JP2004121051A

JP2004121051A - Human cancer spermary antigen

Info

Publication number: JP2004121051A
Application number: JP2002287794A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Kawakami; 河上　裕; Taku Iwata; 岩田　卓; Tomonobu Fujita; 藤田　知信
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2022-09-30
Also published as: JP4336870B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a polynucleotide used for the immunotherapy of cancer, to provide a polypeptide, to provide a recombinant cell, to provide an immunotherapy, to provide a medicine used for the immunotherapy, and to provide a diagnostic medicine. <P>SOLUTION: A new cancer spermary antigen KU-EM-1 gene cDNA which spermary-specifically expresses in a normal cell and widely expresses in a cancer cell strain is obtained by screening an expression library with an antibody existing in the serum of a cancer patient and then examining the expression pattern of the obtained positive clone. The immunotherapy of cancer comprises purifying KU-EM-1 peptide expressed in a recombinant cell obtained by transducing Escherichia coli with the cDNA expression vector of KU-EM-1 gene, mixing the purified KU-EM-1 peptide with an immature dendritic cell originated from a monocyte obtained from a cancer patient, maturing the immature dendritic cell, and then subcutaneously injecting the mature dendritic cell as a treating agent into a femoral region. A cancer can be diagnosed by detecting the presence of KU-EM-1 peptide antibody in the serum of a patient. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の免疫療法に用いるためのポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換え細胞、免疫療法とその免疫療法に用いられる治療剤、及び癌の診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、広く行われている癌の治療法には、外科的療法、化学的療法、放射線療法があるが、第四の治療法として、生物が固有に持つ免疫反応を利用する免疫療法が期待を集めている。癌細胞に発現している癌抗原に対し、免疫誘導を行い、免疫反応を利用して癌細胞の排除を行うのである。実際、メラノーマにおいては、免疫学的排除が起こることが示されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
そのような免疫療法の対象となる癌抗原として、癌と、正常組織では主に精巣に発現している癌精巣抗原（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ抗原）が、特に有望視されている。癌細胞は、本来自己の持つ細胞が変異してできたものであるため、癌細胞の発現するタンパク質に対しては、通常免疫系は反応しないものと考えられる。しかし、精巣には、主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）分子を発現していない細胞が存在し、そのため、そのような細胞上のタンパク質は免疫系によって認識されない。従って、癌細胞と精巣に共有される癌精巣抗原に対しては、自己タンパク質であるにもかかわらず、外から抗原を導入してやることにより免疫反応を誘導させることができる。実際、癌患者の血清内に癌精巣抗原の抗体が存在している場合が観察されるが、その場合、癌に対する免疫反応はそれほど強くない。従って、癌精巣抗原に対する強い免疫反応を誘導することにより、癌細胞を免疫反応により攻撃することができる優れた方法を開発することができる。
【０００４】
免疫反応を誘導した時、その開始の決定は抗原提示細胞としての樹状細胞に依存する。免疫反応は、細胞障害性Ｔ細胞や活性化マクロファージなどによる細胞性免疫と、抗体産生による体液性免疫の２種類があり、それぞれの反応を誘導するヘルパーＴ細胞として、Ｔｈ１及びＴｈ２がある。樹状細胞は、これらヘルパーＴ細胞に抗原を提示し、ヘルパーＴ細胞の分化誘導を制御している。しかしながら、癌細胞において癌抗原の発現量が少ない、あるいは免疫系からの何らかのエスケープ機構が働いている等が原因で、癌細胞に対する免疫反応は弱い。従って、癌免疫療法の方法論として、直接Ｔ細胞などのエフェクター細胞を活性化するだけでなく、生体外で樹状細胞を活性化し、癌抗原を提示させ、免疫反応を開始させてから生体内に戻すという試みが行われている。実際に、ヒト以外の脊椎動物を用いた実験では、抗原ペプチドや遺伝子を導入した樹状細胞を投与することによって、高い免疫効果が得られている。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第５８４４０７５号明細書
【０００６】
【特許文献２】
米国特許第５９９４５２３号明細書
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような癌の免疫療法は始まったばかりであり、有用な癌精巣抗原ばかりか、利用できる癌抗原はほとんど知られていない。
そこで、本発明は、癌の免疫療法に用いるためのポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換え細胞、免疫療法とその免疫療法に用いられる治療剤、及び癌の診断剤を提供することを目的としてなされた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、以下の塩基配列のいずれか、またはその一部を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号：１に示される塩基配列。
（ｂ）配列番号：１に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列であって、配列番号：１にコードされるタンパク質と同等の機能を持つタンパク質をコードする塩基配列。主に癌と精巣で発現するタンパク質をコードすることが望ましい。
（ｃ）配列番号１と相補的な塩基配列、即ち（ａ）と相補的な塩基配列。
（ｄ）配列番号１と相補的な塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列、即ち（ｂ）と相補的な塩基配列。この配列の相補的な塩基配列は、配列番号：１にコードされるタンパク質と同等の機能を持つタンパク質をコードする塩基配列であることが好ましく、主に癌と精巣で発現するタンパク質をコードすることが望ましい。
【０００９】
これらのポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、のいずれであってもよい。また、１個若しくは数個の塩基の欠失、置換、若しくは付加等の遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を持つが、アミノ酸配列が同じであったり、元の塩基配列がコードするタンパク質と同等の機能を持つポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。特に、（ａ）及び（ｂ）の塩基配列、並びに（ｃ）及び（ｄ）の相補的な塩基配列は、癌精巣抗原をコードすることがさらに好ましい。
【００１０】
また、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有することを特徴とする（以下、前記ポリペプチドと称する）。１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加等の遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を持つが、元のタンパク質と同等の機能を持つポリぺプチドも本発明の範囲内である。特に、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を持つポリペプチドは、主に癌細胞と精巣で発現していることが好ましく、癌精巣抗原であることがさらに好ましい。
【００１１】
また、本発明にかかる組換え細胞は、前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現するように、ポリヌクレオチドを導入したことを特徴とする。また、前記ポリペプチドを発現するように、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入してもよい。また、前記ポリヌクレオチドが、タグ分子をコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドであることを特徴としてもよい。なお、この組換え細胞は、大腸菌、初代培養細胞、株化した培養細胞など、どんな種類の細胞であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明にかかる免疫療法は、ヒト以外の脊椎動物における癌の免疫療法であって、前記ポリペプチドを抗原とし、その抗原に対して生体内で免疫誘導を行うステップを含むことを特徴とする。また、ヒト以外の脊椎動物における癌の免疫療法であって、前記ポリペプチドを抗原とし、その抗原に対して生体外で免疫誘導を行うステップを含むことを特徴としてもよい。また、前記抗原に対してエフェクター細胞に免疫誘導させるステップを含むことを特徴としてもよい。このエフェクター細胞はＴ細胞であってもよいが、それに限らずＮＫＴ細胞などでもよい。また、抗原提示細胞に前記抗原を提示させるステップを含むことを特徴としてもよい。この抗原提示細胞は樹状細胞であってもよいが、それに限らない。これらの免疫療法は、ヒトにも応用することができる。ここで、「免疫誘導」とは、免疫反応を誘導することをいい、生体内であっても、生体外であっても構わない。
【００１３】
