JP2004105095A - Virus growable/algilytic by specifically infecting on red tide-derived diatom rhizosolenia method and agent for controlling the red tide using the virus, and methods for isolating, subculturing and storing the virus - Google Patents
Virus growable/algilytic by specifically infecting on red tide-derived diatom rhizosolenia method and agent for controlling the red tide using the virus, and methods for isolating, subculturing and storing the virus Download PDFInfo
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、赤潮原因珪藻に特異的に感染して増殖・溶藻しうるウイルス、該ウイルスを利用する赤潮防除方法および赤潮防除剤、並びに該ウイルスの単離方法、継代培養方法、および保存方法に関し、より詳細には、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうるウイルス、該ウイルスを利用する赤潮防除方法および赤潮防除剤、並びに該ウイルスの単離方法、継代培養方法、および凍結保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
わが国の海面養殖業は、国内漁業生産額全体の約１／４を占めている。この振興にあたっては、とくに養殖漁場の環境保全を図ることが不可欠であり、なかでも深刻な被害を引き起こす赤潮に対する有効な対策の推進がきわめて重要である。
【０００３】
２０００年後半から２００１年前半にかけて有明海で発生したノリの色落ち現象は、ノリ養殖に壊滅的な被害をもたらした。朝日新聞社の統計によると、福岡・佐賀・長崎・熊本の４県の２０００年度のノリ生産額は１９９９年度のそれよりも約１３０億円減少した。この色落ち現象の原因として珪藻の一種である珪藻リゾソレニア属による赤潮の影響が強く疑われている。
【０００４】
この現象の原因については現在のところ、大量に発生したリゾソレニアが本来ノリの栄養として使われるべき栄養塩を過剰に摂取し、その結果、養殖ノリに十分量の栄養塩が供給されずノリが色落ちを起こし、その商品価値が著しく下落したと考えられている。
【０００５】
一方、翌２００１年度にはノリは大豊作となった。これについては、有明海に繁茂する珪藻種がリゾソレニア属ではなくキートセロス属であったという点がその理由と考えられている。すなわちノリ養殖を行う環境において、そこに繁茂する珪藻の種類が何かはきわめて重要な問題であり、繁茂する珪藻の種類を人為的に選択・制御する技術の構築が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
こうした背景の下、珪藻を宿主とする世界で初めてのウイルスが発見・分離された。このウイルス（ＲｓＶ：Ｒｈｉｚｏｓｏｌｅｎｉａ ｓｅｔｉｇｅｒａ ｖｉｒｕｓ）は、中心目珪藻の一種リゾソレニア・セティゲラ（Ｒｈｉｚｏｓｏｌｅｎｉａ ｓｅｔｉｇｅｒａ）に対して選択的に感染する。該ウイルスは、高収量である点、安定保存性が高いという点で優れている。
【０００７】
リゾソレニア・セティゲラは、２０００年度のノリ色落ち被害原因種であるリゾソレニア・インブリカータと同属の近縁種であり、これまでも有明海でしばしば赤潮を形成してきた種類である。本発明は、実用に叶うリゾソレニア赤潮防除技術の開発を念頭に置きながら、ＲｓＶの珪藻赤潮防除への応用の可能性を探ることをその主要な目的とする。ウイルス利用による赤潮防除は、他生物や生態系全体への負荷が小さい環境修復技術としてその安全性に高い期待が寄せられており、ウイルスの大量培養技術・散布手法・コスト等の面での諸問題がクリアされれば、実用化への道が開かれるものと期待される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リゾソレニア・セティゲラに感染し死滅させるウイルス（ＲｓＶ）の分離に世界で初めて成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを提供する。リゾソレニア属の藻類はリゾソレニア・セティゲラであるとよい。本発明の一態様において、ウイルスは、尾部構造および外膜構造を欠き、粒径約２３−２６ｎｍの球形である。この態様において、ウイルスの平均粒径は２４ｎｍであることが好ましい。
【００１０】
また、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを含有する液体試料を０．１μｍ孔径のフィルターで濾過し、得られた濾液をリゾソレニア属の藻類の培養液に接種して培養を行い、リゾソレニア属の藻類の溶藻が観察された培養液を限界希釈することにより前記ウイルスをクローニングする工程を含む、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスの単離方法を提供する。
【００１１】
リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを含有する液体試料としては、該ウイルスに感染しているリゾソレニア属の藻類を含有する液体試料（例えば、リゾソレニア赤潮終息期の海水、前記ウイルスに感染しているリゾソレニア属の藻類の培養液など）、前記ウイルスを含有する海底泥の懸濁液、該懸濁液を遠心分離して得られた上清などを例示することができる。
【００１２】
本発明のウイルスの単離方法において、植物プランクトン、細菌類、ならびに大型のウイルス粒子を除去するため、孔径０．８μｍのヌクレポアメンブレンフィルターで濾過後、最終的に０．１μｍのフィルターで濾過を行うのが適当である。
【００１３】
リゾソレニア属の藻類を培養するための培地としては、ＳＷＭ３培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＡＳＰ系培地などの液体培地を例示することができる。
【００１４】
リゾソレニア属の藻類の培養液を調製するためのリゾソレニア属の藻類は、対数増殖期にあるリゾソレニア・セティゲラであるとよく、例えば新鮮なＳＷＭ３培地に体積比で約１／１０量の対数増殖期末期または定常期初期にあるリゾソレニア・セティゲラ培養液を接種し、温度１０〜１５℃、光強度１００〜１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ ｓ−１、明暗周期１２時間明：１２時間暗の培養条件下で２〜３日間培養することで、対数増殖期にあるリゾソレニア・セティゲラ培養液を調製することができる。このリゾソレニア・セティゲラ培養液に該ウイルスをウイルス粒子数が藻体細胞数の１／１００〜１０倍になるように接種し上記培養条件下に５日間以上置くとよい。
【００１５】
ウイルスのクローニングにおける限界希釈は、１００〜１０−１０倍の希釈段階で行うとよい。
【００１６】
また、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスに感染して、溶藻が確認されたリゾソレニア属の藻類の培養液を遠心処理し、得られた上清をリゾソレニア属の藻類の培養液に接種して培養を行う操作を少なくとも１回繰り返す工程を含む、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを継代培養する方法を提供する。
【００１７】
