JP2004113067A

JP2004113067A - New microbial strain having cellulose degradation performance, using method therefor and growth promotion method

Info

Publication number: JP2004113067A
Application number: JP2002279233A
Authority: JP
Inventors: Kazuaki Tamatsubo; 珠坪　一晃; Yoshiki Nagaya; 長屋　由亀; Akiko Miya; 宮　晶子
Original assignee: Ebara Corp
Current assignee: Ebara Corp
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2004-04-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new microbial strain having cellulose degradation performance and to provide a using method therefor and a growth promotion method. <P>SOLUTION: The new microbial strain is a strain which has cellulose degradation performance, comprises a base sequence of 16S rRNA gene exhibiting ≥90% homology to a sequence described by sequence number 1 and/or a base sequence of a cellulase gene exhibiting ≥80% homology to a sequence described by a sequence number 2 and belongs to genus Clostridium. Typically, Clostridium sp. JC3 strain (FERM P-19026) may be cited as the strain. The new microbial strain is used together with an acid fermentation and a methane fermentation bacteria in a cellulose-containing organic waste and/or waste water so that the cellulose contained in the organic waste and/or waste water is decomposed and recovered as methane gas. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セルロース分解能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する新菌株、それを利用した処理方法、その増殖促進法、およびそれを含むセルロース分解除去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人口の増加や生活の高度化に伴って、家庭や様々な産業から排出される廃棄物の量が増加して来ている。なかでも、下水汚泥や生ごみなどの高有機物含有廃棄物については、主に埋め立てや海洋投棄、焼却による処理が行われてきた。しかしながら、日本国内では恒常的な埋め立て地不足に悩まされており、また有機性廃棄物の焼却に関しても、それに伴うダイオキシン類などの発生について問題視されて来ている。さらに、ロンドン条約の改正（岸辺和美、ロンドン条約付属書改正について、バイオサイエンスとインダストリー、１９９４年、Ｖｏｌ．５２，　Ｎｏ．　７）に伴い、下水汚泥や産業廃棄物の海洋投棄や洋上焼却が禁止されることとなった。このような背景から、有機性廃棄物の適切な処理方法の開発は急務であるといえる。
【０００３】
下水余剰汚泥や畜産廃棄物の生物学的な処理・減容化方法として、メタン発酵技術が知られている。この技術では、嫌気的な環境条件下で複数の嫌気性微生物群の連係プレーにより、有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。しかしながら、難分解性の固形性有機物であるセルロースを多く含有する、下水汚泥、生ゴミ、古紙、製紙工場やパルプ工場からの排水のメタン発酵処理では、その加水分解・酸生成反応が律速となっており、３０〜４０日程度の長い処理時間を必要とするうえ、有機物分解率（メタンへの転換率）も、易分解性の廃水などと比較してかなり低い（Ｄｅ　Ｂａｅｒｅ　Ｌ．，　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ　ｗａｓｔｅ：　ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ，　Ｗａｔｅｒ　Ｓｃｉ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　２０００；４１（３）：２８３−９０）。すなわちメタン発酵を中心とした高効率な有機性廃棄物の処理技術を確立するためには、高いセルロース分解能を有し、メタン発酵汚泥などのような嫌気的な条件下で生育可能な微生物およびその増殖促進法の開発が待たれている。
【０００４】
セルロース分解微生物の研究は比較的長く、草食動物の管腔（ルーメン）に生息する微生物や（Ｈｕｎｇａｔｅ　Ｒ．Ｅ．，　Ｍｅｔｈａｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｕｍｅｎ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ．　ＥｘｐｅｒｉｅｎｔｉａＳｕｐｐｌ．，　１９８２；４３：１１７−２０）、堆肥や土壌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ，　Ｍｃｂｅｅ　Ｒ．Ｈ．　Ｔｈｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９５３；５０５−５０６）、コンポスト（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ，　Ｍａｄｄｅｎ　Ｒ．Ｈ．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｔｒａｃｏｒａｒｉｕｍ　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９８３；３３：８３７−８４０、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｊｏｓｕｉ，　Ｓｕｋｈｕｍａｖａｓｉ　Ｊ．，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｊｏｓｕｉ　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　ａ　Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ，　Ｍｏｄｅｒａｔｅ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｔｈａｉ　Ｃｏｍｐｏｓｔ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９８８；３８：１７９−１８２　）、底泥（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，　Ｊａｎｎａｓｃｈ　Ｈ．Ｗ．，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ　ｓｐ．　ｎｏｖ．　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ，　ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ．　Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１９８８；１５０：１０３−１０４）、温泉（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｗｉｅｇｅｌｉｉ，　Ｃｏｏｋ　Ｇ．Ｍ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙ　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，　Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｗｉｅｇｅｌｉｉ　ｓｐ．　ｎｏｖ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９６；４６：１２３−１２７）などから分離された微生物が報告されている。
【０００５】
しかしながら、セルロース含有廃棄物・廃水の処理を目的としたメタン発酵微生物群集において優占的にセルロース分解に寄与する微生物群に関する情報は著しく少なかった。
単離したセルロース分解菌をメタン発酵などの複数の微生物群が混在する環境に添加することによってセルロースの分解能を高めようという、いわゆるバイオオーグメンテーション技術に関する幾つかの研究例が報告されている。Ｍｌａｄｅｎｏｖｓｋａ　Ｚ．は糞尿のメタン発酵において、そこに含まれるセルロース等の繊維分の分解を促進させるためにセルロース分解菌の投与を行った。しかしながら、系外から投与した分解菌のメタン発酵系内での定着には成功しておらず、セルロース分解能を高めることが出来なかった（Ｍｌａｄｅｎｏｖｓｋａ　Ｚ．，　Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ　ｂｉｏｇａｓ　ｒｅａｃｔｏｒ　ｂｙ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ−ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，　２００１；１８３−１８８）。この様に、様々な嫌気性微生物群の存在するメタン発酵などの微生物群集において、有用細菌の利用を行う場合には、その汚濁物質に対する分解能の高さのみならず、微生物群集において定着できる能力を有する細菌を選択し、その利用法を開発する必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、難分解性の固形性有機物であるセルロースに対し高い分解能を有する嫌気性微生物を選択すること、及びこれを用いて有機性廃棄物や廃水に含まれるセルロースを迅速に分解するための手段を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、セルロース分解メタン発酵微生物群集内で、セルロース分解に伴って菌数の増加する一群の新菌株を見いだし、またそれら菌株の単離と増殖温度特性の調査により、培養環境を高温度に保つことにより本発明の一群の新菌株の増殖が促進されることを見いだし本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、セルロース分解能を有し、且つ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を示す、クロストリジウムに属する新菌株群に関する。
更に、本発明の新菌株は、セルラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を示す。本発明の新菌株群のうちの１つは、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６）である。
【０００８】
本発明の新菌株群において、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の相同性は、他の菌種と区別するためには９０％以上でよいが、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上である。また、そのセルラーゼ遺伝子の相同性は、他の菌種と区別するためには８０％以上でよいが、好ましくは８３％以上で、より好ましくは８５％以上である。
本発明の新菌株は、上記の様にセルロースに対して分解能を持てば良いが、セロビオースに対して分解能を持つことが好ましい。
【０００９】
他の側面において本発明は、上記新菌株群のいずれか、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を用いて、有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理することを特徴とする、有機性廃棄物及び／又は廃水の処理方法を提供する。
更に本発明は、上記新菌株を、セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中で、酸発酵及びメタン発酵微生物と共に用いることにより、該有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理してメタンガスとして回収することを特徴とするメタン発酵方法を提供する。
更に本発明は、上記新菌株の培養環境である有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とするメタン発酵方法を提供する。その培養環境は、好ましくは４５℃〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃になるように制御される。
【００１０】
更なる他の側面において本発明は、上記新菌株の培養環境であるセルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とする、新菌株の増殖促進法を提供する。
更なる他の側面において本発明は、上記新菌株を含有することを特徴とするセルロース分解除去剤を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の新菌株群の一例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を挙げることができる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、以下のようにして単離されたものである。
し尿、浄化槽汚泥、生ゴミを処理しているメタン発酵槽より採取した消化汚泥１００　ｍＬ（乾燥重量約１５ｇ）をセルムバイアル瓶に入れ、セルロースパウダーを１ｇ、アンモニア性窒素（１３０ｍｇ−Ｎ／Ｌ）、リン酸カリウム（５０ｍｇ−Ｐ／Ｌ）、酵母エキス（５０ｍｇ）を加えて、嫌気的条件下（溶存酸素濃度０ｍｇ／Ｌ，　酸化還元電位　−２００ｍＶ以下）、５５℃、ｐＨ７〜７．５で振とう培養した。セルムバイアル瓶内の汚泥中の細菌叢の変化とセルロースの分解状況を解析し、セルロース分解能を有する菌株を発見、単離した。
【００１２】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６として寄託されている（寄託日：平成１４日９年１９日）ので、この機関より入手することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株以外の本発明の新菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株と同様に消化汚泥などからセルロースに対する分解能を指標として選択することができ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及び／又はセルラーゼ遺伝子を解析することによって同定できる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の菌学的性質及び分類上の位置は以下の通りである。
【００１３】
（ａ）形態学的性状
菌学的性質については、形態的にはかん菌で、運動性があり、生理学的にはグラム陰性で、至適温度は５５℃、基質特異性は表１に示すとおりであった。
【００１４】
【表１】