さらに、本発明にかかる治療剤は、癌の免疫療法に用いられる治療剤であって、前記ポリペプチドを含むことを特徴とする。また、前記組換え細胞を含むことを特徴としてもよい。また、生体外で調製され、前記ポリペプチドに対して免疫誘導されたエフェクター細胞を含むことを特徴としてもよい。このエフェクター細胞はＴ細胞であってもよい。また、生体外で調製され、前記ポリペプチドをＴ細胞に提示する抗原提示細胞を含むことを特徴としてもよい。この抗原提示細胞は樹状細胞であってもよい。
【００１４】
なお、この治療剤は、薬理学的に許容された賦形剤又は基剤をさらに含有してもよい。
【００１５】
さらに、本発明にかかる癌の診断剤は、前記ポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００１６】
さらに、本発明にかかる癌の診断用マーカーは、前記ポリペプチドに対する抗体を含むことを特徴とする。また、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドを含むことを特徴としてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実験方法に関しては、以下の記載では、特に説明がない場合、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　（Ｅｄ．），　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）；　Ｆ．　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｒ．　Ｂｒｅｎｔ，　Ｒ．　Ｅ．　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，　Ｄ．　Ｄ．　Ｍｏｏｒｅ，　Ｊ．Ｇ．　Ｓｅｉｄｍａｎ，　Ｊ．　Ａ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｋ．　Ｓｔｒｕｈｌ　（Ｅｄ．），　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
なお、本発明の目的、特徴、利点及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書に記した記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者には明らかである。
【００１９】
癌精巣抗原に対しては、前記のように、癌患者の血清内に抗体が作られている場合がある。そこで、癌患者の血清中に存在する抗体を用いて、発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、そのような癌精巣抗原をコードする遺伝子を単離することが期待できる。実際、本発明において利用される癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子は、子宮体癌患者の血清中にその産物に対する抗体が含まれるため、その血清を用いて、ヒト子宮体癌由来の細胞株ｃＤＮＡより構築されたλファージ発現ライブラリーをスクリーニングして得ることができた。また、進行メラノーマ患者の血清を用いて、ヒト精巣由来のｃＤＮＡより構築されたλファージ発現ライブラリーのスクリーニングを並行して行っていたが、癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子は、このスクリーニングにおいても独立に単離された。このことは、癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１が、免疫原性の点で、癌の免疫療法において、非常に有望なクローンであることが示唆する。
【００２０】
このようにして得られたＫＵ−ＥＭ−１をコードするｃＤＮＡを用い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを合成する。合成方法としては、導入する細胞に適切なエンハンサー／プロモーターをもつなど、適当な発現ベクターに、Ｈｉｓタグなどをコードするヌクレオチドタグを融合したＫＵ−ＥＭ−１ｃＤＮＡ全長または一部を含むポリヌクレオチドを挿入し、このＫＵ−ＥＭ−１タグ融合ペプチド発現ベクターを、大腸菌、哺乳類培養細胞、昆虫培養細胞などに導入して発現させたタグ融合ペプチドを、タグを利用して精製する方法や、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写系でＫＵ−ＥＭ−１ｃＤＮＡ全長または一部を転写させ、ウサギ網状赤血球抽出液や大腸菌　Ｓ３０　抽出液を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いてタグ融合ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを発現させ、発現したタグ融合ペプチドをタグを利用して精製する方法等がある。タグ融合ペプチドは、最終段階でタグを除去し、ＨＰＬＣなどで、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドだけを精製しても良い。ここで、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドは、タンパク質全長を含んでいなくても、一部のペプチドであっても良い。また、タンパク質のうち異なる部分に対応する複数のペプチドの混合物であっても良い。
【００２１】
このようにして調製した精製ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを用いて、以下の方法を用いてＫＵ−ＥＭ−１に対する免疫反応を生体内で活性化する。これにより、癌の免疫療法における治療剤として、ＫＵ−ＥＭ−１を癌の治療に用いることができる。ここで、精製ペプチドの代わりに、ＫＵ−ＥＭ−１ｃＤＮＡ全長または一部をエレクトロポレーションなどにより遺伝子導入し、発現させた細胞（以後、組換え細胞と称する）を用いてもよい。この組換え細胞は、ＫＵ−ＥＭ−１以外の免疫原性を抑制するため、患者本人の細胞であることが好ましい。
【００２２】
（１）癌精巣抗原ペプチドまたは組換え細胞の投与
これは、精製ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを癌患者に直接注射する方法である。癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１は、癌組織、及び正常組織においては精巣のみで発現が観察され、ある種の癌患者の血清中で、ＫＵ−ＥＭ−１に対する抗体が検出されているため、精製ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドは、自己蛋白として認識されず、高い抗原性を持つことが考えられる。この際、精製ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを、例えば、ＫＬＨ、テタヌストキソイドなどのヘルパーエピトープ、ｈｓｐ（熱ショックタンパク）、コレステロール多糖体などで修飾したり、　フロイト不完全アジュバントや合成アジュバントなどと共に注射したりすることによって、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドの免疫原性をさらに高める操作を行っても良い。また、ビーズなどの担体にＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを結合させても良い。
または、ＫＵ−ＥＭ−１組換え細胞を注射しても良い。この組換え細胞においては、免疫原性を高めるため、膜や鞭毛と結合した状態で発現させることにより細胞外に発現させることが好ましい。
【００２３】
他の方法として、タンパク質やペプチドを直接投与するのではなく、体内でＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを生成させるため、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドの発現ベクターを有した細菌やウイルスを患者に投与してもよい。この際、細菌やウイルスを無害化しておくことが好ましい。また、感染はするが、複製しないように改変されたレトロウイルスやアデノウイルスにＫＵ−ＥＭ−１ペプチドの発現ベクターを組み込み、患者に感染させることによって、体内でＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを発現させても良い。
【００２４】
このようにして、体内にＫＵ−ＥＭ−１ペプチドが導入されると、体内の免疫系がＫＵ−ＥＭ−１ペプチドを異種蛋白として認識し、ＫＵ−ＥＭ−１ペプチドに対して免疫反応が誘導される。こうして誘起された免疫反応は、ＫＵ−ＥＭ−１を発現している癌細胞を攻撃する。
【００２５】
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激Ｔ細胞の投与
Ｔ細胞を利用した免疫療法の一つとして、体外で抗癌エフェクター細胞となるＴ細胞を多量に増やして投与する受動免疫法がある。ここでは、体外で癌抗原を認識するＴ細胞を増殖させ、それを患者体内に戻す方法を例に挙げる。
【００２６】
患者末梢血から白血球成分採取装置を用いて、白血球分画を採取し、精製ＫＵ−ＥＭ−１タンパク質を添加して培養する。２４時間後に容器内にＩＬ−２を加え更に６日間培養する。培養を始めてから７日後に容器内の浮遊細胞を回収し、固相化抗ＣＤ３抗体で２日間更に活性化刺激する。次にＩＬ−２を含んだ培養液に浮遊状態で５日間培養し、増殖させる。こうして癌精巣抗原であるＫＵ−ＥＭ−１を提示されて活性化刺激を受けた後、増殖刺激を受けて数十億個に増殖したＴ細胞を、患者の静脈内あるいは動脈内に注入する。
【００２７】
注入するＴ細胞は、限界希釈法やＨＬＡテトラマー法などにより、あらかじめＫＵ−ＥＭ−１に高親和性のあるＴ細胞を選択してから注入しても良い。
【００２８】
（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激樹状細胞の投与
最近、樹状細胞が、Ｔ細胞に抗原を提示し、Ｔ細胞を活性化する強力な抗原提示細胞であることが明らかになってきた。そこで、この細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで癌精巣抗原を提示させた状態で生体内に戻すことにより、生体内で癌精巣抗原をＴ細胞に提示させ、その癌精巣抗原に対する免疫反応を誘導するという、癌免疫療法が行われ始めている。この系を、ＫＵ−ＥＭ−１を用いた癌免疫療法に適用する。
【００２９】
患者末梢血から白血球成分採取装置を用いて、白血球分画を採取して、容器内で２時間培養する。容器内の浮遊液を集めてから、新しい培養液を注入し容器の底に付着している細胞（単球）をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて培養する。６日間培養して、未熟樹状細胞を誘導した後、すべての細胞（浮遊細胞および接着細胞）を回収し、回収した細胞に精製ＫＵ−ＥＭ−１タンパク質を混ぜ合わせた後、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＣＤ４０リガンドを加えて更に１８時間培養し、成熟樹状細胞を誘導する。再度すべての細胞を回収・洗浄した後、生理食塩水に懸濁し、５×１０^７個の樹状細胞を大腿部両側に０．２　ｃｃずつ皮下注射し、計１×１０^８個投与する。
【００３０】
