【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ヒト由来の、アポトーシス（細胞死）を誘導するタンパク質ＢＡＤをコードする核酸に関するものであり、負の制御を受けないアポトーシス誘導蛋白を利用した医療分野への応用を目指すものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内においてアポトーシスは、不用になった細胞を除去するために生理的に行われている生物現象であり、これを利用し、不要となった細胞を除去することは最も望まれる癌治療法となる。これまでの癌の治療薬は、実際、癌細胞にアポトーシスを誘導させる作用を有していることが既知の事実となっている。したがって、アポトーシスを制御する分子を利用したがん治療は、生体反応を利用した最も有望なものであると期待しうる。アポトーシスに関わる蛋白質を利用した癌治療は、これまでに多くの報告がなされているが、実用化には到っていない。この理由の一つとして、アポトーシス関連分子は、様々な蛋白質との相互作用または蛋白質の修飾によって、機能制御を受けており、必ずしもその発現量の増加のみでアポトーシスが惹起されるわけではないことが想定されている。本発明が対象とするアポトーシス誘導タンパク質ＢＡＤは、セリンのリン酸化によって非活性型となっており、セリンの脱リン酸化によって活性型、すなわちアポトーシス誘導能を示すようになることが知られている。、このため、リン酸化反応を利用してその生物学的活性を調節し易いことが予想されることから、他のアポトーシス制御分子に比較して、活性が制御し易い点から、これを利用した癌治療は極めて有望なものに発展しえる。本発明者らは、最近、ＢＡＤ が上皮細胞の足場喪失時におけるアポトーシス、すなわちアノイキスに際し、重要な働きを担っていることを証明した（論文投稿中）。アノイキスが抑制されると、癌の転移、腹膜播種が起こり易くなり、癌細胞の進展を促進させることを本発明者らが証明していることから（Ｔａｋａｏｋａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２９７１−２９７７， １９９７； Ｙａｗａｔａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６： ２６８１−２６８６， １９９８）、これに関わるＢＡＤを利用し、癌の進展を阻止しえることが期待できる。ヒトに生じる癌のほとんどは上皮細胞由来であることを考慮すると、ＢＡＤを利用したがん治療の応用範囲は、極めて広く、様々な分野で応用しうると思われる。そこで、このＢＡＤ変異株を作成し、その機能解析をし、負の制御を受けない新規分子を見出すことが必須である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
解決しようとする問題点は、ＢＡＤの機能が、リン酸化によって、そのアポトーシス誘導能が損なわれる点である。負の制御を受けない変異型ＢＡＤは、人為的にアポトーシスを惹起させるために理想的な分子であるといえる。本発明は、ヒト由来の、アポトーシス誘導作用を有するタンパク質ＢＡＤの点突然変異型をコードする核酸を提供するとともに、これによる悪性腫瘍の遺伝子治療法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リン酸化によって負に制御されないようにするため、点突然変異により、アポトーシス誘導能を損なわずに、活性維持型である新規ＢＡＤ分子を見出すことを最も主要な特徴とする。本発明者らは、ヒトＢＡＤ遺伝子配列に対応するＰＣＲプライマーを作製し、ハイブリッド形成法により、点突然変異を有するＢＡＤ（以下ＢＡＤＤ１１９Ｇ）の全長をコードするｃＤＮＡをクローニングした。そして、ＢＡＤＤ１１９Ｇ ｃＤＮＡをヒト癌細胞において発現させ、アポトーシス誘導能を野生型ＢＡＤ （以下ＢＡＤｗｔ） と比較した。さらに、両発現タンパク質のセリンリン酸化反応および結合蛋白について調べた。その結果、アポトーシス誘導のための血清除去（飢餓状態）において、ＢＡＤＤ１１９Ｇ該発現タンパク質は、ＢＡＤｗｔとほぼ同様のアポトーシス誘導能を示した。しかし、非飢餓状態においては、ＢＡＤＤ１１９Ｇが高いアポトーシス誘導能を維持したのに対し、ＢＡＤｗｔでは、アポトーシス誘導能が低下していた。また、ＢＡＤＤ１１９Ｇはセリン残其のリン酸化がほとんど認められず、負の制御を受けず活性化型ＢＡＤの機能を持続していることが判明した。すなわち、本発明は、（１）ヒトＢＡＤをコードする単離されたＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列が、配列番号１４で表される配列に対し、配列番号１５で表される配列は、ＢＡＤの機能活性部位（ＢＨ３ドメイン）内に１塩基の突然変異を人工的に導入したものである。（２）配列番号１４で表される該ＤＮＡ配列に相補的配列を有するプライマーを作製する。（３）ＢＡＤの機能活性部位（ＢＨ３ドメイン）内に一塩基のみ置換したプライマーをセンス及びアンチセンスの両方向に作製する。（４）配列番号１４で表される配列をＲＴ−ＰＣＲ法を用いてクローニングし、これをテンプレートとして用いる。（５）（１）に記載のＤＮＡ配列を含む哺乳類細胞における発現ベクター、（６）（１）に記載のＤＮＡ配列を含むバクテリアにおける発現ベクター、（７）（６）に記載のベクターによってＢＡＤと結合する蛋白質の回収、に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
ＢＡＤ分子のＢＨ３ドメイン内の１アミノ酸を変異させることにより活性維持型の変異ＢＡＤをその本来のアポトーシス誘導能を損なわずに実現した。本発明者らは、ヒトＢＡＤ遺伝子の配列番号１で表される該ＤＮＡ配列に対応するセンス、およびアンチセンスＰＣＲプライマーを作製し、ヒトＢＡＤ遺伝子全長ｃＤＮＡをクローニングした。また、これをテンプレートとして点突然変異を有する配列番号２で表される配列、変異型ＢＡＤ遺伝子をクローニングした。これらのｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターに組み込み、ミドリサル腎上皮由来の培養細胞ＣＯＳ−７に対して、細胞傷害活性を示すか否かを解析した。そして、バクテリア発現ベクターにおいても配列番号１４及び１５で表される配列をクローニングし、これらの蛋白質と結合する結合蛋白の回収を行った。配列番号１及び２で表される配列中には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみを含む。上記ＢＡＤ遺伝子（配列番号：１及び２）を、哺乳類細胞における発現ベクターｐＥＧＦＰを用いて発現させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析すると、分子量、約 ５８ｋ ダルトンを示す（図１）。ＣＯＳ−７培養細胞に、該発現タンパク質を発現させると、３７℃で１８時間血清除去培養した場合、トリパンブルー染色（図２）より、核の濃縮などのアポトーシス様形態変化とともに細胞死を起こし、発現タンパク質がアポトーシス誘導能を有していることを示す。細胞から蛋白質を抽出し、カスパーゼ３活性の測定を行うと、その活性化が認められ、アポトーシスが起こっていることが明らかである（図３）。ＢＡＤ変異型遺伝子（配列番号：１５）を同様にＣＯＳ−７細胞に発現させると、ほぼ同様にアポトーシスが惹起されていることが示される （図２，３）。しかし、１０％血清の含まれる培養条件では、ＢＡＤ変異型遺伝子導入された細胞の方が明らかに強いアポトーシス誘導能があることが示される（図９）。
