JP2004099447A

JP2004099447A - Cholesterol-lowering peptide

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Publication number: JP2004099447A
Application number: JP2002259350A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Uchiumi; 内海　成; Motoyasu Adachi; 安達　基泰; Yoshie Sai; 崔　善江
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2004-04-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a peptide composed of an amino acid sequence in a region having a high cholesterol-lowering activity in a soybean protein, a cholesterol-lowering agent comprising the peptide as an active ingredient, a food and drink, a feed, a food and drink additive and a feed additive having the cholesterol-lowering activity imparted thereto by elucidating the amino acid sequence. <P>SOLUTION: Various deficient mutant peptides are prepared by using a region of Ile114 to Arg161 in a soybean protein Ala subunit as the center and a binding ability and affinity for various bile acids are examined to thereby elucidate amino acid sequences Val Ala Trp Trp Met Tyr having the high cholesterol-lowering activity. Thereby, the peptide and the cholesterol-lowering agent comprising the peptide as the active ingredient can be provided. The food and drink, the feed, the food and drink additive and the feed additive having the cholesterol-lowering activity imparted thereto can be provided. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドならびに該ペプチドを含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、成人病、中でも心臓血管系の疾患による死亡率が急増している。そして、その発症率と血中コレステロール濃度の相関が指摘されている。このような中、食品成分により血中コレステロール値を低減しようという試みがなされている。例えば、血中コレステロール値を低減するタンパク質として、大豆タンパク質（例えば、非特許文献１参照）、ホエータンパク質（例えば、非特許文献２参照）、乳清タンパク質（例えば、特許文献１参照）などが知られている。
【０００３】
特に大豆タンパク質は血中コレステロール低減効果が期待でき、更に安価に入手しやすいことから、食事療法の一環として、あるいは健康食品へ配合した形で近年広く使用されてきている。また、大豆タンパク質を酵素で加水分解して得られた分子量２００〜１，５００のオリゴペプチドの混合物に更に高い血中コレステロール低減作用があることが示されている（例えば、特許文献２参照）。
血中コレステロール低減効果を期待できる量を摂取するためには、飲食品中に多量に配合する必要がある。多量に配合すれば大豆特有の風味、あるいは加水分解により生じる苦味などが障害となることにより大豆タンパク質は十分には利用されていなかった。
【０００４】
また、これら大豆タンパク質において活性領域が明らかにされていないことは、高純度が要求される医薬品としての使用を妨げ、また共存する他のペプチドなどと区別することが要求される飲食品への使用を困難にしている。そこで、コレステロール低減化活性を有する公知のタンパク質あるいはペプチド混合物から活性領域を明らかにすることが課題となっている。
【０００５】
このような中、血中コレステロール低減作用と相関が高いとされている、胆汁酸との親和性を指標として大豆タンパク質中の活性画分について検討されている。胆汁酸との高い親和性を示すペプチドは、腸管内で胆汁酸の再吸収を阻害すること、あるいは胆汁酸混合ミセル中へのコレステロールの溶解性を低下させることによって、体内のコレステロールの低減効果を期待できることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。そして、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニット（以下単にＡ_ｌａともいう）中において、胆汁酸との高い結合能を有するＩｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の領域が見出されている（例えば、非特許文献４参照）。
しかし、この領域も４８個のアミノ酸残基から構成される大きなペプチド断片であり、活性領域とは言えず、医薬や飲食品として応用するには依然として十分ではない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平５−１７６７１３号公報
【特許文献２】
特開昭６０−１１４２５号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．　Ｎｕｔｒ．　Ｓｏｃ．，　４１，　１９，　（１９８２）
【非特許文献２】
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５５，　８１３　（１９９１）