ここでは、単球由来の樹状細胞を用いたが、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞由来の樹状細胞など、由来の異なる樹状細胞でも良い。しかし、比較的簡便に多量の樹状細胞が得られるため、単球由来の樹状細胞が好ましい。
【００３１】
また、未熟樹状細胞に癌抗原を加えたが、　抗原のプロセシングを必要とするタンパク質やＲＮＡを取り込ませるときには、この場合のように未熟樹状細胞を用いるのが好ましく、例えばペプチドを感作させるような場合は、成熟樹状細胞やＣＤ４０Ｌなどでより活性化した樹状細胞でもよい。
【００３２】
また、未熟樹状細胞に精製タンパク質をそのまま加えたが、樹状細胞に抗原を提示させる方法としては、癌精巣抗原を粒子状の大きさにして樹状細胞に貪食させる方法、エンドサイトーシスに用いられる受容体を介して、癌精巣抗原を樹状細胞に取り込ませる方法、癌抗原の発現ベクターを樹状細胞に遺伝子導入する方法、癌抗原をｉｎ　ｖｉｔｒｏで転写させ、得られたＲＮＡを導入する方法、癌抗原を発現させた細胞と樹状細胞を細胞融合する方法、等様々な方法が考えられ、いずれであっても構わない。
【００３３】
投与する樹状細胞は、未成熟細胞でも良いが、成熟細胞の方がＴ細胞の活性化について、より強い活性を持つため、成熟細胞の方が好ましい。
【００３４】
一方、癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１は、癌患者の血清中にその抗体が検出されている。従って、患者血清中のＫＵ−ＥＭ−１に対する抗体がある場合、その患者は癌を有していると診断できる。また、図１に示すように、ＫＵ−ＥＭ−１の発現は、正常組織には精巣にしか検出できないが、癌細胞では、由来にかかわらず、広範な癌種で発現していることが明らかになった。そこで、発癌が疑われる組織を患者から一部採取し、ＫＵ−ＥＭ−１の発現を調べることで、癌細胞の有無を調べることができる。その場合、癌細胞の発現マーカーとしては、ＫＵ−ＥＭ−１のＲＮＡでもタンパク質でもよく、ＲＮＡの場合、ノザン・ブロッティングやｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションなどで、タンパク質の場合、ウエスタン・ブロッティングや免疫組織学的染色などで、ＫＵ−ＥＭ−１の発現を検出できる。
以下、本発明の実施例について詳細に述べる。
【００３５】
＜実施例１＞
本実施例では、ヒト子宮体癌患者の血清中に含まれる抗体に対する抗原をコードする遺伝子をＳＥＲＥＸ法により単離することで、ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子をクローニングした。
【００３６】
まず、子宮体癌細胞株ＨｅｃＩｂ（北里大学医学部蔵元らによって樹立され、慶應義塾大学医学部産婦人科学教室に供与）、ＳＮＧＩＩ（発明者らが樹立）、Ｉｓｈｉｋａｗａ株（筑波大学医学部西田らによって樹立され、慶應義塾大学医学部産婦人科学教室に供与）、を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含んだＦ−１２培地で培養し、グアニジン−塩化セシウム密度勾配遠心法により、全ＲＮＡを抽出した。各細胞株から単離された全ＲＮＡを等量ずつ混合し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ｓｕｐｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社の商品名）を用いて、全ＲＮＡからポリＡ^＋ＲＮＡを単離した。５μｇのポリＡ^＋ＲＮＡから、λＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｃＤＮＡ　ライブラリーキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の商品名）を用いて、λファージライブラリーを作製した。増幅前のライブラリーサイズは、２．５×１０^６ｐｆｕであった。
【００３７】
プローブとしての子宮体癌患者血清１８サンプル（ＫＫＳ１〜ＫＫＳ１８）に対しては、大腸菌とファージに対する非特異的なシグナルを抑制するため、大腸菌とファージを用いて前処理（ｐｒｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）を行った。まず、血清と大腸菌抽出物を混合し、室温で４時間静置した後遠心し、上清を回収して最終的に１００倍希釈になるように、ＴＢＳＴ−ＳＭ（５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ）を加えた。次に、外来インサートを持たないλファージが形成したプラークに対し、ライブラリー・スクリーニングと同様にニトロセルロース・メンブレンを作製し、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）で２回洗浄し、ＴＢＳＴ−ＳＭでブロッキングした。大腸菌抽出物処理済みの血清を加え、４時間静置した後、血清を回収し、以降の実験に用いた。
ホスト大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’を用いて、作製したライブラリー　をＮＺＹ培地上にまいてプラークを形成させ、ＩＰＴＧを浸したニトロセルロース・メンブレンを乗せることにより、ファージ・インサートの発現を誘導しながら、発現したタンパク質をメンブレンにブロッティングした。ライブラリーをブロッティングしたメンブレンに、前処理した血清を加え、４時間静置した。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄後、最終４０００倍希釈になるようにアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＦｃγＩｇＧ抗体を加えて、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５−１５０ｍＭ　ＮａＯＨ）で２回洗浄し、アルカリホスファターゼの基質であるニトロブルー・テトラゾリウム（Ｒｏｃｈｅ社の商品）と、ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｌｉｃｈ社の商品）を用いて発色させた。得られた陽性プラークに対し、同様に２次スクリーニングを行い、偽陽性プラークを除去した。最終的に得られた陽性ファージクローンに対し、Ｔ３プライマー及びＴ７プライマーを用いて、９４℃　１分−５５℃　１分−７２℃　２分を３５サイクルという条件でＰＣＲを行って挿入ＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を精製後、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００３８】
配列表の配列番号３、４にそれぞれプライマーの塩基配列を示す。
Ｔ３プライマー：　ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ　　　［配列番号：３］
Ｔ７プライマー：　ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ　　［配列番号：４］
【００３９】
プローブとして、血清ＫＫＳ１〜ＫＫＳ３を等量混合した血清を用いた場合、約１００万クローンについてスクリーニングを行った結果、２４の陽性クローンを得、塩基配列を決定した結果、最終的に１３の独立な遺伝子に由来することが明らかになった。プローブとして、血清ＫＫＳ４〜ＫＫＳ７をそれぞれ独立に用いた場合、総計約４００万クローンから、１７１の陽性クローンが得られ、最終的に６５の独立な遺伝子に由来していた。
【００４０】
各クローンに対し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、正常組織及び各種癌細胞における発現を調べたところ、図１に示すように、正常組織では精巣のみで発現が検出され、癌細胞株では広範に発現の観察されたＫＵ−ＥＭ−１が同定された。なお、ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子に対しては、特異的なプライマー・ペア（Ｓプライマー及びＡＳプライマー）を用いて、９４℃　３０秒−５６℃　３０秒−７２℃　２分のサイクルを３５サイクル行うという条件で、ＰＣＲを行った。
【００４１】
配列表の配列番号５、６にそれぞれプライマーの塩基配列を示す。
Ｓプライマー：　　ＣＴＴＣＣＡＡＣＣＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＡＧ　　　［配列番号：５］
ＡＳプライマー：　ＣＴＣＣＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴ　　　［配列番号：６］
【００４２】
ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴを用いた相同性検索の結果、この遺伝子は新規遺伝子であることが明らかになった。この遺伝子は、多くの癌精巣抗原と同様にＸ染色体上に存在し、ＯＲＦの長さは１８９６塩基で、推定６３１アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。アミノ酸配列にはＤＥＡＤ　ｂｏｘを有するドメインがあり、ＲＮＡ輸送に関与していることが示唆されている。
【００４３】
＜実施例２＞
本実施例では、進行メラノーマ患者の血清中に含まれる抗体に対する抗原をコードする遺伝子を単離することによって、ＫＵ−ＥＭ−１遺伝子をクローニングした。詳細な実験方法は実施例１と同様であるので、本実施例では実験方法の記述は省略する。
【００４４】
まず、樹状細胞療法後の進行メラノーマ患者３人の血清を混合し、プローブとして用いて、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約７５万クローンをスクリーニングし、９８の陽性クローンが得られ、塩基配列を決定した結果、２８の独立な遺伝子に由来していた。このうち、新規遺伝子は５個含まれており、そのうちクローンＭ３７は実施例１におけるＫＵ−ＥＭ−１と同一遺伝子に由来していることが明らかになった。
【００４５】
＜実施例３＞
癌精巣抗原に対しては、前記のように、癌患者の血清内に抗体が作られている場合がある。従って、癌精巣抗原ＫＵ−ＥＭ−１に対する抗体の存在が、癌の存在を示し、癌の診断につながると考えられる。
【００４６】
本実施例では、子宮体癌患者、メラノーマ患者、及び大腸癌患者の血清中に、ＫＵ−ＥＭ−１に対する抗体が存在するかどうかをファージによるタンパク質発現系及びウエスタン・ブロッティングを用いて調べた。
【００４７】
ファージによるタンパク質発現系を用いた方法の詳細は、ＳＥＲＥＸ法と同様であり、ＳＥＲＥＸ法は実施例１で述べたので、ここでは詳細な実験的手法の説明は省略する。実施例１で得られたＫＵ−ＥＭ−１を挿入配列として有し、そのタンパク質を発現できるファージクローンを、１０ｃｍ培養プレートあたり２５００プラークになるようにまき、ＫＵ−ＥＭ−１タンパク質をニトロセルロース・メンブレンに結合させる。このＫＵ−ＥＭ−１タンパク質を結合したメンブレンが癌の診断剤になりうる。すなわち、癌患者の血清を、そのメンブレンと反応させることにより、癌抗原を検出することができる。結果を表１に示す。子宮体癌患者では１８症例中１例、メラノーマ患者では２２例中２例、大腸癌患者では１３例中２例において、抗体が検出された。これに対し、健常人では、３６例中抗体を検出した例はなかった。
【００４８】
【表１】