【０００６】
本発明の核酸は、上記ＤＮＡ情報に基づき、公知の標準技法を用いて、ｃＤＮＡから調製され、さらに合成されたプライマーを用いて変異型を調製できる。本発明のＤＮＡに代表される核酸配列は、ＲＮＡの形態、例えばｍＲＮＡ、あるいはＤＮＡの形態、例えば、クローニングまたは合成で作製されるｃＤＮＡを含む。該ＤＮＡは二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）、または一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ）であってもよい。一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡは、コーディング鎖（センス鎖）であってもよく、また、ノンコーディング鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。”単離された”本発明の核酸分子とは、点突然変異を含むＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。さらに、単離されたＤＮＡ分子を用いて変異型ＢＡＤと結合する新規蛋白の同定に応用することも含まれる。さらにまた、本発明の核酸に基づくたんぱく質が、非タンパク質医薬担体などと結合し、その活性を変化させるものも含まれる。
【０００７】
本発明は、ＢＡＤの蛋白質結合領域ＢＨ３ドメイン内の核酸分子の変異体に関するものであるが、同部位以外にもＢＡＤのリン酸化反応に影響の生じる変異型ＢＡＤも含まれる。変異は、例えば、自然のアレル変異のように自然に発生するとともに、人為的に生じる変異は、当該技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて作製できる。このような変異は、一つまたは二つ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって作製される変異を含む。コーディング領域の変更は、保存的、または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生じ得る。精製、または発現されたＢＡＤタンパク質の活性は、癌細胞に対するアポトーシス誘導活性を調べることにより可能である。
【０００８】
用途／医薬組成物 本発明の変異型ＢＡＤをコードする核酸配列は、これを含むベクターを用いて、悪性腫瘍の形成および／または転移を抑制する遺伝子治療剤として用いることができる。遺伝子治療剤は、ＨＶＪリポソーム法、本発明の核酸を、注射等によってそのまま投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法、あるいはリポフェクションによって投与する方法、適当なベクター、例えば、アデノウイスルベクター、アデノ関連ベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、等を用いて、ヒトを含む哺乳類に投与することができる。本発明の遺伝子治療剤は、局所的、または適当な期間のみアポトーシス誘導が生じる必要性から、変異型ＢＡＤが一過性に発現するような状況で投与することが望ましい。そのためには、腫瘍局所への注射等によって、そのまま投与する方法、ＨＶＪリポソーム法、アデノウイスルベクターを用いる方法、ワクシニアウイルスベクターを用いる方法、等が望ましい。また、腹膜播種した場合は、腹腔内投与という手段によって目的を達成しうることが期待できる。本発明の組換え変異型ＢＡＤは、その有するアポトーシス誘導・促進能に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待できる。該適用疾患としては、より具体的には、例えば、各種癌，及び子宮筋腫、ポリープなどの増殖性疾患が主たる対象となるが、さらに自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ等の膠原病、さらに潰瘍性大腸炎、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、インスリン依存性（Ｉ）型糖尿病、等への応用も例示できる。また、白血病などの各種血液疾患においても適用できる。
【０００９】
本発明の組換え変異型ＢＡＤ遺伝子ベクターを、制癌剤として用いる場合、その投与により、癌細胞に対してアポトーシスを誘導乃至はこれを促進でき、制癌作用を発揮する。また、変異型ＢＡＤは、その製剤形態、および投与経路にかかわらず、効果を期待できる。例えば、これを癌の化学療法剤として知られている他の各種の制癌剤や放射線療法と併用することができる。組換え変異型ＢＡＤは、この際に併用する他の制癌剤の効果を一層助長し、相乗効果を発揮することができる。したがって、併用する制癌剤を通常用いられる量よりもかなり少量であっても、十分な癌治療効果が期待でき、これにより、併用制癌剤の副作用の軽減化を図ることができる。かかる化学療法剤としては、例えば、５ーフルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン、フトラフール、エンドキサン、アドリアマイシン等を例示できる。組換え変異型ＢＡＤ遺伝子ベクターは、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、あるいは腹腔内）に投与されえる。この際に、リピオドールなどの脂溶性の溶媒を使用し、局所に停滞させえる処方もできる。悪性腫瘍の治療のために必要な変異型ＢＡＤの投与量は、用法、患者の年令、性別、症状の程度、等を考慮して適宜決定されるが、アデノウイルスベクターを用いた場合、通常、成人１回当たり、１０８−１０ ＰＦＵ 程度であり、数日以上の間隔を経て数回の投与を行う。さらに、ウイルスベクターを置換し、異なったアプローチにより感染、処方を施行することも可能である。
