｃｈ，ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ），カルバミルコリン（ｃａｒｂａｍｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。
【００３１】
アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）受容体に作用するものとしては、アンジオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ），ＣＧＰ４２１１２等が挙げられる。
エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）受容体に作用するものとしては、エンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１），エンドセリン−２（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−２），エンドセリン−３（ｅｎｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３）等が挙げられる。
プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）受容体に作用するものとしては、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２），プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２），プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）、プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２），トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）等が挙げられる。
【００３２】
ＡＴＰおよびアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、２−クロロ−シクロ−ペンチルアデノシン（２−ｃｈｌｏｒｏ−ｃｙｃｌｏ−ｐｅｎｔｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ），ＣＧＳ−２１６８０，ＮＥＣＡ，ＡＰＮＥＡ，２−ＭｅＳＡＴＰ，ＵＴＰ等が挙げられる。
ＬＰＳ受容体に作用するものとしては、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）等が上げられる。
受容体アンタゴニストとは、受容体（レセプター）に結合してアゴニストの効果を阻害するが、それ自体は受容体（レセプター）と結合しても阻害効果を発揮できない物質のことをいう。受容体アンタゴニストとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
【００３３】
アドレナージック（Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ）受容体に作用するものとして、プラゾシン（ｐｒａｚｏｓｉｎ），ブナゾシン（ｂｕｎａｚｏｓｉｎ），イダゾキサン（ｉｄａｚｏｘａｎ），ピペロキサン（ｐｉｐｅｒｏｘａｎｅ），ヨヒンビン（ｙｏｈｉｍｂｉｎ），ラウウォールシン（ｒａｕｗｏｌｓｃｉｎｅ），アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ），メトプロノロール（ｍｅｔｏｐｒｏｎｏｌｏｌ），エスモロール（ｅｓｍｏｌｏｌ），アセブトロール（ａｃｅｂｕｔｏｌｏｌ），ブトキサミン（ｂｕｔｏｘａｍｉｎｅ），ＳＲ５９２３０，ＳＲ５８８９４等が挙げられる。
【００３４】
ドパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、フルペンチキソール（ｆｌｕｐｅｎｔｉｘｏｌ），フェノチアジン（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅｓ），チオキサンテン（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅｓ），ＳＣＨ２３３９０，フルフェナジン（ｆｌｕｐｈｅｎａｚｉｎｅ），スルピリド（ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ），フェノチアジン（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅｓ），ドンペリドン（ｄｏｍｐｅｒｉｄｏｎｅ），ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ），スピペロン（ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ），ブチロフェノン（ｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅｓ），ＡＪ７６，ＵＨ２３２，クロザピン（ｃｌｏｚａｐｉｎｅ）等が挙げられる。
ムスカリン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ＱＮＢ，アトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ），ピレンゼピン（ｐｉｒｅｎｚｅｐｉｎｅ），メトクトラミン（ｍｅｔｈｏｃｔｒａｍｉｎｅ），ヘキサハイドロシラディフェニドール（ｈｅｘａｈｙｄｒｏｓｉｌａｄｉｆｅｎｉｄｏｌ），ヒンバシン（ｈｉｍｂａｃｉｎｅ），４−ＤＡＭＰ等が挙げられる。
【００３５】
ギャバ（ＧＡＢＡ）受容体に作用するものとしては、ビククリン（ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ），ピクロトキシン（ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ）等が挙げられる。
グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ストリキニーネ（ｓｔｒｙｃｈｉｎｉｎｅ）等が挙げられる。
オピエート（Ｏｐｉａｔｅ）受容体に作用するものとしては、ナロキサン（ｎａｌｏｘａｎｅ）等が挙げられる。
グルタメート（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）受容体に作用するものとしては、ＭＫ−８０１，Ｄ−ＡＰ５（フォスフォノバレレート；ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｖａｌｅｒａｔｅ），ＤＰＰ，ＣＮＱＸ，γ−Ｄ−グルタミル−タウリン（γ−Ｄ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔａｕｒｉｎｅ），γ−Ｄ−グルタミル−アミノチル−スルフォネート（γ−Ｄ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ａｍｉｎｏｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ），ＭＣＰＧ等が挙げられる。
【００３６】
ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ディフェンハイドラミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ），ピリルアミン（ｐｙｒｉｌａｍｉｎｅ），ブリムアミド（ｂｕｒｉｍａｍｉｄｅ），メチアミド（ｍｅｔｉａｍｉｄｅ），シメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ），チオペルアミド（ｔｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅ）等が挙げられる。
セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）受容体に作用するものとしては、シアノピンドロール（ｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ），ＷＡＹ１００６３５，メチオセピン（ｍｅｔｈｉｏｔｈｅｐｉｎ），ミアンセリン（ｍｉａｎｓｅｒｉｎ），リタンセリン（ｒｉｔａｎｓｅｒｉｎ），ケタンセリン（ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ），ＳＢ２０４７４１，メテルゴリン（ｍｅｔｅｒｇｏｌｉｎｅ），メスラージン（ｍｅｓｕｌｅｒｇｉｎｅ），トロピセトロン（ｔｒｏｐｉｓｅｔｒｏｎ），オンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ），グラニセトロン（ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ），ＳＢ２０４０７０，クロザピネン（ｃｌｏｚａｐｉｎｅｎｅ）等が挙げられる。
【００３７】
ニコチニック（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ）受容体に作用するものとしては、α−ブンガロトキシン（α−ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）等が挙げられる。
アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ）受容体に作用するものとしては、イソサルタン（ｉｏｓａｒｔａｎ），カンデサルタン（ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）等が挙げられる。
プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）受容体に作用するものとしては、ＳＣ−１９２２０，ＡＨ６８０９等が挙げられる。
ＡＴＰおよびアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）受容体に作用するものとしては、ＤＰＤＣＰＸ，８−シクロペンチル−テオフィリン（８−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ−ｔｈｅｏｐｈｙｌｉｎｅ），ＣＰ−６６７１３等が挙げられる。
【００３８】
本発明に使用される受容体化合物は、２種類以上の化合物を自ら合成し、揃えて使用してもよく、市販で入手できる化合物を揃えて使用してもよく、また、化合物ライブラリーとして市販されているものを用いてもよい。例えば、市販の化合物ライブラリーとしては、ＬＯＰＡＣＴＭ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）等が挙げられる。
ここでいう化合物ライブラリーとは、少なくとも２種類以上の化合物の集団のことである。化合物は、化合物単体またはそれらの化合物が、プレート、ビーズ、ピン、平板、繊維、膜等の担体に物理的吸着や化学的結合による方法で結合されているものを使用してもよい。
細胞の分化とは、細胞が成熟、すなわち、もとの非特殊細胞より、性質または機能がより特殊化した状態になる過程をいう。例えば、受精した卵細胞は一定の順序を経て分裂増加しながら、種々の特殊の機能を有する器官や臓器を形成する細胞に変化する。成長は、同一の単位の増幅の繰り返しの過程であるが、分化は、これらの単位が異なった方向、より特殊な機能へ変化する過程をいう。
【００３９】
分化は、細胞が目で見える変化をきたす前に始まっているもので、この化学的変化による分化の状態を不可視性（ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ）または化学分化（ｃｈｅｍｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）と呼ぶ。すべての細胞に共通した能力ないし特徴から、最終的には全く特殊な細胞となるが、これは遺伝的な影響のほかホルモン等の影響を受けている。化学的には、細胞内のタンパク合成等がなんらかの引き金で顕性となり、その後、その細胞に備わった遺伝的な能力ないし潜在力が続発し続けるものと考えられている。
【００４０】
例えば、ＡＲ４２Ｊ細胞株の場合、ＨＧＦとアクチビンの添加によって、インスリン産生細胞へと分化することが知られている（Ｍａｓｈｉｍａ Ｈ， Ｓｈｉｂａｔａ Ｈ， Ｍｉｎｅ Ｔ ａｎｄ Ｋｏｊｉｍａ Ｉ： Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３９６９−３９７６，１９９６）。この際、ＡＲ４２Ｊ細胞の形態は、球状から紡錘状に形態変化する。したがって、この細胞が分化したか否かを検出する方法としては、顕微鏡による目視観察が簡単である。さらに、ある特定の細胞に分化したか否かを検出するためには、例えば、細胞内に産生された特定のタンパク質を検出する方法が挙げられる。例えば、ＡＲ４２Ｊ細胞内に産生されたインスリンは、蛍光抗体により染色し、蛍光顕微鏡で観察することによって検出することができる。
【００４１】
以上述べたように、本発明は、膵幹細胞を安定、かつ、安価にインスリン産生細胞に分化誘導させることができる。また、本発明の方法によってスクリーニングされた化合物は、膵幹様細胞の分化誘導剤として使用できる。当然のことながら、その膵幹様細胞の誘導効果をさらに向上させた誘導体を合成するためのリード化合物として使用することができる。これらの化合物およびその誘導体は、膵幹様細胞を分化させる際に、化合物単体としても使用できる。また、その化合物を細胞培養用プラスチックシャーレ、ビーズおよび繊維、布、不織布、発泡体等のような多孔質基材に吸着させたり、あるいは化学的に結合させて固定化して使用することもできる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００４３】
【実施例１】
ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞（群馬大学生体調節研究所小島至教授より供与をうけた）を、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（２０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）、５ｍＭのＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ社製）、ペニシリンーストレプトマイシン（米国、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、および１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ社製）で培養した。
その後、１×１０５個／ｍｌの濃度の上記細胞２００μｌの細胞懸濁液をＦａｌｃｏｎＴＭ９６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに播種した。
【００４４】
続いて、化合物ライブラリー「ＬＯＰＡＣＴＭ」（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に含まれる非タンパク性の化合物を、終濃度４．４μｇ／ｍｌになるように上記細胞培養液で希釈した溶液５μｌのみを添加したものと、１００ｐＭのＨＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を２２μｌと化合物ライブラリー「ＬＯＰＡＣＴＭ」に含まれる非タンパク性の化合物を４〜５μｇ／ｍｌになるように上記細胞培養液で希釈した溶液５μｌを添加したもの、また、比較のために、１００ｐＭのＨＧＦを２２μｌと上記化合物の代わりに終濃度２ｎＭのＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を２２μｌを添加したものおよび何も添加しなかったものを５％ＣＯ２条件下、２日間培養した。
【００４５】
その後、光学顕微鏡にて細胞の形態を観察した。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真結果を図１〜４に示す。
図１は、ＨＧＦ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、およびパクリタキセルのいずれも添加しないで培養したコントロールのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、丸い形状を保ったままであり、細胞の形態変化は認められない。図２は、ＨＧＦ（１００ｐＭ）とＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎＭ）を添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、紡錘状になり形態変化したことが認められる。図３は、ＨＧＦ（１００ｐＭ）とパクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）を添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、突起状のものを出し形態変化したものがあることが認められる。図４は、パクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ） のみを添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、突起状のものを出し形態変化したものがあることが認められる。すなわち、ＨＧＦ存在下においても、非存在下においてもパクリタキセルを添加したものは、細胞が形態変化したことが認められる。
【００４６】
【実施例２】
実施例１でＡＲ４２Ｊ細胞株を形態変化させた化合物（パクリタキセル）がインスリンを産生しているかを確認するために、以下の操作を行った。ＦａｌｃｏｎＴＭ６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に滅菌済みカバーグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｄ．，ＬＴＤ．社製）を入れ、１×１０５個／ｍｌの濃度の上記細胞２ｍｌの細胞懸濁液を加え、５％ＣＯ２条件下、１日間培養した。この後１００ｐＭのＨＧＦを２２０μｌと上記非タンパク性の化合物５０μｌを添加し、５％ＣＯ２条件下、３日間培養した。細胞が接着したカバーグラスを６穴プレートに移し、３％パラホルムアルデヒド １．５ｍｌを入れ、４０分間接触させ、細胞を固定した。
【００４７】
この細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、１．５ｍｌの５０ｍＭグリシン溶液（和光純薬社製）を入れ、シェイカー（ＩＷＡＫＩ ＳＨＡＫＥＲ ＳＨＫ−５０、Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．，ＬＴＤ．社製）を用いて３分間撹拌した。この操作を２回繰り返した後に、１．５ｍｌの０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液（ナカライテスク社製）を入れ、シェイカーを用いて５分間撹拌した。その後、この細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、ブロックエースＴＭ（雪印乳業社製）と４０分間接触させた。