【００４９】
次に、常法に従って、実施例１で得られたＫＵ−ＥＭ−１遺伝子を挿入配列として有し、ＫＵ−ＥＭ−１タンパク質をＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現させるための大腸菌発現ベクターを作製し、その融合タンパク質を大腸菌で発現させた。Ｈｉｓタグを利用して、ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）カラムを用いて精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製タンパクを電気泳動して、ニトロセルロース・メンブレンに結合させた。このＫＵ−ＥＭ−１タンパク質を結合したメンブレンが癌の診断剤になりうる。このメンブレンを用いて、癌患者の血清をプローブにしたウエスタン・ブロッティングを行った。表２に結果を示す。子宮体癌患者では４例中１例、メラノーマ患者では２例中２例において、抗体が検出された。しかも、ここで検出された患者は、ファージにおけるタンパク質発現系を用いて検出された患者と一致した。
【００５０】
【表２】

【００５１】
このように、患者血清内における、ＫＵ−ＥＭ−１タンパク質に対する抗体の検出方法が確立され、従って血清中におけるＫＵ−ＥＭ−１タンパク質に対する抗体の存在を調べることにより、癌の存在を検出することができる。検出方法については、上記以外でもＥＬＩＳＡ法などを用いてもよい。
【００５２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によると、癌の免疫療法に用いるためのポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換え細胞、免疫療法とその免疫療法に用いられる治療剤、及び癌の診断剤を提供することができる。
【００５３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べたＫＵ−ＥＭ−１の発現パターンを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to polynucleotides, polypeptides, recombinant cells, immunotherapy and therapeutic agents used for the immunotherapy, and diagnostic agents for cancer for use in cancer immunotherapy.
[0002]
[Prior art]
Currently, there are surgical treatment, chemotherapy, and radiation therapy as cancer treatments that are widely used, but the fourth treatment method is expected to be immunotherapy using the immune response inherent in the organism. Collecting. Immunity is induced against cancer antigens expressed in cancer cells, and the cancer cells are eliminated using the immune reaction. In fact, it has been shown that immunological exclusion occurs in melanoma (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
[0003]
As cancer antigens to be subjected to such immunotherapy, cancer and cancer-testis antigens that are expressed mainly in testis in normal tissues are particularly promising. Since cancer cells are originally formed by mutating their own cells, it is considered that the immune system usually does not react to proteins expressed by cancer cells. However, there are cells in the testis that do not express major histocompatibility complex (MHC) molecules, so proteins on such cells are not recognized by the immune system. Therefore, an immune reaction can be induced by introducing an antigen from the outside against a cancer testis antigen shared by cancer cells and testis, although it is a self-protein. In fact, a case where an antibody of a cancer testis antigen is present in the serum of a cancer patient is observed, but in that case, an immune reaction against the cancer is not so strong. Therefore, it is possible to develop an excellent method capable of attacking cancer cells by immune reaction by inducing a strong immune reaction against cancer testis antigen.
[0004]
When an immune response is induced, its initiation decision depends on dendritic cells as antigen presenting cells. There are two types of immune responses, cellular immunity caused by cytotoxic T cells and activated macrophages, and humoral immunity caused by antibody production. There are Th1 and Th2 as helper T cells that induce each reaction. Dendritic cells present antigens to these helper T cells to control differentiation induction of helper T cells. However, the immune response to cancer cells is weak due to the low expression level of cancer antigens in cancer cells or some escape mechanism from the immune system. Therefore, as a methodology of cancer immunotherapy, not only directly activates effector cells such as T cells, but also activates dendritic cells in vitro, presents cancer antigens, initiates an immune reaction, and then enters the body. Attempts have been made to return. In fact, in experiments using vertebrates other than humans, a high immune effect is obtained by administering dendritic cells into which antigen peptides or genes have been introduced.
[0005]
[Patent Document 1]
US Pat. No. 5,844,075
[0006]
[Patent Document 2]
US Pat. No. 5,994,523
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, such cancer immunotherapy has just begun, and not only useful cancer testis antigens but also available cancer antigens are not known.
Therefore, the present invention has been made for the purpose of providing a polynucleotide, a polypeptide, a recombinant cell, an immunotherapy and a therapeutic agent used for the immunotherapy, and a diagnostic agent for cancer for use in cancer immunotherapy. .
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The polynucleotide according to the present invention has any one of the following base sequences or a part thereof.
(A) The base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and have the same function as the protein encoded by SEQ ID NO: 1. A nucleotide sequence encoding a protein having It is desirable to encode proteins that are expressed primarily in cancer and testis.
(C) A base sequence complementary to SEQ ID NO: 1, that is, a base sequence complementary to (a).
(D) A base sequence complementary to SEQ ID NO: 1, wherein one or several bases are deleted, substituted, or added, that is, a base sequence complementary to (b). The complementary base sequence of this sequence is preferably a base sequence encoding a protein having a function equivalent to that of the protein encoded by SEQ ID NO: 1, and mainly encodes a protein expressed in cancer and testis. Is desirable.
[0009]
These polynucleotides may be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, or single-stranded RNA. In addition, it has a genetic polymorphism such as deletion, substitution, or addition of one or several bases, but it has the same amino acid sequence or is equivalent to the protein encoded by the original base sequence Functional polynucleotides are also within the scope of the present invention. In particular, the base sequences (a) and (b) and the complementary base sequences (c) and (d) more preferably encode a cancer testis antigen.
[0010]
The polypeptide according to the present invention includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Or having a partial amino acid sequence of these amino acid sequences (hereinafter referred to as the polypeptide). A polypeptide having a genetic polymorphism such as deletion, substitution, or addition of one or several amino acids, but having a function equivalent to that of the original protein is also within the scope of the present invention. In particular, the polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is expressed mainly in cancer cells and testis. Preferably, it is a cancer testis antigen.
[0011]
The recombinant cell according to the present invention is characterized in that a polynucleotide is introduced so as to express a polypeptide encoded by the polynucleotide. Further, a polynucleotide having a base sequence encoding the polypeptide may be introduced so as to express the polypeptide. In addition, the polynucleotide may be a fusion polynucleotide with a polynucleotide encoding a tag molecule. The recombinant cell may be any type of cell such as Escherichia coli, primary cultured cells, established cultured cells.
[0012]
Furthermore, the immunotherapy according to the present invention is an immunotherapy of cancer in vertebrates other than humans, comprising the step of inducing immunity in vivo against the antigen using the polypeptide as an antigen. To do. Moreover, it is the immunotherapy of the cancer in vertebrates other than a human, Comprising: You may include the step which uses the said polypeptide as an antigen and carries out immunity induction | guidance | derivation with respect to the antigen in vitro. The method may further comprise a step of immunizing effector cells against the antigen. The effector cell may be a T cell, but is not limited thereto, and may be an NKT cell or the like. The method may further include the step of presenting the antigen-presenting cell with the antigen. The antigen-presenting cell may be a dendritic cell, but is not limited thereto. These immunotherapy can also be applied to humans. Here, “immunity induction” refers to inducing an immune reaction, which may be in vivo or in vitro.
[0013]
Furthermore, the therapeutic agent according to the present invention is a therapeutic agent used for cancer immunotherapy, and is characterized by comprising the polypeptide. Moreover, it may be characterized by including the recombinant cell. Further, it may be characterized by comprising effector cells prepared in vitro and immunized with respect to the polypeptide. The effector cell may be a T cell. In addition, antigen-presenting cells prepared in vitro and presenting the polypeptide to T cells may be included. The antigen-presenting cell may be a dendritic cell.
[0014]
In addition, this therapeutic agent may further contain a pharmacologically acceptable excipient or base.
[0015]
Furthermore, the diagnostic agent for cancer according to the present invention is characterized by comprising the polypeptide.
[0016]