リゾソレニア属の藻類の培養は、本発明のウイルスに感染させる前であるか、後であるかを問わず、温度１０〜１５℃（１５℃が最も好適）、光強度１００〜１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ ｓ−１、明暗周期のある条件下で行うことが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを有効成分として含む赤潮防除剤を提供する。
【００１９】
さらにまた、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを赤潮水域に散布することからなる赤潮防除方法を提供する。
【００２０】
このウイルスを固定化剤に包埋して、ノリ養殖筏に設置してもよい。これにより、ウイルスを継続的に筏周辺に放出させることができる。
【００２１】
固定化剤としては、合成高分子ゲル、合成樹脂プレポリマー、天然多糖類、中空糸膜、シリコンポリマー、活性炭、マイクロカプセル、各種増粘剤等を例示することができる。
【００２２】
ウイルスを固定化剤に包埋したものを耐海水性のネットまたは容器に入れて、筏に吊したり、筏に固定するといった方法で波に常に洗われている状態にするとよい。
【００２３】
また、本発明は、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスに感染した宿主の培養液または該培養液を濃縮して得られた懸濁液を凍結保存するか、あるいは冷暗所に保存することを含む、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる、粒径０．１μｍ未満のウイルスを保存する方法を提供する。凍結保存をする場合には、ウイルスに感染した宿主の培養液または該培養液を濃縮して得られた懸濁液を凍結保護剤と混合し、該混合物を凍結保存するとよい。冷暗所に保存する場合には、ウイルスに感染した宿主の培養液または該培養液を濃縮して得られた懸濁液を４℃前後の暗所に保存するとよい。
【００２４】
前記ウイルスに感染した宿主の培養液を濃縮するには、１５００〜２５００ ｒｐｍの低速遠心分離を１０〜１５分間行うとよい。この操作により、高密度ウイルス感染細胞懸濁液が得られる。
【００２５】
本明細書において、「赤潮」とは、プランクトンの急激な増殖に伴い海水の色が変化する現象を指す。この用語は、水産生物の被害の有無に関わらず広く用いられる。わが国の有害赤潮の原因となるプランクトンとしては、シャットネラ属、ギムノディニウム属、ヘテロシグマ属などが挙げられる。「リゾソレニア属の藻類」とは珪藻綱に属するもので、リゾソレニア属に属する種としてはリゾソレニア・セティゲラ、リゾソレニア・ロンギセタ、リゾソレニア・ヘベタータ、リゾソレニア・インブリカータ、リゾソレニア・ベルゴニー、リゾソレニア・アラタ、リゾソレニア・インディカ、リゾソレニア・デリカテュラなどが挙げられる。「リゾソレニア・セティゲラ」は、赤潮原因珪藻の一種であり、細胞は両殻が斜めに突出した棒状の円筒形である。冬季に増殖して優占種となるケースが多く、これまでにもしばしば有明海で赤潮を構成するプランクトンとして発生した（平成３年１−３月、平成５年２月、平成６年２月、平成７年１−３月、平成１２年１２月）。
【００２６】
「ウイルス」とは、感染した宿主細胞内においてのみ増殖しうる感染性をもった球形または繊維状の微小構造体をいう。ウイルスは、二分裂で増殖することはできず、宿主細胞の生合成系を利用することでのみ自己の複製を行うという点で、細菌とは全く異なる。また、細菌の場合と比較して宿主特異性が著しく高いのが特徴である。なお、「宿主特異性が高い」とは、病原性寄生生物（この場合はウイルス）が感染し増殖しうる宿主生物種の範囲（宿主域）が狭いことを意味する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本研究の対象生物であるリゾソレニア・セティゲラは、赤潮原因珪藻の一種であり、細胞は両殻が斜めに突出した棒状の円筒形である。冬季に増殖して優占種となるケースが多く、これまでにもしばしば有明海で赤潮を構成するプランクトンとして発生した（平成３年１−３月、平成５年２月、平成６年２月、平成７年１−３月、平成１２年１２月）。
【００２９】
本発明のウイルスは、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうる。リゾソレニア・セティゲラに特異的に感染して増殖しうるウイルス（ＲｓＶ：リゾソレニア・セティゲラ・ウイルス）は、尾部構造および外膜構造を欠く粒径約２３−２６ｎｍの球形ウイルスである。実験では、このウイルスに感染したリゾソレニア細胞は最終的に色素が抜け落ち死滅する。さらにその際、おびただしい数の複製された子孫ウイルスを放出し、新たな（すなわち、未感染の）リゾソレニア細胞の感染・死滅を誘発する。また、本ウイルスの宿主特異性は高く、これまでのところ、リゾソレニア・セティゲラ以外の植物プランクトンに対する本ウイルスの影響は全く検出されていない。
【００３０】
本発明のウイルスは、以下のようにして単離することができる。まず、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうるウイルスに感染しているリゾソレニア属の藻類を含有する海水（例えば、リゾソレニア赤潮終息期の海水）または海底泥中に存在するウイルスを懸濁させた海水培地を、最終的に０．１μｍ孔径のフィルターで濾過し、得られた濾液を対数増殖状態にあるリゾソレニア属の藻類の培養液に接種し、１５℃、１２時間明：１２時間暗の明暗のサイクルで５−７日間、１４５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ −２ ｓ−１の白色蛍光灯の照射下で培養する。光強度は市販の光量子計を用いて測定することができる。
【００３１】
リゾソレニア属の藻類の培養液は、この藻類を予めマイクロピペット法または限界希釈法によりクローニングして、株化しておき、２ｎＭのＮａ２ＳｅＯ３含有改変ＳＷＭ３培地（Ｃｈｅｎ ら， １９６９， Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ ５：２１１−２２０； Ｉｔｏｈ ＆ Ｉｍａｉ， １９８７， Ｓｈｕｗａ， Ｔｏｋｙｏ， ｐ．１２２−１３０）に接種後、１４５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ −２ ｓ−１の白色蛍光灯を１２時間明：１２時間暗の明暗サイクルで照射し、１５℃で培養することにより調製できる。新鮮なＳＷＭ３培地に対し体積比で約１／１０量の対数増殖期末期または定常期初期にあるリゾソレニア属藻類の培養液を接種し上記条件下においた場合、培養開始後約１〜２日で対数増殖期に入る。
【００３２】
次いで、リゾソレニア属の藻類の溶藻が観察された培養液をリゾソレニア属の藻類の培養液で限界希釈することによりウイルスをクローニングする。リゾソレニア属の藻類の培養液の調製法は上記のとおりである。限界希釈は次のようにして行うとよい。まず、リゾソレニア属の藻類の溶藻が観察された培養液をとり、改変ＳＷＭ３培地で１００〜１０−１０倍に段階希釈し、各希釈液を対数増殖中のリゾソレニア属の藻類の培養液に接種する。これらを、例えば １５℃、１４５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１、１２時間明：１２時間暗の明暗周期条件下で７〜１０日間培養する。培養後、リゾソレニア属の藻類の溶藻が観察された最も希釈段階の高いものを選択して、その培養液について上記の段階希釈法による処理を少なくとも２回繰り返す。最終の段階希釈法による処理の後、リゾソレニア属の藻類の溶藻が観察された培養液のうち、最も希釈段階の高い培養液を採取して、対数増殖中のリゾソレニア属の藻類の培養液に接種する。以上の操作をもって、本発明のウイルスのクローニングの完了とみなすことができる。
【００３３】
ウイルスのクローニングが完了したリゾソレニア属の藻類の培養液から遠心分離（例えば、２，０００〜７，０００ ｒｐｍ、５〜１０分）により細胞残さを除去後、遠心上清を上記の要領で段階希釈法によって処理して得られた各希釈段階における死滅ウェル数から、統計的計算により上清中に存在したウイルスの密度を推定することができる。