【００１５】
（ｂ）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子
１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示すとおりである。なお、配列番号３は、配列番号２のセルラーゼ遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列を示す。
【００１６】
（ｃ）分類上の位置
１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性と生化学的分類試験結果から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、バチルス／クロストリジウムグループ、クロストリジウム属に属すものであると同定された。
しかしながら、下記に示されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子に対して、それぞれ９０％及び８０％以上の相同性を示す菌株は、既存の種に属する菌種としては存在しないことから、既存の種に属さない細菌であると同定した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と相同性の高い１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子としては、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．，　Ｇｉｓｈ，　Ｗ．，　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｗ．，　Ｍｙｅｒｓ，　Ｅ．Ｗ．　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．Ｊ．　（１９９０）　”Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ．”　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３−４１０）による遺伝子データベース上の既知遺伝子との比較と、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ　（Ｈｉｇｇｉｎｓ，　Ｄ．　Ｇ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｊ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｔ．　Ｊ．　（１９９６）　Ｕｓｉｎｇ　ＣＬＵＳＴＡＬ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２６６，　３８３−４０２）による相同性解析により、クロストリジウム　サーモセラム（ＤＳＭ１２３７；　Ｒａｉｎｅｙ，Ｆ．　Ａ．，　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ：　Ａｉｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９３；１７５（１５）４７７２−４７７９）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、クロストリジウム　アルドリッチの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、アセチビブリオ　セルロリチカス（ＡＴＣＣ３３２８８）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、バクテロイド　セルロソロヴァンス（ＡＴＣＣ３５６０３）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、クロストリジウム　スターコラリウムサブスピーシーズ　レプトスパタムの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を例示することができる。
それら１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株との間の相同性は、次の通りであった。
【００１７】
クロストリジウム　サーモセラム：
８８％（１−１６２３ｂｐ）
クロストリジウム　アルドリッチ：
８７％（１−１６２１ｂｐ）
アセチビブリオ　セルロリチカス：
８６％（４−１６０５ｂｐ）
バクテロイド　セルロソロヴァンス：
８５％（４−１６０５ｂｐ）
クロストリジウム　スターコラリウムサブスピーシーズ
のレプトスパタム：　８４％（１−１６２２ｂｐ）
このように、本発明の新菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の全長について９０％以上の相同性を示す遺伝子を持つ細菌株についての報告例はない。
【００１８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のセルラーゼ遺伝子の塩基配列と相同性の高いセルラーゼ遺伝子は、遺伝子バンクの検索結果とＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗによる相同性解析結果より、クロストリジウム　サーモセラムのｃｂｈＡ遺伝子（Ｚｖｅｒｌｏｖ，　Ｖ．Ｖ．，　Ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍａｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＣｂｈＡ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９９８；１８０（１２）３０９１−３０９９）と、クロストリジウム　サーモセラムのｃｅｌＫ遺伝子（Ｋａｔａｅｖａ，　Ｉ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＣｅｌＫ，　ａ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９９；１８１（１７）５２８８−５２９５）が挙げられる。それらセルラーゼ遺伝子のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株との間の相同性は、次の通りであった。
【００１９】
クロストリジウム　サーモセラムの
ｃｂｈＡ遺伝子：７９％（１−１１０９ｂｐ）
クロストリジウム　サーモセラムの
ｃｅｌＫ遺伝子：７２％（１−１００９ｂｐ）
このように、本発明の新菌株のセルラーゼ遺伝子と８０％以上の相同性を示す遺伝子を有する細菌種についても現在までに報告されていない。
【００２０】
以上の事実から、本発明の新菌株群は、以下の（１）〜（４）の点で、クロストリジウム属において他の菌種と区別される新菌種に属するものであると考えられる。
（１）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を有する；
（２）セルラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を有する；
（３）セルロース分解能を有する；且つ
（４）セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中、特にメタン発酵汚泥中の酸発酵及びメタン発酵微生物群内での定着及び増殖能を有する。
【００２１】
また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の近縁株も幾つか発見されたが、それらの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号１及び配列番号２とそれぞれ９０％以上の相同であるか、又は実質的に相同であった。このことから、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の近縁で上記新菌株群があると見られ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株はその代表株であると考えられる。図５に上記新菌株群の系統学的位置を示す。
【００２２】
（ｄ）培養方法
上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株に代表される新菌株の培養は、以下のようにして行うことができる。
培地としては、クロストリジウム属細菌に使用される培地であれば、いずれの培地も用いることができるが、表２に示した培地を用いるのが好ましい。培養液は、予め煮沸や窒素ガスでの置換により脱酸素し、キャップ付き試験管などに分注して気相部を窒素ガス置換して完全に嫌気状態とする。培養温度は、５５℃から６０℃が適当であり、ｐＨは中性域に保つことが望ましい。
【００２３】
【表２】

