【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけ抗リン脂質抗体の検査方法として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
動脈や静脈の血栓症や習慣性流産をきたす疾患として抗リン脂質症候群Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＰＳ）が知られている。主な抗リン脂質抗体としては、カルジオリピン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対する抗体、さらにカルジオリピンに結合したβ２ＧＰ１上に新たに出現した抗原決定基に対して反応する抗体（抗β２ＧＰ１抗体）、ループスアンチコアグラントが知られている。特に若年者の血栓症や習慣性流産では抗リン脂質抗体は重要であり、陽性者では発症予防をはかる必要があることから、ループスアンチコアグラントや抗カルジオリピン抗体などの抗リン脂質抗体の検査は臨床的意義が高いと言われている。ループスアンチコアグラントはＡＰＴＴの延長をもたらすが、臨床的には凝固亢進状態を示し、血栓症をきたす。ループスアンチコアグラントの検査方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、カオリン凝固時間、希釈ＡＰＴＴ、希釈ラッセル蛇毒時間、血小板中和試験等を組み合わせて行われている。ＡＰＴＴ延長を認めた検体を、活性化剤とリン脂質から調製されているＡＰＴＴ試薬を、水で希釈してリン脂質濃度を低下させて測定する希釈ＡＰＴＴ法では、リン脂質の濃度は低下するので抗リン脂質抗体により阻害されるリン脂質の効果を検査している。しかしこの方法では、活性化剤の濃度も同時に低下するので、正確な検査ができなかった。そこでリン脂質を含まないで活性化剤のみを含む組成液でＡＰＴＴ試薬を希釈する方法が提案されている。しかし、この場合でも抗リン脂質抗体の特異性を検査することができないといった欠点がある上に、リン脂質濃度全体が下がるため測定値の比較が困難であった。
【０００３】
血小板中和試験では、正常人の血小板濃縮画分を別途調製しそれを検体に添加した場合にＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを検査している。この検査では正常人の血小板を別途調製する煩雑な操作が必要であり、簡便な操作法が要望されていた。希釈ラッセル蛇毒試験は凝固時間の延長した検体にリン脂質を添加することにより凝固時間の延長が改善されるか否かを検査している。この場合もリン脂質の成分を特定した組成物を添加するのではなく、単に天然のリン脂質抽出物を添加しているだけである。従って、抗リン脂質抗体の特異性を考慮した検査が要望されている。
【０００４】
米国特許５４７２８５２には、活性化プロテインＣによる抗凝固作用を利用して抗リン脂質抗体を検査する方法が開示されている。この例示では一定濃度のリン脂質を用いて活性化プロテインＣの有無による凝固時間の比較を行い抗リン脂質抗体を検査している。従って、リン脂質濃度による凝固時間を比較する開示はされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗リン脂質抗体の特異性を検査できると同時に、凝固機能検査に反映しうる抗リン脂質抗体の検査を提供することである。
【０００６】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、血液凝固に関与するリン脂質について詳細に検討したところ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が凝固活性に大きく影響していること、又ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が活性型プロテインＣによる抗凝固活性の発現に影響していることから、これら特定のリン脂質濃度の異なるＡＰＴＴ試薬を組み合わせて血液凝固検査を行うことにより抗リン脂質抗体を特異的に検査できることを見出し本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は以下の構成からなる。
１、抗原性を有する特定のリン脂質の異なる濃度の組成物を組み合わせて用いることを特徴とする抗リン脂質抗体の検査方法。
２、抗リン脂質抗体の検査法が血液凝固法である上記１に記載の方法。
３、上記１又は２に記載の方法に用いる試薬又はキット。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、抗リン脂質抗体の検査法に関するものであり、とりわけループスアンチコアグラントの検査に適用される凝固検査に応用される。
【０００９】