【００３４】
本発明のウイルスを赤潮水域に散布することにより、赤潮を防除することができる。赤潮の防除にあたっては、本発明のウイルスの培養液またはその上清をそのまま使用してもよいが、本発明のウイルスを活性成分として含む製剤を調製してこれを使用してもよい。本発明の赤潮防除方法および赤潮防除剤は、自然環境中にすでに存在している宿主特異性の高いウイルスを利用するので、生態系への負荷が小さな環境修復技術として、その安全性に高い期待が寄せられる。また、本発明の赤潮防除剤は、他の通常の薬剤と異なり、ウイルス自体に自己複製能が備わっているため、少量の投入で広範囲への赤潮制御が期待できる。また、ウイルスを固定化剤に包埋したものをノリ養殖筏に設置し、ウイルスを継続的に筏周辺に放出させるとよい。この方法は、ウイルスの海水中への希釈拡散を抑え、赤潮防除の対象となる筏周辺に長期間に渡り高いウイルス密度を維持する上で有効であると考えられる。固定化剤としては、合成高分子ゲル、合成樹脂プレポリマー、天然多糖類、中空糸膜、シリコンポリマー、活性炭、マイクロカプセル、各種増粘剤等を利用することができる。
【００３５】
次に、本発明のウイルスを継代培養する方法について説明する。
【００３６】
本発明のウイルスに感染して、溶藻が確認されたリゾソレニア属の藻類の培養液を遠心処理（例えば、７，０００ ｒｐｍ、５分）し、得られた上清を対数増殖中のリゾソレニア属の藻類の培養液に接種して培養を行う。培養液中の細胞密度を光学顕微鏡下で経日的にモニターする方法により、その後の藻体の増殖を評価することができる。これにより、上記の方法で継代培養したウイルスが、リゾソレニア属の藻類に対する感染性を保持していることがわかる。
【００３７】
さらに、本発明のウイルスを保存する方法について説明する。殺藻因子（ウイルス）接種後１２０時間目の宿主培養液０．５ｍｌを凍結保護剤と混合し、この混合物を凍結保存する。凍結保護剤としては、セルバンカー２（ＢＬＣ−１、 十慈フィールド社製）を使用するとよい。例えば、殺藻因子（ウイルス）接種後１２０時間目の宿主培養液を等量のセルバンカー２と混合し、バイアル中に分注し、バイアルを−１９６℃の液体窒素中に浸漬し、凍結させ、そのままの状態で保存する。また、殺藻因子（ウイルス）接種後１２０時間目の宿主培養液を４℃暗所に保存してもよい。
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３９】
【実施例】
〔実施例１〕
材料および方法
供試プランクトン
殺藻因子の分離には、有明海から分離されたリゾソレニアＳ３株を用いた。培地には改変ＳＷＭ３培地を用い、培養は温度１５°Ｃ、光強度１４５ μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ ｓ−１、１２ｈＬ： １２ｈＤの明暗周期条件下で行った。
【００４０】
殺藻因子の分離
殺藻因子の分離に供した試水は、２００２年４月２４日に有明海の佐賀県海域で採取された。試水を０．２μｍのヌクレポアメンブレンフィルターで濾過後、得られた各濾水１ｍｌを対数増殖中のリゾソレニアＳ３株の培養液１ ｍｌにそれぞれ接種した。また、対照として０．２μｍ以下の画分を加熱処理（オートクレーブ（１２１℃×１５分））したものを同様にそれぞれ接種し、上述の条件下で培養を行った。
殺藻因子をクローニングすることを目的とし、以下のように限界希釈法を２回繰り返し行った。上述の培養で溶藻が確認された培養液を改変ＳＷＭ３培地で１００−１０−１０倍に段階希釈し、各希釈液１００μｌを対数増殖中のリゾソレニア株の培養液１５０μｌに接種した。実験には９６穴マイクロプレートを使用し、各希釈段階につき８本立てで接種を行った。また、改変ＳＷＭ３培地のみを接種したものを対照区として設けた。これらを上述の条件下で１４日間培養した。溶藻が見られたウェルのうち、最も高い希釈段階で接種を行ったウェル中の溶藻培養液を複数採取し、再度上述の段階希釈法による処理を試みた。２回目の処理で溶藻が見られたウェルのうち、最高希釈段階の溶藻培養液を２００μｌ採取し、０．１μｍのヌクレポアメンブレンフィルターで濾過後、その濾液を対数増殖中のリゾソレニアＳ３株（溶藻がみられた実験区で使用したものと同じ株）の培養液１ｍｌに接種した。以上の操作をもって、殺藻因子のクローニングが完了したものとみなした。また、得られた殺藻因子懸濁液を無菌検査培地ＳＴ１０−１に接種し２０℃で１−２日間培養後、白濁の有無によって混在する細菌の有無を確認した。
【００４１】
得られた殺藻因子の力価の測定
クローン化および無菌化が完了した殺藻因子の一部について、各溶藻液を、各殺藻因子を分離する際に使用した宿主株の対数増殖期培養に接種し、上記条件下で培養を行った。接種から５日目に培養液をそれぞれ採取し、上記の限界希釈法により処理し、各希釈段階で生じた溶藻ウェル数から、供した試料中の殺藻因子密度を推定した。
【００４２】
透過型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡による微視的観察
得られた殺藻因子クローンのうちからＲｓＶ０１株を選択し、各溶藻培養液２．５ｍｌを対数増殖中のリゾソレニアＳ３株の培養液５００ｍｌにそれぞれ接種した。接種前および接種から約９６時間後にサンプルを採取し、常法により固定包埋処理後、ＪＥＯＬ社製ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡による観察を行った。また、溶藻培養液中の殺藻因子の形態観察をネガティブ染色法により行った。
また、上述の殺藻因子クローンによる溶藻培養液３５０μｌに、システアミン塩酸塩を添加したトリスバッファーに溶解したＤＡＰＩ溶液（１５μｇ ｍｌ−１）２５μｌを添加した。５−１０分間、暗所で染色後、孔径０．０２μｍのＡｎｏｄｉｓｋフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上に減圧濾過により捕集し、蛍光顕微鏡を用いて紫外線励起下で観察した。
【００４３】
接種実験
上述の殺藻因子クローンによる溶藻培養液を孔径０．１μｍのメンブレンフィルターで濾過して得られた濾液、ならびにその一部をオートクレーブ処理（１２１℃×１５分）したものを、対数増殖中のリゾソレニアＳ３株培養液２５０ｍｌに対してそれぞれ５ｍｌずつ接種し、上述の条件下で培養を行った。実験は、各実験区につき１本立てで行い、細胞密度の変化を経日的にモニターすることで、その後の藻体の増殖を評価した。
また、感染の継続性について検討するため、溶藻培養液を７０００ｒｐｍで５分間遠心し得られた上清５０μｌを対数増殖中のリゾソレニア株培養液１ ｍｌに接種するという操作を３回以上繰り返し行った。また、対照として非接種区を設け、ともに上述の条件下で培養を行った。
【００４４】
宿主範囲の検討
表１に示した対数増殖中の各藻体株培養液７００μｌに対して、上述の溶藻培養液を７０００ｒｐｍで５分間遠心して得られた上清３５μｌをそれぞれ接種し、上述の条件下で培養を行った。また、対照として非接種区を設けた。実験は各実験区につき２本立てで行い、経日的に光学顕微鏡により被検細胞の状態を観察し、その後の藻体の増殖を評価した。接種１４日後までに溶藻が確認されなかったものについては、本殺藻因子の宿主ではないものと判定した。
【００４５】
ウイルスの保存
殺藻因子接種後１２０時間目の宿主培養液０．５ｍｌを等量のセルバンカー２（ＢＬＣ−１、 十慈フィールド社製）と混合撹拌した後、−１９６℃で保存した。凍結開始後１７日目に解凍処理を行った。また、並行して、同じ宿主培養液を４℃暗所に１７日間保存した。
保存実験に供した細胞懸濁液、解凍後のウイルス懸濁液、および冷蔵保存後のウイルス懸濁液のタイター（＝力価、殺藻因子の単位体積あたりの密度）をそれぞれ限界希釈法により算出し、比較した。
【００４６】
結果および考察
殺藻因子の分離
リゾソレニアＳ３株は、試水の０．１μｍ以下の画分を接種することにより、細胞の色素が失われ、死滅に至った（図１）。一方、０．１μｍ以下の画分を熱処理したものを接種した場合には、死滅は観察されず、増殖の継続が確認された。