【００１０】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１１】［実施例１］ 野生型ＢＡＤ ｃＤＮＡ の単離（配列番号：１）は、合成した特異的プライマー；配列番号：３及び４，または ５及び６）を用いて ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社の ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ｍｏｄｅｌ ９６００ を使用）を行った。ＰＣＲ 反応液は ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃＤＮＡ ２５ ｎｇ， １０ ｐｍｏｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ， ２．５ ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ， ２ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５ μＬ １０ ｘ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｔａｑ （ＴＡＫＡＲＡ）， ２．５ ｕｎｉｔｓ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ／ ５０ μＬ で、反応条件は ９８℃， ２ ｍｉｎ ／ ９８℃−１０ ｓｅｃ，５０℃−６０ ｓｅｃ， ７２℃−１．５ ｍｉｎ Ｘ ２５ ｃｙｃｌｅ である。２つの合成されたＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマー３及び６を用いて、再度 同様にＰＣＲを施行した。増幅されたＤＮＡを。約１ ｋｂ断片を、それぞれ ｐｃＤＮＡ３， ｐＥＧＦＰ−Ｃ１， ｐＧＥＸ−２Ｔに組込み、部分塩基配列を ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社の ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙｒｅａｃｔｉ−ｏｎ ｋｉｔ と ＡＢＩ３７７ ＰＲＩＳＭ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ を用いて解析した。得られた塩基配列の情報から点突然変異が人為的に組み込まれたことを確認した（配列番号：２）。
【００１２】［実施例２］ 野生型もしくは変異型ＢＡＤ遺伝子を哺乳類発現ベクターに組替えられたＤＮＡを４ ｍｇ を リポフェクション法（Ｅｆｆｅｃｔｅｎ）によって ５ ｘ １０５ 個の ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入している。遺伝子導入後４８時間後に細胞を回収し、その発現量をウエスタンブロット法によって解析すると、コントロール細胞に比し明らかにＢＡＤ蛋白の発現が増加していることが判る （図１）。遺伝子導入後、無血清培地にて培養し、２４時間後の細胞死の検索を行ったところ、両者とも、明らかに細胞死を誘導していることが明らかになった （図２）。さらに、１２時間後の時点におけるカスパーゼ３の活性も両者とも明らかにカスパーゼ３の活性化が起こっていることが判明した（図３）。
【００１３】［実施例３］ 野生型もしくは変異型ＢＡＤ遺伝子を哺乳類発現ベクターに組替えられたＤＮＡを４ ｍｇ を リポフェクション法（Ｅｆｆｅｃｔｅｎ）によって ５ ｘ １０５ 個の ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入し、２４時間後に細胞をメタノール固定し、共焦点顕微鏡にて両ＢＡＤ蛋白の細胞内局在を観察した。両者ＢＡＤ蛋白は、ミトコンドリア膜表層に局在していることが判る（図４）。
【００１４】［実施例４］ 野生型もしくは変異型ＢＡＤ遺伝子をバクテリア発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ）に組替えられたＤＮＡをバクテリア株ＴＢＩに遺伝子導入（トランスフォーメーション）し、ＧＳＴ−ＢＡＤ融合蛋白を作成した （図５）。この融合蛋白を用いて、ＢＡＤ結合蛋白を部分精製し、ウエスタンブロットにて確認した。この結果、両ＢＡＤともアポトーシス抑制物質Ｂｃｌ−ＸＬと良く結合することが判明した（図６
）。
【００１５】［実施例５］ 野生型もしくは変異型ＢＡＤ遺伝子によって作製された ＧＳＴ−ＢＡＤ融合蛋白を用いて、ＢＡＤ結合蛋白を部分精製し、ウエスタンブロットにて確認したところ、野生型ＢＡＤとは異なっている点として、変異型ＢＡＤは、ＢＡＤのアポトーシス誘導作用を阻害する１４−３−３蛋白と結合しないことが判明した （図７）。
【００１６】［実施例６］ 野生型もしくは変異型ＢＡＤ遺伝子のヒト細胞への遺伝子導入によって発現された両ＢＡＤ蛋白のセリン残基のリン酸化レベルを解析したところ、野生型ＢＡＤ蛋白は、主要な３箇所のリン酸化部位のいずれもが良くリン酸化されているのに対し、変異型ＢＡＤでは、ほとんどリン酸化されていないことが判明した （図８）。
【００１７】このような変異型ＢＡＤは、セリンのリン酸化による負の制御を受けないので、アポトーシス誘導能の特性を損なうことなく、アポトーシスを誘導することができる。従って、癌治療の際に、野生型ＢＡＤでも死なない細胞においても、アポトーシスを誘導することが容易になる。さらに、この分子を用いて非リン酸化ＢＡＤと結合し易い分子を同定するための良いプローブとなりうる。
【００１８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の変異型ＢＡＤは、セリンのリン酸化による負の制御を受けず、野生型のアポトーシス誘導能を損なわずに保持しているので、抗癌剤としての利用が期待される。
【００１９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＯＳ−７ 細胞中における野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ 蛋白の発現。ウエスタンブロット法による検出。
【図２】血清除去下における培養時の野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ 遺伝子導入による細胞死誘導能。遺伝子導入後、１２時間（白）２４時間（黒）における細胞死。