このカバーグラスに１μｇ／ｍｌの濃度の抗インスリン−マウスモノクローナル抗体（Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ社製）３０μｌを滴下し、６０分間接触させた。１．５ｍｌの０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を入れ、シェイカーを用いて５分間撹拌した。
【００４８】
この細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、４μｇ／ｍｌの濃度の蛍光標識された二次抗体Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５６８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）３０μｌを滴下し、遮光下６０分間接触させた。その後、１．５ｍｌの０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を入れ、シェイカーを用いて５分間撹拌した。この細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後に、スライドグラスにＰｅｒｍａ ＦｌｕｏｒＴＭ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＭＵＮＯＮＴＭ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ社製）を１滴滴下し、カバーグラスを接着させた。マニキュアでカバーグラスの周囲を塗り固定した後に、共焦点レーザー走査顕微鏡 ＬＳＭ−４１０（カールツアイス社製）にて観察した。その際のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を図５〜７に示す。
【００４９】
図５は、ＨＧＦ（１００ｐＭ）とＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎＭ）を添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、赤い蛍光発色が認められ、細胞内にインスリンが産生されたことが認められる。図６は、ＨＧＦ（１００ｐＭ）とパクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）を添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、赤い蛍光発色が認められ、細胞内にインスリンが産生されたことが認められる。図７は、パクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）のみを添加した場合のＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真を示す。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、赤い蛍光発色が認められ、細胞内にインスリンが産生されたことが認められる。なお、ＨＧＦ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、およびパクリタキセルのいずれも添加しなかったコントロールのＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は、赤い蛍光発色は認められなかった。
以上のことから、ＨＧＦ存在下においても、非存在下においてもパクリタキセルを添加したものは、細胞内に発現したインスリンの蛍光抗体による発色が認められ、ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞はパクリタキセルによってインスリン産生細胞へと分化することが確認された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、膵幹様細胞を、安定、容易、かつ、安価にインスリン産生細胞に分化誘導させる非タンパク性の化合物を取得することができる。得られた化合物は、糖尿病患者を治療するためのインスリン産生細胞の移植に用いる細胞を調製するために有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真（コントロール（未添加））。
【図２】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真（ＨＧＦ（１００ｐＭ）とＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎＭ）を添加）。
【図３】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真（ＨＧＦ（１００ｐＭ）とパクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）を添加）。
【図４】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の光学顕微鏡写真（パクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ） のみ添加）。
【図５】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（ＨＧＦ（１００ｐＭ）とＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎＭ）を添加）。
【図６】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（ＨＧＦ（１００ｐＭ）とパクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）を添加）。
【図７】ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡写真（パクリタキセル（４．４μｇ／ｍｌ）のみ添加）。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells, a method for screening for a substance for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells, and a substance for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells obtained by the screening. More specifically, the present invention relates to a technique for obtaining a non-protein compound having excellent differentiation-inducing ability by using an inexpensive non-protein compound when inducing differentiation of pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is a serious disease that is spreading not only in Japan but also worldwide. According to a survey conducted by the former Ministry of Health and Welfare in 1997, about 6.9 million people who are strongly suspected of diabetes, and adding 6.8 million people who cannot deny the possibility of diabetes, about 13.7 million people are at risk. It is estimated to be a group. The WHO estimates that the worldwide diabetic population will be more than 150 million in 2000 and will reach about 300 million in 2025.
[0003]
In recent years, islet transplantation has been receiving attention as a curative treatment for diabetes. Pancreatic islet transplantation is expected as an excellent treatment for diabetes that enables physiological control of blood sugar, is easy to perform, and can be applied to high-risk patients. Pancreatic islet transplantation aims to prevent or improve the progression of diabetic secondary lesions by improving glucose metabolism, but insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), whose glycemic control is difficult even with intensive insulin therapy or continuous subcutaneous insulin infusion therapy, is exactly what islet transplantation Is considered to be a good adaptation.