有明海の試水を材料として得られた各溶藻培養液に対して、限界希釈法による処理を２回施し、表２に示す殺藻因子クローン株計９株が分離された。これらの殺藻因子株は、現在、すべて細菌の混在しない状態で、本発明者らにより培養が継続されている。
【００４７】
得られた殺藻因子の力価の測定
各殺藻因子株の力価を測定した結果に基づき、各株の最高収量を表３に示した。収量は１０７〜１０８／ｍｌのオーダーにあり、測定した株の中での最高値は３．８５×１０８／ｍｌであった。
【００４８】
透過型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡による微視的観察
透過型電子顕微鏡による細胞切片の観察結果を図２に示した。ＲｓＶ０１株の接種区では、接種から９６時間目には一部の細胞の崩壊が確認された。透過型電子顕微鏡による観察の結果、殺藻因子接種から９６時間後の細胞質中に小型のウイルス様粒子が多数検出された（図２Ｄ）。熱処理した殺藻因子懸濁液を接種した実験区ならびに無菌海水接種区においては、藻体細胞は活発な増殖を継続し、透過型電子顕微鏡による細胞切片観察によっても、健常な細胞内構造が観察された（図２Ｃ）。
溶藻培養液をネガティブ染色法により観察した結果、直径約２３−２６ｎｍ（平均２４ｎｍ）の球形ウイルス様粒子が多数観察され、いずれも外膜構造ならびに尾部構造を持たないことが確認された（図２Ｅ）。
また、蛍光顕微鏡観察の結果、過去に分離された微細藻類に感染する大型２本鎖ＤＮＡウイルス（ＨａＶ， ＨｃＶ等）でみられたような明瞭な粒子の染色は確認されず、ＤＡＰＩ染色による観察は該殺藻因子には不適であると考えられた。
【００４９】
接種実験
前処理を施した殺藻因子クローンＲｓＶ０１を接種した場合のリゾソレニアＳ３株の細胞密度の推移を図３に示した。０．１μｍ濾液接種区では、接種８日目から細胞密度の減少が見られた。熱処理接種区では、接種１３日後においても細胞密度の減少はみられなかった。同実験に用いた培養の写真を図４に示した。
また、連続した植え継ぎ実験から、本殺藻因子クローンは対数増殖中のリゾソレニア細胞を速やかにかつ繰り返し溶藻せしめることが確認された。
以上の結果から、この殺藻因子のサイズは０．１μｍ未満であり、かつ加熱処理により著しく殺藻性を喪失することが示唆された。
以上のことから、このウイルス様粒子は、１）病巣部には必ずその菌もしくはウイルスが検出される、２）健常な組織からはその菌もしくはウイルスは検出されない、３）人為的にその因子を接種することにより宿主にある特定の病気を起こさせることができる、という「コッホの条件」を満たしている。このことから、このウイルス様粒子がまさしく殺藻因子であり、「ウイルス」であることが示された。本ウイルスを「ＲｓＶ （リゾソレニア・セティゲラ・ウイルス）」と命名した。
【００５０】
宿主特異性
ＲｓＶ０１株は、標的種であるリゾソレニア・セティゲラ２株を除く珪藻１２種、緑藻１種、真正眼点藻１種、渦鞭毛藻９種、ユーグレナ藻１種およびラフィド藻６種に対して殺藻性を示さなかった（表１）。この実験結果から、本ウイルスがリゾソレニア・セティゲラにのみ特異的に感染するウイルスである可能性が高いと推察された。
【００５１】
ウイルスの保存方法
保存実験に供した細胞懸濁液、解凍後のウイルス懸濁液、および冷蔵保存後のウイルス懸濁液のタイターをそれぞれ限界希釈法により算出した結果を図５に示した。この結果から、凍結保存処理および冷暗所保存によりＲｓＶの力価はほとんど低下しないことが判明した。したがって、ＲｓＶ懸濁液をきわめて安定な状態で簡単に保存できることが可能である。
【００５２】
このように、我々は、西日本各地の海域で赤潮を形成し、貝類養殖業に多大な被害を及ぼしている渦鞭毛藻リゾソレニア・セティゲラに感染し、殺藻するウイルスＲｓＶの分離に成功した。ウイルスは爆発的な増殖力を有することから、小規模かつ低コストで多大な効果が期待できること、本ウイルスは天然環境水中から分離されたものであること、本ウイルスはリゾソレニアに特異的に感染し、殺藻すること、を考慮すると、本ウイルスの散布はリゾソレニア赤潮の防除法として有効であることが期待される。また、ＲｓＶには「高収量性」と「高安定性」が備わっている上、きわめて小型であることから、固定化剤（合成高分子ゲル）に包埋したものをノリ養殖筏に設置し、ウイルスを継続的に筏周辺に放出させることからなる赤潮防除方法を提供する上で有利な要件を備えているといえる。
【００５３】
【表１】
【表２】
なお、上記のウイルスクローンは、独立行政法人 水産総合研究センター 瀬戸内海区水産研究所（所長：福所邦彦） 赤潮環境部 赤潮生物研究室の研究グループに保管されており、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて分譲を行う用意がある。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、リゾソレニア属の藻類に特異的に感染して増殖しうるウイルスが提供された。また、本発明により、リゾソレニア属に特異的に感染して増殖・溶藻しうるウイルス、該ウイルスを利用するリゾソレニア赤潮防除方法およびリゾソレニア赤潮防除剤、並びに該ウイルスの単離方法、継代培養方法、および保存方法が提供された。本発明のウイルスを用いることにより、リゾソレニア赤潮を防除することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】赤潮原因珪藻リゾソレニア・セティゲラの光学顕微鏡写真。Ａ： 未感染の細胞、Ｂ： ＲｓＶに感染し色素を失った死滅細胞、Ｃ：外被が壊れ細胞質が漏出したＲｓＶ感染細胞。
【図２】赤潮原因珪藻リゾソレニア・セティゲラおよびＲｓＶの電子顕微鏡写真。Ａ：未感染の細胞の断面像、Ｂ： 未感染細胞の細胞質の拡大像、Ｃ： ＲｓＶ感染細胞の断面像、Ｄ： ＲｓＶ感染細胞の細胞質の拡大像、Ｅ： ＲｓＶ粒子の陰性染色像。 ウイルスのサイズが小さいため断面像のみの比較では差が分かりにくいが、感染細胞の細胞質内に多数の高電子密度粒子（＝ウイルス）が散在している様子が分かる。 また、陰性染色によりウイルスの形態は球形であることが推察される。
【図３】赤潮原因珪藻リゾソレニア・セティゲラに対するＲｓＶの影響を示すグラフ。 実験区では培養開始後１日目にウイルス接種を行った。 ウイルス接種後８日目より対照区と実験区の細胞密度に顕著な差がみられ始めた。
【図４】接種実験で用いた培養の写真（ウイルス接種後１１日目）。 対照区（右）に比べてウイルス接種区（左）では明らかに藻体の死滅が起こっていることが分かる。
【図５】ＲｓＶの凍結および冷蔵条件下でのタイターの変化を示すグラフ。 いずれの条件においても、保存開始時と保存開始後１７日目でほとんどタイターの減少がみられないことが分かる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a virus capable of specifically infecting red tide causing diatoms to proliferate and dissolve, red tide control method and red tide control agent using the virus, isolation method, subculture method and storage of the virus More specifically, the present invention relates to a virus capable of specifically infecting and growing algae of the genus Rhizosolenia, a red tide control method and a red tide control agent using the virus, and a method for isolating the virus, a subculture method, And a cryopreservation method.
