【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多種類の蛋白質を分離精製してアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定方法並びに蛋白質同定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質の同定には、通常、ペプチドマスフィンガープリンティング法（ＰＭＦ法）が用いられる。ＰＭＦ法とは、二次元電気泳動（２−ＤＥ）で分離した蛋白質をゲル中でプロテアーゼ分解し、分解物を質量分析装置で分析し、その結果得られた質量スペクトル（ペプチドマスフィンガープリント）をＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較することにより、タンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する方法である。２−ＤＥは蛋白質の分離精製を行う手法であり、第一段目の分離手段（一次元目の電気泳動）として等電点ゲル電気泳動で蛋白質を等電点のグループ毎に分離し、第二段目の分離手段（二次元目の電気泳動）としてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分子量分離する。２−ＤＥは非常に分離能が高いものの、一次元目の電気泳動に約１７時間、二次元目の電気泳動に数時間、合計約２０時間もの時間を要する問題がある。
【０００３】
上記問題の解決法としては、例えば、一次元目の電気泳動としてフリーフロー電気泳動を用いた報告がなされている（例えば、［非特許文献１］を参照）。フリーフロー電気泳動を用いることで、一次元目の電気泳動に要する時間を１．５時間に短縮した。ここに、フリ−フロー電気泳動とは、２枚の板に挟まれて構成された液体流路に一定流速で支持液を流して流出口への液の流れを作り、該流路への液体注入口近傍に設けた試料注入口から試料を注入し、流路の両端に設けた電極に電圧を印加することによって試料に含まれる物質が電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動分離しながら流出口に流出する原理を利用した電気泳動法である。支持液として両性電解質のキャリアアンフォライトを用いれば等電点電気泳動も可能である。ゲル電気泳動とは異なり、ゲルを用いない無担体電気泳動であるため、高速で分離と分取が実現できる。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００１、１、８０７−８１８
【０００５】
しかしながら、上記先行例は二次元目の電気泳動にＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用しているため、質量分析装置で分析する際にゲルからのスポットの切り出しが必要となる。ゲルからのスポットの切り出しは人間の手作業か、もしくはロボットアームによる作業となり、オンライン作業でないため、ハイスループットな分析システムを構築できないという問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、上記問題を解決すべくなされたもので、スポットの切り出しの必要性が無く蛋白質同定に要する時間を短縮できる、高速で連続的にオンライン作業を可能とする、ハイスル−プットな蛋白質同定方法及び蛋白質同定装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決手段】
本発明の第１の視点は、多種類の蛋白質をゲルによらない分離精製方法を用いて分離精製し、分離精製物についてアミノ酸配列分析を行うことによって蛋白質を同定する蛋白質同定方法であって、分離精製工程が少なくとも二段の分離精製工程からなり、第一段目の分離精製工程をフリーフロー電気泳動法によって行なう、蛋白質同定方法に関する。
【０００８】
本発明の蛋白質同定方法によれば、多種類の蛋白質をゲルによらない分離精製方法を用いて分離精製するので、分離・分取によって連続的にサンプルを得ることが可能となり、従来技術のように質量分析の場合のスポット切り出し作業の必要が無く、蛋白質同定に要する時間が短縮できる。また、第一段目の分離精製工程を無担体電気泳動式のフリーフロー電気泳動法によって行なうので、より高速な分離・分取が可能となる。
【０００９】
以下に、本発明の蛋白質同定方法の好ましい実施態様を挙げる。（１）−（６）を任意に組合わせた態様も本発明の蛋白質同定方法の好ましい実施態様である。
（１） 第二の段目の分離精製工程を、液体クロマトグラフ法もしくはキャピラリー電気泳動法によって行なう。本構成により、第二の分離精製工程から得た分取液を直接液体クロマトグラフ工程もしくはキャピラリー電気泳動工程に繋げることが可能となり、ハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００１０】
（２） 前記アミノ酸配列の分析を、質量分析装置もしくはペプチドシークエンサーを用いてを行なう。本構成により、第二の分離精製工程から得た分取液を直接アミノ酸配列分析工程に繋げることが可能となり、ハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００１１】
（３） 第一段目の分離精製工程の前工程において、脱塩工程を行う。被分離精製試料中に多くの塩が含まれると、第一段目の分離精製工程のフリーフロー電気泳動工程は分離能力に影響がでる。本構成により、フリーフロー電気泳動工程での分離分取を安定することができ、安定性の高いハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００１２】
（４） 第一段目の分離精製工程と第二段目の分離精製工程の間で脱気工程を行なう。第二の分離精製工程は気泡が含有されると正確な分離の妨げになる。第二の分離精製工程に繋げるにあたり、分取液を脱気することによりその精度を上げることができる。本構成により、安定性の高いハイスループットな蛋白質同定装置が実現できる。
【００１３】
（５） 第一段目の分離精製工程と第二段目の分離精製工程の間で濃縮工程を行なう。第一段目の分離精製工程のフリーフロー電気泳動工程において、分離分取後のサンプルは希釈された状態となる。第二の分離精製工程に繋げるにあたり、分取液を濃縮することにより第２分離精製工程の感度を上げることができる。本構成により、フリーフロー電気泳動工程で希釈されたサンプルを濃縮することができ、感度の高いハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００１４】