【図３】血清除去下における野生型ＢＡＤ及び変異型ＢＡＤ遺伝子導入による ｃａｓｐａｓｅ−３ の活性化。遺伝子導入後、９時間（白）１８時間（黒）におけるｃａｓｐａｓｅ−３活性。
【図４】ＣＯＳ−７細胞中における野生型ＢＡＤ蛋白の細胞内局在（蛍光顕微鏡図）。
【図５】ＣＯＳ−７細胞中における変異型ＢＡＤ蛋白の細胞内局在（蛍光顕微鏡図）。
【図６】野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ のＧＳＴ融合蛋白の発現。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルの蛋白染色による検出。
【図７】野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ−ＧＳＴ 融合蛋白の Ｂｃｌ−ＸＬ 蛋白との結合能。ＢＡＤ−ＧＳＴ融合蛋白によるｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ後、ウエスタンブロット法による検出。
【図８】野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ 蛋白の １４−３−３ 蛋白との結合能。１４−３−３−ＧＳＴ融合蛋白によるｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ後、ウエスタンブロット法による検出。
【図９】野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ のセリン残基のリン酸化。
【図１０】活性型Ａｋｔ遺伝子の共遺伝子導入された ＣＯＳ−７ 細胞中における野生型 ＢＡＤ 及び変異型 ＢＡＤ のアポトーシス細胞死の誘導能。ＢＡＤ遺伝子のみ導入されたコントロール細胞（白）活性型Ａｋｔ遺伝子とともにＢＡＤ遺伝子を導入された細胞（黒）。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a human-derived nucleic acid that encodes a protein BAD that induces apoptosis (cell death), and aims to be applied to the medical field using an apoptosis-inducing protein that does not undergo negative control.
[0002]
[Prior art]
In vivo, apoptosis is a physiological phenomenon that is performed physiologically to remove cells that are no longer needed. Using this to remove unnecessary cells is the most desirable cancer treatment method. Become. It is a known fact that conventional therapeutic agents for cancer actually have an effect of inducing apoptosis in cancer cells. Therefore, cancer treatment using molecules that control apoptosis can be expected to be the most promising using biological reactions. Many reports on cancer treatment using proteins involved in apoptosis have not been put into practical use. One reason for this is that apoptosis-related molecules are subject to functional control through interaction with various proteins or protein modifications, and apoptosis is not always triggered only by an increase in the expression level. Assumed. It is known that the apoptosis-inducing protein BAD targeted by the present invention is inactivated by serine phosphorylation and becomes active, ie, induces apoptosis, by serine dephosphorylation. Because of this, it is expected that the biological activity can be easily regulated by using phosphorylation reaction, and this was used because the activity was easier to control compared to other apoptosis control molecules. Cancer treatment can be very promising. The present inventors have recently proved that BAD plays an important role in apoptosis, that is, anoikis, in the case of loss of the epithelial cell scaffold (in paper submission). When anoikis is suppressed, cancer metastasis and peritoneal dissemination are likely to occur, and the present inventors have demonstrated that cancer cells are promoted (Takaoka A, et al., Oncogene 14: 2971). Yawata A, et al., Oncogene 16: 2681-2686, 1998), and BAD related thereto can be expected to be able to prevent the progression of cancer. Considering that most cancers occurring in humans are derived from epithelial cells, the application range of cancer treatment using BAD is extremely wide, and can be applied in various fields. Therefore, it is essential to create this BAD mutant, analyze its function, and find a new molecule that is not subject to negative control.