[0004]
Pancreatic islet transplantation is feasible with local anesthesia and is minimally invasive, making it safer for diabetics and does not require vascular anastomosis, so the progression of vascular lesions precludes pancreatic (organ) transplantation It can be performed in patients who have not. Also, insulin is released into the portal circulation, which is physiologically advantageous. Furthermore, it has many advantages as compared with pancreatic (organ) transplantation, such as so-called banking by cryopreservation of isolated islets.
[0005]
In the practice of non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) clinical practice, insulin therapy is actively used. This is based on the idea that insulin administration causes the patient's own pancreatic islet β-cells to rest and wait for the β-cell function to recover, which has been actively introduced in recent years and reported good results. Have been. This indicates that NIDDM can also be treated by pancreatic islet transplantation. If pancreatic islets are transplanted during the period when β-cell function in NIDDM patients is decreasing, β-cell function is restored again, and NIDDM There is also a possibility that deterioration can be prevented.
[0006]
Islet transplantation, which began at the experimental medical stage, did not perform well at first, but from March 1999, at the University of Alberta in Edmonton, Canada, a new breakthrough Edmonton Protocol was implemented, It has been reported that all seven cases of transplantation became insulin independent (see Non-patent Document 1), and a multicenter trial using this protocol is also being prepared.
[0007]
As described above, the reason for the development of clinical studies on islet transplantation was that a large-scale pancreatic islet separation method from large animal pancreas was studied. It has been a great success to have successfully isolated large islets. However, it has been pointed out that there is an absolute shortage of pancreatic islet cells due to a shortage of organ donors.
Thus, attempts have been made to obtain a large amount of stem cells and differentiate them into insulin-producing cells. As a method for differentiating into insulin-producing cells, a differentiation method by stimulation with cytokines or growth factors has been attempted, but there is still no satisfactory method at present.
[0008]
For example, Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 disclose that a proteinaceous substance such as glucagon-like peptide-1 (GLP-1) or exendin-4 is added to AR42J cells, which are pancreatic stem-like cells. It has been reported that they act to differentiate into cells that produce insulin. However, GLP-1 and Exendin-4 are peptide proteins in which 10 or more amino acid residues are bound, and therefore are degraded during cell culture, have poor long-term storage stability, and are extremely costly to prepare. There was a disadvantage that this was the case.
[0009]
Therefore, in order to eliminate these drawbacks, use non-proteinaceous compounds as substitutes for cytokines and growth factors that are stable, have good long-term storage, and can be produced at low cost even in cell culture. Can be considered.
Non-patent Document 3 describes the addition of secondary metabolites of plants and microorganisms and known transmission inhibitors to rat pancreatic tumor cells AR42J-B13 as non-proteinaceous compounds that promote pancreatic stem cell differentiation. It has been reported that by using HGF in combination with a non-proteinaceous compound, conophylline, which is a vinca alkaloid, the cells undergo morphological changes and express insulin.
[0010]
Cell differentiation and proliferation are thought to be induced by stimulation of the cells by acting on receptors present in the cells, but in the above report, the bioactive substances tested were secondary to plants and microorganisms. There is only description that the substance is a metabolite or a known signal transducer inhibitor, but there is no description of an agonist or antagonist having an effect on a receptor or any description suggesting the same. In addition, there is a problem that conophylline cannot be obtained as a commercial product at low cost.
[0011]
That is, there has been no excellent method for inducing pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells in a stable, easy, and inexpensive manner. There were no inexpensive non-protein compounds that were stable during cultivation and had good long-term storage stability.
[0012]
[Non-patent document 1]
Shapiro AM, Lakey JRT, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, Rajotte RV: N Eng J Med
, 343, 230-238 (2000).
[Non-patent document 2]
Jie Zhou, Xiaolin Wang, Marco A .; Pineyro, and Josephine M. Egan: Di
abetes, 48, 2358-2366 (1999)
[Patent Document 1]
JP 2002-522068 A
[Non-Patent Document 3]
Ayano Hiroki, Itaru Kojima, Hiroyasu Hatakeyama, Izumi Takei, Kazuo Umezawa, The 44th Annual Meeting of the Japanese Diabetes Society, Vol. 44, S-213, Supplement 1
, 2001.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to prepare cells used for transplantation of insulin-producing cells for treating diabetic patients, to stably, easily, and inexpensively differentiate pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells, and An object of the present invention is to provide an inexpensive non-protein compound which is stable in cell culture and has good long-term storage stability.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, surprisingly, non-proteinaceous receptor agonists, non-proteinaceous receptor antagonists and analogs thereof on pancreatic stem-like cells After adding a compound selected from the group consisting of, the present inventors have found that a substance capable of differentiating pancreatic stem-like cells can be found by detecting the differentiation of these cells, thereby completing the present invention.
[0015]
That is, the present invention is as follows.
(1) Pancreatic stem-like cells are cultured in a medium to which at least one compound selected from the group consisting of non-protein receptor agonists, non-protein receptor antagonists and their analogs is added, A method for inducing stem-like cells to differentiate into insulin-producing cells.
(2) The method for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells according to (1), wherein the growth factor is further cultured in a medium to which the growth factor has been added.
(3) The method for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells according to (1) or (2), wherein the pancreatic stem-like cells are AR42J cell lines.
(4) The method for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells into insulin-producing cells according to (2) or (3), wherein the growth factor is HGF.