抗原性の有する特定のリン脂質の例としてＰＳを例に本発明を説明する。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＥ及びＰＳを適当な組成比で混合したリン脂質混合物とＰＳを除いた組成で調製したリン脂質混合物をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、溶媒成分を除去した後、適当な水溶媒を少量加えて、脂質を懸濁させることにより脂質小胞体、いわゆるリポソームを調製することができる。調製したリポソームをさらに超音波処理して微粒子のリポソームを調製することも可能である。調製した各リポソームを適当な緩衝液に懸濁する。一方、ＡＰＴＴ試薬の活性化剤は公知のものを用いることができる。たとえばコロイドシリカ、エラグ酸等を適宜選択してリポソーム溶液と混合することによりＡＰＴＴ試薬を調製することができる。本発明の方法はこのようにして調製したＰＳを含むＡＰＴＴ試薬とＰＳを含まないＡＰＴＴ試薬をそれぞれ単独又は適当な比率で混合して用いるか、予めＰＳの濃度を変化させて調製したリポソームを用いてもよい。
【００１０】
調製したＡＰＴＴ試薬を用いて、血漿検体の凝固時間を測定する。凝固時間の測定方法は、一定量の血漿と調製したＡＰＴＴ試薬をインキュベーションしたのち、塩化カルシウム溶液を添加して凝固を開始させ、塩化カルシウムの添加から凝固が観察されるまでの時間を測定する。このような凝固時間の測定は通常の血液凝固分析装置で測定される。ＰＳ濃度が通常のＡＰＴＴ測定に用いられるものと、それより約５分の１から２０分の１濃度のものを調製し、両試薬で正常検体及び検査検体のＡＰＴＴを測定し、凝固時間の延長度合いを比較検討する。ループスアンチコアグラントの検体では正常検体に比較してＡＰＴＴの延長が認められ、ＰＳ濃度の低い試薬で、より顕著に延長が認められればＰＳに対する抗体の存在が示唆される。
【００１１】
上記の例ではＰＳをターゲットにしたＡＰＴＴ試薬の例を示したが、ＰＥの場合にも同様に試薬を調製することができる。この場合には活性型プロテインＣを添加して、抗凝固活性を検査することが有効である。活性型プロテインＣを添加して前述のごとく正常血漿のＡＰＴＴを測定すると添加しない場合に比べてＡＰＴＴの延長が認められ、その延長度はＰＥ濃度が高い試薬で顕著になる。一方、ループスアンチコアグラントの検体ではＰＥ濃度にあまり依存しないＡＰＴＴを示し、ＰＥ濃度の低い試薬では正常検体よりも短縮したＡＰＴＴが観察されることになる。このように各試薬でのＡＰＴＴを比較することにより抗ＰＥ抗体の存在を検査することが可能である。
【００１２】
非常に複雑で多様な挙動を示すループスアンチコアグラント検体も本発明の方法により検査することにより、特定のリン脂質に対する抗体の存在と凝固機能検査が可能になる。
ＰＳやＰＥのみならず、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール等についても同様に調製できる。本発明は、濃度を変化させるリン脂質は１種類に限られない。例えばＰＳとＰＥの両方を変化させることも可能である。また凝固活性測定試薬はＡＰＴＴに限らずＰＴ試薬でも良い。ＰＴ試薬の場合には遺伝子組換え技術により調製した組織因子をリン脂質と結合させて、ホロ化させる方法がとられる。この場合リン脂質の組成を変化させた試薬を調製し、組み合わせて用いることにより本発明を実施できる。さらに、天然の組織因子を用いる場合には、組織より抽出した組織因子からリン脂質を除いた後、別途リン脂質の組成を変化させたリン脂質組成物を再構成することによっても実施可能である。
【００１３】
本発明で用いるリン脂質の脂肪酸については、特に限定されないが、不飽和脂肪酸を含むもの、さらに酸化されたリン脂質を用いることも可能である。
【００１４】
本発明は血小板中和試験の代用としても用いられる。すなわち、通常のＡＰＴＴ測定で延長を認めた検体に、血小板中和試験では正常人の血小板を加えて、ＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを測定している。本発明の方法では、例えばＰＳの濃度を通常又はそれ以上に含むリン脂質組成物を血小板の代わりに添加してＡＰＴＴを測定し、ＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを検査する。従来の正常血小板を添加する方法に比べて血小板の調製が不要になり簡単に検査が可能になる。またあらかじめ、通常のＡＰＴＴ試薬よりも２倍程度高濃度にＰＳを含むＡＰＴＴ試薬を調製しておき、通常のＡＰＴＴ試薬で測定した凝固時間と高濃度ＰＳ試薬での凝固時間を比較することにより高リン脂質抗体を検査することが可能になる。
【００１５】