（６） 第一の分離精製工程のフリーフロー電気泳動法を、１００μｍ以下の厚みの電気泳動室にて行なう。第一の分離精製工程であるフリーフロー電気泳動は大型の分離室を用いた装置が多く、微量サンプルの取り扱いが難しい。本発明の蛋白質同定方法において、第二の分離精製工程は微量サンプルを扱うことが可能な工程であるため、第一の分離精製工程においても微量サンプルが扱えると全工程を微量化することが可能となり、微量サンプルによるハイスループットな蛋白質同定が実現できる。本実施態様は、この要請に合致するものである。
【００１５】
本発明の第二の視点は、多種類の蛋白質を分離精製するためのゲルによらない分離精製手段、該分離精製手段からの分離精製物についてアミノ酸配列分析を行うアミノ酸分析手段とを含む、蛋白質同定装置であって、前記分離精製手段が少なくとも二段の分離精製手段からなり、第一段目の分離精製手段がフリーフロー電気泳動手段である、蛋白質同定装置に関する。本蛋白質同定装置については、上述の蛋白質同定装置で記載したと同様な作用効果が得られるので、冗長な繰り返しを避けるためその作用効果の記載は省略する。以下の本発明の蛋白質同定装置の好ましい実施態様についても同様。
【００１６】
本発明の蛋白質同定装置の好ましい実施態様を以下に挙げる。（１）−（６）を任意に組合わせた態様も本発明の蛋白質同定装置の好ましい実施態様である。
【００１７】
（１） 第二の段目の分離精製手段が、液体クロマトグラフィ手段もしくはキャピラリー電気泳動手段である。
（２）前記アミノ酸配列分析手段が、質量分析装置もしくはペプチドシークエンサーである。
【００１８】
（３） 第一段目の分離精製手段の上流に、脱塩手段を有する。
（４） 第一段目の分離精製手段と第二段目の分離精製手段との間に脱気手段を設ける。
【００１９】
（５） 第一段目の分離精製手段と第二段目の分離精製手段との間に濃縮手段を設ける。
（６） 第一の分離精製手段であるフリーフロー電気泳動手段が、１００μｍ以下の厚みの電気泳動室を有する。
【００２０】
【発明の実施の態様】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）被分離精製多種類蛋白質
本発明で分離精製の対象とする多種類蛋白質は、細胞あるいは細胞内小胞体由来の蛋白質であり、従来行なわれている前処理を行なったものである。即ち、細胞等を粉砕後、遠心分離し、溶剤に溶解・懸濁させたものを被分離精製試料として用いる。該試料はそのまま用いてもよく、あるいはペプチド断片化処理した試料を用いることもできる。
【００２１】
（２）ゲルによらない分離精製等
「ゲルによらない分離精製」とは、生化学分野で主に用いられているゲル担体を用た電気泳動分離でない分離手段をいい、フリーフロー電気泳動法、液体クロマトグラフ法、キャピラリー電気泳動法などがある。フリーフロー電気泳動法は無担体電気泳動法として研究がなされている技術である。液体クロマトグラフ法もしくはキャピラリー電気泳動法は、分離分析分野において既に確立された技術であり、近年、質量分析装置と一体化された装置も開発されている。
【００２２】
フリーフロー電気泳動
フリーフロー電気泳動装置の要部を図１に示す。図中、１はフリーフロー電気泳動素子を示し、１ａはガラス基板、２は２枚のガラス基板１ａ，１ａの間に形成された泳動分離室、３は泳動分離室上流端部に設けた複数の支持液注入口、４は支持液注入口の下流中央に設けたサンプル注入口である。泳動分離室の両側には一対の電極５が設けられ、下流端部には分離液排出口６が設けられている。
【００２３】
フリーフロー電気泳動は、粗分離（グルーピング：グループ分け）をするために行なうが、グルーピングの目的により、以下の分類を行なうことができる。
▲１▼フリーフローゾーン電気泳動
分子量と電荷に基づいて、被分離精製蛋白質をグルーピングするもので、分子の実効移動度によるグルーピングを行うことができる。分離能は高くはないが、単一バッファーにて実施できる利点がある。
▲２▼フリーフロー等電点電気泳動
物質の等電点に基づいて、被分離精製蛋白質をグルーピングするもので、分子の等電点によるグルーピングを行うことができる。等電点に基づいて収束分離するため、分離能は高い。しかし、バッファーに両性電解質を添加する必要があり、分取液に両性電解質が混合する、ランニングコストが高い等のデメリットがある。
▲３▼フリーフロー等速電気泳動
フリーフローゾーン電気泳動と同様に、分子の移動度に基づいて被分離精製蛋白質をグルーピングするものである。本手法では、泳動方向に対して、試料よりも先行して試料よりも移動度の速い溶質を含んだバッファーを、試料の後ろに試料よりも移動度の遅い溶質を含んだバッファーを泳動させることで、試料は先行イオンと終末イオンの間に挟まれて分離しながら収束する。このためフリーフローゾーン電気泳動よりも分離能は高いが、複数のバッファーを用いる、条件出しが困難などのデメリットがある。
上記方法の中から適当な手法を選択して実施する。分離能が高い分離が欲しい場合は▲２▼または▲３▼を用いる。条件設定がしやすい点で▲２▼が優れているが、バッファー中に両性電解質が混在した状態で回収されるため、後の処理が複雑となる場合がある。▲１▼は分離能は低くとも簡便な条件設定での分離が可能であるという利点がある。
なお、液体クロマトグラフ法もしくはキャピラリー電気泳動法は、ともに当該技術では周知の技術であるので、説明は省略する。
【００２４】
本発明の蛋白質同定方法では、分離精製工程が少なくとも二段の分離精製工程からなるので、一段目の上流側のフリーフロー電気泳動と二段目のゲルによらない下流側分離精製工程との二段の分離工程としてもよいし、さらに追加のゲルによらない分離工程を一段目のフリーフロー電気泳動工程の上流で、あるいは第一段目と第２段目の分離工程の間で、あるいは第２段目の分離精製工程の下流で行なうこともできる。
【００２５】
（３）アミノ酸配列分析
アミノ酸配列分析は、分離精製工程終了後、分離精製物に対してペプチド断片化処理を行なった後に行なうことができ、また被分離精製試料に対してペプチド断片化処理をおこない分離精製処理の後アミン酸配列分析を行なってもよい。また、アミノ酸配列分析を質量分析装置で行なう際には、ペプチド断片化処理自体行なわなくともよい場合もある。ペプチド断片化処理は、例えば、適当なプロテアーゼを用いて行なうが、ペプチド断片化処理自体は周知の技術であり説明は省略する。
【００２６】