【非特許文献３】
Ｊ．　Ｎｕｔｒ．，　１２９，　１７２５　（１９９９）
【非特許文献４】
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１（１９９０）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規ペプチドを有効成分として含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、食品添加剤および飼料添加剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明は、（１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、（２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から連続した１〜１１のアミノ酸が付加されたペプチド、および（１）または（２）に記載のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に１以上のアミノ酸が付加され、かつコレステロール低減化活性を有するペプチドからなる群より選ばれるペプチド（以下、本発明のペプチドともいう）、ならびに本発明のポリペプチドを含有するコレステロール低減化剤、飲食品、飼料、食品添加剤および飼料添加剤に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、上記のとおりであるが、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１で表わされるアミノ酸配列のＣ末端に配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から連続した１〜１１のアミノ酸が付加されたペプチドには、コレステロール低減化活性を有する限り、該ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に更に１以上、好ましくは１〜数十個、さらに好ましくは１〜数個のアミノ酸配列が付加されていてもよい。該ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に付加される１以上のアミノ酸としては、例えば配列番号４で表わされるアミノ酸配列のＣ末端（Ｇｌｙ）から始まり、かつＮ末端（Ｐｈｅ）に向けて連続した１以上のアミノ酸があげられる。なお、配列番号４は、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのＰｈｅ１−Ｇｌｙ１２８の領域のアミノ酸配列である。
【００１０】
本発明のペプチドは、自然界に存在するタンパク質、特に大豆タンパク質から適当な酵素で分解後、分離精製したり（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１（１９９０））、化学的手法により合成して（ペプチド合成，　丸善（１９７５））得ることができる。また、分子生物学的手法により、遺伝子鋳型情報をもとに構築したプラスミドを組み込み適当な宿主中で発現させて得ること等もできる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））。
【００１１】
本発明のペプチドを含有するコレステロール低減化剤（以下、本発明のコレステロール低減化剤ともいう）、ならびに該ペプチドを含有するコレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤（以下、それぞれ本発明の飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤ともいう）について、以下に示す。
【００１２】
本発明のコレステロール低減化剤は、本発明のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体を含有していてもよい。また本発明のコレステロール低減化剤には、コレステロール低減化に有効な任意の他の成分が添加されていてもよい。
【００１３】
コレステロール低減化に有効な他の成分（以下、単に他の有効成分ともいう）としては、例えば、プラバスタチンナトリウム、シンバスタチン、フルバスタチンナトリウム、アトルバスタチンカルシウム水和物、クロフィブラート、クロフィブラートアルミニウム、クリノフィブラート、シンフィブラート、ベザフィブラート、フェノフィブラート、ニコモール、ニセリトロール、コレスチラミン、コレスチミド、プロブコール、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ、ポリエンホスファチジルコリン、エラスターゼ、イコサペント酸エチル、ロバスタチン、モナコリンＫ、酪酸リボフラビン、植物ステロール、植物ステロールエステル、キトサン、デキストリン、低分子アルギン酸ナトリウム、サポニン等があげられる。これら成分は精製物であっても該成分含有物または抽出物であってもよい。
【００１４】
本発明のコレステロール低減化剤は、本発明のペプチド、好ましくは配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬理学的に許容される塩を、必要に応じて他の有効成分と薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法（製剤学（改訂第２版），　南江堂（１９９５））により製造できる。
【００１５】
本発明のコレステロール低減化剤の投与経路は、例えば経口投与または、例えば静脈内投与などの非経口投与をあげることができる。
投与形態としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤等があげられる。
【００１６】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、スクロース、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類などの希釈剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどの香料などを使用して製造できる。
【００１７】