本発明はさらに、希釈蛇毒試験にも用いられる。希釈蛇毒試験では蛇毒により凝固第Ｘ因子が活性化され、活性化凝固第Ｘ因子とリン脂質、凝固第Ｖ因子によりプロトロンビンが活性化されトロンビンが生成し、凝固が進む。このとき抗リン脂質抗体があると凝固時間の延長が観察される。リン脂質を添加すると凝固時間の延長が改善されることを観察して抗リン脂質抗体の検査を行っている。従来の方法ではリン脂質の組成を特定していないため感度が低いが、本発明では、特定のリン脂質、例えばＰＳの濃度を高めたリン脂質組成物或いはＰＳ単独で検体に添加することにより、抗ＰＳ抗体を吸収することにより、感度よく検査できる。
【００１６】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
ホスファチジルコリンヂオレイル（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミンジオレイル（ＰＥ）及びホスファチジルセリンジオレイル（ＰＳ）の各１ｍｇ／ｍＬクロロホルム溶液を調製し、ＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／１の比率で組み合わせたリン脂質組成溶液の１００μＬをガラス製の小試験管に分注し窒素気流中で乾燥後、１００μＬの水と直径約２ｍｍのガラス玉を加えてリン脂質を懸濁させリポソームを調製した。調製したリポソームはさらに１５ＫＨｚで５分間超音波処理して、ユニラメラリポソーム（ＵＬＬ）を調製した。ＰＳを含まないリン試薬用の脂質としてＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／０（ＰＳの代わりに溶媒のみを入れて濃度を調整）の比率で組み合わせたリン脂質組成溶液を調製して同様にＵＬＬを調製した。市販のエラグ酸０．０２５ｇを０．００１Ｍ水酸化ナトリウム液１Ｌで溶解した。これに５０μｍｏｌ／Ｌになるように硫酸銅を混合し、さらに、この溶液にＴｒｉｓを０．２２ｇ、ＨＥＰＥＳを１．４５ｇ溶解させてエラグ酸溶液とした。調製した各ＵＬＬ懸濁液をエラグ酸溶液で１００倍希釈し、ＡＰＴＴ試薬を調製した（高ＰＳ試薬及び無ＰＳ試薬）。高ＰＳ試薬を無ＰＳ試薬で１０倍希釈したものをＰＳ低濃度ＡＰＴＴ試薬（低ＰＳ試薬）として調製した。調製した３種類の試薬で正常血漿及び抗リン脂質抗体陽性の血漿のＡＰＴＴをそれぞれ測定した。その結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】
以上の結果、低ＰＳ試薬では抗リン脂質抗体陽性血漿のＡＰＴＴが極度な延長を示し、
これらの検体には抗ＰＳ抗体の存在が強く示唆され、本発明の有用性が示された。
【００１９】
【実施例２】
実施例１のＰＳの代わりにＰＥ濃度を変化させ、ＰＳとＰＣ濃度を一定にした試薬を調製して、同様に正常血漿及び抗リン脂質抗体陽性の血漿のＡＰＴＴをそれぞれ測定した。その結果を表２に示した。
【００２０】
【表２】
【００２１】
以上の結果これらの検体では、抗リン脂質抗体陽性血漿のＡＰＴＴが正常血漿のＡＰＴＴよりも有意に延長しているが、ＰＥ濃度に依存したＡＰＴＴの変動は認められないことから、ＰＥは直接的にＡＰＴＴ測定に影響しないことがわかった。
【００２２】
【実施例３】
蛇毒、商品名プロタックで活性化したプロテインＣを、検体に添加して３分間放置した後、実施例２で用いた試薬でＡＰＴＴを測定した。その結果を表３に示した。
【００２３】
【表３】
【００２４】
以上の結果、抗リン脂質抗体陽性血漿では高ＰＥ試薬で正常血漿に比べて顕著にＡＰＴＴの短縮を認め、抗ＰＥ抗体によりＰＥの作用が減じられることによる活性化プロテインＣの抗凝固作用が低下することが確かめられ、本発明の有用性が確かめられた。
【００２５】
【実施例４】
実施例１で調製したＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／１のリポソームで調製したＡＰＴＴ試薬で測定し、正常検体及びＡＰＴＴの延長を認めた抗リン脂質抗体陽性血漿について、ＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／２のリポソーム及び正常ヒト血小板をそれぞれ添加してＡＰＴＴを測定した。その結果を表４に示した。
【００２６】
【表４】
【００２７】
以上結果、本発明の方法は血小板中和試験の血小板に代用して用いることが可能であることが判った。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、抗リン脂質抗体を特異的に感度よく検査することができ、ループスアンチコアグラントの成因を検査する上においても有用である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is used in the field of clinical testing, and particularly as a method for testing antiphospholipid antibodies.