アミノ酸配列分析は、質量分析による方法、ペプチドシークエンサーによる方法、アミノ酸組成分析による方法によって決定することができる。これらの中で、本発明の蛋白質分析方法及び装置では、微量の蛋白質での分析が可能で、且つ直接アミノ酸配列分析工程に繋げることができるので、質量分析による方法、及びペプチドシークエンサーによる方法を好適に用いることができる。
【００２７】
（４）脱塩
脱塩工程は、ゲル濾過法、イオン交換膜を介したバッファー置換法、電気透析法等によって行うことができる。この中で、本発明の蛋白質分析方法及び装置では、連続的脱塩を可能な電気透析法が好適に用いることができる。
（５）脱気
脱気工程は、液の入った容器を減圧して脱気する方法、液体クロマトグラフ法で用いられる脱気装置による方法等によって行うことができる。この中で、本発明の蛋白質分析方法及び装置では、連続的脱気が可能な液体クロマトグラフ法で用いられる脱気装置が好適に用いることができる。
（６）濃縮
濃縮工程は、加熱による方法、イオン交換膜を介してバッファー量を減らす方法、濃縮カラムによる方法等によって行うことができる。この中で、本発明の蛋白質分析方法及び装置では、濃縮カラムによる方法が好適に用いることができる。
（７）蛋白質、それをコードする遺伝子の同定
アミノ酸配列の分析結果から得られたアミノ酸配列情報をＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算されるアミノ酸配列情報と比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定計算する。このような同定計算方法は、既知であるので説明は省く。以下に、質量分析法の場合、ペプチドシークエンス法の場合について述べる。
▲１▼ 質量分析の場合
質量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定計算する。
▲２▼ ペプチドシークエンス法の場合
ペプチドシークエンサーの分析結果から得られたアミノ酸配列分析データをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算されるアミノ酸配列分析データと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定計算する。
【００２８】
以下に本発明の蛋白質同定方法の実施態様を具体的に説明する。これらの実施態様は単に本発明の例示的実施態様であって、本発明はこれらのものに限定されるものではない。本発明は、いかに述べる実施態様の他、種々の実施態様を採用できることは言うまでもない。また、以下の実施態様中、「・・・工程」を「・・・手段」とすることにより、本発明の蛋白質同定装置となることに留意。
（１）第１の実施態様
図１に、第１の実施態様をブロック図を用いて模式的に説明する。即ち、本実施態様は、
第一工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第二工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第三工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第四工程：量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程からなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００２９】
（２）第２の実施態様
図１に、第１の実施態様をブロック図を用いて模式的に説明する。即ち、本実施態様は、
第一工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第二工程：キャピラリー電気泳動法による分離精製工程、
第三工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第四工程：量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程からなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３０】
（３）第３の実施態様
第一工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第二工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第三工程：ペプチドシークエンサーによるアミノ酸配列分析工程、
第四工程：ペプチドシークエンサーの分析結果から得られたアミノ酸配列分析データをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算されるアミノ酸配列分析データと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程とからなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３１】
（４）第４の実施態様
第一工程：脱塩工程、
第二工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第三工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第四工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第五工程：量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程とからなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３２】
（５） 第５の実施態様
第一工程：脱塩工程、
第二工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第三工程：脱気工程、
第四工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第五工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第六工程：量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程とからなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３３】
（６）第６の実施態様
第一工程：脱塩工程、