Furthermore, the diagnostic marker for cancer according to the present invention comprises an antibody against the polypeptide. In addition, the polynucleotide or the polypeptide may be included.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to examples. Regarding the experimental method, in the following description, J.I. Sambrook, E .; F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); M.M. Ausubel, R.A. Brent, R.A. E. Kingston, D.C. D. Moore, J.M. G. Seidman, J.M. A. Smith, K.M. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. A method described in a standard protocol collection such as the above, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
[0018]
The objects, features, advantages and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. . The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited thereto. Not what you want. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description given herein within the spirit and scope of the invention disclosed herein.
[0019]
For cancer testis antigens, as described above, antibodies may be produced in the serum of cancer patients. Therefore, it is expected that a gene encoding such a cancer testis antigen can be isolated by screening an expression library using an antibody present in the serum of a cancer patient. In fact, the cancer testis antigen KU-EM-1 gene used in the present invention contains antibodies against its product in the serum of patients with endometrial cancer. A λ phage expression library constructed from cDNA could be obtained by screening. In addition, the λ phage expression library constructed from human testis-derived cDNA was screened in parallel using the serum of patients with advanced melanoma, but the cancer testis antigen KU-EM-1 gene was used in this screening. Was also isolated independently. This suggests that the cancer testis antigen KU-EM-1 is a very promising clone in the immunotherapy of cancer in terms of immunogenicity.
[0020]
The KU-EM-1 peptide is synthesized in vitro using the cDNA encoding KU-EM-1 thus obtained. As a synthesis method, a polynucleotide containing the full length or a part of KU-EM-1 cDNA fused with a nucleotide tag encoding a His tag or the like is inserted into an appropriate expression vector such as having an appropriate enhancer / promoter for the cell to be introduced. The tag fusion peptide expressed by introducing this KU-EM-1 tag fusion peptide expression vector into Escherichia coli, cultured mammalian cells, cultured insect cells, etc., can be purified using the tag, or in vitro transcription. KU-EM-1 cDNA full-length or a part is transcribed in the system, and the tag fusion KU-EM-1 peptide is expressed using an in vitro translation system using a rabbit reticulocyte extract or Escherichia coli S30 extract. There is a method of purifying a fusion peptide using a tag. In the tag fusion peptide, the tag may be removed at the final stage, and only the KU-EM-1 peptide may be purified by HPLC or the like. Here, the KU-EM-1 peptide may not include the entire protein length or may be a partial peptide. Moreover, the mixture of the some peptide corresponding to a different part among proteins may be sufficient.
[0021]
Using the purified KU-EM-1 peptide thus prepared, the immune reaction against KU-EM-1 is activated in vivo using the following method. Thereby, KU-EM-1 can be used for the treatment of cancer as a therapeutic agent in the immunotherapy of cancer. Here, instead of the purified peptide, a cell (hereinafter referred to as a recombinant cell) in which the full length or part of the KU-EM-1 cDNA is introduced by electroporation and expressed may be used. This recombinant cell is preferably a patient's own cell in order to suppress immunogenicity other than KU-EM-1.
[0022]
(1) Administration of cancer testis antigen peptide or recombinant cells
This is a method in which purified KU-EM-1 peptide is directly injected into cancer patients. Cancer testis antigen KU-EM-1 is observed only in the testis in cancer tissues and normal tissues, and antibodies against KU-EM-1 are detected in the serum of certain cancer patients. It is considered that the purified KU-EM-1 peptide is not recognized as a self protein and has high antigenicity. At this time, the purified KU-EM-1 peptide is modified with a helper epitope such as KLH or tetanus toxoid, hsp (heat shock protein), cholesterol polysaccharide, etc., or injected together with Freud's incomplete adjuvant or synthetic adjuvant. For example, an operation for further enhancing the immunogenicity of the KU-EM-1 peptide may be performed. Further, the KU-EM-1 peptide may be bound to a carrier such as a bead.
Alternatively, KU-EM-1 recombinant cells may be injected. In this recombinant cell, in order to enhance immunogenicity, it is preferably expressed outside the cell by being expressed in a state of being bound to a membrane or flagella.
[0023]
As another method, in order to produce KU-EM-1 peptide in the body instead of directly administering protein or peptide, a bacterium or virus having an expression vector of KU-EM-1 peptide is administered to a patient. Also good. At this time, it is preferable to detoxify bacteria and viruses. In addition, an KU-EM-1 peptide expression vector is incorporated into a retrovirus or adenovirus that has been infected but not replicated, and the patient is infected to express the KU-EM-1 peptide in the body. May be.
[0024]
Thus, when the KU-EM-1 peptide is introduced into the body, the immune system in the body recognizes the KU-EM-1 peptide as a heterologous protein and induces an immune reaction against the KU-EM-1 peptide. Is done. The immune response thus induced attacks cancer cells expressing KU-EM-1.
[0025]
(2) Administration of in vitro antigen-stimulated T cells
As one of the immunotherapy using T cells, there is a passive immunization method in which T cells that become anticancer effector cells outside the body are increased and administered. Here, a method of expanding T cells that recognize cancer antigens outside the body and returning them to the patient's body is taken as an example.
[0026]
A leukocyte fraction is collected from a patient's peripheral blood using a leukocyte component collecting device, and purified KU-EM-1 protein is added and cultured. After 24 hours, IL-2 is added to the container and further cultured for 6 days. Seven days after the start of the culture, the floating cells in the container are collected and stimulated for further activation with a solid-phased anti-CD3 antibody for 2 days. Next, it is cultured for 5 days in a floating state in a culture solution containing IL-2 and allowed to proliferate. Thus, after KU-EM-1 which is a cancer testis antigen is presented and subjected to activation stimulation, T cells that have proliferated and have grown to billions are injected into a patient's vein or artery.
[0027]
The T cells to be injected may be injected after selecting T cells having high affinity for KU-EM-1 in advance by the limiting dilution method or the HLA tetramer method.
[0028]
(3) Administration of in vitro antigen-stimulated dendritic cells
Recently, it has become clear that dendritic cells are powerful antigen-presenting cells that present and activate T cells. Therefore, the cancer testis antigen is presented in vivo in a state where the cancer testis antigen is presented to the cells in vitro, so that the cancer testis antigen is presented to the T cells in vivo, and an immune response to the cancer testis antigen is induced. Immunotherapy is beginning to take place. This system is applied to cancer immunotherapy using KU-EM-1.
[0029]
A leukocyte fraction is collected from the peripheral blood of a patient using a leukocyte component collecting device and cultured in a container for 2 hours. After collecting the suspension in the container, a new culture solution is injected, and the cells (monocytes) adhering to the bottom of the container are cultured using GM-CSF and IL-4. After culturing for 6 days to induce immature dendritic cells, all the cells (floating cells and adherent cells) are recovered, and after the purified cells are mixed with purified KU-EM-1 protein, TNF-α, IL-1 and CD40 ligand are added and cultured for an additional 18 hours to induce mature dendritic cells. After all the cells have been collected and washed again, they are suspended in physiological saline and 5 × 10 5 ⁷ Dendritic cells were injected subcutaneously at 0.2 cc on both sides of the thigh, totaling 1 x 10 ⁸ One dose is administered.
[0030]
Although monocyte-derived dendritic cells are used here, dendritic cells derived from different origins such as CD34-positive hematopoietic progenitor cell-derived dendritic cells may be used. However, monocyte-derived dendritic cells are preferred because a large amount of dendritic cells can be obtained relatively easily.
[0031]
In addition, when cancer antigens are added to immature dendritic cells, it is preferable to use immature dendritic cells as in this case when proteins or RNA that require antigen processing are incorporated, for example, sensitize peptides. In such a case, mature dendritic cells or dendritic cells activated by CD40L or the like may be used.