[0002]
[Prior art]
Antiphospholipid syndrome (APS) is known as a disease that causes arterial or venous thrombosis and habitual miscarriage. The main antiphospholipid antibodies include antibodies against cardiolipin, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine, antibodies reacting with an antigenic determinant newly appearing on β2GP1 bound to cardiolipin (anti-β2GP1 antibody), lupus anticore Grant is known. In particular, antiphospholipid antibodies are important for thrombosis and habitual miscarriage in young people, and it is necessary to prevent the onset in positive individuals.Therefore, tests for antiphospholipid antibodies such as lupus anticoagulant and anticardiolipin antibodies are not recommended. It is said to have high clinical significance. Lupus anticoagulant results in prolonged APTT, but clinically shows hypercoagulable states, leading to thrombosis. The test method for lupus anticoagulant is performed by combining activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clotting time, diluted APTT, diluted Russell snake venom time, platelet neutralization test and the like. In the diluted APTT method, in which the APTT elongation is measured by diluting an APTT reagent prepared from an activator and a phospholipid with water to reduce the phospholipid concentration, the concentration of the phospholipid is decreased. We are examining the effect of phospholipids inhibited by antiphospholipid antibodies. However, in this method, since the concentration of the activator also decreases at the same time, an accurate test cannot be performed. Therefore, a method has been proposed in which the APTT reagent is diluted with a composition solution containing only an activator without a phospholipid. However, even in this case, there is a drawback that the specificity of the antiphospholipid antibody cannot be examined, and further, it is difficult to compare the measured values because the entire phospholipid concentration decreases.
[0003]
In the platelet neutralization test, whether a platelet-enriched fraction of a normal individual is separately prepared and added to a sample is examined to determine whether the elongation of APTT is improved. In this test, a complicated operation for separately preparing platelets of normal persons was required, and a simple operation method was demanded. The diluted Russell snake venom test examines whether the addition of phospholipids to a sample with an extended clotting time improves the clotting time. In this case, too, a natural phospholipid extract is simply added instead of adding a composition in which the components of the phospholipid are specified. Therefore, there is a demand for a test considering the specificity of the antiphospholipid antibody.
[0004]
U.S. Pat. No. 5,472,852 discloses a method for testing antiphospholipid antibodies using the anticoagulant effect of activated protein C. In this example, an anti-phospholipid antibody is tested by comparing the coagulation time with and without activated protein C using a constant concentration of phospholipid. Therefore, there is no disclosure of comparing the clotting time with the phospholipid concentration.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a test for an anti-phospholipid antibody which can be used to test the specificity of the anti-phospholipid antibody and can be reflected in a coagulation function test.
[0006]
[Means to solve the problem]
The present inventors have examined in detail the phospholipids involved in blood coagulation, and found that phosphatidylserine (PS) has a large effect on coagulation activity, and that phosphatidylethanolamine (PE) has an effect on the activity of activated protein C. The present invention was found to be able to specifically test anti-phospholipid antibodies by performing a blood coagulation test by combining these specific APTT reagents having different phospholipid concentrations, since they affect the expression of coagulation activity. .
[0007]
The present invention has the following configuration.
1. A method for testing an anti-phospholipid antibody, which comprises using compositions having different concentrations of specific phospholipids having antigenicity in combination.
2. The method according to 1 above, wherein the test method for the antiphospholipid antibody is a blood coagulation method.
3. A reagent or kit used in the method according to 1 or 2 above.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a method for testing an antiphospholipid antibody, and particularly to a coagulation test applied to a lupus anticoagulant test.