第二工程：フリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第三工程：濃縮工程、
第四工程：脱気工程、
第五工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第六工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第七工程に量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程とからなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３４】
（７）第７の実施態様
第一工程：１００μｍ以下の厚みの電気泳動槽にて行われるフリーフロー電気泳動法による分離精製工程、
第二工程：液体クロマトグラフ法による分離精製工程、
第三工程：質量分析装置によるアミノ酸配列分析工程、
第四工程に量分析装置の分析結果から得られた質量スペクトルをＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較しタンパク質やそれをコードする遺伝子を同定する計算工程とからなる、蛋白質同定方法及び装置。
【００３５】
【発明の効果】
本願請求項１及び請求項８に係る発明では、多種類の蛋白質をゲルによらない分離精製方法，手段を用いて分離精製するので、分離・分取によって連続的にサンプルを得ることが可能となり、従来技術のように質量分析の場合のスポット切り出し作業の必要が無く、蛋白質同定に要する時間が短縮できる。また、第一段目の分離精製工程を無担体電気泳動式のフリーフロー電気泳動法によって行なうので、より高速な分離・分取が可能となる。
【００３６】
本願請求項２、９に係る発明では、第二の段目の分離精製工程を、液体クロマトグラフ法、手段もしくはキャピラリー電気泳動法、手段によって行なうので、第二の分離精製工程、手段から得た分取液を直接液体クロマトグラフ工程もしくはキャピラリー電気泳動工程、手段に繋げることが可能となり、ハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００３７】
本願請求項３，１０に係る発明では、前記アミノ酸配列の分析を、質量分析装置もしくはペプチドシークエンサーを用いてを行なうので、第二の分離精製工程、手段から得た分取液を直接アミノ酸配列分析工程、手段に繋げることが可能となり、ハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００３８】
本願請求項４，１１に係る発明では、第一段目の分離精製工程、手段の前工程、手段において、脱塩を行う。被分離精製試料中に多くの塩が含まれると、第一段目の分離精製工程、手段のフリーフロー電気泳動工程、手段は分離能力に影響がでる。本構成により、フリーフロー電気泳動工程での分離分取を安定することができ、安定性の高いハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００３９】
本願請求項５，１２に係る発明では、第一段目の分離精製工程、手段と第二段目の分離精製工程、手段の間で脱気工程、手段を設けたので、第二の分離精製工程、手段は気泡が含有されると正確な分離の妨げになる。第二の分離精製工程、手段に繋げるにあたり、分取液を脱気することによりその精度を上げることができる。本構成により、安定性の高いハイスループットな蛋白質同定装置が実現できる。
【００４０】
本願請求項６，１３に係る発明では、第一段目の分離精製工程、手段と第二段目の分離精製工程、手段の間で濃縮を行なう。第一段目の分離精製工程、手段のフリーフロー電気泳動工程、手段において、分離分取後のサンプルは希釈された状態となる。第二の分離精製工程、手段に繋げるにあたり、分取液を濃縮することにより第２分離精製工程、手段の感度を上げることができる。本構成により、フリーフロー電気泳動工程、手段で希釈されたサンプルを濃縮することができ、感度の高いハイスループットな蛋白質同定が実現できる。
【００４１】
本願請求項７，１４に係る発明では、第一の分離精製工程、手段のフリーフロー電気泳動法、手段を、１００μｍ以下の厚みの電気泳動室にて行なう。第一の分離精製工程、手段でのフリーフロー電気泳動は大型の分離室を用いた装置が多く、微量サンプルの取り扱いが難しい。本発明の蛋白質同定方法、装置において、第二の分離精製工程、手段は微量サンプルを扱うことが可能な工程、手段であるため、第一の分離精製工程、手段においても微量サンプルが扱えると全工程を微量化することが可能となり、微量サンプルによるハイスループットな蛋白質同定が実現できる。本実施態様は、この要請に合致するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛋白質同定方法及び装置において用いることができるフリーフロー電気泳動装置の要部を示す平面図である。
【図２】本発明の第１の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図３】本発明の第２の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図４】本発明の第３の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図５】本発明の第４の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図６】本発明の第５の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図７】本発明の第６の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【図８】本発明の第７の実施態様をブロック図を用いて模式的に示す。
【符号の説明】
１・・・フリーフロー電気泳動素子、１ａ・・・ガラス基板、２・・・泳動分離室、３・・・支持液注入口、４・・・サンプル注入口、・・・電極、６・・・分離液排出口６[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein identification method for separating and purifying various kinds of proteins and performing amino acid sequence analysis, and a protein identification device.
