【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便かつ特異性に優れた変形性関節症の検定方法、及び、上記方法を行うための検定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、症状として関節炎が観察される疾患には、変形性関節症（以下、ＯＡともいう）、関節リウマチ（以下、ＲＡともいう）、全身性エリテマトーデス（以下、ＳＬＥともいう）等があるが、このうち、変形性関節症は、関節軟骨の変性、骨辺縁の肥厚及び滑膜の変化を特徴とする、主として加齢とともに発生する変形関節疾患である。変形性関節症は、一般に加齢や荷重、又は、遺伝的素因による軟骨の変性としてとらえられている。しかし、組織学的には滑膜炎を有し、滑膜表層細胞の増生が観察される等、炎症、即ち、免疫反応も関与している可能性も示唆されている。
しかしながら、全身性炎症反応はむしろ弱く、血液を用いた有用な免疫学的検査はこれまで存在しなかった。
そのため、変形性関節症をより簡便にかつ特異的に測定することのできる検定方法が望まれていた。
【０００３】
一方、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）は、解糖系においてＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）とジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）との可逆的な異性化を触媒する酵素として知られている。非特許文献１には、関節リウマチ罹患者の滑液におけるＴＰＩの活性が著しく上昇することが開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ａｎｏｎ． Ａｂｓｔｒａｃｔａ． ＸＩＩ． Ｃｏｎｇｒｅｓｓｕｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉｃｕｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｓ， １４（１９６９）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の現状に鑑みて、変形性関節症を簡便かつ特異的に検定するための方法、及び、それを実施するための検定キットを提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自己抗原としてＴＰＩに着目し、これと変形性関節症との関連性を鋭意研究した結果、驚くべきことに、血液中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度と変形性関節症とのあいだに相関性があること、及び、変形性関節症と同様に関節炎を１症状とする関節リウマチや全身性エリテマトーデスにおいてはこのような相関性はないことを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、血液検体中における抗ＴＰＩ自己抗体の濃度を測定することからなる変形性関節症の検定方法である。
また、本発明は、上記検定方法を行うための変形性関節症検定キットでもある。更に、本発明は、検体ドナーから採取した血液検体をＴＰＩと反応させることからなる抗ＴＰＩ自己抗体濃度の測定方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
【０００７】
本発明においては、血液検体中の抗ＴＰＩ自己抗体の濃度を測定することによって、変形性関節症を検定することができる。すなわち、血液を注射器等によって採取し、この血液検体を用いて抗ＴＰＩ自己抗体の濃度を測定することによって変形性関節症を検定する。
上記血液検体としては、血液から遠心分離操作等を行い分離した血清を用いてもよい。血清を用いることにより非特異的な反応を抑制し、より精度良く検定を行うことができる。
【０００８】
本発明の検定方法においては、検体ドナーから採取した血液検体中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定した後、これを、健常な血液中の標準的な抗ＴＰＩ自己抗体濃度、又は、変形性関節症を患っている患者の血液中の特異な抗ＴＰＩ自己抗体濃度と比較することにより、上記血液検体を提供した検体ドナーが変形性関節症を患っている可能性が高い否かを検定することができる。
抗ＴＰＩ自己抗体濃度によって変形性関節症を検定するにあたっては、抗ＴＰＩ自己抗体の濃度が高いほど変形性関節症の可能性が高いと検定することができる。
【０００９】
抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定するための手段としては特に限定されないが、抗原抗体反応を利用して抗ＴＰＩ自己抗体を検出する方法を挙げることができる。この場合、血液中に存在する抗ＴＰＩ自己抗体と特異的に結合するＴＰＩを使用することができる。
上記ＴＰＩとしては、組み換えＴＰＩを使用してもよい。上記組み換えＴＰＩとしては、例えば、固相との結合能を有するものが好適に使用でき、このようなものとしては、固相との結合能を有する蛋白とＴＰＩとの融合蛋白等を挙げることができる。
【００１０】
本発明において抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定する手段としては、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
ＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定する場合には、公知のＥＬＩＳＡ法を用いることができる。具体的には、ポリスチレン等の固相にＴＰＩを結合させ、そこに血液検体を添加し、酵素標識抗体を反応させて可視化することにより、固相に結合した酵素活性を測定する。これによって検体中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定することができる。
【００１１】
本発明の変形性関節症の検定方法の適用範囲としては特に限定されず、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス等の哺乳動物を挙げることができるが、特にヒトに対して好ましく適用される。
【００１２】
本発明は、上記検定方法を実施するための検定キットでもある。