[0009]
The present invention will be described using PS as an example of a specific phospholipid having antigenicity. A phosphatidylcholine (PC), a phospholipid mixture in which PE and PS are mixed at an appropriate composition ratio, and a phospholipid mixture prepared in a composition excluding PS are respectively dissolved in an organic solvent such as chloroform, and after removing the solvent component, By adding a small amount of an aqueous solvent and suspending the lipid, a lipid vesicle, a so-called liposome, can be prepared. The prepared liposomes can be further subjected to ultrasonic treatment to prepare fine particle liposomes. Each prepared liposome is suspended in an appropriate buffer. On the other hand, a known activator for the APTT reagent can be used. For example, an APTT reagent can be prepared by appropriately selecting colloidal silica, ellagic acid, and the like and mixing the liposome solution. The method of the present invention uses the thus prepared APTT reagent containing PS and the APTT reagent not containing PS alone or in a mixture at an appropriate ratio, or uses liposomes prepared by changing the concentration of PS in advance. You may.
[0010]
Using the prepared APTT reagent, the coagulation time of the plasma sample is measured. As a method of measuring the coagulation time, after incubating a fixed amount of plasma with the prepared APTT reagent, a calcium chloride solution is added to start coagulation, and the time from the addition of calcium chloride to the time when coagulation is observed is measured. Such a measurement of the coagulation time is measured by an ordinary blood coagulation analyzer. The PS concentration used for normal APTT measurement and the one with a concentration of about 1/5 to 1/20 were prepared. The APTT of normal and test samples was measured with both reagents, and the coagulation time was extended. Compare the degree. APTT is prolonged in the lupus anticoagulant sample as compared to the normal sample, and the presence of an antibody against PS is suggested if a prominent prolongation is observed with a reagent having a low PS concentration.
[0011]
In the above example, the example of the APTT reagent targeting PS is shown, but the reagent can be similarly prepared for PE. In this case, it is effective to test the anticoagulant activity by adding activated protein C. When activated protein C was added and the APTT of normal plasma was measured as described above, APTT was prolonged as compared with the case where no active protein C was added, and the prolongation was more pronounced with a reagent having a higher PE concentration. On the other hand, a sample of lupus anticoagulant shows an APTT that does not depend much on the PE concentration, and an APTT shorter than that of a normal sample is observed with a reagent having a low PE concentration. As described above, it is possible to examine the presence of the anti-PE antibody by comparing the APTT of each reagent.
[0012]
Testing of lupus anticoagulant samples that exhibit extremely complex and diverse behavior by the method of the present invention enables the presence of antibodies against specific phospholipids and a test of coagulation function.
Not only PS and PE but also cardiolipin, phosphatidylinositol and the like can be similarly prepared. In the present invention, the phospholipid that changes the concentration is not limited to one type. For example, both PS and PE can be changed. The coagulation activity measuring reagent is not limited to APTT, but may be PT reagent. In the case of a PT reagent, a method is employed in which tissue factor prepared by a genetic recombination technique is combined with a phospholipid to form a holoform. In this case, the present invention can be practiced by preparing reagents having different phospholipid compositions and using them in combination. Furthermore, when a natural tissue factor is used, the method can also be performed by removing the phospholipid from the tissue factor extracted from the tissue and then reconstituting a phospholipid composition having a different phospholipid composition. .
[0013]
The fatty acid of the phospholipid used in the present invention is not particularly limited, but it is also possible to use a fatty acid containing an unsaturated fatty acid or a oxidized phospholipid.
[0014]
The present invention can also be used as a substitute for a platelet neutralization test. That is, in a platelet neutralization test, platelets of a normal person are added to a sample in which elongation is recognized by normal APTT measurement, and whether or not elongation of APTT is improved is measured. In the method of the present invention, for example, a phospholipid composition containing a normal or higher concentration of PS is added in place of platelets to measure APTT, and it is examined whether the elongation of APTT is improved. Compared with the conventional method of adding normal platelets, platelet preparation is not required and testing can be easily performed. In addition, an APTT reagent containing PS at a concentration about twice as high as that of a normal APTT reagent is prepared in advance, and the clotting time measured with a normal APTT reagent is compared with the clotting time with a high-concentration PS reagent. It becomes possible to test phospholipid antibodies.