[0032]
In addition, purified protein was added to immature dendritic cells as they were, and methods for presenting antigens to dendritic cells include methods of phagocytosing cancer testis antigens in particle size and dendritic cells, and endocytosis. Method of incorporating cancer testis antigen into dendritic cells via the receptor used, method of gene expression of cancer antigen expression vector into dendritic cells, transcription of cancer antigen in vitro, and introduction of obtained RNA Various methods are possible, such as a method for cell fusion, a method for fusing a cell expressing a cancer antigen and a dendritic cell, and any method may be used.
[0033]
The dendritic cells to be administered may be immature cells, but mature cells are preferred because mature cells have stronger activity for T cell activation.
[0034]
On the other hand, the antibody of cancer testis antigen KU-EM-1 has been detected in the serum of cancer patients. Therefore, if there is an antibody against KU-EM-1 in the patient serum, the patient can be diagnosed as having cancer. Moreover, as shown in FIG. 1, the expression of KU-EM-1 can be detected only in testis in normal tissues, but in cancer cells, it is clear that it is expressed in a wide range of cancer types regardless of origin. Became. Therefore, it is possible to examine the presence or absence of cancer cells by collecting a part of a tissue suspected of carcinogenesis from a patient and examining the expression of KU-EM-1. In this case, the expression marker for cancer cells may be KU-EM-1 RNA or protein. In the case of RNA, it may be Northern blotting or in situ hybridization. In the case of protein, it may be Western blotting or immunohistological. The expression of KU-EM-1 can be detected by staining or the like.
Examples of the present invention will be described in detail below.
[0035]
<Example 1>
In this example, the KU-EM-1 gene was cloned by isolating a gene encoding an antigen against an antibody contained in the serum of a human endometrial cancer patient by the SEREX method.
[0036]
First, endometrial cancer cell lines, HecIb (established by Kitasato University School of Medicine, Kuramoto et al., Provided to Keio University School of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology), SNGII (established by the inventors), Ishikawa strain (Tsukuba University School of Medicine, Nishida et al. , Provided to Keio University School of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology), was cultured in F-12 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), and total RNA was extracted by guanidine-cesium chloride density gradient centrifugation. Equal amounts of total RNA isolated from each cell line were mixed, and the polyA was isolated from the total RNA using Oligotex-dT30super (trade name of TAKARA). ⁺ RNA was isolated. 5 μg poly A ⁺ From the RNA, a λ phage library was prepared using a λZAP Express cDNA library kit (trade name of Stratagene). The library size before amplification is 2.5 × 10 ⁶ pfu.
[0037]
For 18 samples of endometrial cancer patient serum (KKS1 to KKS18) as a probe, preabsorption was performed using Escherichia coli and phage in order to suppress non-specific signals to Escherichia coli and phage. First, serum and E. coli extract are mixed, allowed to stand at room temperature for 4 hours and then centrifuged, and the supernatant is collected and TBST-SM (TBST containing 5% skim milk) is finally diluted to 100-fold. added. Next, a nitrocellulose membrane was prepared for plaques formed by λ phage having no foreign inserts, and washed twice with TBST (TBS containing 0.05% Tween 20) in the same manner as in library screening. Blocked with SM. After the serum treated with the E. coli extract was added and allowed to stand for 4 hours, the serum was collected and used in the subsequent experiments.
Using the host E. coli XL1-Blue MRF ′, spreading the prepared library on NZY medium to form plaques and placing a nitrocellulose membrane soaked with IPTG, while inducing the expression of phage insert, The expressed protein was blotted on a membrane. Pretreated serum was added to the membrane blotted library and allowed to stand for 4 hours. After the membrane was washed 3 times with TBST, alkaline phosphatase-labeled anti-human FcγIgG antibody was added so that the final dilution was 4000 times, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with TBST, it was washed twice with TBS (10 mM Tris pH 7.5-150 mM NaOH), nitroblue tetrazolium (a product of Roche), which is a substrate for alkaline phosphatase, and bromo-4-chloro-3- Color was developed using indolyl-phosphoric acid (a product of Sigma-Aldrich). Secondary screening was similarly performed on the obtained positive plaques to remove false positive plaques. The final positive phage clone was amplified by PCR using T3 primer and T7 primer under conditions of 94 ° C 1 min-55 ° C 1 min-72 ° C 2 min 35 cycles. After purifying the PCR product, the base sequence of the inserted DNA was determined.
[0038]
The base sequences of the primers are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing, respectively.
T3 primer: AATTAACCCTCACTAAAGGG [SEQ ID NO: 3]
T7 primer: GTAATACGACTCACTATAGGGC [SEQ ID NO: 4]
[0039]
When using serum mixed with equal amounts of serum KKS1 to KKS3 as a probe, about 1 million clones were screened. As a result, 24 positive clones were obtained and the nucleotide sequence was determined. It was revealed that it originated from a gene. When serum KKS4 to KKS7 were used independently as probes, 171 positive clones were obtained from a total of about 4 million clones, and finally derived from 65 independent genes.
[0040]
RT-PCR was performed on each clone, and the expression in normal tissues and various cancer cells was examined. As shown in FIG. 1, in normal tissues, expression was detected only in the testis, and extensive expression was observed in cancer cell lines. Observed KU-EM-1 was identified. For the KU-EM-1 gene, a specific primer pair (S primer and AS primer) is used, and a cycle of 94 ° C. 30 seconds-56 ° C. 30 seconds-72 ° C. 2 minutes is performed 35 cycles. PCR was carried out under the conditions.
[0041]
The base sequences of the primers are shown in SEQ ID Nos. 5 and 6 in the sequence listing, respectively.
S primer: CTTCCAACCGTATTGTAGCGAG [SEQ ID NO: 5]
AS primer: CTCCTTGCGTCTTTTCCAGGT [SEQ ID NO: 6]
[0042]
Homology search using NCBI BLAST revealed that this gene is a novel gene. This gene, like many cancer testis antigens, is present on the X chromosome, has an ORF length of 1896 bases, and encodes a polypeptide consisting of a putative 631 amino acid. The amino acid sequence has a domain with a DEAD box, which is suggested to be involved in RNA transport.
[0043]
<Example 2>
In this example, the KU-EM-1 gene was cloned by isolating the gene encoding the antigen against the antibody contained in the serum of patients with advanced melanoma. Since the detailed experimental method is the same as in Example 1, the description of the experimental method is omitted in this example.
[0044]
First, sera from three patients with advanced melanoma after dendritic cell therapy were mixed and used as a probe to screen a human testis cDNA library. About 750,000 clones were screened and 98 positive clones were obtained. As a result of determining the nucleotide sequence, they were derived from 28 independent genes. Of these, five new genes were included, and it was revealed that clone M37 was derived from the same gene as KU-EM-1 in Example 1.
[0045]
<Example 3>
For cancer testis antigens, as described above, antibodies may be produced in the serum of cancer patients. Therefore, the presence of an antibody against the cancer testis antigen KU-EM-1 indicates the presence of cancer and is thought to lead to the diagnosis of cancer.
[0046]
In this example, the presence of an antibody against KU-EM-1 in the serum of endometrial cancer patients, melanoma patients, and colorectal cancer patients was examined using a protein expression system using phage and Western blotting.
[0047]
The details of the method using the protein expression system by phage are the same as the SEREX method, and since the SEREX method has been described in Example 1, detailed description of the experimental method is omitted here. A phage clone having the KU-EM-1 obtained in Example 1 as an insert sequence and capable of expressing the protein was seeded at 2500 plaques per 10 cm culture plate, and the KU-EM-1 protein was nitrocellulose. Bind to membrane. The membrane bound with this KU-EM-1 protein can be a diagnostic agent for cancer. That is, a cancer antigen can be detected by reacting the serum of a cancer patient with the membrane. The results are shown in Table 1. Antibodies were detected in 1 out of 18 cases in endometrial cancer patients, 2 out of 22 cases in melanoma patients, and 2 out of 13 cases in colorectal cancer patients. On the other hand, in healthy people, no antibody was detected in 36 cases.
[0048]
[Table 1]