[0002]
[Prior art]
Usually, peptide mass fingerprinting (PMF method) is used for protein identification. The PMF method is a method in which a protein separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE) is protease-degraded in a gel, the decomposed product is analyzed by a mass spectrometer, and the resulting mass spectrum (peptide mass fingerprint) is obtained. This is a method for identifying a protein or a gene encoding the protein by comparing the protein with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to a DNA base sequence. 2-DE is a technique for separating and purifying proteins. As a first-stage separation means (first-dimensional electrophoresis), proteins are separated into groups of isoelectric points by isoelectric point gel electrophoresis. The molecular weight is separated by SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) as a second stage separation means (second dimension electrophoresis). Although 2-DE has a very high resolution, it has a problem that it takes about 17 hours for the first dimension electrophoresis and several hours for the second dimension electrophoresis, that is, about 20 hours in total.
[0003]
As a solution to the above problem, for example, there has been a report using free-flow electrophoresis as first-dimension electrophoresis (for example, see [Non-Patent Document 1]). By using free flow electrophoresis, the time required for the first dimension electrophoresis was reduced to 1.5 hours. Here, free-flow electrophoresis means that a supporting liquid is caused to flow at a constant flow rate in a liquid flow path sandwiched between two plates to form a liquid flow to an outlet, and the liquid flows to the flow path. A sample is injected from the sample injection port provided near the inlet, and voltage is applied to the electrodes provided at both ends of the flow path, whereby the substance contained in the sample is electrophoretically separated on the positive or negative electrode side by the principle of electrophoresis. This is an electrophoresis method using the principle of flowing out to the outlet while the flow is in progress. If a carrier ampholyte of an ampholyte is used as a supporting solution, isoelectric focusing can be performed. Unlike gel electrophoresis, since it is carrier-free electrophoresis without using gel, separation and fractionation can be realized at high speed.
[0004]
[Non-Patent Document 1] Proteomics 2001, 1, 807-818
[0005]
However, since the above-mentioned prior art utilizes SDS-PAGE for the second dimension electrophoresis, it is necessary to cut out spots from the gel when analyzing with a mass spectrometer. The extraction of spots from the gel is performed manually by a human or by a robot arm, and is not an online operation, so that there is a problem that a high-throughput analysis system cannot be constructed.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is possible to reduce the time required for protein identification without the necessity of cutting out spots, to enable high-speed continuous online operation, and to obtain a high-throughput protein. An object of the present invention is to provide an identification method and a protein identification device.
[0007]
[Means for solving the problem]
A first aspect of the present invention is a protein identification method for separating and purifying various kinds of proteins using a separation / purification method without using a gel, and performing protein analysis on the separated / purified product to identify proteins, The present invention relates to a protein identification method in which the separation and purification step comprises at least two steps of separation and purification, and the first step of separation and purification is performed by free-flow electrophoresis.
[0008]
According to the protein identification method of the present invention, since various proteins are separated and purified using a separation and purification method that does not use a gel, it is possible to continuously obtain a sample by separation and fractionation, as in the prior art. In addition, there is no need to perform spot cutting work in the case of mass spectrometry, and the time required for protein identification can be reduced. In addition, since the first-stage separation and purification step is performed by a free-flow electrophoresis method using a carrier-free electrophoresis method, higher-speed separation and fractionation can be performed.
[0009]
Hereinafter, preferred embodiments of the protein identification method of the present invention will be described. An embodiment in which (1) to (6) are arbitrarily combined is also a preferred embodiment of the protein identification method of the present invention.
(1) The second-stage separation and purification step is performed by liquid chromatography or capillary electrophoresis. With this configuration, it is possible to directly connect the aliquot obtained from the second separation and purification step to a liquid chromatography step or a capillary electrophoresis step, and to realize high-throughput protein identification.
[0010]
(2) The amino acid sequence is analyzed using a mass spectrometer or a peptide sequencer. With this configuration, it is possible to directly connect the fractionated solution obtained from the second separation and purification step to the amino acid sequence analysis step, and to realize high-throughput protein identification.
[0011]
(3) A desalting step is performed before the first separation / purification step. When a large amount of salt is contained in the sample to be separated and purified, the free-flow electrophoresis step in the first step of separation and purification affects the separation ability. With this configuration, it is possible to stabilize the separation and fractionation in the free-flow electrophoresis step, and to realize highly stable and high-throughput protein identification.
[0012]
(4) A deaeration step is performed between the first-stage separation and purification step and the second-stage separation and purification step. The second separation and purification step hinders accurate separation if bubbles are contained. In connecting to the second separation / purification step, the precision can be improved by degassing the fractionated liquid. With this configuration, a stable and high-throughput protein identification device can be realized.
[0013]
(5) A concentration step is performed between the first-stage separation and purification step and the second-stage separation and purification step. In the free-flow electrophoresis step of the first-stage separation and purification step, the sample after separation and separation is in a diluted state. In connection with the second separation and purification step, the sensitivity of the second separation and purification step can be increased by concentrating the fractionated solution. With this configuration, the sample diluted in the free-flow electrophoresis step can be concentrated, and high-sensitivity, high-throughput protein identification can be realized.