[0002]
[Prior art]
Japan's sea farming industry accounts for about a quarter of the total domestic fishery production. In this promotion, it is indispensable to protect the environment of aquaculture grounds in particular, and it is extremely important to promote effective measures against the red tide that causes serious damage.
[0003]
The discoloration phenomenon of laver that occurred in the Ariake Sea from late 2000 to early 2001 caused devastating damage to laver farming. According to the statistics of Asahi Shimbun, the amount of laver production in the four prefectures of Fukuoka, Saga, Nagasaki, and Kumamoto in FY 2000 was about 13 billion yen less than that in FY 1999. The cause of this discoloration phenomenon is strongly suspected to be the effect of red tide caused by the genus Diatom Rhizosolenia, a kind of diatom.
[0004]
As for the cause of this phenomenon, a large amount of lysosolenia currently consumes excessive nutrients that should be used as nutrients for laver, and as a result, a sufficient amount of nutrients are not supplied to the cultured laver and the laver is colored. It is believed that the product value dropped significantly.
[0005]
On the other hand, in 2001, Nori became a great harvest. The reason for this is thought to be that the diatom species that proliferates in the Ariake Sea was not genus Rhizosolenia but Genus Cerros. In other words, in the environment where laver culture is carried out, what kind of diatom that grows there is an extremely important problem, and it is desired to establish a technique for artificially selecting and controlling the kind of diatom that grows.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Against this background, the world's first virus with diatoms as a host was discovered and isolated. This virus (RsV: Rhizosolenia stigera virus) selectively infects Rhizosolenia stigera, a kind of central diatom. The virus is excellent in terms of high yield and high stable storage stability.
[0007]
Rhizosolenia Setigella is a related species of the same genus as Rhizosolenia inbricater, which is the cause of damage caused by laver discoloration in 2000, and has often formed red tides in the Ariake Sea. The main object of the present invention is to explore the possibility of application of RsV to diatom red tide control, keeping in mind the development of a lysosolenia red tide control technology that is practically used. Red tide control using viruses is expected to be highly safe as an environmental restoration technology that places little burden on other organisms and the entire ecosystem, and various aspects such as mass culture technology, spraying method, and cost of viruses are expected. If the problem is cleared, it is expected that the way to practical use will be opened.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have succeeded in the isolation of a virus (RsV) that infects and kills Rhizosolenia cetigella for the first time in the world, and completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention provides a virus having a particle size of less than 0.1 μm that can specifically infect and proliferate algae belonging to the genus Rhizosolenia. The algae belonging to the genus Rhizosolenia is preferably Rhizosolenia cetigera. In one embodiment of the invention, the virus lacks a tail structure and an outer membrane structure and is spherical with a particle size of about 23-26 nm. In this embodiment, the average virus particle size is preferably 24 nm.
[0010]
In addition, the present invention filters a liquid sample containing a virus with a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and proliferate algae of the genus Rhizosolenia, with a filter having a pore size of 0.1 μm, and the obtained filtrate Inoculate and inoculate a culture solution of Rhizosolenia algae, and include a step of cloning the virus by limiting dilution of the culture solution in which Lysosolenia algae lytic algae was observed. The present invention provides a method for isolating viruses having a particle size of less than 0.1 μm, which can infect and propagate.
[0011]
As a liquid sample containing a virus having a particle size of less than 0.1 μm capable of specifically infecting and proliferating Rhizosolenia algae, a liquid sample containing Rhizosolenia algae infected with the virus (for example, Seawater at the end of Rhizosolenia red tide, culture solution of algae of Rhizosolenia infected with the virus, etc.) suspension of submarine mud containing the virus, supernatant obtained by centrifuging the suspension Etc. can be illustrated.
[0012]
In the virus isolation method of the present invention, in order to remove phytoplankton, bacteria, and large virus particles, it is filtered with a Nuclepore membrane filter having a pore size of 0.8 μm, and finally filtered with a 0.1 μm filter. It is appropriate to do.
[0013]
Examples of the medium for culturing the algae belonging to the genus Rhizosolenia include liquid medium such as SWM3 medium, ESM medium, f / 2 medium, and ASP medium.
[0014]
The lysosolenia algae for preparing a culture solution of the genus Rhizosolenia is preferably Rhizosolenia cetigella in the logarithmic growth phase, for example, the end of the logarithmic growth period of about 1/10 volume by volume in a fresh SWM3 medium. Or inoculated with Rhizosolenia cetigera culture solution in the early stationary phase, temperature 10-15 ° C., light intensity 100-150 μmol photons m-2S-1The culture medium of Rhizosolenia cetigella in the logarithmic growth phase can be prepared by culturing for 2 to 3 days under the culture condition of light /
[0015]
The limiting dilution in virus cloning is 100-10-10It is good to carry out at the dilution step of 2 times.
[0016]
In addition, the present invention provides a centrifugal treatment of a culture solution of a lysosolenia algae that is infected with a virus having a particle size of less than 0.1 μm and that has been confirmed to be dissolved by a virus having a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and grow a lysosolenia alga And a step of inoculating the obtained supernatant into a culture medium of the genus Rhizosolenia and repeating the culture at least once. Provided is a method for subculturing viruses smaller than 1 μm.
[0017]
Regardless of whether the algae of the genus Rhizosolenia is before or after being infected with the virus of the present invention, the temperature is 10 to 15 ° C. (15 ° C. is most suitable), and the light intensity is 100 to 150 μmol photons m.-2S-1It is preferable to carry out under conditions with a light-dark cycle.
[0018]
Furthermore, the present invention provides a red tide control agent comprising, as an active ingredient, a virus having a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and proliferate algae belonging to the genus Rhizosolenia.