本発明の検定キットの態様は、本発明の検定方法を簡便に実施するための検定キットであれば特に限定されない。具体的には、血液中に含まれる抗ＴＰＩ自己抗体と特異的に結合するＴＰＩを含有し、抗原抗体反応を利用して血液中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定できる検定キットが好ましい。
上記検定キットとしては、血液中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定することを可能にするＴＰＩや器材等を少なくとも１種含んでいればよく、特に、抗ＴＰＩ自己抗体濃度の測定にあたってＥＬＩＳＡ法を利用する場合には、ＴＰＩを固定化した担体等が挙げられる。
【００１３】
また、本発明は、検体ドナーから採取した血液検体をＴＰＩと反応させることからなる、抗ＴＰＩ自己抗体濃度の測定方法でもある。上記反応にあたっては、上述のように、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
【００１４】
抗ＴＰＩ自己抗体濃度の測定にあたっては、ＴＰＩを固相に結合させる工程を含むことが好ましい。ＴＰＩを固相に結合させるには、上記固相との結合能を有する蛋白とＴＰＩとの融合蛋白を使用することが好ましい。
【００１５】
【実施例】
以下に試験例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら試験例のみに限定されるものではない。
【００１６】
（試験例１）血液中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度の測定
（１）組み換えＴＰＩの作成
ＴＰＩの遺伝子を軟骨細胞由来のｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。ＴＰＩの遺伝子増幅に使用したプライマーの配列は図１に示すとおりである。増幅した遺伝子は大腸菌用の蛋白発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（ＮＥＢ社製）にヒスチジンタグをコードする遺伝子と共に挿入し、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）との融合蛋白（ＭＢＰ−ＴＰＩ融合蛋白）として発現させた。精製はＮｉ−ＮＴＡをキレートしたカラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐキレーティングカラム、アマシャム社製）を用い、ヒスチジンタグとの親和性を利用して行った。
【００１７】
（２）ＥＬＩＳＡ法による抗ＴＰＩ自己抗体の検出
９６穴プレートを上記で生成したＭＢＰ−ＴＰＩ融合蛋白とコントロールとして同様に精製したＭＢＰ単独蛋白１０μｇ／ウェルでコートし、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、５００倍に希釈した血清サンプルを反応させた。洗浄後、ＴＰＩに反応した抗体を抗ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（ザイメット社製）と反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンを基質とし加え発色させた。ＭＢＰ−ＴＰＩ融合蛋白に対するＯＤ値からＭＢＰ単独蛋白に対するＯＤ値を差し引いたものをＴＰＩに対するＯＤ値とし、以下の式に従い、ユニット表示し、健常人の平均ＯＤ値に標準偏差の３倍を加えたＯＤ値（１００ユニット）以上を陽性とした。
結合ユニット＝［検体のＯＤ値／（健常人の平均ＯＤ値＋健常人のＯＤ値の標準偏差の３倍）］×１００
【００１８】
上記のＥＬＩＳＡ法による検定は、ＯＡ６１検体、ＲＡ５４検体、ＳＬＥ４３検体、健常人９４検体に対して行った。結果を図２に示した。
この結果から、抗ＴＰＩ自己抗体濃度は、変形性関節症を患う患者の２０％に認められるが、関節リウマチの罹患者、全身性エリテマトーデスの罹患者では５〜６％であり、抗ＴＰＩ自己抗体が変形性関節症に特異性の高い自己抗体であることがわかった。以上によって、血清中の抗ＴＰＩ自己抗体濃度を測定することにより変形性関節症を検定できることが明らかとなった。
【００１９】
（試験例２）軟骨細胞におけるＴＰＩの発現
２４時間１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで刺激した軟骨細胞と、刺激していない軟骨細胞とから、それぞれＲＮＡを調製しＲＴ−ＰＣＲで増幅した。コントロールとしてアクチンの遺伝子を同様に増幅した。増幅に用いたプライマーの配列はＴＰＩについては図３に示し、β−ａｃｔｉｎについては図４に示した。増幅は９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分を２５サイクル行った。増幅させた遺伝子はアガロースゲル電気泳動で分離し、ＥｔＢｒ染色を施した後、ＵＶで検出した。結果を図５に示した。
【００２０】
ＩＬ−１βはＯＡ軟骨細胞の病態に関与していることが知られているが、この結果から、ＴＰＩの遺伝子発現はＩＬ−１βによって増加することが示され、これにより、ＴＰＩはＯＡの病態に関与していることが示唆された。
【００２１】
【発明の効果】
本発明は、上述のような構成を有するので、血液検体を用いて簡便かつ特異的に変形性関節症を検定することができる検定方法及び検定キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１においてＴＰＩ遺伝子の増幅に使用したプライマーの配列を示す図である。
【図２】試験例１におけるＥＬＩＳＡ法による抗ＴＰＩ自己抗体の検定結果を示す図である。
【図３】試験例２においてＴＰＩ遺伝子の増幅に使用したプライマーの配列を示す図である。
【図４】試験例２においてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅に使用したプライマーの配列を示す図である。
【図５】ＩＬ−１βによるＴＰＩの遺伝子発現の促進効果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a simple and highly specific method for assaying osteoarthritis, and an assay kit for performing the method.