(5) The pancreas according to any one of (1) to (4), wherein the compound selected from the group consisting of a non-protein receptor agonist, a non-protein receptor antagonist and analogs thereof is paclitaxel. A method for inducing stem-like cells to differentiate into insulin-producing cells.
[0016]
(6) culturing the pancreatic stem-like cells in a medium to which at least one compound selected from the group consisting of a non-protein receptor agonist, a non-protein receptor antagonist and an analog thereof is added, A method for screening a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance, comprising detecting the differentiation of a cell.
(7) The method for screening a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance according to (6), wherein the growth factor is further cultured in a medium to which the growth factor has been added.
(8) The method of (6) or (7), wherein the pancreatic stem-like cell is an AR42J cell line.
(9) The method for screening a substance for inducing pancreatic stem-like cell differentiation according to (7) or (8), wherein the growth factor is HGF.
(10) The method for screening a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance according to any one of (6) to (9), wherein the differentiation of the cell is detected by a change in the form of the cell.
[0017]
(11) The method for screening a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance according to any one of (6) to (9), wherein the differentiation of the cell is detected by analyzing insulin produced in the cell.
(12) A pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance obtained by the method for screening a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance according to any one of (6) to (11).
(13) A derivative of the pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance synthesized using the pancreatic stem-like cell differentiation-inducing substance according to (12) as a lead substance.
(14) A method for using the substance for inducing pancreatic stem-like cell differentiation according to (12) as a pancreatic stem-like cell differentiation-inducing agent.
(15) A method of using the derivative of the substance for inducing pancreatic stem-like cell differentiation according to (13) as an agent for inducing pancreatic stem-like cell differentiation.
[0018]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method of inducing differentiation according to the present invention comprises the step of treating pancreatic stem-like cells with at least one compound selected from the group consisting of non-protein receptor agonists, non-protein receptor antagonists and analogs thereof (hereinafter, receptor compounds). , Abbreviated as). In consideration of efficient differentiation into specific cells such as insulin-producing cells, it is preferable to culture pancreatic stem-like cells in a medium containing the compound and a growth factor.
[0019]
Pancreatic stem-like cells refer to stem cells that have the ability to differentiate into cells that form the pancreas, and include embryonic stem cells (ES cells), adult stem cells, stem cells derived from fetal tissues, and the possibility of subculturing them into cancer Cell lines and the like.
In the method of the present invention, any of the above-mentioned pancreatic stem-like cells can be used.However, in consideration of conducting a screening for a compound that differentiates into insulin-producing cells, it is preferable to use adult stem cells and fetal tissue-derived cells. Stem cells, more preferably pancreatic stem cells. Considering that a large amount of screening is carried out, a subcultured cell line that is made cancerous with cells derived from the pancreas is most preferable.
[0020]
Examples of the cell lines that can be subcultured and transformed into cancer cells include AR42J cell lines established from rat pancreatic tumors (Mashima H, Ohnishi H, Wakabayashi K, Mine T, Miyagawa J, Hanafusa T, SenoM, Yamada Kamada, and Yamada Kamada). : J Clin Invest 97: 1647-1654, 1996), IMD-1, IMI-1 cell lines established from mouse pancreatic ducts and pancreatic islets (Sharma A, Tanema M, Rietz P, Weitekamp J and Bonner). -Weir S: Diabetes 50, S42-43, 2001) and the like.
As a pancreatic stem-like cell used to differentiate into insulin-producing cells using a receptor compound or a medium to which the receptor compound and a growth factor are added, considering the simplicity of cell culture, AR42J cell line is used. The AR42J-B13 strain subcloned from the AR42J cell line is more preferred.
[0021]
Growth factors generally refer to substances that have the effect of increasing the number, weight, volume, etc. of cells, tissues, organs, and individuals. It has the function of causing hypertrophy and promoting cell division. Specific examples of the growth factors include epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor α (TGF-α), transforming growth factor-α, amphiregulin, and schwannoderried growth factor. SDGF; Schwannoma-derived growth factor, Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), Heparin binding EGF-like growth factor, Betacellulin, GF, neuregulin, neugrins, betacellulin Platelet-deriv; d growth factor, heparin binding growth factor-1 (HBGF-1; heparin binding growth factor-2), heparin binding growth factor-2 (HBGF-2; heparin binding growth factor-2), int-2 -1 / K-fgf, FGF-5, FGF. 6 / hst-2, keratinocyte growth factor (KGF; keratinocyte growth factor), androgen-induced growth factor (AIGF), and fibroblast growth factor-9 (FGF-9), androgen-induced growth factor (AIGF). , 2 (FGF-1,2; fibroblast growth factor-1,2), insulin-like growth factor I, II (IGF-I, II; insulin-like growth factor-I, II), insulin (insulin), insulin- Like growth factor bi (IGFBP; insulin-like growth factor bi) ending protein), hepatocyte growth factor (HGF), hepatocyte growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), placenta-derived growth factor (GFF) and placental growth factor (GF) , Midkine, pleiotrophin and the like.
[0022]
In the method of the present invention, it is preferable to use the above-mentioned growth factor in consideration of examining the state of differentiation after enhancing the proliferation ability of the cells. At this time, any of the above-mentioned growth factors can be used, but in view of efficient differentiation into insulin-producing cells, betacellulin or HGF is preferably used, and more preferably HGF.
The non-protein receptor agonist, the non-protein receptor antagonist and its analogs used in the present invention will be described.