[0019]
Furthermore, the present invention provides a red tide control method comprising spraying a red tide water area with a virus having a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and proliferate algae belonging to the genus Rhizosolenia.
[0020]
You may embed this virus in a fixing agent, and you may install in a laver culture basket. As a result, the virus can be continuously released around the heel.
[0021]
Examples of the immobilizing agent include synthetic polymer gels, synthetic resin prepolymers, natural polysaccharides, hollow fiber membranes, silicon polymers, activated carbon, microcapsules, and various thickeners.
[0022]
It is recommended that the virus embedded in the immobilizing agent is put in a seawater-resistant net or container and hung on a basket or fixed to the basket so that it is always washed with waves.
[0023]
The present invention also relates to a culture solution of a host infected with a virus having a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and proliferate algae of the genus Rhizosolenia, or a suspension obtained by concentrating the culture solution. A method for preserving a virus having a particle size of less than 0.1 μm, which can specifically infect and proliferate against algae of the genus Rhizosolenia, which comprises cryopreserving or storing in a cool dark place. In the case of cryopreservation, a culture solution of a host infected with a virus or a suspension obtained by concentrating the culture solution is mixed with a cryoprotectant, and the mixture is cryopreserved. When storing in a cool dark place, the culture solution of the host infected with the virus or the suspension obtained by concentrating the culture solution may be stored in a dark place around 4 ° C.
[0024]
In order to concentrate the culture solution of the host infected with the virus, low-speed centrifugation at 1500 to 2500 rpm may be performed for 10 to 15 minutes. By this operation, a high-density virus-infected cell suspension is obtained.
[0025]
In the present specification, “red tide” refers to a phenomenon in which the color of seawater changes with rapid proliferation of plankton. This term is widely used regardless of the presence or absence of aquatic product damage. Examples of plankton that cause harmful red tides in Japan include the genera Shutterella, Gymnodinium and Heterosigma. `` Rhizosolenia algae '' belongs to the diatom class, and the species belonging to the genus Rhizosolenia is Rhizosolenia Setigella, Rhizosolenia longiseta, Rhizosolenia hebetta, Rhizosolenia inbricata, Rhizosolenia bergoni, Rhizosolenia arata, Rhizoronia arata, Rhizorenia reso Examples include Rhizosolenia delicatesula. “Rhizosolenia cetigera” is a kind of red tide-causing diatom, and the cells are rod-shaped cylinders with both shells projecting diagonally. In many cases, it proliferates in winter and becomes a dominant species, and has often occurred as a plankton that constitutes the red tide in the Ariake Sea (January-March 1991, February 1993, February 1994, (January-March 1995, December 2000).
[0026]
A “virus” refers to a spherical or fibrous microstructure that is capable of growing only in infected host cells. Viruses are completely different from bacteria in that they cannot grow in two divisions and replicate only by using the host cell biosynthetic system. In addition, the host specificity is remarkably high compared to the case of bacteria. “High host specificity” means that the range (host range) of host species that can infect and propagate pathogenic parasites (in this case, viruses) is narrow.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0028]
The target organism of this study, Rhizosolenia cetigera, is a kind of red tide diatom, and the cells are rod-shaped cylinders with both shells protruding diagonally. In many cases, it proliferates in winter and becomes a dominant species, and has often occurred as a plankton that constitutes the red tide in the Ariake Sea (January-March 1991, February 1993, February 1994, (January-March 1995, December 2000).
[0029]
The virus of the present invention can specifically infect and amplify algae of the genus Rhizosolenia. A virus that can specifically infect and propagate in Rhizosolenia cetigera (RsV: lysosolenia cetigera virus) is a spherical virus having a particle size of about 23 to 26 nm that lacks a tail structure and an outer membrane structure. In experiments, lysosolenia cells infected with this virus eventually lose their pigment and die. In addition, it releases a large number of replicated progeny viruses and induces infection and death of new (ie, uninfected) lysosolenia cells. In addition, the host specificity of the virus is high, and thus far, no influence of the virus on phytoplankton other than Rhizosolenia and Setigella has been detected.
[0030]
The virus of the present invention can be isolated as follows. First of all, suspend the virus that exists in seawater containing the algae of the genus Rhizosolenia (for example, the seawater at the end of the Rhizosolenia red tide) or in the seabed mud that is infected with a virus that can specifically infect and propagate the algae of the genus Rhizosolenia. The turbid seawater medium is finally filtered through a filter having a pore size of 0.1 μm, and the obtained filtrate is inoculated into a culture solution of the genus Rhizosolenia in a logarithmic growth state, 15 ° C., 12 hours light: 12 hours 145 μmol photons m for 5-7 days in dark / dark cycle-2S-1Incubate under white fluorescent light. The light intensity can be measured using a commercially available photon meter.
[0031]
A culture solution of algae belonging to the genus Rhizosolenia was established by cloning the algae in advance by micropipette method or limiting dilution method, and establishing 2 nM Na.2SeO3After inoculation in the modified SWM3 medium (Chen et al., 1969, J. Physol 5: 211-220; Itoh & Imai, 1987, Shuwa, Tokyo, p. 122-130), 145 μmol photonsm-2S-1Can be prepared by irradiating a white fluorescent lamp with a light / dark cycle of 12 hours light: 12 hours dark and culturing at 15 ° C. When fresh SWM3 medium is inoculated with the culture solution of Rhizosolenia algae at the end of the logarithmic growth period or the early stationary phase in an amount of about 1/10 by volume, it is about 1 to 2 days after the start of the culture. Enter the logarithmic growth phase.
[0032]
Next, the virus is cloned by limiting dilution of the culture solution in which the algae of the genus Rhizosolenia was observed with the culture solution of the genus Rhizosolenia. The method for preparing the culture solution of the genus Rhizosolenia is as described above. Limit dilution may be performed as follows. First, a culture solution in which an algae of the genus Rhizosolenia was observed was taken out with a modified SWM3 medium.0-10-10Dilute serially and inoculate each dilution into logarithmically growing lysosolenia algae cultures. These are, for example, 15 ° C., 145 μmol photons m-2s-1, 12 hours light: cultured for 7 to 10 days under light / dark cycle conditions of 12 hours darkness. After culturing, the one with the highest dilution level in which an algae of the genus Rhizosolenia is observed is selected, and the treatment by the serial dilution method is repeated at least twice for the culture solution. After treatment by the final serial dilution method, among the culture media in which lysosornia algae was observed, the culture solution with the highest dilution level was collected and used as the culture solution for logarithmic growing lysosolenia algae. Inoculate. The above operation can be regarded as the completion of the cloning of the virus of the present invention.
[0033]
After removing the cell residue from the culture solution of the genus Rhizosolenia after cloning of the virus by centrifugation (for example, 2,000 to 7,000 rpm, 5 to 10 minutes), the centrifugation supernatant is serially diluted as described above. The density of virus present in the supernatant can be estimated by statistical calculation from the number of dead wells in each dilution step obtained by the method.