[0014]
(6) The free flow electrophoresis of the first separation and purification step is performed in an electrophoresis chamber having a thickness of 100 μm or less. In the free-flow electrophoresis, which is the first separation and purification step, many apparatuses use a large separation chamber, and it is difficult to handle a small amount of sample. In the protein identification method of the present invention, since the second separation and purification step is a step capable of handling a small amount of sample, if the small amount of sample can be handled in the first separation and purification step, it is possible to reduce the amount of all steps. Thus, high-throughput protein identification using a small amount of sample can be realized. This embodiment meets this requirement.
[0015]
A second aspect of the present invention relates to a protein comprising: a gel-free separation / purification means for separating / purifying various kinds of proteins; and an amino acid analysis means for performing an amino acid sequence analysis on the separated / purified product from the separation / purification means. An identification device, wherein the separation / purification means comprises at least two-stage separation / purification means, and the first-stage separation / purification means is a free-flow electrophoresis means. With the present protein identification device, the same operation and effect as described in the above-described protein identification device can be obtained, and therefore, the description of the operation and effect will be omitted to avoid redundant repetition. The same applies to the following preferred embodiments of the protein identification device of the present invention.
[0016]
Preferred embodiments of the protein identification device of the present invention are described below. An embodiment in which (1) to (6) are arbitrarily combined is also a preferred embodiment of the protein identification device of the present invention.
[0017]
(1) The second-stage separation and purification means is liquid chromatography means or capillary electrophoresis means.
(2) The amino acid sequence analyzing means is a mass spectrometer or a peptide sequencer.
[0018]
(3) Desalination means is provided upstream of the first-stage separation and purification means.
(4) Deaeration means is provided between the first-stage separation and purification means and the second-stage separation and purification means.
[0019]
(5) Concentrating means is provided between the first-stage separation and purification means and the second-stage separation and purification means.
(6) The free-flow electrophoresis means as the first separation and purification means has an electrophoresis chamber having a thickness of 100 μm or less.
[0020]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Multi-Purpose Proteins to be Separated and Purified The multi-proteins to be separated and purified in the present invention are proteins derived from cells or intracellular endoplasmic reticulum, and have been subjected to conventional pretreatment. That is, cells and the like are crushed, centrifuged, dissolved and suspended in a solvent, and used as a sample to be separated and purified. The sample may be used as it is, or a sample subjected to peptide fragmentation treatment may be used.
[0021]
(2) Separation and purification without using a gel "Separation and purification without using a gel" refers to separation means that is not mainly used in the field of biochemistry but is separated by electrophoresis using a gel carrier. , Liquid chromatography, capillary electrophoresis and the like. Free flow electrophoresis is a technique that has been studied as carrier-free electrophoresis. Liquid chromatography or capillary electrophoresis is a technique already established in the field of separation and analysis, and in recent years, an apparatus integrated with a mass spectrometer has been developed.
[0022]
Free Flow Electrophoresis FIG. 1 shows a main part of a free flow electrophoresis apparatus. In the figure, reference numeral 1 denotes a free-flow electrophoresis element, 1a denotes a glass substrate, 2 denotes an electrophoresis separation chamber formed between two glass substrates 1a, 1a, and 3 denotes a plurality provided at an upstream end of the electrophoresis separation chamber. The support liquid inlet 4 is a sample inlet provided at the center downstream of the support liquid inlet. A pair of electrodes 5 is provided on both sides of the electrophoresis separation chamber, and a separation liquid outlet 6 is provided at the downstream end.
[0023]
Free flow electrophoresis is performed for coarse separation (grouping: grouping), and the following classification can be performed depending on the purpose of grouping.
{Circle around (1)} Free-flow zone Electrophoresis is a method of grouping proteins to be separated and purified on the basis of molecular weight and electric charge, and can perform grouping based on the effective mobility of molecules. Although the resolution is not high, there is an advantage that it can be performed with a single buffer.
{Circle over (2)} Free-flow isoelectric focusing [0108] The protein to be separated and purified is grouped based on the isoelectric point of the electrophoretic substance. The molecules can be grouped by isoelectric point. Since the convergence separation is performed based on the isoelectric point, the resolution is high. However, it is necessary to add an amphoteric electrolyte to the buffer, and there are disadvantages such as mixing of the amphoteric electrolyte with the fractionated liquid and high running cost.
(3) Free flow isotachophoresis Similar to free flow zone electrophoresis, proteins to be separated and purified are grouped based on the mobility of molecules. In this method, in the electrophoresis direction, a buffer containing a solute with a higher mobility than the sample precedes the sample, and a buffer containing a solute with a lower mobility than the sample moves behind the sample. Thus, the sample is converged while being separated and sandwiched between the leading ion and the terminal ion. For this reason, the separation ability is higher than in the free flow zone electrophoresis, but there are disadvantages such as the use of a plurality of buffers and difficulty in determining conditions.
An appropriate method is selected and executed from the above methods. If high resolution is desired, use (2) or (3). (2) is excellent in that the conditions can be easily set, but since the amphoteric electrolyte is recovered in a mixed state in the buffer, the subsequent processing may be complicated. (1) has an advantage that separation can be performed under simple conditions even if the separation power is low.
In addition, the liquid chromatography method or the capillary electrophoresis method is a well-known technique in the art, and the description thereof is omitted.