経口投与に適当な、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、白糖、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などの植物末などの賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油などの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液などの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００１８】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
【００１９】
これら非経口製剤においても、経口製剤で例示した希釈剤、防腐剤、保存剤、香料、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明のコレステロール低減化剤は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質または重篤度により異なるが、経口の場合、成人一人当り本発明のペプチドを乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り本発明のペプチド乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．１〜２ｇを一日一回ないし数回投与する。
【００２０】
本発明のコレステロール低減化剤を継続的に投与することにより、体内のコレステロール値を低減することができる。
なお、本発明のコレステロール低減化剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物に対しても使用することができる。動物に使用する場合は、本発明のペプチドの乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５ｇ〜２ｇ／ｋｇを一日一回ないし数回投与する。
【００２１】
本発明の飲食品または飼料としては、本発明のペプチドをそのまま飲食品もしくは飼料としたもの、または該ペプチドを飲食品もしくは飼料に添加したものがあげられる。該飲食品または飼料はコレステロール低減化活性を有し、健康の維持、向上の目的で使用される。
【００２２】
本発明の飲食品または飼料は、本発明のペプチドをそのまま、または必要に応じて他の有効成分を添加する以外は一般的な飲食品または飼料の製造方法を用いることにより、製造することができる。
また、該飲食品または飼料は一般の飲食品または飼料に用いられる成形・造粒等の加工方法で加工してもよい。加工方法としては、流動層造粒、攪拌造粒、押出造粒、転動造粒、気流造粒、圧縮成形造粒、解砕造粒、噴霧造粒、噴射造粒などの造粒方法、パンコーティング、流動層コーティング、ドライコーティングなどのコーティング方法、パフドライ、過剰水蒸気法、フォームマット方法、マイクロ波加熱方法などの膨化方法などがあげられる。
【００２３】
本発明の飲食品または飼料は本発明のペプチドを通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％含有するように添加される。
本発明の飲食品としては、例えば健康食品、健康飲料、ジュース類、清涼飲料水、スープ類、茶類、乳酸菌飲料、発酵乳、冷菓、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂粉乳等の乳製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の食肉製品、魚肉錬り製品、だし巻き、卵豆腐等の卵製品、クッキー、ゼリー、スナック菓子、チューイングガム等の菓子類、パン類、麺類、漬け物類、薫製品、干物、佃煮、調味料等があげられる。
【００２４】
飲食品の形態としては、例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等があげられる。
本発明の飲食品には、必要に応じて一般の飲食品に用いられる甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物などの添加物を添加してもよい。
【００２５】
甘味料としては、アスパルテーム、カンゾウ、ステビア、キシロース、ラカンカ、などがあげられる。
着色料としては、カロチノイド色素、ウコン色素、フラボノイド、カラメル色素、シコン色素、スピルリナ色素、葉緑素、ムラサキイモ色素、ムラサキヤマイモ色素、シソ色素、ブルーベリー色素などがあげられる。
【００２６】
保存料としては、亜硫酸ナトリウム、安息香酸類、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、ソルビン酸類、プロピオン酸類、などがあげられる。
増粘安定剤としては、アラビアガムやキサンタンガムなどのガム類、アルギン酸類、キチン、キトサン、キダチアロエ抽出物、グァーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、カゼインナトリウム、コーンスターチ、カルボキシメチルセルロース類、ゼラチン、寒天、デキストリン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、微小繊維状セルロース、微結晶セルロース、海藻セルロース、ポリアクリル酸ソーダ、ポリリン酸ナトリウム、カラギーナン、酵母細胞壁、コンニャクイモ抽出物、ナタデココ、マンナンなどがあげられる。
【００２７】
酸化防止剤としては、ビタミンＣ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム、エリソルビン酸、オリザノール、カテキン、ケルセチン、クローブ抽出物、酵素処理ルチン、リンゴ抽出物、ゴマ油抽出物、ジブチルヒドロキシトルエン、ウイキョウ抽出物、セイヨウワサビ抽出物、セリ抽出物、チャ抽出物、テンペ抽出物、ドクダミ抽出物、トコトリエノール、トコフェロール類、ナタネ油抽出物、生コーヒー豆抽出物、ヒマワリ種子、フェルラ酸、ブチルヒドロキシアニソール、ブルーベリー葉抽出物、プロポリス抽出物、ヘゴ・イチョウ抽出物、ヘスペレチン、コショウ抽出物、ホウセンカ抽出物、没食子酸、ヤマモモ抽出物、ユーカリ抽出物、ローズマリー抽出物などがあげられる。
【００２８】
発色剤としては、亜硝酸ナトリウムなどがあげられる。
漂白剤としては、亜硫酸ナトリウムなどがあげられる。
防かび剤としては、オルトフェニルフェノールなどがあげられる。