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved is that the function of BAD is impaired in its ability to induce apoptosis by phosphorylation. Mutant BAD that is not negatively controlled is an ideal molecule for artificially inducing apoptosis. An object of the present invention is to provide a human-derived nucleic acid encoding a point mutation type of protein BAD having an apoptosis-inducing action, and to provide a gene therapy method for malignant tumors thereby.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The main feature of the present invention is to find a novel BAD molecule that maintains its activity without damaging apoptosis-inducing ability by point mutation so that it is not negatively controlled by phosphorylation. The present inventors prepared PCR primers corresponding to the human BAD gene sequence, and cloned a cDNA encoding the full length of BAD having a point mutation (hereinafter referred to as BADD119G) by a hybridization method. Then, BADD119G cDNA was expressed in human cancer cells, and the apoptosis-inducing ability was compared with wild-type BAD (hereinafter referred to as BADwt). Furthermore, serine phosphorylation reaction and binding protein of both expressed proteins were examined. As a result, in serum removal (starvation state) for apoptosis induction, the BADD119G expressed protein showed almost the same apoptosis induction ability as BADwt. However, in the non-starved state, BADD119G maintained high apoptosis-inducing ability, whereas BADwt had reduced apoptosis-inducing ability. In addition, BADD119G showed almost no phosphorylation of serine residue, and was found not to be negatively controlled and to maintain the function of activated BAD. That is, the present invention provides (1) an isolated DNA sequence encoding human BAD, wherein the DNA sequence is represented by SEQ ID NO: 14 and the sequence represented by SEQ ID NO: 15 is: A one-base mutation is artificially introduced into the functional active site (BH3 domain) of BAD. (2) A primer having a sequence complementary to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 14 is prepared. (3) A primer in which only one base is substituted in the functional active site (BH3 domain) of BAD is prepared in both sense and antisense directions. (4) The sequence represented by SEQ ID NO: 14 is cloned using the RT-PCR method and used as a template. (5) an expression vector in a mammalian cell containing the DNA sequence described in (1), (6) an expression vector in a bacterium containing the DNA sequence described in (1), and (7) It relates to the recovery of bound proteins.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