[0015]
The present invention is further used in a dilution snake venom test. In the diluted snake venom test, coagulation factor X is activated by snake venom, prothrombin is activated by activated coagulation factor X and phospholipids, and coagulation factor V to generate thrombin, and coagulation proceeds. At this time, if an antiphospholipid antibody is present, prolongation of the coagulation time is observed. An anti-phospholipid antibody test is conducted by observing that the addition of phospholipid improves the prolongation of the clotting time. Although the sensitivity is low because the composition of the phospholipid is not specified in the conventional method, in the present invention, a specific phospholipid, for example, a phospholipid composition in which the concentration of PS is increased or PS alone is added to a specimen, By absorbing the anti-PS antibody, the test can be performed with high sensitivity.
[0016]
【Example】
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the examples.
Embodiment 1
A 1 mg / mL chloroform solution of each of phosphatidylcholine-oleyl (PC), phosphatidylethanolaminedioleyl (PE) and phosphatidylserinedioleyl (PS) was prepared and combined in a ratio of PC / PE / PS = 1/1/1. After dispensing 100 μL of the phospholipid composition solution into a small glass test tube and drying in a nitrogen stream, 100 μL of water and a glass ball having a diameter of about 2 mm were added to suspend the phospholipid to prepare a liposome. The prepared liposome was further subjected to ultrasonic treatment at 15 KHz for 5 minutes to prepare a unilamellar liposome (ULL). A phospholipid composition solution was prepared by combining at a ratio of PC / PE / PS = 1/1/0 (adjusting the concentration by inserting only a solvent instead of PS) as a lipid for a PS-free phosphoreagent, and ULL was prepared. 0.025 g of commercially available ellagic acid was dissolved in 1 L of a 0.001 M sodium hydroxide solution. This was mixed with copper sulfate so as to have a concentration of 50 μmol / L, and 0.22 g of Tris and 1.45 g of HEPES were dissolved in this solution to obtain an ellagic acid solution. Each of the prepared ULL suspensions was diluted 100-fold with an ellagic acid solution to prepare an APTT reagent (high PS reagent and no PS reagent). A 10-fold dilution of a high PS reagent with a PS-free reagent was prepared as a PS low concentration APTT reagent (low PS reagent). APTT of normal plasma and anti-phospholipid antibody-positive plasma were measured with the three prepared reagents, respectively. The results are shown in Table 1.
[0017]
[Table 1]
As a result, with the low PS reagent, the APTT of anti-phospholipid antibody-positive plasma shows extremely prolonged,
These samples strongly suggested the presence of an anti-PS antibody, indicating the usefulness of the present invention.
[0019]
Embodiment 2
A reagent was prepared in which the PE concentration was changed in place of the PS of Example 1 and the PS and PC concentrations were kept constant, and APTT of normal plasma and anti-phospholipid antibody-positive plasma were similarly measured. The results are shown in Table 2.
[0020]
[Table 2]
As described above, in these samples, the APTT of anti-phospholipid antibody-positive plasma was significantly longer than that of normal plasma, but since there was no change in APTT dependent on PE concentration, PE was directly It was found that it did not affect the APTT measurement.
[0022]
Embodiment 3
After snake venom, protein C activated by trade name Protac was added to the sample and left for 3 minutes, APTT was measured with the reagent used in Example 2. Table 3 shows the results.
[0023]
[Table 3]
As a result, the anti-phospholipid antibody-positive plasma significantly reduced the APTT with the high PE reagent as compared to the normal plasma, and the anticoagulant effect of activated protein C was reduced due to the reduction of the effect of PE by the anti-PE antibody And the usefulness of the present invention was confirmed.
[0025]
Embodiment 4
The normal sample and the anti-phospholipid antibody positive plasma in which the extension of APTT was observed were measured by the PCTT / PE / PS = 1/1/1 liposome prepared in Example 1, and the PC / PE / PS was measured. The APTT was measured by adding liposomes (= 1/2) and normal human platelets. Table 4 shows the results.
[0026]
[Table 4]
As a result, it was found that the method of the present invention can be used in place of platelets in a platelet neutralization test.
[0028]
【The invention's effect】
According to the present invention, an anti-phospholipid antibody can be specifically and sensitively tested, and is also useful in testing the origin of lupus anticoagulant.