[0034]
The red tide can be controlled by spreading the virus of the present invention in the red tide water area. In controlling red tide, the culture solution or supernatant of the virus of the present invention may be used as it is, or a preparation containing the virus of the present invention as an active ingredient may be prepared and used. Since the red tide control method and the red tide control agent of the present invention use a host-specific virus that already exists in the natural environment, it is expected to be highly safe as an environmental restoration technique with a small burden on the ecosystem. Is sent. The red tide control agent of the present invention, unlike other ordinary drugs, has a self-replicating ability in the virus itself, and therefore, it can be expected to control red tide over a wide range with a small amount of input. Moreover, it is good to install what embedded the virus in the fixing agent in the laver culture cocoon, and to continuously release the virus around the cocoon. This method is considered to be effective in suppressing the dilution and diffusion of viruses into seawater and maintaining a high virus density for a long period around the ridges targeted for red tide control. As the immobilizing agent, synthetic polymer gel, synthetic resin prepolymer, natural polysaccharide, hollow fiber membrane, silicon polymer, activated carbon, microcapsule, various thickeners, and the like can be used.
[0035]
Next, a method for subculturing the virus of the present invention will be described.
[0036]
Centrifugal treatment (for example, 7,000 rpm, 5 minutes) of the culture solution of the algae of the genus Rhizosolenia that has been confirmed to have dissolved algae after being infected with the virus of the present invention, and the resulting supernatant is logarithmically growing Inoculate the algae culture solution and culture. Subsequent growth of algal bodies can be evaluated by a method of monitoring the cell density in the culture broth with an optical microscope over time. Thereby, it can be seen that the virus subcultured by the above method retains the infectivity to algae of the genus Rhizosolenia.
[0037]
Further, a method for storing the virus of the present invention will be described. 0.5 ml of the host culture solution 120 hours after inoculation with the algicidal factor (virus) is mixed with a cryoprotectant, and this mixture is stored frozen. As a cryoprotectant, Cell Banker 2 (BLC-1, manufactured by Toji Field) may be used. For example, 120 hours after inoculation of the algicidal factor (virus), the host culture solution is mixed with an equal amount of
[0038]
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. The scope of the present invention is not limited by these examples.
[0039]
【Example】
[Example 1]
Materials and methods
Test plankton
For isolation of the algicidal factor, Rhizosolenia strain S3 isolated from Ariake Sea was used. A modified SWM3 medium is used as the medium, and the temperature is 15 ° C and the light intensity is 145 μmol photons-2S-1, 12 hL: It was performed under a light-dark cycle condition of 12 hD.
[0040]
Isolation of algicidal factors
The test water used for the separation of the algicidal factor was collected on April 24, 2002, in the sea area of Saga Prefecture in the Ariake Sea. The sample water was filtered through a 0.2 μm Nuclepore membrane filter, and 1 ml of each of the obtained filtrates was inoculated into 1 ml of a culture solution of logarithmic lysosolenia S3 strain. Moreover, what carried out the heat processing (autoclave (121 degreeC x 15 minutes)) of the fraction below 0.2 micrometer as a control | contrast was similarly inoculated, and it culture | cultivated on the above-mentioned conditions.
For the purpose of cloning the algicidal factor, the limiting dilution method was repeated twice as follows. The culture solution in which the algae was confirmed by the above-mentioned culture was changed to 10 with the modified SWM3 medium.0-10-10The dilution was serially diluted, and 100 μl of each dilution was inoculated into 150 μl of a logarithmically growing lysosolenia strain. A 96-well microplate was used for the experiment, and inoculation was carried out in 8 tubes at each dilution stage. Moreover, what inoculated only the modified SWM3 culture medium was provided as a control group. These were cultured for 14 days under the conditions described above. Among the wells in which lysed algae were observed, a plurality of lysed algae cultures were collected from the wells that had been inoculated at the highest dilution level, and the above-described serial dilution method was tried again. Of the wells where lysed algae were found in the second treatment, 200 μl of the highest dilution stage lysed broth was collected, filtered through a 0.1 μm Nuclepore membrane filter, and the filtrate was logarithmically growing Rhizosolenia S3 strain It was inoculated into 1 ml of the culture solution of the same strain as that used in the experimental section where the algae was observed. With the above operation, it was considered that cloning of the algicidal factor was completed. Further, the obtained algicidal factor suspension was used as a sterile test medium ST10.-1And incubating at 20 ° C. for 1-2 days, the presence or absence of mixed bacteria was confirmed by the presence or absence of white turbidity.
[0041]
Determination of the titer of the obtained algicidal factor
For some of the algicidal factors that have been cloned and sterilized, each lysed solution is inoculated into the logarithmic growth phase culture of the host strain used to isolate each algicidal factor and cultured under the above conditions. went. On the 5th day after inoculation, each culture solution was collected and treated by the above limiting dilution method, and the algicidal factor density in the provided sample was estimated from the number of dissolved algal wells generated at each dilution stage.
[0042]
Microscopic observation with transmission electron microscope and fluorescence microscope
RsV01 strain was selected from the obtained algicidal factor clones, and 2.5 ml of each lysed culture broth was inoculated into 500 ml of the logarithmically growing lysosolenia strain S3. Samples were collected before inoculation and about 96 hours after inoculation, and after fixed embedding treatment by a conventional method, observation was performed with a JEOL JEM-1010 transmission electron microscope. In addition, morphological observation of the algicidal factor in the lysed broth was performed by negative staining.
In addition, DAPI solution (15 μg ml) dissolved in Tris buffer with cysteamine hydrochloride added to 350 μl of algal broth culture solution by the above-mentioned algicidal factor clones.-1) 25 μl was added. After staining in the dark for 5 to 10 minutes, the solution was collected by vacuum filtration on an Anodisk filter (Whatman) having a pore size of 0.02 μm, and observed under ultraviolet excitation using a fluorescence microscope.
[0043]
Inoculation experiment
The filtrate obtained by filtering the algae culture solution of the above-mentioned algicidal factor clones with a membrane filter having a pore size of 0.1 μm, and a part of which was autoclaved (121 ° C. × 15 minutes) 5 ml of each was inoculated to 250 ml of the Rhizosolenia S3 strain culture solution and cultured under the conditions described above. The experiment was performed in a single configuration for each experimental group, and the subsequent growth of algal bodies was evaluated by monitoring changes in cell density over time.
In addition, in order to examine the continuity of infection, the operation of inoculating 50 ml of the supernatant obtained by centrifuging the lysed broth at 7000 rpm into 1 ml of the exponentially growing lysosolenia strain culture was repeated three times or more. It was. In addition, a non-inoculated section was provided as a control, and both were cultured under the conditions described above.
[0044]
Examination of host range
To each 700 μl of each logarithmic growth culture shown in Table 1 was inoculated with 35 μl of the supernatant obtained by centrifuging the above-mentioned algal culture for 5 minutes at 7000 rpm, and cultured under the above conditions. Went. In addition, a non-inoculated area was provided as a control. The experiment was performed in two sets for each experimental group, and the state of the test cells was observed with an optical microscope over time, and the subsequent growth of algal bodies was evaluated. Those in which no algae were confirmed by 14 days after inoculation were judged not to be the host of the present algicidal factor.
[0045]
Virus storage
After mixing and stirring 0.5 ml of the host culture solution 120 hours after inoculation with the algicidal factor with an equal amount of Cell Banker 2 (BLC-1, manufactured by Toji Field), it was stored at -196 ° C. Thawing was performed on the 17th day after the start of freezing. In parallel, the same host culture solution was stored in the dark at 4 ° C. for 17 days.