[0024]
In the protein identification method of the present invention, since the separation / purification step comprises at least two steps of separation / purification steps, the two steps of the first-stage upstream free-flow electrophoresis and the second-stage downstream separation / purification step without using a gel are used. A separate separation step may be used, or an additional gel-free separation step may be performed upstream of the first free-flow electrophoresis step, or between the first and second separation steps, or It can also be performed downstream of the second stage separation and purification step.
[0025]
(3) Amino acid sequence analysis Amino acid sequence analysis can be performed after the separation and purification step and after subjecting the separated and purified product to peptide fragmentation, and the sample to be separated and purified is subjected to peptide fragmentation. After the separation and purification treatment, amino acid sequence analysis may be performed. When the amino acid sequence analysis is performed by the mass spectrometer, the peptide fragmentation treatment itself may not be required in some cases. The peptide fragmentation treatment is performed using, for example, an appropriate protease, but the peptide fragmentation treatment itself is a well-known technique, and a description thereof is omitted.
[0026]
Amino acid sequence analysis can be determined by a method using mass spectrometry, a method using a peptide sequencer, or a method using amino acid composition analysis. Among them, the protein analysis method and apparatus of the present invention enable analysis with a trace amount of protein and can be directly connected to the amino acid sequence analysis step. Therefore, a method using mass spectrometry and a method using a peptide sequencer are preferable. Can be used.
[0027]
(4) Desalting The desalting step can be performed by a gel filtration method, a buffer replacement method through an ion exchange membrane, an electrodialysis method, or the like. Among them, in the protein analysis method and apparatus of the present invention, an electrodialysis method capable of continuous desalting can be suitably used.
(5) Degassing The degassing step can be performed by a method of depressurizing and degassing the container containing the liquid, a method using a degassing device used in liquid chromatography, or the like. Among them, in the protein analysis method and apparatus of the present invention, a degassing apparatus used in liquid chromatography capable of continuous degassing can be suitably used.
(6) Concentration The concentration step can be performed by a method of heating, a method of reducing the amount of buffer through an ion exchange membrane, a method of using a concentration column, or the like. Among them, in the protein analysis method and apparatus of the present invention, a method using a concentration column can be suitably used.
(7) Identification of a protein and a gene encoding the protein The amino acid sequence information obtained from the analysis result of the amino acid sequence is compared with the amino acid sequence information calculated from the amino acid sequence corresponding to the DNA base sequence to encode the protein or the protein. Identify and calculate genes. Since such an identification calculation method is known, its description is omitted. Hereinafter, the case of mass spectrometry and the case of peptide sequence method will be described.
{Circle around (1)} In the case of mass spectrometry A mass spectrum obtained from an analysis result of a mass spectrometer is compared with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to a DNA base sequence to identify and calculate a protein and a gene encoding the same.
{Circle around (2)} In the case of the peptide sequencing method, the amino acid sequence analysis data obtained from the analysis result of the peptide sequencer is compared with the amino acid sequence analysis data calculated from the amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA, and the protein and the gene encoding it are determined. Identify and calculate.
[0028]
Hereinafter, embodiments of the protein identification method of the present invention will be specifically described. These embodiments are merely exemplary embodiments of the present invention, and the present invention is not limited to these embodiments. It goes without saying that the present invention can adopt various embodiments other than the embodiment described above. Also, in the following embodiments, it is noted that the "... step" is replaced by "... means" to provide the protein identification device of the present invention.
(1) First Embodiment FIG. 1 schematically illustrates a first embodiment using a block diagram. That is, this embodiment is
First step: Separation and purification step by free flow electrophoresis,
Second step: separation and purification step by liquid chromatography,
Third step: amino acid sequence analysis step using a mass spectrometer,
Fourth step: a calculation step of comparing a mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify a protein or a gene encoding the same, Protein identification method and device.
[0029]
(2) Second Embodiment FIG. 1 schematically illustrates a first embodiment with reference to a block diagram. That is, this embodiment is
First step: Separation and purification step by free flow electrophoresis,
Second step: separation and purification step by capillary electrophoresis,
Third step: amino acid sequence analysis step using a mass spectrometer,
Fourth step: a calculation step of comparing a mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify a protein or a gene encoding the same, Protein identification method and device.
[0030]
(3) Third Embodiment First Step: Separation and Purification Step by Free Flow Electrophoresis,
Second step: separation and purification step by liquid chromatography,
Third step: an amino acid sequence analysis step using a peptide sequencer,
Fourth step: a calculating step of comparing the amino acid sequence analysis data obtained from the analysis result of the peptide sequencer with the amino acid sequence analysis data calculated from the amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify the protein and the gene encoding the same And a protein identification method and device.
[0031]
(4) Fourth Embodiment First Step: Desalting Step,
Second step: Separation and purification step by free flow electrophoresis,
Third step: separation and purification step by liquid chromatography,
Fourth step: an amino acid sequence analysis step using a mass spectrometer,
Fifth step: a calculation step of comparing a mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify a protein or a gene encoding the same. , Protein identification method and apparatus.