ガムベースとしては、アセチルリシノール酸メチル、ウルシロウ、エステルガム、エレミ樹脂、オウリキュウリロウ、オゾケライト、オポパナックス樹脂、カウリガム、カルナウバロウ、グアヤク樹脂、グッタカチュウ、グッタハンカン、グッタペルカ、グリセリン脂肪酸エスエル、ゲイロウ、コパオババルサム、コーパル樹脂、ゴム、コメヌカロウ、サトウキビロウ、シェラック、ジェルトン、スクロース脂肪酸エステル、ソルバ、ソルビタン脂肪酸エステル、タルク、炭酸カルシウム、ダンマル樹脂、チクル、チルテ、ツヌー、低分子ゴム、パラフィンワックス、ファーバルサム、プロピレングリコール脂肪酸エステル、粉末パルプ、粉末モミガラ、ホホバロウ、ポリイソブチレン、ポリブテン、マイクロクリスタルワックス、マスチック、マッサランドバチョコレート、ミツロウ、りん酸カルシウム等があげられる。
【００２９】
苦味料としては、イソアルファー苦味酸、カフェイン、カワラタケ抽出物、キナ抽出物、キハダ抽出物、ゲンチアナ抽出物、香辛料抽出物、酵素処理ナリンジン、ジャマイカカッシア抽出物、デオブロミン、ナリンジン、ニガキ抽出物、ニガヨモギ抽出物、ヒキオコシ抽出物、ヒメマツタケ抽出物、ボラペット、メチルチオアデノシン、レイシ抽出物、オリーブ茶、ダイダイ抽出物、ホップ抽出物、ヨモギ抽出物等があげられる。
【００３０】
酵素または酵素源としては、アミラーゼ、トリプシン、レンネット、乳酸菌等があげられる。
光沢剤としては、ウルシロウ、モクロウ等があげられる。
酸味料としては、アジピン酸、イタコン酸、クエン酸類、コハク酸類、酢酸ナトリウム、酒石酸類、二酸化炭素、乳酸、フィチン酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸等があげられる。
【００３１】
調味料としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、イソロイシン、グリシン、セリン、シスチン、チロシン、ロイシン、プロリンなどのアミノ酸、イノシン酸ナトリウム、ウリジル酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、シチジル酸ナトリウム、リボヌクレオチドカルシウム、リボヌクレオチドナトリウムなどの核酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、塩化カリウム、塩水湖水低塩ナトリウム液、粗製海水塩化カリウム、ホエイソルト、りん酸三カリウム、りん酸水素ニカリウム、りん酸ニ水素カリウム、りん酸水素ニナトリウム、りん酸ニ水素ナトリウム、りん酸三ナトリウム、クロレラ抽出物等があげられる。
【００３２】
乳化剤としては、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル等があげられる。
強化剤としては、亜鉛塩類、ビタミンＣ、各種アミノ酸、５−アデニル酸、塩化鉄、ヘスペリジン、各種焼成カルシウム、各種未焼成カルシウム、ジベンゾイルチアミン、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、チアミン塩酸塩、デュナリエラカロチン、トコフェロール、ニコチン酸、ニンジンカロチン、パーム油カロチン、パントテン酸カルシウム、ビタミンＡ、ヒドロキシプロリン、ピロリン酸ニ水素カルシウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、フェリチン、ヘム鉄、メナキノン、葉酸、リボフラビン等があげられる。
【００３３】
製造用剤としては、アセトン、イオン交換樹脂などの加工助剤、イチジク葉抽出物、イナワラ灰抽出物、カオリン、グリセリン脂肪酸エステル、クワ抽出物、骨灰、シソ抽出物、ショウガ抽出物、各種タンニン、ファフィア抽出物、ブドウ種子抽出物、エタノール等があげられる。
【００３４】
香料としては、前述の香料等があげられる。
香辛料抽出物としては、唐辛子抽出物、ニンニク抽出物等があげられる。
本発明の飲食品の摂取量は、成人に対し一日あたり本発明のペプチド乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇである。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取者の症状の程度や年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００３５】
本発明の飲食品は、１日に１回ないし数回摂取する。該飲食品を継続的に摂取することにより、体内のコレステロールを低減化することができる。
本発明のペプチドを添加してなる飼料は、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等の動物、好ましくは哺乳類に対する飼料として用いられる。例えば、本発明の飼料はイヌ、ネコ、ネズミ等のペット用飼料、ウシ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ、七面鳥等の家禽用飼料、タイ、ハマチ等の養殖魚用飼料等として用いられ、好ましくは、ペット用飼料または家畜用飼料として用いられる。
【００３６】
本発明の飼料は、飼料原料に本発明のペプチドを適宜配合して製造することができる。飼料原料としては、穀物類、そうこう類、植物性油かす類、動物性飼料原料、その他飼料原料、精製品等があげられる。
穀物類としては、例えばマイロ、小麦、大麦、えん麦、らい麦、玄米、そば、あわ、きび、ひえ、とうもろこし、大豆等があげられる。
【００３７】
そうこう類としては、例えば米ぬか、脱脂米ぬか、ふすま、末粉、小麦胚芽、麦ぬか、トウモロコシぬか、トウモロコシ胚芽等があげられる。
植物性油かす類としては、例えば大豆油かす、きな粉、あまに油かす、綿実油かす、落花生油かす、サフラワー油かす、やし油かす、パーム油かす、ごま油かす、ひまわり油かす、なたね油かす、カポック油かす、からし油かす等があげられる。
【００３８】
動物性飼料原料としては、例えば魚粉（北洋ミール、輸入ミール、ホールミール、沿岸ミール等）、フィッシュソルブル、肉粉、肉骨粉、血粉、分解毛、骨粉、家畜用処理副産物、フェザーミール、蚕よう、脱脂粉乳、カゼイン、乾燥ホエー等があげられる。
【００３９】
その他飼料原料としては、植物茎葉類（アルファルファ、ヘイキューブ、アルファルファリーフミール、ニセアカシア粉末等）、トウモロコシ加工工業副産物（コーングルテン、ミール、コーングルテンフィード、コーンステープリカー等）、でんぷん加工品、砂糖、発酵工業産物（酵母、ビールかす、麦芽根、アルコールかす、しょう油かす等）、農産製造副産物（柑橘加工かす、豆腐かす、コーヒーかす、ココアかす等）、その他（キャッサバ、そら豆、グアミール、海藻、オキアミ、スピルリナ、クロレラ、鉱物等）等があげられる。
【００４０】