The titer (= titer, density per unit volume of algicidal factor) of cell suspension, thawed virus suspension, and refrigerated virus suspension used for storage experiments was determined by the limiting dilution method. Calculated and compared.
[0046]
Results and Discussion
Isolation of algicidal factors
The Rhizosolenia strain S3 was inoculated with a fraction of 0.1 μm or less of the test water, and the cell dye was lost, leading to death (FIG. 1). On the other hand, when inoculating a heat-treated fraction of 0.1 μm or less, no death was observed and continuation of growth was confirmed.
Each of the algae cultures obtained using the Ariake Sea test water as a material was treated twice by the limiting dilution method, and a total of 9 algicidal factor clones shown in Table 2 were isolated. These algaecidal factor strains are currently continuously cultured by the present inventors in a state where no bacteria are present.
[0047]
Determination of the titer of the obtained algicidal factor
Based on the results of measuring the titer of each algicidal factor strain, the maximum yield of each strain is shown in Table 3. Yield 107-108/ Ml, and the highest value among the measured strains is 3.85 × 108/ Ml.
[0048]
Microscopic observation with transmission electron microscope and fluorescence microscope
The observation result of the cell section by the transmission electron microscope is shown in FIG. In the inoculated section of RsV01 strain, the destruction of some cells was confirmed 96 hours after the inoculation. As a result of observation with a transmission electron microscope, a large number of small virus-like particles were detected in the cytoplasm 96 hours after the inoculation of the algicidal factor (FIG. 2D). In the experimental group inoculated with the heat-treated algicidal factor suspension and in the aseptic seawater inoculated group, the algal somatic cells continued to proliferate, and a healthy intracellular structure was observed by observation of the cell section with a transmission electron microscope. (FIG. 2C).
As a result of observing the lysed broth by negative staining, a large number of spherical virus-like particles having a diameter of about 23-26 nm (average 24 nm) were observed, and it was confirmed that none had an outer membrane structure and a tail structure (Fig. 2E).
In addition, as a result of fluorescence microscope observation, clear particle staining as seen in large double-stranded DNA viruses (HaV, HcV, etc.) infecting microalgae isolated in the past was not confirmed, and observation by DAPI staining Was considered unsuitable for the algicidal factor.
[0049]
Inoculation experiment
The transition of the cell density of Rhizosolenia strain S3 when inoculated with the pretreated algicidal factor clone RsV01 is shown in FIG. In the 0.1 μm filtrate inoculation group, a decrease in cell density was observed from the 8th day of inoculation. In the heat-treated inoculation group, no decrease in cell density was observed even 13 days after inoculation. A photograph of the culture used in the experiment is shown in FIG.
Moreover, it was confirmed from the continuous planting experiment that this algal killing factor clone rapidly and repeatedly lyses the logarithmically growing lysosolenia cells.
From the above results, it was suggested that the size of the algicidal factor is less than 0.1 μm and that the algicidal property is remarkably lost by the heat treatment.
Based on the above, this virus-like particle is 1) the fungus or virus is always detected in the lesion, 2) the fungus or virus is not detected in healthy tissue, and 3) the factor is artificially added. Satisfies the Koch condition that a host can cause a specific disease by inoculation. This indicates that this virus-like particle is exactly an algicidal factor and is a “virus”. This virus was named “RsV (Rhizosolenia cetigera virus)”.
[0050]
Host specificity
RsV01 strain kills 12 species of diatoms, 1 species of green algae, 1 species of true ocular algae, 9 species of dinoflagellate, 1 species of Euglena algae and 6 species of rafido algae, excluding the 2 target species Rhizosolenia cetigella It did not show sex (Table 1). From this experimental result, it was speculated that there is a high possibility that this virus is a virus that specifically infects only Rhizosolenia and Setigella.
[0051]
How to save viruses
FIG. 5 shows the results of calculating the titers of the cell suspension, the thawed virus suspension, and the refrigerated virus suspension subjected to the preservation experiment by the limiting dilution method. From this result, it was found that the titer of RsV hardly decreased by freezing and cold storage. Therefore, it is possible to easily store the RsV suspension in a very stable state.
[0052]
In this way, we succeeded in isolating the virus RsV that infects and kills the dinoflagellate Rhizosolenia settiguela, which forms red tides in the seas of western Japan and causes great damage to the shellfish farming industry. Since the virus has an explosive growth potential, it can be expected to have a large effect at a small scale and at a low cost, the virus is isolated from water in the natural environment, and the virus specifically infects lysosolenia. In view of the algae killing, it is expected that the dispersal of this virus is effective as a control method for red tide of Rhizosolenia. In addition, RsV is equipped with “high yield” and “high stability” and is extremely small. It can be said that it has an advantageous requirement in providing a red tide control method that continuously releases virus around the cocoon.
[0053]
[Table 1]
[Table 2]
The above virus clones are stored in the research group of the Red Sea Environment Laboratory, Red Sea Environment Laboratory, Seto Inland Sea Fisheries Research Institute (Director: Kunihiko Fukusho), an independent administrative agency, Fisheries Research Center. Article 27 of the Patent Law Enforcement Regulations We are ready to sell in accordance with the provisions of No. 3.
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, a virus capable of specifically infecting and proliferating algae of the genus Rhizosolenia was provided. Further, according to the present invention, a virus capable of specifically proliferating and lysing by infecting genus Rhizosolenia, a lysosolenia red tide control method and a lysosolenia red tide control agent using the virus, and a method for isolating and subculturing the virus , And storage methods were provided. By using the virus of the present invention, lysosolenia red tide can be controlled.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an optical micrograph of a red tide cause diatom Rhizosolenia cetigera. A: uninfected cells, B: dead cells that have been infected with RsV and have lost their pigments, C: RsV-infected cells that have had their outer coat broken and leaked cytoplasm.
FIG. 2 is an electron micrograph of red tide causing diatom Rhizosolenia cetigella and RsV. A: Cross-sectional image of uninfected cells, B: Enlarged image of cytoplasm of uninfected cells, C: Cross-sectional image of RsV-infected cells, D: Enlarged image of cytoplasm of RsV-infected cells, E: Negative-stained image of RsV particles. <Due to the small size of the virus, it is difficult to see the difference only by comparing the cross-sectional images, but it can be seen that many high electron density particles (= viruses) are scattered in the cytoplasm of infected cells. In addition, it can be inferred from the negative staining that the form of the virus is spherical.
FIG. 3 is a graph showing the effect of RsV on the red tide causing diatom Rhizosolenia cetigera. In the experimental group, virus was inoculated on the first day after the start of culture. From the 8th day after virus inoculation, a marked difference in cell density between the control group and the experimental group began to be observed.
FIG. 4 is a photograph of the culture used in the inoculation experiment (11 days after virus inoculation). It can be seen that in the virus-inoculated area (left), algal cells are clearly killed compared to the control area (right).
FIG. 5 is a graph showing changes in titer under freezing and refrigeration conditions for RsV. Under any condition, it can be seen that there is almost no decrease in titer at the start of storage and on the 17th day after the start of storage.
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