[0049]
Next, according to a conventional method, an E. coli expression vector having the KU-EM-1 gene obtained in Example 1 as an insertion sequence and expressing the KU-EM-1 protein as a fusion protein with a His tag is prepared. The fusion protein was expressed in E. coli. After purification using an NTA (Nitritriacetic acid) column using a His tag, the purified protein was electrophoresed by SDS-PAGE and bound to a nitrocellulose membrane. The membrane bound with this KU-EM-1 protein can be a diagnostic agent for cancer. Using this membrane, Western blotting was performed using the serum of a cancer patient as a probe. Table 2 shows the results. Antibody was detected in 1 of 4 patients with endometrial cancer and in 2 of 2 patients with melanoma. Moreover, the patients detected here were consistent with those detected using the protein expression system in phage.
[0050]
[Table 2]

[0051]
Thus, a method for detecting antibodies to KU-EM-1 protein in patient sera has been established, thus detecting the presence of cancer by examining the presence of antibodies to KU-EM-1 protein in the serum. Can do. As for the detection method, an ELISA method or the like may be used in addition to the above.
[0052]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is possible to provide a polynucleotide, a polypeptide, a recombinant cell, an immunotherapy and a therapeutic agent used for the immunotherapy, and a diagnostic agent for cancer for use in cancer immunotherapy. it can.
[0053]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the expression pattern of KU-EM-1 examined using RT-PCR in Example 1 of the present invention.