[0002]
[Prior art]
In general, diseases in which arthritis is observed as symptoms include osteoarthritis (hereinafter also referred to as OA), rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as RA), systemic lupus erythematosus (hereinafter also referred to as SLE), and the like. Among them, osteoarthritis is a osteoarthritis mainly occurring with aging, characterized by degeneration of articular cartilage, hypertrophy of bone margins, and changes in synovium. Osteoarthritis is generally regarded as degeneration of cartilage due to aging, load, or genetic predisposition. However, histologically, it has synovitis and the proliferation of synovial lining cells is observed, suggesting that inflammation, that is, the possibility of immune response may also be involved.
However, the systemic inflammatory response is rather weak, and there has been no useful immunological test using blood.
Therefore, an assay method capable of more simply and specifically measuring osteoarthritis has been desired.
[0003]
On the other hand, triose phosphate isomerase (TPI) is an enzyme that catalyzes the reversible isomerization of D-glyceraldehyde-3-phosphate (G-3-P) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP) in a glycolysis system. Also known as Non-Patent Document 1 discloses that the activity of TPI in synovial fluid of a patient suffering from rheumatoid arthritis is significantly increased.
[0004]
[Non-patent document 1]
Anon. Abstracta. XII. Congressus Rheumatologicus Internationalis, 14 (1969)
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for simply and specifically assaying for osteoarthritis, and an assay kit for performing the same, in view of the above-mentioned situation.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have focused on TPI as a self-antigen, and as a result of diligently studying the relationship between TPI and osteoarthritis, surprisingly, it was found that the anti-TPI autoantibody concentration in blood The present inventors have found that there is a correlation between them, and that there is no such correlation in rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus, which has one symptom of arthritis as in osteoarthritis, and has reached the present invention.
That is, the present invention is a method for assaying osteoarthritis, which comprises measuring the concentration of an anti-TPI autoantibody in a blood sample.
The present invention is also an osteoarthritis assay kit for performing the above assay method. Furthermore, the present invention is also a method for measuring an anti-TPI autoantibody concentration, which comprises reacting a blood sample collected from a sample donor with TPI.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0007]
In the present invention, osteoarthritis can be assayed by measuring the concentration of anti-TPI autoantibody in a blood sample. That is, blood is collected using a syringe or the like, and osteoarthritis is assayed by measuring the concentration of anti-TPI autoantibody using this blood sample.
As the blood sample, serum separated from blood by centrifugation or the like may be used. By using serum, non-specific reactions can be suppressed, and the assay can be performed more accurately.
[0008]
In the assay method of the present invention, after measuring the anti-TPI autoantibody concentration in a blood sample collected from a sample donor, the concentration is determined as the standard anti-TPI autoantibody concentration in healthy blood or osteoarthritis. By comparing with the specific anti-TPI autoantibody concentration in the blood of a patient suffering from the above, it is possible to test whether or not the sample donor who provided the blood sample is highly likely to have osteoarthritis. it can.
When assaying osteoarthritis by anti-TPI autoantibody concentration, it can be determined that the higher the anti-TPI autoantibody concentration, the higher the possibility of osteoarthritis.
[0009]
Means for measuring the anti-TPI autoantibody concentration is not particularly limited, and examples thereof include a method for detecting an anti-TPI autoantibody using an antigen-antibody reaction. In this case, a TPI that specifically binds to an anti-TPI autoantibody present in blood can be used.
As the TPI, a recombinant TPI may be used. As the above-mentioned recombinant TPI, for example, those having the ability to bind to a solid phase can be suitably used, such as a fusion protein of a protein having the ability to bind to a solid phase and TPI. it can.
[0010]
In the present invention, ELISA is preferable as a means for measuring the anti-TPI autoantibody concentration.
When the anti-TPI autoantibody concentration is measured using the ELISA method, a known ELISA method can be used. Specifically, TPI is bound to a solid phase such as polystyrene, a blood sample is added thereto, and an enzyme-labeled antibody is reacted and visualized to measure the activity of the enzyme bound to the solid phase. Thereby, the anti-TPI autoantibody concentration in the sample can be measured.
[0011]
The scope of application of the method for assaying osteoarthritis of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, pigs, rats, and mice. It is preferably applied.