[0032]
(5) Fifth Embodiment First Step: Desalting Step,
Second step: Separation and purification step by free flow electrophoresis,
Third step: degassing step,
Fourth step: separation and purification step by liquid chromatography,
Fifth step: amino acid sequence analysis step using a mass spectrometer,
Sixth step: a calculation step of comparing a mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with a mass spectrum calculated from an amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify a protein and a gene encoding the same. , Protein identification method and apparatus.
[0033]
(6) Sixth Embodiment First Step: Desalting Step,
Second step: Separation and purification step by free flow electrophoresis,
Third step: concentration step,
Fourth step: degassing step,
Fifth step: separation and purification step by liquid chromatography,
Sixth step: amino acid sequence analysis step by mass spectrometer,
The seventh step comprises a calculation step of comparing the mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with the mass spectrum calculated from the amino acid sequence corresponding to the base sequence of DNA to identify the protein and the gene encoding it. , Protein identification method and apparatus.
[0034]
(7) Seventh Embodiment First Step: Separation and purification step by free flow electrophoresis performed in an electrophoresis tank having a thickness of 100 μm or less,
Second step: separation and purification step by liquid chromatography,
Third step: amino acid sequence analysis step using a mass spectrometer,
The fourth step includes a calculation step of comparing the mass spectrum obtained from the analysis result of the mass spectrometer with the mass spectrum calculated from the amino acid sequence corresponding to the DNA base sequence to identify the protein and the gene encoding the same. , Protein identification method and apparatus.
[0035]
【The invention's effect】
In the inventions according to claims 1 and 8 of the present application, since various proteins are separated and purified using a separation and purification method and means without using a gel, it is possible to continuously obtain a sample by separation and fractionation. Unlike the prior art, there is no need to perform spot extraction in the case of mass spectrometry, and the time required for protein identification can be reduced. In addition, since the first-stage separation and purification step is performed by a free-flow electrophoresis method using a carrier-free electrophoresis method, higher-speed separation and fractionation can be performed.
[0036]
In the invention according to claims 2 and 9 of the present application, the separation and purification step of the second stage is performed by liquid chromatography, means or capillary electrophoresis, and thus the separation and purification step is obtained from the second separation and purification step and means. The fractionated solution can be directly connected to a liquid chromatography step or a capillary electrophoresis step or means, and high-throughput protein identification can be realized.
[0037]
In the invention according to claims 3 and 10 of the present application, the analysis of the amino acid sequence is performed using a mass spectrometer or a peptide sequencer. It can be connected to steps and means, and high-throughput protein identification can be realized.
[0038]
In the invention according to claims 4 and 11 of the present application, desalting is carried out in the first stage of the separation / purification step and the step before the means. When many salts are contained in the sample to be separated and purified, the separation and purification step of the first stage, the free-flow electrophoresis step of the means, and the means affect the separation ability. With this configuration, it is possible to stabilize the separation and fractionation in the free-flow electrophoresis step, and to realize highly stable and high-throughput protein identification.
[0039]
In the invention according to claims 5 and 12 of the present application, the degassing step and the means are provided between the first-stage separation and purification step and the means and the second-stage separation and purification step. The steps and means hinder accurate separation when air bubbles are contained. In connection with the second separation / purification step and means, the precision can be improved by degassing the fractionated liquid. With this configuration, a stable and high-throughput protein identification device can be realized.
[0040]
In the invention according to claims 6 and 13 of the present application, concentration is performed between the first-stage separation and purification step and the second stage separation and purification step. In the first-stage separation and purification step, the free-flow electrophoresis step and the means, the sample after separation and separation is in a diluted state. In connection with the second separation / purification step / means, the sensitivity of the second separation / purification step / means can be increased by concentrating the fractionated solution. With this configuration, the sample diluted in the free-flow electrophoresis step and means can be concentrated, and high-throughput protein identification with high sensitivity can be realized.
[0041]
In the invention according to claims 7 and 14, the first separation / purification step and the free flow electrophoresis method are performed in an electrophoresis chamber having a thickness of 100 μm or less. In the first separation / purification step, the free-flow electrophoresis in the means often uses a large separation chamber, and it is difficult to handle a small amount of sample. In the protein identification method and apparatus of the present invention, the second separation / purification step and means are steps and means capable of handling a small amount of sample. The number of steps can be reduced, and high-throughput protein identification using a small amount of sample can be realized. This embodiment meets this requirement.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a plan view showing a main part of a free-flow electrophoresis device that can be used in the protein identification method and device of the present invention.
FIG. 2 schematically shows a first embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 3 schematically shows a second embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 4 schematically shows a third embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 5 schematically shows a fourth embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 6 schematically shows a fifth embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 7 schematically shows a sixth embodiment of the present invention using a block diagram.
FIG. 8 schematically shows a seventh embodiment of the present invention using a block diagram.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Free flow electrophoresis element, 1a ... Glass substrate, 2 ... Electrophoresis separation chamber, 3 ... Support liquid inlet, 4 ... Sample inlet, ... Electrode, 6 ...・ Separated liquid outlet 6