By mutating one amino acid in the BH3 domain of the BAD molecule, an activity-maintained mutant BAD was realized without impairing its original ability to induce apoptosis. The present inventors prepared sense and antisense PCR primers corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the human BAD gene, and cloned the full length cDNA of the human BAD gene. Further, using this as a template, the sequence represented by SEQ ID NO: 2 having a point mutation, the mutant BAD gene was cloned. These cDNAs were incorporated into a mammalian expression vector, and it was analyzed whether or not they exhibited cytotoxic activity against cultured cell COS-7 derived from green monkey kidney epithelium. And also in the bacterial expression vector, the sequences represented by SEQ ID NOs: 14 and 15 were cloned, and the binding proteins that bind to these proteins were recovered. The sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 contain only an open reading frame (ORF). When the BAD gene (SEQ ID NOs: 1 and 2) is expressed using the expression vector pEGFP in mammalian cells and analyzed by 10% SDS-PAGE, it shows a molecular weight of about 58 k Dalton (FIG. 1). When the expressed protein is expressed in COS-7 cultured cells, when serum-removed culture is performed at 37 ° C. for 18 hours, cell death occurs due to apoptosis-like morphological changes such as nuclear concentration from trypan blue staining (FIG. 2). It shows that the expressed protein has the ability to induce apoptosis. When protein is extracted from the cells and caspase 3 activity is measured, the activation is observed and it is clear that apoptosis occurs (FIG. 3). When the BAD mutant gene (SEQ ID NO: 15) is expressed in COS-7 cells in the same manner, it is shown that apoptosis is induced almost similarly (FIGS. 2 and 3). However, under the culture conditions containing 10% serum, it is shown that the cells into which the BAD mutant gene has been introduced clearly have a stronger ability to induce apoptosis (FIG. 9).
[0006]
Based on the above DNA information, the nucleic acid of the present invention can be prepared from cDNA using a known standard technique, and a mutant can be prepared using a synthesized primer. Nucleic acid sequences represented by the DNA of the present invention include RNA forms such as mRNA, or DNA forms such as cDNA produced by cloning or synthesis. The DNA may be double-stranded or single-strand. The single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand). An “isolated” nucleic acid molecule of the present invention refers to DNA or RNA containing point mutations. Further, it includes application to identification of a novel protein that binds to mutant BAD using an isolated DNA molecule. Furthermore, the protein based on the nucleic acid of the present invention binds to a non-protein pharmaceutical carrier and changes its activity.