[0012]
The present invention is also an assay kit for performing the above assay method.
The embodiment of the assay kit of the present invention is not particularly limited as long as it is an assay kit for easily performing the assay method of the present invention. Specifically, an assay kit containing TPI that specifically binds to anti-TPI autoantibodies contained in blood and capable of measuring the concentration of anti-TPI autoantibodies in blood using an antigen-antibody reaction is preferable.
The above-mentioned assay kit only needs to contain at least one kind of TPI, equipment, and the like that enable measurement of anti-TPI autoantibody concentration in blood. In particular, the ELISA method is used for measuring anti-TPI autoantibody concentration. In this case, a carrier on which TPI is immobilized may be used.
[0013]
The present invention is also a method for measuring an anti-TPI autoantibody concentration, which comprises reacting a blood sample collected from a sample donor with TPI. In the above reaction, an ELISA method can be used as described above.
[0014]
The measurement of the anti-TPI autoantibody concentration preferably includes a step of binding TPI to a solid phase. In order to bind TPI to a solid phase, it is preferable to use a fusion protein of TPI and a protein capable of binding to the solid phase.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Test Examples, but the present invention is not limited to only these Test Examples.
[0016]
(Test Example 1) Measurement of anti-TPI autoantibody concentration in blood (1) Preparation of recombinant TPI The TPI gene was amplified from chondrocyte-derived mRNA by RT-PCR. The sequences of the primers used for TPI gene amplification are as shown in FIG. The amplified gene was inserted into a protein expression vector pMAL-c for Escherichia coli (manufactured by NEB) together with a gene encoding a histidine tag, and expressed as a fusion protein with maltose binding protein (MBP) (MBP-TPI fusion protein). . Purification was carried out using a column in which Ni-NTA was chelated (Hi-Trap chelating column, manufactured by Amersham) and utilizing the affinity with the histidine tag.
[0017]
(2) Detection of anti-TPI autoantibody by ELISA method A 96-well plate was coated with the MBP-TPI fusion protein generated above and 10 μg / well of MBP-only protein similarly purified as a control, and blocked with PBS containing 1% BSA. Thereafter, a serum sample diluted 500-fold was reacted. After washing, an antibody reacted with TPI was reacted with an anti-peroxidase-labeled human IgG antibody (manufactured by Zymet), and color was added by adding o-phenylenediamine as a substrate. The value obtained by subtracting the OD value for MBP-only protein from the OD value for MBP-TPI fusion protein was defined as the OD value for TPI, expressed in units according to the following formula, and three times the standard deviation was added to the average OD value of healthy subjects. An OD value (100 units) or more was defined as positive.
Binding unit = [OD value of sample / (average OD value of healthy person + 3 times standard deviation of OD value of healthy person)] × 100
[0018]
The above-described ELISA test was performed on 61 OA samples, 54 RA samples, 43 SLE samples, and 94 healthy subjects. The results are shown in FIG.
From these results, the anti-TPI autoantibody concentration was found in 20% of patients suffering from osteoarthritis, but was 5-6% in patients suffering from rheumatoid arthritis and those suffering from systemic lupus erythematosus. Is an autoantibody with high specificity for osteoarthritis. From the above, it became clear that osteoarthritis can be assayed by measuring the anti-TPI autoantibody concentration in serum.
[0019]
(Test Example 2) Expression of TPI in chondrocytes RNA was prepared from chondrocytes stimulated with 100 ng / ml IL-1β for 24 hours and chondrocytes not stimulated, and amplified by RT-PCR. As a control, the actin gene was similarly amplified. The sequences of the primers used for amplification are shown in FIG. 3 for TPI and in FIG. 4 for β-actin. Amplification was performed at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute for 25 cycles. The amplified genes were separated by agarose gel electrophoresis, subjected to EtBr staining, and detected by UV. The results are shown in FIG.
[0020]
Although IL-1β is known to be involved in the pathology of OA chondrocytes, the results indicate that TPI gene expression is increased by IL-1β, whereby TPI is expressed in the pathology of OA. Was suggested to be involved.
[0021]
【The invention's effect】
Since the present invention has the above-described configuration, it is possible to provide an assay method and an assay kit that can easily and specifically assay for osteoarthritis using a blood sample.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the sequences of primers used for amplification of a TPI gene in Test Example 1.
FIG. 2 shows the results of assaying anti-TPI autoantibodies by ELISA in Test Example 1.
FIG. 3 is a view showing the sequences of primers used for amplification of a TPI gene in Test Example 2.
FIG. 4 is a diagram showing the sequences of primers used for amplifying the β-actin gene in Test Example 2.
FIG. 5 is a graph showing the effect of IL-1β to promote TPI gene expression.