[0023]
The non-protein compound refers to a compound excluding a peptide or protein having 10 or more amino acid residues in which amino acids are connected by peptide bonds. Thus, for example, insulin and albumin are peptides and proteins consisting of 10 or more amino acid residues, and are therefore proteinaceous compounds. On the other hand, the RGD peptide, which is a cell-adhesive peptide, is composed of three amino acid residues R (arginine residue), G (glycine residue) and D (aspartic acid residue), ie, less than 10 amino acid residues. Since it is a peptide, it is a non-protein compound. Naturally, a compound containing no amino acid residue is also a non-protein compound.
[0024]
The receptor is also called a receptor, and refers to a structure that exists in a cell and recognizes a foreign substance or physical stimulus to induce a response in the cell.
For example, typical receptors include Adrenergic receptor, Dopamine receptor, Muscarine receptor, Gaba (GABA) receptor, Glycine receptor, and Opiate. ) Receptor, Glutamate receptor, Histamine receptor, Serotonin receptor, Nicotinic receptor, Angiotensin II receptor, Endothelin grunge receptor, Endothelin grunge receptor (Prostaglandin) receptor, ATP and adenosine (Adenosine) receptor, LPS receptor and the like.
[0025]
The receptor agonist refers to a substance that causes a structural change of the receptor by binding to the receptor (receptor) and then exhibits various physiological actions. Examples of the receptor agonist include the following.
Epinephrine, norepinephrine, phenylepinephrine, methoxamine, methoxamine, clonidine, clocinidine, apraclonidine, apraclonidine, apraclonidine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonine, anipraclonin, anipraclonine, anipraclonine, and the like. isoproterenol, dobutamine, salbutanol, terbutaline, CL316, CL243 and the like.
[0026]
As those acting on dopamine receptors, SKF-38393, SCH23390, butaclamol, flupentixol, haloperidol, quinpirole, amomorphin, morphomorphoin (morphoin) apomorphine), LY-1418565, spiperone, sulpiride, TL99, pergolide and the like.
[0027]
Examples of those acting on muscarine receptors include Ach, muscarine, oxotremorine, and bethanechol. Those acting on GABA receptors include muscimol, baclofen and the like.
Examples of those that act on a glycine (Glycine) receptor include taurine and beta-alanine.
[0028]
As those acting on opiate receptors, morphine, D-alanyl-D-leucyl-enkephalin (D-Ala-D-leu-enkephalin), methkepamide (metkepamid), leucyl-enkephalin (leu- Enkephalin, dynorphin, ketacyclazocine, N-allylnormetazocine, phencyclidine, nalorphine, β-endorphin and beta Can be
[0029]
As a substance acting on a glutamate receptor, NMDA (N-methyl-D-2-amino-5-D-aspartate; N-methyl-D-2-amino-5-D-aspartate), AMPA (Α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate; α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate), quinsqualate, ibotenate, kainate (Kainate), domoic acid, ACPD, and the like.
[0030]
Examples of those that act on a histamine receptor include histamine, α-methylhistamine, and the like.
Those acting on the serotonin receptor include 8-OH-DPAT, 5-CT, ipsapirone, CP93129, sumatriptan, α-methyl-5-HT (α-methyl-5-HT). HT), m-chlorophenyl-biguanide, cisapride, 5-methoxytryptamine, and the like.
Examples of those acting on the nicotinic receptor include Ach, nicotine, carbamylcholine, and the like.
[0031]
As those acting on the angiotensin II (Angiotensin II) receptor, angiotensin II (angiotensin II), CGP42112 and the like can be mentioned.
Endothelin-1 (endothelin-1), endothelin-2 (endothelin-2), endothelin-3 (endothelin-3) and the like can be mentioned as those acting on the endothelin (Endothelin) receptor.
Prostaglandin (Prostaglandin) receptors that act on prostaglandin D2 (PGD2), prostaglandin E2 (PGE2), prostaglandin F2α (PGF2α), prostaglandin I2 (PGI2), thromboxane A2 (TXA2) and the like.
[0032]
Examples of those acting on ATP and adenosine (Adenosine) receptors include 2-chloro-cyclo-pentyladenosine, CGS-21680, NECA, APNEA, 2-MeSATP, UTP and the like. .
Examples of those that act on the LPS receptor include paclitaxel (Taxol (registered trademark), manufactured by Bristol-Myers Squibb) and the like.
A receptor antagonist refers to a substance that binds to a receptor (receptor) and inhibits the effect of an agonist, but does not itself exert an inhibitory effect even when bound to a receptor (receptor). Examples of the receptor antagonist include the following.
[0033]
Acting on adrenergic receptors include prazosin, bunazosin, idazoxan, piperoxane, yohimbin, lauhimsinol, lauimsinol, lauolsinol and lauolsinaw. , Metopronolol, esmolol, acebutolol, butoxamine, SR59230, SR58894, and the like.
[0034]
As those acting on dopamine (Dopamine) receptor, flupentixol (flupentixol), phenothiazines (phenothiazines), thioxanthenes, SCH23390, fluphenazine (fluphenazine), sulphenide, sulphenide (sulphenide) Domperidone, haloperidol, spiperone, butyrophenone, AJ76, UH232, clozapine and the like.
Those acting on the muscarinic receptor include QNB, atropine, pirenzepine, methoctramine, hexahydrosiladifenidol, hexahydradifenidol, and hinbacin, etc. No.
[0035]
Those acting on GABA receptors include bicuculline, picrotoxin, and the like.