Claims

A polynucleotide having any one of the following base sequences or a part thereof.
(A) The base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(C) a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1.
(D) A base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1.

The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, or a part of the amino acid sequence Polypeptide.

A recombinant cell into which the polynucleotide has been introduced so as to express the polypeptide encoded by the polynucleotide according to claim 1.

A recombinant cell into which a polynucleotide having a base sequence encoding the polypeptide is introduced so as to express the polypeptide according to claim 2.

The recombinant cell according to claim 3 or 4, wherein the polynucleotide is a fusion polynucleotide with a nucleotide encoding a molecular tag.

An immunotherapy for cancer in vertebrates other than humans, comprising the step of inducing immunity in vivo against the antigen using the polypeptide according to claim 2 as an antigen.

An immunotherapy for cancer in vertebrates other than humans, comprising the step of inducing immunity in vitro against the antigen using the polypeptide according to claim 2 as an antigen.

8. The immunotherapy according to claim 7, further comprising the step of immunizing effector cells against the antigen.

The immunotherapy according to claim 8, wherein the effector cells are T cells.

The immunotherapy according to claim 7, further comprising the step of presenting the antigen-presenting cell with the antigen.

The immunotherapy according to claim 10, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell.

A therapeutic agent used for immunotherapy of cancer, comprising the polypeptide according to claim 2.

The therapeutic agent used for the immunotherapy of cancer, Comprising: The therapeutic agent characterized by including the recombinant cell of Claim 3 or 4.

A therapeutic agent used for immunotherapy of cancer, comprising an effector cell prepared in vitro and immunized with respect to the polypeptide according to claim 2.

The therapeutic agent according to claim 14, wherein the effector cell is a T cell.

A therapeutic agent used for immunotherapy of cancer, comprising an antigen-presenting cell prepared ex vivo and presenting the polypeptide of claim 2 to a T cell.

The therapeutic agent according to claim 16, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell.

A diagnostic agent for cancer comprising the polypeptide according to claim 2.

A marker for diagnosing cancer, comprising an antibody against the polypeptide according to claim 2.

A cancer diagnostic marker comprising the polynucleotide according to claim 1 or the polypeptide according to claim 2.