【００２４】
廃棄物・廃水の処理方法
本発明の新菌株を用いたセルロースを含有する廃棄物及び／又は廃水の処理は、典型的には、上記培養条件で培養した本菌株を含む微生物培養液又はその乾燥菌体を、発酵槽（酸発酵槽、メタン発酵槽など）に添加することにより行われる。この際、本発明の菌株の増殖を補助する無機塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン、炭素源を同時に添加しても良い。
添加される本菌株の量は、処理対象の廃棄物に含まれるセルロースの量や投入する発酵槽の運転状況などに応じて任意に定めることができるが、典型的には、発酵槽内の最終濃度で１０^６〜１０^１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度である。
【００２５】
上記のように本発明の菌株を添加する必要があるのは、処理対象となる環境中に本菌株が存在しない場合である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株あるいはその近縁株がもともと存在している環境では、本菌株を人為的に添加せずに、既存の本菌株を利用して、そこに含まれるセルロースを分解処理することができる。
そのような土着の本菌株の存在については、本菌株に特有な遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法を用いた検出により、複数の高温メタン発酵においてその存在を確認することができる。そのような本発明の新菌株がもともと存在する環境あるいは試料としては、メタン発酵槽、酸生成槽、余剰汚泥、ゴミ埋め立て地土壌、堆肥、家畜糞尿、水田土壌、底泥などを例示することができる。
好ましくは、これら処理対象となる環境に下記の培養条件及び／又は後述の増殖促進法を適用することにより、本発明の新菌株を定着且つ増殖させることができる。
【００２６】
好ましい培養環境への調整についての詳細は下記の通りである。
先ず、本発明の新菌株は、嫌気性細菌であり、分子状酸素が存在する環境下では増殖することが出来ないため、分子状酸素が存在する環境で本菌株を使用する場合は、不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム、アルゴンあるいは炭酸ガスなどを用いた曝気を行うことにより環境中に存在する酸素の除去を行う。また、硫化ナトリウム、システイン塩酸などの還元剤を添加しても良い。環境中に好気性の微生物が存在する場合は、好気性微生物が利用可能な有機物、例えば生ゴミ、余剰汚泥、し尿、デンプン、グルコースなどを加えることにより、予め環境から酸素を除去しても良い。
【００２７】
また、処理対象となる環境に本菌株の増殖を補助する無機塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン、炭素源を同時に添加しても良い。炭素源は添加してもよいが、本発明の増殖促進法においては、主としてセルロースが存在する条件下で微生物を増殖させるためセルロースが炭素源となるので、通常、炭素源の添加の必要はない。炭素源を添加する場合は、セルロース及びその中間代謝基質であるセロビオースを添加するのが好ましい。ただし、中間代謝基質が高濃度に存在すると本菌株によるセルロースの分解を阻害する場合があるので、セルロース存在下でセロビオースの添加を行う場合は、その濃度が高くならないように留意する必要がある。またセルロースを多く含有する紙ゴミや、パルプや紙の製造廃水などを添加しても良い。酵母エキス、ペプトンなどのタンパク質を豊富に含む炭素源を添加しても良いが、また、これら以外の炭素源（例えば、安息香酸、グルタミン酸）であっても構わない。ただし、セルロース、セロビオース以外の上記の炭素源を用いた場合、セルロース分解菌以外の微生物も同時に増殖することが考えられるため、実際の使用に当たってはセルロースあるいはセルロースを多く含む廃棄物を炭素源として用いることが望ましい。
【００２８】
新菌株の増殖促進法
メタン発酵汚泥や余剰汚泥など、本発明の菌株が存在する環境中には本菌株以外の多種多様な微生物が数多く存在している。本菌株をこの様な微生物の群集内で利用する場合、純粋培養系とは異なり、それぞれ異なった基質特異性や機能を持つ微生物群との増殖競合が生じ、必ずしも本菌株の微生物群集内での定着及び増殖を順調になしうるとは限らない。
本発明のクロストリジウム属に属する新菌株は、そのような環境において比較的高温で増殖が促進されることが分かった。
【００２９】
すなわち、本発明の増殖促進法は、上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のような新菌株を含む処理対象となる環境を高温に保つことを特徴とするものである。本菌株を含む環境の培養温度は、高温度域、即ち４５℃〜６５℃に維持するのが好ましく、５０〜６０℃になるように制御することがより好ましい。
上記のように培養環境を高温度に維持することにより、中温性細菌の増殖は抑制され、高温性細菌である本発明の菌株の増殖は促進される。また、処理対象となる環境中にセルロースなどの本菌株の増殖基質が十分に存在しない場合は、その培養環境中に増殖基質であるセルロース及びその中間代謝基質であるセロビオースなどを添加することにより、本発明の菌株を優占的に増殖させることもできる。
【００３０】
メタン発酵汚泥など、水素生成酢酸化菌やメタン生成細菌が存在する環境において上記増殖促進法を適用することにより、本発明のセルロース分解菌によるセルロースの分解除去を促進することができる。この場合、セルロースを含む処理対象の環境を高温度に維持する。その好ましい温度条件は上述の通りである。これにより、セルロース類は本発明の菌株の作用により糖、エタノール、脂肪酸、水素へ分解され、そして、それらの産物は、最終的に酸生成細菌及びメタン生成細菌の作用によりメタンガスへ転換され、かくして、効率的にメタンガスを回収することができる。本法によって増殖が促進される菌株として、下記実施例ではＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を例示しているが、これに限定されるわけではない。
【００３１】
セルロース分解除去剤
本発明の新菌株を含有するセルロース分解除去剤は、新菌株の培養物又はその乾燥菌体を含んでなる。必要であれば、菌体をその新菌の生存及び生物活性を維持するために生物学的に許容される公知の増量剤等と混合した組成物として提供してもよい。その形態は液体でも固体でもよく、保存及び運搬等の条件に適したものであればよい。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
〔実施例１〕
発明菌株によるセルロースの分解
発明者らによってメタン発酵汚泥より単離されたクロストリジウム属に属する嫌気性細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（以下、単に「ＪＣ３株」という）によるセルロースの分解効果を調査するために、セルロースパウダーを用いた回分式の分解実験を行った。
セルロース分解実験には、４５ｍｌ容量のブチルゴムキャップ付き試験管を用いた。炭素源としてセルロースパウダーを８ｇ／Ｌ，　酵母エキスを２ｇ／Ｌ含む嫌気性細菌用の培地（表２）を予め脱酸素し、試験管に１０ｍｌ分注した。その後、スクリューキャップとブチルゴム栓で試験管を密閉した後、試験管の気相部を窒素ガスで置換した。
【００３３】
試験管を高圧滅菌処理後、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、５５℃温度条件下、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養１週間後、ガス発生量（ｍｌ）をシリンジで測定した後、生成ガスの水素含有量（ガスクロマトグラフによる測定）を測定し水素発生量を算定した。培養液５ｍｌを遠心分離し、沈殿物は残存セルロース量の解析に供した。また遠沈上清は、０．２μｍフィルターで濾過し、高速液体クロマトグラフィーによる脂肪酸（乳酸、蟻酸、酢酸、酪酸など）の分析と、有機物濃度（化学的酸素要求量：ＣＯＤ、重クロム酸カリウム法による）の分析に供した。
図１には、試験管内のセルロースと、セルロース分解に伴って生産される中間代謝有機物のＣＯＤをベースとした有機物量のマスバランスを示した。図に示すように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、１週間の培養で投入したセルロースの約８０％を分解し、糖、エタノール、脂肪酸、水素に転換した。
【００３４】
〔実施例２〕
発明微生物のセルロースでの生育に及ぼす温度の影響
発明者らによって、メタン発酵汚泥より単離されたクロストリジウム属に属する細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株がセルロースを炭素源として増殖する場合において、その増殖に及ぼす培養温度の影響を調査するために、異なる培養温度条件下でセルロースを炭素源とする分解実験を行った。ＪＣ３株の培養は、セルロースを含む培地（表２）を用いて行った。培養温度は、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃の４段階に設定し、分光光度計を用いて６６０ｎｍ波長で吸光度を測定した（培養開始後６日目）。
【００３５】
図２には、各培養温度条件下におけるＪＣ３株のセルロースでの増殖の様子を示した。培養開始時には、予めセルロース培地で前培養した菌液を、０．０１％（ｖ／ｖ）加えた。なお、菌体を含む培地の培養開始前の吸光度（ＯＤ：　ＯＰＴＩＣＡＬ　ＤＥＮＳＩＴＹ）は、約０．１１であった。この値を各サンプルのＯＤ値から差し引いた値を図２にプロットした。図２より、５５℃温度条件下での培養において最もＪＣ３株の増殖が促進され、培地の吸光度は約０．９に達した。４５℃においてもＪＣ３株の増殖が観察され、５５℃培養の約６０％の吸光度を示した。一方、６５℃、７５℃での培養では、顕著な菌体の増殖（吸光度の増加）は、見られなかった。これより、ＪＣ３株の至適増殖温度は、５０℃〜６０℃の範囲であることが分かった。すなわち、本発明の菌株を含む環境を高温度域（５０℃〜６０℃）に維持することにより、クロストリジウム属に属するセルロース分解菌ＪＣ３株のセルロースでの増殖、換言すればセルロースの分解を促進できることが分かった。
【００３６】
〔実施例３〕
セルロース処理メタン発酵汚泥における発明菌株の増殖
本発明のセルロース分解菌ＪＣ３株は、それ単独でもセルロースの分解処理に使用できるが、
酸生成細菌やメタン生成細菌など、種々の微生物が混在するメタン発酵槽汚泥中でも使用することができる。この場合、ＪＣ３株により加水分解・酸生成されたセルロースは、他の細菌群（水素生成酢酸化菌、メタン生成細菌など）の作用により、炭酸ガスとメタンガスにまで転換される。
一般的なメタン発酵汚泥中には、異なった基質特異性や温度依存性を持つ嫌気性細菌群が数多く存在している。本発明菌株をこの様な微生物の群集内で利用する場合、純粋培養系とは異なり、それぞれ異なった基質特異性や機能を持った細菌群の増殖競合が生じ、必ずしも発明菌株の優占的増殖と微生物群集内での定着が行われるとは限らない。
そこで、一般的なメタン発酵汚泥を用いたセルロース分解実験を行い、メタン発酵微生物群集内での土着の発明菌株の増殖の様相を調査した。また、本発明菌株を含む環境を高温度に維持することにより、発明菌株が増殖促進が可能かについても検証を行った。
【００３７】
セルロースのメタン発酵実験は、図３に示したラボスケールのメタン発酵槽を用いて行った。し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っているメタン発酵槽より採取した汚泥１．２Ｌに、表３の無機培地１．２　Ｌとセルロースパウダー４３．２ｇを加え、５９日間、半連続培養を行った。経時的にメタンガスの生成量をモニタリングし、投入セルロースの８５％以上がメタンガスへと転換された時点で、セルロースを含む表３の培地を発酵槽内滞留時間が２５日となる様に半連続投入した。この実験系ではメタン発酵汚泥に存在する土着のＪＣ３株もしくはその近縁株の増殖の様相を調査するため、ＪＣ３株の添加は行わなかった。また、培養温度が発明菌株の増殖に及ぼす影響を調査するために、培養温度は高温（５５℃）と中温（３５℃）に設定した。
【００３８】
【表３】