As a substance that acts on a glycine (Glycine) receptor, strychinine and the like can be mentioned.
Examples of those that act on opiate receptors include naloxane.
As those acting on the glutamate receptor, MK-801, D-AP5 (phosphonovalerate), DPP, CNQX, γ-D-glutamyl-taurine (γ-D-glutamyl-taurine), γ-D-glutamyl-aminotyl-sulfonate (γ-D-glutamyl-aminothyl-sulfonate), MCPG and the like.
[0036]
Those acting on the histamine receptor include diphenhydramine, pyrilamine, burimamide, methamide, cimetidine, thioperamide and thioperamide.
Acting on the serotonin receptor include cyanopindolol, WAY100635, methiothepin, mianserin, ritanserin, ketanserin, mesanterin, mesanterin, methanserin and methanserin, (Mesurergine), tropisetron, ondansetron, granisetron, SB204070, clozapinene, and the like.
[0037]
As a substance acting on a nicotinic receptor, α-bungarotoxin and the like can be mentioned.
As those acting on the angiotensin II receptor, there are isosartan, candesartan and the like.
Examples of those acting on prostaglandin receptors include SC-19220, AH6809 and the like.
Those acting on ATP and adenosine (Adenosine) receptors include DPDCPX, 8-cyclopentyl-theophylline, CP-66713 and the like.
[0038]
The receptor compound used in the present invention may be prepared by synthesizing two or more kinds of compounds by themselves, and may be used in combination, may be used in combination with commercially available compounds, or may be used as a compound library. You may use what is done. For example, commercially available compound libraries include LOPAC TM (Manufactured by Research Biochemical International).
Here, the compound library is a group of at least two or more types of compounds. As the compound, a compound alone or a compound in which the compound is bonded to a carrier such as a plate, a bead, a pin, a flat plate, a fiber, a membrane by physical adsorption or chemical bonding may be used.
Cell differentiation refers to the process by which a cell matures, that is, becomes more specialized in nature or function than the original non-special cell. For example, a fertilized egg cell undergoes a divisional increase in a certain order and changes into an organ having various special functions or a cell forming an organ. Growth is the process of repeated amplification of the same unit, while differentiation refers to the process by which these units change in different directions, to more specialized functions.
[0039]
Differentiation begins before a cell undergoes a visible change, and the state of differentiation due to this chemical change is called invisible or chemical differentiation. Due to the ability or characteristics common to all cells, the cells eventually become completely special cells, which are affected not only by genetic effects but also by hormones and the like. Chemically, it is considered that intracellular protein synthesis and the like become evident by some trigger, and thereafter, the genetic ability or potential provided in the cell continues to occur.
[0040]
For example, in the case of the AR42J cell line, differentiation into insulin-producing cells is known by the addition of HGF and activin (Mashima H, Shibata H, Mine T and Kojima I: Endocrinology 137: 3969-3976, 1996). . At this time, the morphology of the AR42J cell changes from a sphere to a spindle. Therefore, as a method for detecting whether or not the cells have differentiated, visual observation with a microscope is easy. Further, in order to detect whether or not the cell has differentiated into a specific cell, for example, a method of detecting a specific protein produced in the cell can be mentioned. For example, insulin produced in AR42J cells can be detected by staining with a fluorescent antibody and observing with a fluorescence microscope.
[0041]
As described above, the present invention can induce pancreatic stem cells to differentiate into insulin-producing cells stably and at low cost. In addition, the compounds screened by the method of the present invention can be used as an agent for inducing differentiation of pancreatic stem-like cells. As a matter of course, it can be used as a lead compound for synthesizing a derivative whose pancreatic stem-like cell inducing effect is further improved. These compounds and derivatives thereof can also be used as a single compound when differentiating pancreatic stem-like cells. Further, the compound can be used by adsorbing it on a porous substrate such as a plastic dish for cell culture, beads and fibers, cloth, nonwoven fabric, foam or the like, or by chemically bonding and immobilizing the compound.
[0042]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0043]
Embodiment 1
AR42J-B13 cells (provided by Professor Shigeru Kojima of the Institute of Bioregulation, Gunma University) were prepared using HEPES-NaOH (20 mM) (manufactured by Sigma) and 5 mM NaHCO3. 3 (Sigma), penicillin streptomycin (GIBCO-BRL, USA), and a DMEM medium (pH 7.4) (Sigma) containing 10% FCS (GIBCO-BRL).
Then 1 × 10 5 A cell suspension of 200 μl of the cells at a concentration of TM The cells were seeded in each well of a 96-well plate (Becton Dickinson).
[0044]
Subsequently, the compound library “LOPAC TM (Research Biochemical International), to which only 5 μl of a solution obtained by diluting a non-protein compound in the cell culture solution to a final concentration of 4.4 μg / ml was added, and 100 pM HGF (Genzyme) was added. / Techne) and compound library “LOPAC” TM 5 μl of a solution prepared by diluting the non-protein compound contained in the above-mentioned cell culture solution to 4-5 μg / ml, and for comparison, 22 μl of 100 pM HGF and 22 μl of the above compound were used for comparison. Was added with 22 μl of Activin A (Genzyme / Techne) at a final concentration of 2 nM and 5% CO2 without any addition. 2 Under the conditions, the cells were cultured for 2 days.
[0045]
Thereafter, the morphology of the cells was observed with an optical microscope. Light micrographs of AR42J-B13 cells are shown in FIGS.