[0007]
The present invention relates to a mutant of a nucleic acid molecule in the protein binding region BH3 domain of BAD, but also includes a mutant BAD that affects the phosphorylation reaction of BAD in addition to the same site. Mutations occur naturally, such as natural allelic mutations, and artificially generated mutations can be made using site-directed mutagenesis techniques known in the art. Such mutations include mutations made by nucleotide substitutions, deletions or additions involving one or more nucleotides. Changes in the coding region can result in conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. The activity of the purified or expressed BAD protein is possible by examining the apoptosis-inducing activity against cancer cells.
[0008]
Use / Pharmaceutical Composition The nucleic acid sequence encoding the mutant BAD of the present invention can be used as a gene therapy agent that suppresses the formation and / or metastasis of malignant tumors using a vector containing the same. The gene therapy agent may be an HVJ liposome method, a method of directly administering the nucleic acid of the present invention by injection, the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, the electroporation method, the method using a gene gun, or a method using lipofection. Vectors such as adenovirus vectors, adeno-related vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, retrovirus vectors, etc. can be used to administer to mammals including humans. The gene therapy agent of the present invention is desirably administered in a situation where the mutant BAD is transiently expressed because of the need to induce apoptosis locally or only for an appropriate period. For that purpose, a method of administration as it is by injection into a tumor local area, a HVJ liposome method, a method using an adenovirus vector, a method using a vaccinia virus vector, and the like are desirable. Moreover, when peritoneal seeding is performed, it can be expected that the object can be achieved by means of intraperitoneal administration. The recombinant mutant BAD of the present invention can be applied to various diseases based on its ability to induce and promote apoptosis, and a desired pharmacological effect can be expected. More specifically, the applicable diseases mainly include proliferative diseases such as various cancers and uterine fibroids and polyps, but also autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Examples include collagen disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, myasthenia gravis, and insulin-dependent (I) type diabetes. It can also be applied to various blood diseases such as leukemia.
[0009]
When the recombinant mutant BAD gene vector of the present invention is used as an anticancer agent, its administration can induce or promote apoptosis of cancer cells and exert an anticancer effect. In addition, the mutant BAD can be expected to be effective regardless of its preparation form and administration route. For example, it can be used in combination with other various anticancer agents and radiation therapy known as cancer chemotherapeutic agents. The recombinant mutant BAD can further enhance the effects of other anticancer agents used in combination at this time, and can exert a synergistic effect. Therefore, even if the amount of the anticancer drug used in combination is considerably smaller than the amount usually used, a sufficient cancer therapeutic effect can be expected, thereby reducing the side effects of the combined anticancer drug. Examples of such chemotherapeutic agents include 5-fluorouracil (5-FU), mitomycin, ftorafur, endoxan, adriamycin and the like. The recombinant mutant BAD gene vector can be administered parenterally (eg, intravenously, intramuscularly, or intraperitoneally). At this time, a fat-soluble solvent such as lipiodol can be used to make the formulation stagnant locally. The dosage of mutant BAD necessary for the treatment of malignant tumor is appropriately determined in consideration of usage, patient age, sex, symptom level, etc. Usually, when adenovirus vector is used, The dose is about 10 8 -10 PFU per adult and is administered several times at intervals of several days or more. Furthermore, it is also possible to replace the viral vector and carry out infection and prescription by different approaches.
[0010]
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Isolation of wild type BAD cDNA (SEQ ID NO: 1) was performed by PCR (Applied Biosystems) using synthesized specific primers; SEQ ID NOs: 3 and 4, or 5 and 6). DNA thermal cycler model 9600 was used). PCR reaction solution was template cDNA 25 ng, 10 pmol each primer, 2.5 mM each dNTP, 2 mM MgCl 2 , 5 μL 10 x buffer for Pyrobest Taq (TAKARA) The reaction conditions are 98 ° C., 2 min / 98 ° C.-10 sec, 50 ° C.-60 sec, 72 ° C.-1.5 min X 25 cycle. Using the two synthesized PCR products as templates, PCR was performed again in the same manner using primers 3 and 6. Amplified DNA. About 1 kb fragment was incorporated into pcDNA3, pEGFP-C1, and pGEX-2T, respectively, and the partial base sequence was analyzed using PE Applied Biosystems' ABI PRISM BigDye terminator cycle I sequencing read-only I7. It was confirmed from the information of the obtained base sequence that a point mutation was artificially incorporated (SEQ ID NO: 2).