【００３９】
連続培養開始時（０日目）、培養２０日目、培養４１日目、培養終了時（５９日目）に汚泥をサンプリングし、真性細菌の１６Ｓ　ｒＤＮＡを標的にしたＰＣＲ法による遺伝子増幅、増幅した遺伝子混合物のＤＧＧＥ法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）による分離、分離した微生物遺伝子（ＤＮＡバンド）の遺伝子配列の決定と濃度の測定により、微生物群集内に存在するＪＣ３株の同定と半定量を行った。また、実験開始時と終了時の汚泥については、別途セルロースを単一炭素源としたメタン生成活性（セルロース分解活性）の測定を行った。
図４には、各培養日数でのメタン発酵汚泥の微生物群集の構造をＰＣＲ法およびＤＧＧＥ法により解析した結果を示した。ＤＧＧＥ法では、試料中の微生物群の存在をＤＮＡバンドとして示すことができる。これより、植種汚泥中には存在の認められなかった（ＤＧＧＥ法の検出限界以下）Ｃ１バンドに対応する細菌が、高温培養汚泥では培養２０日目にはバンドとして検出される様になった。また、培養の継続に伴いＣ１バンドに対応する細菌のポピュレーション（存在割合）が増大している（Ｃ１バンドの濃度の上昇）ことが分かる。このＣ１バンドの遺伝子配列を決定したところ、発明株ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）遺伝子の配列と１００％の相同性（約２００塩基の断片）が得られた。この発明菌株のメタン発酵微生物群集内での優占化により、高温メタン発酵汚泥のセルロースからのメタン生成能は培養開始前の汚泥の５０倍にまで達した。一方中温培養汚泥では、培養後４１日を経た時点でも高温培養汚泥中にみられたＣ１バンド（ＪＣ３株）は検出されず、セルロース分解活性も高温培養汚泥の数分の一程度であった。
【００４０】
以上の結果より、高温度条件下（５５℃）でのメタン発酵汚泥のセルロースを炭素源とした培養により、ＪＣ３株と同一もしくは近縁なセルロース微生物を選択的に増殖促進できることが明らかになった。また、ＪＣ３株に近縁なセルロース分解微生物の高密度集積化を行うことにより、汚泥のセルロース分解能を飛躍的に向上させることが可能であることが分かった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は、セルロース分解能を有する新規な一群の嫌気性微生物を提供する。この微生物により、難分解性有機物であるセルロースを多く含む有機性廃棄物・廃水等を効率的に分解することができる。また、本発明の菌株群をメタン発酵汚泥中で使用することにより、セルロースをエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。
本発明の増殖促進法をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のような新菌株に適用することにより、セルロースを含有する廃棄物及び／又は廃水処理において、本菌株の増殖促進、即ちセルロース分解を促進することができる。
【００４２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明菌株のセルロースの加水分解特性を示す。
【図２】図２は、本発明菌株のセルロースでの生育に及ぼす培養温度の影響を示す。
【図３】図３は、セルロース分解実験に用いたメタン発酵槽の概要を示す。
【図４】図４は、各培養日数でのセルロース分解メタン発酵汚泥の微生物群集の構造をＰＣＲ法およびＤＧＧＥ法により解析した結果を示す。
【図５】図５は、新規セルロース分解菌株群の系統学的位置を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a new strain belonging to the genus Clostridium having the ability to degrade cellulose, a treatment method using the same, a method for promoting the growth thereof, and a cellulolytic degrading agent containing the same.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, the amount of waste discharged from homes and various industries has been increasing with the increase in population and the sophistication of life. Above all, wastes containing high organic substances such as sewage sludge and garbage have been mainly treated by landfill, ocean dumping and incineration. However, Japan is suffering from a constant shortage of landfills, and there is a growing concern about the generation of dioxins and the like associated with the incineration of organic waste. Furthermore, with the revision of the London Treaty (Kazumi Kishibe, revision of the Annex to the London Treaty, Bioscience and Industry, 1994, Vol. 52, No. 7), the dumping of sewage sludge and industrial waste into the ocean and incineration at sea are prohibited. It was decided to be. Against this background, it is urgent to develop an appropriate method for treating organic waste.
[0003]
BACKGROUND ART Methane fermentation technology is known as a biological treatment and volume reduction method for wastewater sludge and livestock waste. In this technique, organic substances can be converted to methane gas as energy by cooperative play of a plurality of anaerobic microorganisms under anaerobic environmental conditions. However, in the methane fermentation treatment of sewage sludge, garbage, waste paper, wastewater from paper mills and pulp mills containing a large amount of cellulose, which is a hard-to-degrade solid organic substance, the hydrolysis and acid generation reactions are rate-limiting. It requires a long treatment time of about 30 to 40 days, and the organic matter decomposition rate (conversion rate to methane) is considerably lower than that of easily decomposable wastewater (De Baere L., Anaerobic digestion). of solid waste: state-of-the-art, Water Sci. Technol., 2000; 41 (3): 283-90). In other words, in order to establish a highly efficient organic waste treatment technology centering on methane fermentation, microorganisms that have a high cellulose degradability and can grow under anaerobic conditions such as methane fermentation sludge The development of a growth promotion method is awaited.
[0004]
Studies on cellulolytic microorganisms have been relatively long, including microorganisms that live in the lumen of herbivores (lumens) and (Hungate RE, {Methane-formation-and-cellulose-digestion-biochemical-economy-ecology-ecology-ecology-ecology-ecology. 43: 117-20), compost and soil (Clostridium @ thermocellum, Mcbee @ RH. @ The @ Characteristics @ of @ Clostridium @ thermocellum. @ Int. @ J. @ Syst.Bacteriol., 50-Ct.5-Cter .. ..... Ostridium stercorarium, Madden R.H. Isolation and Characterization of Clostridium stracorarium sp nov, Cellulolytic Thermophile Int J. Syst Bacteriol, 1983; 33:. 837-840, Cellulomonas josui, Sukhumavasi J., Clostridium josui sp. Nov., a Cellulolytic, Moderate Thermolytic Specifications from Thai Compost. Int. J. Syst.Bacteriol. 38: 179-182), bottom mud (Thermoga neapolitana, Jannasch HW, Thermotoga neapolitanaｐsp. Nov. Of the extreme thermother thermistor. Wiegelii, {Cook} GM. \ Characterization \ of \ a \ New \ Obligately \ Anaerobic \ Thermophile, \ Thermanaerobacter \ wiegelii \ sp. \ Nov. Int. t. Bacteriol. , {1996; 46: 123-127).
[0005]
However, there was significantly less information on the microbial communities that dominantly contribute to cellulose degradation in the methane fermentation microbial communities for the treatment of cellulose-containing waste and wastewater.
There have been reported several examples of research on a so-called bioaugmentation technique, which aims to enhance the resolution of cellulose by adding an isolated cellulose-decomposing bacterium to an environment in which a plurality of microorganism groups are mixed, such as methane fermentation. Mladenovska @ Z. In the methane fermentation of manure, administration of a cellulolytic bacterium was carried out in order to promote the decomposition of fibrous components such as cellulose contained therein. However, colonization of the degrading bacteria administered from outside the system in the methane fermentation system has not been successful, and the cellulolytic activity could not be increased (Mladenovska Z., Bioaugmentation of a mesophilic biogas reactor by anaerobic xylanetic-xylanolytic-). cellulolytic \ bacteria, \ Anaerobic \ Digestion, \ 2001; 183-188). In this way, when utilizing useful bacteria in microbial communities such as methane fermentation where various anaerobic microbial communities exist, not only high resolution for pollutants but also ability to colonize microbial communities It is necessary to select a bacterium to have and develop a method of using the bacterium.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention selects an anaerobic microorganism having a high resolution for cellulose, which is a hardly degradable solid organic substance, and uses this to rapidly degrade cellulose contained in organic waste and wastewater. The purpose is to provide a means for:
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, in a community of cellulolytic methane-fermenting microorganisms, have found a group of new strains in which the number of bacteria increases with cellulose degradation, and the strains of these strains The present inventors have found that maintaining the culture environment at a high temperature promotes the growth of a group of new strains of the present invention, and have completed the present invention.
That is, the present invention relates to a new strain group belonging to Clostridium, which has the ability to degrade cellulose and has a nucleotide sequence of 16SΔrRNA gene showing 90% or more homology with the sequence described in SEQ ID NO: 1.
Furthermore, in the novel strain of the present invention, the nucleotide sequence of the cellulase gene shows 80% or more homology with the sequence of SEQ ID NO: 2. One of the new strains of the present invention is, for example, Clostridium @ sp. JC3 strain (FERM @ P-19026).
[0008]
In the new strain group of the present invention, the homology of the 16SΔrRNA gene may be 90% or more, but is preferably 93% or more, more preferably 95% or more in order to distinguish it from other bacterial species. In addition, the homology of the cellulase gene may be 80% or more, but is preferably 83% or more, more preferably 85% or more in order to distinguish it from other bacterial species.
The new strain of the present invention may have a resolution for cellulose as described above, but preferably has a resolution for cellobiose.
[0009]
In another aspect, the invention relates to any of the aforementioned new strains, for example, Clostridium sp. Provided is a method for treating organic waste and / or wastewater, comprising decomposing cellulose contained in organic waste and / or wastewater using JC3 strain.
The present invention further provides a method for decomposing cellulose contained in the organic waste and / or wastewater by using the new strain together with acid fermentation and methane fermentation microorganisms in organic waste and / or wastewater containing cellulose. Provided is a methane fermentation method characterized by processing and recovering as methane gas.
Further, the present invention provides a methane fermentation method characterized by maintaining an organic waste and / or wastewater, which is a culture environment of the new strain, at a high temperature. The culture environment is controlled to be preferably 45 ° C to 65 ° C, more preferably 50 ° C to 60 ° C.
[0010]
In still another aspect, the present invention provides a method for promoting the growth of a new strain, which comprises maintaining an organic waste and / or wastewater containing cellulose, which is a culture environment for the new strain, at a high temperature.
In still another aspect, the present invention provides a cellulose degradation-removing agent comprising the novel strain.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As an example of the new strain group of the present invention, Clostridium sp. JC3 strain can be mentioned.
Clostridium @ sp. The JC3 strain was isolated as follows.
100 mL of digested sludge (dry weight: about 15 g) collected from a methane fermentation tank that treats night soil, septic tank sludge, and garbage is placed in a cell vial, 1 g of cellulose powder, and ammonia nitrogen (130 mg-N / L). , Potassium phosphate (50 mg-P / L) and yeast extract (50 mg) under anaerobic conditions (dissolved oxygen concentration 0 mg / L, {redox potential} -200 mV or less) at 55 ° C., pH 7 to 7.5. The cells were cultured with shaking. By analyzing the change of bacterial flora in cellulose sludge in cellulose vials and the degradation status of cellulose, strains having cellulose degradability were found and isolated.
[0012]
The Clostridium @ sp. The JC3 strain has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganisms Depositary as FERM @ P-19026 (deposit date: 19, 2002, 19), and can be obtained from this institution. Clostridium @ sp. A new strain of the present invention other than the JC3 strain is Clostridium sp. As in the case of the JC3 strain, the resolution for cellulose can be selected from digested sludge or the like as an index, and can be identified by analyzing the 16SΔrRNA gene and / or cellulase gene.
Clostridium @ sp. The mycological properties and taxonomic position of the JC3 strain are as follows.
[0013]
(A) Morphological properties
The mycological properties were morphologically bacillus, motile, physiologically gram-negative, the optimal temperature was 55 ° C., and the substrate specificity was as shown in Table 1.
[0014]
[Table 1]