FIG. 1 shows a light micrograph of control AR42J-B13 cells cultured without adding any of HGF, Activin A, and paclitaxel. AR42J-B13 cells keep their round shape, and no change in cell morphology is observed. FIG. 2 shows an optical micrograph of AR42J-B13 cells when HGF (100 pM) and Activin A (2 nM) were added. It is recognized that the AR42J-B13 cells became spindle-shaped and morphologically changed. FIG. 3 shows an optical micrograph of AR42J-B13 cells when HGF (100 pM) and paclitaxel (4.4 μg / ml) were added. It is recognized that some AR42J-B13 cells protrude and have changed morphology. FIG. 4 shows an optical micrograph of AR42J-B13 cells when only paclitaxel (4.4 μg / ml) was added. It is recognized that some AR42J-B13 cells protrude and have changed morphology. That is, it is recognized that the cells to which paclitaxel was added both in the presence and absence of HGF changed their morphology.
[0046]
Embodiment 2
The following operation was performed in order to confirm whether the compound (paclitaxel) that changed the form of the AR42J cell line in Example 1 produced insulin. Falcon TM A sterilized cover glass (Matsunami Glass Ind., LTD.) Is placed in a 6-well plate (Becton Dickinson) and 1 × 10 5 A cell suspension of 2 ml of the above cells at a concentration of cells / ml is added, 2 The cells were cultured under the conditions for one day. Thereafter, 220 μl of 100 μM HGF and 50 μl of the above non-protein compound were added, and 5% CO 2 was added. 2 Under the conditions, the cells were cultured for 3 days. The cover glass to which the cells were adhered was transferred to a 6-well plate, and 1.5 ml of 3% paraformaldehyde was added and contacted for 40 minutes to fix the cells.
[0047]
After washing the cells twice with PBS (-), 1.5 ml of a 50 mM glycine solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and a shaker (IWAKI SHAKER SHK-50, manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) was added. And stirred for 3 minutes. After repeating this operation twice, 1.5 ml of 0.1% Triton X-100 solution (manufactured by Nacalai Tesque) was added, and the mixture was stirred for 5 minutes using a shaker. Thereafter, the cells were washed twice with PBS (-), and then washed with Block Ace. TM (Made by Snow Brand Milk Products) for 40 minutes.
30 μl of an anti-insulin-mouse monoclonal antibody (manufactured by Neo Markers) at a concentration of 1 μg / ml was dropped on this cover glass and contacted for 60 minutes. 1.5 ml of a 0.1% Tween 20 solution (manufactured by BIO-RAD) was added, and the mixture was stirred for 5 minutes using a shaker.
[0048]
After washing the cells twice with PBS (−), the fluorescently labeled secondary antibody Alexa Fluor at a concentration of 4 μg / ml was used. TM 30 μl of 568 goat anti-mouse IgG (H + L) (manufactured by Molecular Probes) was added dropwise, and the mixture was contacted for 60 minutes under light shielding. Thereafter, 1.5 ml of a 0.1% Tween 20 solution (manufactured by BIO-RAD) was added, and the mixture was stirred for 5 minutes using a shaker. After the cells were washed twice with PBS (-), Perma Fluor was placed on a slide glass. TM Aqueous Mounting Medium (IMMUNON TM , Thermo Sandon) was dropped, and the cover glass was adhered. After coating and fixing the periphery of the cover glass with nail polish, observation was performed with a confocal laser scanning microscope LSM-410 (manufactured by Carl Zeiss). FIGS. 5 to 7 show confocal laser scanning micrographs of AR42J-B13 cells at that time.
[0049]
FIG. 5 shows a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells when HGF (100 pM) and Activin A (2 nM) were added. In AR42J-B13 cells, red fluorescence was observed, indicating that insulin was produced in the cells. FIG. 6 shows a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells when HGF (100 pM) and paclitaxel (4.4 μg / ml) were added. In AR42J-B13 cells, red fluorescence was observed, indicating that insulin was produced in the cells. FIG. 7 shows a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells when only paclitaxel (4.4 μg / ml) was added. In AR42J-B13 cells, red fluorescence was observed, indicating that insulin was produced in the cells. The control AR42J-B13 cells to which none of HGF, ActivinA, and paclitaxel were added did not show red fluorescence.
From the above, the presence of paclitaxel in the presence or absence of HGF showed color development by the fluorescent antibody of insulin expressed in the cells, and the AR42J-B13 cells were transformed into insulin-producing cells by paclitaxel. Differentiation was confirmed.
[0050]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to obtain a non-protein compound that induces pancreatic stem-like cells to differentiate into insulin-producing cells stably, easily, and inexpensively. The obtained compound is effectively used for preparing cells used for transplantation of insulin-producing cells for treating a diabetic patient.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a light micrograph of AR42J-B13 cells (control (not added)).
FIG. 2 is a light micrograph of AR42J-B13 cells (HGF (100 pM) and Activin A (2 nM) were added).
FIG. 3 is a light micrograph of AR42J-B13 cells (HGF (100 pM) and paclitaxel (4.4 μg / ml) were added).
FIG. 4 is a light micrograph of AR42J-B13 cells (only paclitaxel (4.4 μg / ml) was added).
FIG. 5 is a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells (HGF (100 pM) and Activin A (2 nM) were added).
FIG. 6 is a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells (HGF (100 pM) and paclitaxel (4.4 μg / ml) were added).
FIG. 7 is a confocal laser scanning micrograph of AR42J-B13 cells (only paclitaxel (4.4 μg / ml) was added).