[Example 2] 4 mg of DNA obtained by recombination of a wild-type or mutant BAD gene into a mammalian expression vector was introduced into 5 × 10 5 COS-7 cells by the lipofection method (Effecten). . When the cells were collected 48 hours after gene introduction and the expression level was analyzed by Western blotting, it was found that the expression of BAD protein was clearly increased compared to control cells (FIG. 1). After the gene introduction, the cells were cultured in a serum-free medium, and cell death after 24 hours was searched. As a result, both were clearly induced to induce cell death (FIG. 2). Furthermore, it was found that both caspase 3 activities after 12 hours were clearly caspase 3 activated (FIG. 3).
[Example 3] 4 mg of DNA obtained by recombination of a wild type or mutant BAD gene into a mammalian expression vector was introduced into 5 × 10 5 COS-7 cells by the lipofection method (Effecten). After time, the cells were fixed with methanol, and the intracellular localization of both BAD proteins was observed with a confocal microscope. Both BAD proteins are found to be localized on the surface layer of the mitochondrial membrane (FIG. 4).
Example 4 A GST-BAD fusion protein was prepared by gene transfer (transformation) into a bacterial strain TBI of a DNA obtained by recombining a wild-type or mutant BAD gene with a bacterial expression vector (pGEX-2T). (FIG. 5). Using this fusion protein, the BAD-binding protein was partially purified and confirmed by Western blot. As a result, both BADs were found to bind well to the apoptosis inhibitor Bcl-XL (FIG. 6).
).
[Example 5] When a BAD-binding protein was partially purified using a GST-BAD fusion protein prepared by a wild-type or mutant BAD gene and confirmed by Western blotting, it was different from wild-type BAD. On the other hand, it was found that mutant BAD does not bind to 14-3-3 protein that inhibits BAD apoptosis-inducing action (FIG. 7).
[Example 6] Phosphorylation levels of serine residues of both BAD proteins expressed by introducing a wild-type or mutant BAD gene into human cells were analyzed. All three phosphorylation sites were well phosphorylated, whereas mutant BAD was hardly phosphorylated (FIG. 8).
Such a mutant BAD is not negatively controlled by phosphorylation of serine, and can induce apoptosis without impairing the properties of apoptosis-inducing ability. Therefore, it becomes easy to induce apoptosis even in cells that do not die with wild-type BAD during cancer treatment. Furthermore, this molecule can be used as a good probe for identifying a molecule that easily binds to non-phosphorylated BAD.
[0018]
【The invention's effect】
As described above, the mutant BAD of the present invention is not subject to negative control due to phosphorylation of serine, and is retained without impairing the wild-type apoptosis-inducing ability, and thus is expected to be used as an anticancer agent.
[0019]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1. Expression of wild-type BAD and mutant BAD protein in COS-7 cells. Detection by Western blot.
FIG. 2 shows cell death inducing ability by introduction of wild-type BAD and mutant BAD genes during culturing under serum removal. Cell death at 12 hours (white) and 24 hours (black) after gene transfer.
[Fig. 3] Activation of caspase-3 by introduction of wild-type BAD and mutant BAD genes under serum removal. Caspase-3 activity at 9 hours (white) and 18 hours (black) after gene introduction.
FIG. 4 shows the intracellular localization of wild-type BAD protein in COS-7 cells (fluorescence micrograph).
FIG. 5 shows intracellular localization of mutant BAD protein in COS-7 cells (fluorescence micrograph).
FIG. 6: Expression of wild-type BAD and mutant BAD GST fusion protein. Detection by protein staining of gel after SDS-PAGE.
FIG. 7 shows the ability of wild-type BAD and mutant BAD-GST fusion protein to bind to Bcl-XL protein. Detection by Western blot after pull-down assay with BAD-GST fusion protein.
FIG. 8 shows the binding ability of wild-type BAD and mutant BAD protein to 14-3-3 protein. Detection by Western blotting after pull-down assay with 14-3-3-GST fusion protein.
FIG. 9 shows phosphorylation of serine residues of wild type BAD and mutant BAD.
FIG. 10 shows the ability of wild-type BAD and mutant BAD to induce apoptotic cell death in COS-7 cells into which an active Akt gene has been co-introduced. Control cells into which only the BAD gene has been introduced (white) Cells into which the BAD gene has been introduced together with the active Akt gene (black).