[0015]
(B) 16S rRNA gene and cellulase gene
The nucleotide sequences of the 16SΔrRNA gene and the cellulase gene are as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. SEQ ID NO: 3 shows the deduced amino acid sequence encoded by the cellulase gene of SEQ ID NO: 2.
[0016]
(C) Classification location
From the homology of the base sequence of the 16S @ rRNA gene and the result of the biochemical classification test, Clostridium @ sp. The JC3 strain was identified as belonging to the Bacillus / Clostridium group, a genus Clostridium.
However, as shown below, Clostridium @ sp. Strains showing 90% and 80% or more homology to the 16SΔrRNA gene and the cellulase gene of the JC3 strain, respectively, do not exist as strains belonging to the existing species. Identified.
Clostridium @ sp. The 16S rRNA gene having a high homology to the base sequence of the 16S rRNA gene of the JC3 strain includes BLAST search (Altschul, @SF, @Gish, @W, Miller, @W, Myers, @EW, & Lipman, @D J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410) and comparison with known genes on a gene database, and CLUSTAL W (Higgins, D. G., Thompson, J. D. and Gibson, T. J. (1996) Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Metho. s Enzymol., 266, 383-402), a Clostridium thermocellum (DSM1237; ａRainey, F. A., Phylogenetic analysisｓｉof anaerobic thermophilic bacteria: Aci. ) 4772-4779) 16S rRNA gene, Clostridium aldrich 16S rRNA gene, Acetibrio cellulolyticus (ATCC 33288) 16S rRNA gene, Bacteroid cellulosolovans (ATCC35603) 16S rRNA gene, Clostridium} It can be exemplified 16S rRNA gene terpolymers Kola potassium subsp Reputosupatamu.
Clostridium sp. Of those 16S rRNA genes. The homology with the JC3 strain was as follows.
[0017]
Clostridium thermocellum:
88% (1-1623 bp)
Clostridium Aldrich:
87% (1-1621 bp)
Acetivibrio Cellulolyticus:
86% (4-1605 bp)
Bacteroid @ Cellulo Solovance:
85% (4-1605 bp)
Clostridium @ Starcorarium Subspecies
Leptospatum: $ 84% (1-1622 bp)
Thus, there is no report on a bacterial strain having a gene showing 90% or more homology with respect to the full length of the 16SΔrRNA gene of the novel strain of the present invention.
[0018]
Clostridium @ sp. The cellulase gene having high homology to the base sequence of the cellulase gene of the JC3 strain was obtained from the gene bank search results and the results of homology analysis using CLUSTAL @ W, based on the cbhA gene of Clostridium thermocellum (Zverlov, << V.V., << Multidominium @ structural @ cellulosomolysis >>). J. Bacteriol. 1998; 180 (12) 3091-3099, and the celK gene of Clostridium thermocellum (Kataeva, A., s. a., s.．,,．．, Ｃｌ,．,．,．,．,．,．,．, Ｃｌ, ｏ,．, ｏ, ａ,,,, ｏ, Clostridium thermocellulum cellibiohydrolase CbhA. . Ase gene encoding CelK, a major cellulosome component of Clostridium thermocellum:. Evidence for gene duplication and recombination J.Bacteriol, 1999; include 181 (17) 5288-5295). These cellulase genes Clostridium @ sp. The homology with the JC3 strain was as follows.
[0019]
Clostridium Thermocellum
cbhA gene: 79% (1-1109 bp)
Clostridium Thermocellum
celK gene: 72% (1-1009 bp)
As described above, a bacterial species having a gene showing 80% or more homology with the cellulase gene of the novel strain of the present invention has not yet been reported.
[0020]
From the above facts, the new strain group of the present invention is considered to belong to a new strain that is distinguished from other strains in the genus Clostridium in the following points (1) to (4).
(1) the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene has 90% or more homology with the sequence of SEQ ID NO: 1;
(2) the base sequence of the cellulase gene has 80% or more homology with the sequence of SEQ ID NO: 2;
(3) having a cellulose decomposability; and
(4) It has the ability to colonize and proliferate in acid fermentation and methane fermentation microorganisms in organic waste and / or wastewater containing cellulose, especially in methane fermentation sludge.
[0021]
Also, Clostridium @ sp. Although some closely related strains of the JC3 strain were also found, their nucleotide sequences of the 16SΔrRNA gene and the cellulase gene were 90% or more homologous or substantially homologous to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. Met. From this, Clostridium @ sp. It seems that the above-mentioned new strain group is present in close relation to the JC3 strain, and Clostridium @ sp. The JC3 strain is considered to be its representative strain. FIG. 5 shows the phylogenetic position of the new strain group.
[0022]
(D) Culture method
The above Clostridium @ sp. The culture of a new strain represented by the JC3 strain can be performed as follows.
As the medium, any medium can be used as long as it is a medium used for a bacterium belonging to the genus Clostridium, but the medium shown in Table 2 is preferably used. The culture solution is deoxygenated by boiling or replacing with nitrogen gas in advance, dispensed into a test tube with a cap or the like, and the gas phase is replaced with nitrogen gas to make it completely anaerobic. The cultivation temperature is suitably from 55 ° C to 60 ° C, and the pH is desirably maintained in a neutral range.
[0023]
[Table 2]

[0024]
Waste and wastewater treatment methods
The treatment of waste containing a cellulose and / or wastewater using the novel strain of the present invention is typically performed by subjecting a microorganism culture solution containing the present strain cultured under the above culture conditions or a dried bacterial cell thereof to a fermenter ( (Acid fermentation tank, methane fermentation tank, etc.). At this time, inorganic salts (nitrogen source, phosphorus source, etc.), vitamins, and carbon sources which assist the growth of the strain of the present invention may be added at the same time.
The amount of the strain to be added can be arbitrarily determined according to the amount of cellulose contained in the waste to be treated, the operating condition of the fermenter to be charged, and the like. 10 in concentration⁶-10¹¹It is about cells / mL.
[0025]
As described above, it is necessary to add the strain of the present invention when the present strain does not exist in the environment to be treated. Clostridium @ sp. In an environment in which the JC3 strain or its closely related strain originally exists, the cellulose contained therein can be degraded using the existing strain without artificially adding the strain.
The presence of such an indigenous bacterial strain can be confirmed in a plurality of high-temperature methane fermentations by detection using a PCR method targeting a gene specific to the bacterial strain. Examples of the environment or sample in which such a new strain of the present invention originally exists include a methane fermentation tank, an acid generation tank, excess sludge, garbage landfill soil, compost, livestock manure, paddy soil, bottom mud, and the like. it can.
Preferably, the novel strain of the present invention can be established and grown by applying the following culture conditions and / or the growth promotion method described below to the environment to be treated.
[0026]
The details of adjustment to a preferred culture environment are as follows.
First, since the new strain of the present invention is an anaerobic bacterium and cannot grow in an environment where molecular oxygen is present, it is inactive when the strain is used in an environment where molecular oxygen is present. Oxygen present in the environment is removed by aeration using a gas, for example, nitrogen, helium, argon or carbon dioxide. Further, a reducing agent such as sodium sulfide or cysteine hydrochloric acid may be added. If aerobic microorganisms are present in the environment, organic matter available to the aerobic microorganisms, such as garbage, excess sludge, night soil, starch, glucose, etc., may be used to remove oxygen from the environment in advance. .
[0027]
Further, inorganic salts (nitrogen source, phosphorus source, etc.), vitamins, and carbon sources that assist the growth of the present strain may be simultaneously added to the environment to be treated. Although a carbon source may be added, in the growth promoting method of the present invention, cellulose is mainly used as a carbon source for growing microorganisms under conditions where cellulose is present. . When a carbon source is added, it is preferable to add cellulose and cellobiose, an intermediate metabolite thereof. However, if the intermediate metabolic substrate is present at a high concentration, it may inhibit the decomposition of cellulose by the present strain, and therefore, when cellobiose is added in the presence of cellulose, care must be taken not to increase the concentration. Further, paper waste containing a large amount of cellulose, pulp or paper production wastewater, or the like may be added. Carbon sources rich in proteins such as yeast extract and peptone may be added, but other carbon sources (eg, benzoic acid, glutamic acid) may be used. However, when using the above carbon source other than cellulose and cellobiose, it is considered that microorganisms other than the cellulose-degrading bacterium may be simultaneously grown, so in actual use, cellulose or waste containing a large amount of cellulose is used as the carbon source. It is desirable.
[0028]
New strain growth promotion method
In an environment where the strain of the present invention exists, such as methane fermentation sludge and surplus sludge, there are many various microorganisms other than the present strain. When this strain is used in a community of such microorganisms, unlike a pure culture system, growth competition with microorganisms having different substrate specificities and functions occurs, and the strain does not necessarily exist in the microorganism community of the strain. Fixation and proliferation cannot always be achieved smoothly.
It was found that the growth of the new strain belonging to the genus Clostridium of the present invention was promoted at a relatively high temperature in such an environment.
[0029]
That is, the growth promotion method of the present invention uses the above Clostridium @ sp. It is characterized in that the environment to be treated including a new strain such as the JC3 strain is kept at a high temperature. The culture temperature of the environment containing the present strain is preferably maintained in a high temperature range, that is, 45 ° C to 65 ° C, and more preferably controlled to be 50 ° C to 60 ° C.
By maintaining the culture environment at a high temperature as described above, the growth of mesophilic bacteria is suppressed, and the growth of the thermophilic bacterium of the present invention is promoted. Further, when the growth substrate of the present strain such as cellulose is not sufficiently present in the environment to be treated, by adding cellulose as a growth substrate and cellobiose as an intermediate metabolite to the culture environment, The strains of the invention can also be grown predominantly.
[0030]
By applying the above-mentioned growth promotion method in an environment in which hydrogen-producing acetic acid bacteria or methane-producing bacteria are present, such as methane fermentation sludge, decomposition and removal of cellulose by the cellulolytic bacteria of the present invention can be promoted. In this case, the environment to be treated containing cellulose is maintained at a high temperature. The preferred temperature conditions are as described above. Thereby, the celluloses are broken down into sugars, ethanol, fatty acids, hydrogen by the action of the strains of the present invention, and their products are finally converted to methane gas by the action of acid-producing bacteria and methanogens, thus. Thus, methane gas can be efficiently recovered. As a strain whose growth is promoted by this method, Clostridium sp. Although the JC3 strain is exemplified, it is not limited thereto.
[0031]
Cellulose decomposition remover
The cellulose-decomposing / removing agent containing the new strain of the present invention comprises a culture of the new strain or a dried cell thereof. If necessary, the cells may be provided as a composition mixed with a known biologically acceptable bulking agent to maintain the survival and biological activity of the new cells. The form may be a liquid or a solid, as long as it is suitable for conditions such as storage and transportation.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0032]
【Example】
[Example 1]
Degradation of cellulose by the inventive strain
The anaerobic bacterium Clostridium @ sp. Belonging to the genus Clostridium isolated from the methane fermented sludge by the inventors. In order to investigate the decomposition effect of cellulose by the JC3 strain (hereinafter, simply referred to as “JC3 strain”), a batch-type decomposition experiment using cellulose powder was performed.
For the cellulose decomposition experiment, a test tube with a butyl rubber cap having a capacity of 45 ml was used. A medium for anaerobic bacteria (Table 2) containing 8 g / L of cellulose powder and 2 g / L of yeast extract as a carbon source was previously deoxygenated, and 10 ml was dispensed into a test tube. Thereafter, the test tube was sealed with a screw cap and a butyl rubber stopper, and the gas phase of the test tube was replaced with nitrogen gas.
[0033]
After autoclaving the test tube, Clostridium @ sp. 10 JC strains⁶The cells were inoculated to give cells / mL, and shaking culture was performed at 100 rpm under a temperature condition of 55 ° C. One week after the culture, the gas generation amount (ml) was measured with a syringe, and then the hydrogen content of the generated gas (measured by gas chromatography) was measured to calculate the hydrogen generation amount. 5 ml of the culture solution was centrifuged, and the precipitate was subjected to analysis of the amount of residual cellulose. The centrifuged supernatant was filtered through a 0.2 μm filter, analyzed for fatty acids (lactic acid, formic acid, acetic acid, butyric acid, etc.) by high performance liquid chromatography, and analyzed for organic matter concentration (chemical oxygen demand: COD, potassium dichromate method). ).
FIG. 1 shows the mass balance of cellulose in a test tube and the amount of organic matter based on COD of an intermediate metabolic organic matter produced as a result of decomposition of cellulose. As shown in the figure, Clostridium @ sp. The JC3 strain decomposed about 80% of the input cellulose in one week of culture and converted it into sugar, ethanol, fatty acid and hydrogen.
[0034]
[Example 2]
Effect of temperature on growth of inventive microorganisms on cellulose.
By the inventors, a bacterium Clostridium {sp. When the JC3 strain was grown using cellulose as a carbon source, a decomposition experiment was performed using cellulose as a carbon source under different culture temperature conditions in order to investigate the effect of culture temperature on the growth. The culture of the JC3 strain was performed using a medium containing cellulose (Table 2). The culture temperature was set at four stages of 45 ° C., 55 ° C., 65 ° C., and 75 ° C., and the absorbance was measured at a wavelength of 660 nm using a spectrophotometer (6 days after the start of the culture).
[0035]
FIG. 2 shows the state of growth of the JC3 strain on cellulose under each culture temperature condition. At the start of the culture, 0.01% (v / v) of a bacterial solution pre-cultured in a cellulose medium was added. The absorbance (OD: \ OPTICAL \ DENSITY) of the medium containing the cells before the start of the culture was about 0.11. The value obtained by subtracting this value from the OD value of each sample was plotted in FIG. 2, the growth of the JC3 strain was most promoted in the culture under the temperature condition of 55 ° C., and the absorbance of the medium reached about 0.9. The growth of the JC3 strain was observed even at 45 ° C., showing an absorbance of about 60% of that at 55 ° C. On the other hand, in the culture at 65 ° C. and 75 ° C., no remarkable cell growth (increase in absorbance) was observed. From this, it was found that the optimal growth temperature of the JC3 strain was in the range of 50 ° C to 60 ° C. That is, by maintaining the environment containing the strain of the present invention in a high temperature range (50 ° C. to 60 ° C.), it is possible to promote the growth of cellulose-degrading bacteria JC3 belonging to the genus Clostridium on cellulose, in other words, the degradation of cellulose. I understood.
[0036]
[Example 3]
Growth of inventive strains in cellulose-treated methane fermentation sludge
The cellulose-degrading bacterium JC3 strain of the present invention can be used alone for cellulose degradation treatment.
It can also be used in methane fermenter sludge mixed with various microorganisms such as acid-producing bacteria and methanogens. In this case, the cellulose hydrolyzed and produced by the JC3 strain is converted into carbon dioxide and methane by the action of other bacteria (hydrogen-producing acetic acid bacteria, methanogenic bacteria, etc.).
In general methane fermentation sludge, there are many anaerobic bacteria with different substrate specificities and temperature dependencies. When the strain of the present invention is used in a community of such microorganisms, unlike a pure culture system, growth competition of bacteria having different substrate specificities and functions occurs, and the dominant growth of the strain of the present invention is not always possible. And colonization within a microbial community does not always occur.
Therefore, a cellulose decomposition experiment using general methane fermentation sludge was performed to investigate the growth of indigenous inventive strains in the methane fermentation microorganism community. Further, it was also verified whether the growth of the inventive strain can be promoted by maintaining the environment containing the inventive strain at a high temperature.
[0037]
The methane fermentation experiment of cellulose was performed using a lab-scale methane fermentation tank shown in FIG. 1.2 L of the inorganic medium shown in Table 3 and 43.2 g of cellulose powder were added to 1.2 L of sludge collected from a methane fermentation tank treating human waste, septic tank sludge, and garbage, and semi-continuous culture was performed for 59 days. went. The amount of methane gas generated is monitored over time, and when 85% or more of the input cellulose is converted to methane gas, the medium shown in Table 3 containing cellulose is semi-continuously input so that the residence time in the fermenter is 25 days. did. In this experimental system, addition of the JC3 strain was not performed in order to investigate the mode of growth of the indigenous JC3 strain or its close relatives present in the methane fermented sludge. In order to investigate the effect of the culture temperature on the growth of the inventive strain, the culture temperature was set to a high temperature (55 ° C.) and a medium temperature (35 ° C.).
[0038]
[Table 3]

[0039]
At the start of continuous culture (day 0), on day 20 of culture, on day 41 of culture, and at the end of culture (day 59), sludge was sampled, and gene amplification and amplification by PCR were performed targeting 16S rDNA of eubacteria. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) of the isolated gene mixture, determination of the gene sequence of the isolated microbial gene (DNA band) and measurement of the concentration, the identification and semi-identification of the JC3 strain present in the microbial community Quantification was performed. Regarding the sludge at the start and end of the experiment, the methane generation activity (cellulose decomposition activity) using cellulose as a single carbon source was separately measured.
FIG. 4 shows the results of analysis of the structure of the microbial community of the methane fermentation sludge on each of the culture days by the PCR method and the DGGE method. In the DGGE method, the presence of a microorganism group in a sample can be indicated as a DNA band. Thus, bacteria corresponding to the C1 band, which was not found in the planted sludge (below the detection limit of the DGGE method), were detected as a band on day 20 of the culture in the high-temperature culture sludge. . In addition, it can be seen that the population (existence ratio) of the bacteria corresponding to the C1 band increases (the concentration of the C1 band increases) with the continuation of the culture. When the gene sequence of the C1 band was determined, 100% homology (a fragment of about 200 bases) with the sequence of the 16SΔrRNA (rDNA) gene of the inventive strain JC3 was obtained. Due to the dominance of the strain of the present invention in the methane-fermenting microbial community, the ability of the high-temperature methane-fermented sludge to produce methane from cellulose reached 50 times that of the sludge before the start of the culture. On the other hand, in the medium-temperature cultured sludge, the C1 band (strain JC3) found in the high-temperature cultured sludge was not detected even after 41 days from the culture, and the cellulolytic activity was only a fraction of that of the high-temperature cultured sludge.
[0040]
From the above results, it was clarified that cultivation of methane fermentation sludge under high temperature conditions (55 ° C.) using cellulose as a carbon source can selectively promote the growth of cellulose microorganisms that are the same as or closely related to the JC3 strain. . In addition, it was found that by performing high-density accumulation of cellulolytic microorganisms closely related to the JC3 strain, it is possible to dramatically improve the cellulose resolution of sludge.
[0041]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel group of anaerobic microorganisms having cellulolytic capacity. The microorganisms can efficiently decompose organic waste and wastewater containing a large amount of cellulose, which is a hardly decomposable organic substance. Further, by using the strain group of the present invention in methane fermentation sludge, cellulose can be converted to methane gas as energy.
The growth promotion method of the present invention is described in Clostridium @ sp. By applying the present invention to a new strain such as the JC3 strain, it is possible to promote the growth of the present strain, ie, the degradation of cellulose, in the treatment of waste containing cellulose and / or wastewater.
[0042]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the hydrolysis characteristics of cellulose of the strain of the present invention.
FIG. 2 shows the effect of culture temperature on the growth of the strain of the present invention on cellulose.
FIG. 3 shows an outline of a methane fermentation tank used for a cellulose decomposition experiment.
FIG. 4 shows the results of analysis of the microbial community structure of the cellulose-degraded methane fermentation sludge by the PCR method and the DGGE method on each culturing day.
FIG. 5 shows the phylogenetic position of a novel cellulolytic strain group.

Claims

A new strain belonging to Clostridium, which has a cellulose-resolving ability and has a nucleotide sequence of 16SΔrRNA gene of 90% or more homology with the sequence of SEQ ID NO: 1.

The new strain according to claim 1, wherein the base sequence of the cellulase gene shows 80% or more homology with the sequence of SEQ ID NO: 2.

Clostridium @ sp. The new strain according to claim 1 or 2, which is a JC3 strain (FERM @ P-19026).

A method for treating organic waste and / or wastewater, comprising decomposing cellulose contained in organic waste and / or wastewater using the novel strain according to claim 1. .

The use of the novel strain according to any one of claims 1 to 3 in an organic waste and / or wastewater containing cellulose together with an acid fermentation and methane fermentation microorganism to produce the organic waste and / or wastewater. A methane fermentation method characterized by decomposing cellulose contained and collecting it as methane gas.

The methane fermentation method according to claim 5, wherein an organic waste and / or wastewater, which is a culture environment of the new strain according to any one of claims 1 to 3, is maintained at a high temperature.

A method for promoting the growth of a new strain, which comprises maintaining an organic waste containing cellulose and / or wastewater, which is a culture environment for the new strain according to any one of claims 1 to 3, at a high temperature.

A cellulolytic agent comprising the novel strain according to any one of claims 1 to 3.