精製品としては、タンパク質（カゼイン、アルブミン等）、アミノ酸、糖質（スターチ、セルロース、スクロース、グルコース等）、ミネラル、ビタミン等があげられる。
本発明の飼料の動物への摂取量は、本発明ペプチド乾燥重量として、動物の体重１ｋｇ、１日あたり通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇである。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取動物の種類、年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４１】
本発明の飼料を動物に継続的に摂取させることにより、体内のコレステロールを低減することができる。
本発明の飲食品添加剤または飼料添加剤は、本発明のペプチド、好ましくは配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを含有し、必要に応じて前述の飲食品に例示した甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物などの添加物を添加してもよい。また、経口製剤で例示した希釈剤、防腐剤、保存剤、香料、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００４２】
本発明の飲食品添加剤は、成人に対し一日あたり、本発明のペプチドを乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇ摂取する。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取者の症状の程度や年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４３】
本発明の飲食品添加剤は、通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の割合で飲食品に添加する。
本発明の飲食品添加剤は、飲食品に添加して１日に１回ないし数回摂取する。本発明の飲食品添加剤を含有する飲食品を継続的に摂取することにより、体内のコレステロールを低減することができる。
【００４４】
本発明の飼料添加剤は、本発明のペプチドを乾燥重量として、動物の体重１ｋｇ、１日あたり通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇ摂取させる。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取動物の種類、年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４５】
本発明の飼料添加物を飼料に添加して動物に継続的に摂取させることにより、体内のコレステロールを低減することができる。
本発明の飼料添加剤の飼料への添加量は、通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。
以下に実施例を記載して本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００４６】
実施例１　高い胆汁酸結合能を有するペプチド領域の探索
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を有する大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのうち、胆汁酸結合能を有することが確認されている配列番号５で表わされるＩｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の領域（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１　（１９９０））に着目し、以下に記す方法により当該領域中に含まれる活性画分を明らかにした。
【００４７】
Ｉｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の部分を中心として、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのＣ末端から順次にアミノ酸残基を欠失させた図１に示す各種欠失変異体ペプチド（デレーションミュータント）を設計した。各変異体は、それらの遺伝子鋳型情報をもとにＰＣＲ法（改訂ＰＣＲ　Ｔｉｐｓ可能性を広げるコツとヒント，　秀潤社（１９９９））により調製し、発現プラスミドに組み込んで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）中で発現させた。該大腸菌を超音波破砕した後に、沈殿画分を０．２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ（ｐ−アミジノフェニル）−メチルスルフォニルフルオライド、１μＭペプスタチンＡおよび２μＭロイペプチンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、６Ｍ尿素液に溶かして評価に供する試料とした。以下に記すような方法により得られるコール酸固定化カラムを用い、溶出速度を指標として胆汁酸との結合強度を測定した。
【００４８】
ＥＡＨセファロース４Ｂ（アマーシャム　ファルマシア社製）に、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いてコール酸（和光純薬工業社製）を結合させ、これをＨＲ１０／１０カラム（アマーシャム　ファルマシア社製）に充填することにより、コール酸固定化カラムを作成した。尿素液に溶解した各欠失変異体ペプチド（試料）を上記のように作製したコール酸固定化カラムに供した後、まず、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．０２％　ＮａＮ_３を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。１Ｍ　ＮａＣｌを含む同緩衝液で再度洗浄した後、カラムに吸着した試料をコール酸ナトリウムを含む上記緩衝液においてコール酸ナトリウム濃度を０から７０ｍＭの濃度勾配をかけて溶出させ分画した。各画分中のタンパク質量を測定し、溶出速度を求めた。
結果を第１表に示す。
【００４９】
【表１】

【００５０】
Ａ_ｌａは分画番号２３の位置に溶出した。Δ［２５０−２９１］（配列番号３で表わされるアミノ酸配列のうち２５０〜２９１番目のアミノ酸残基を欠失させたデレーションミュータント）、Δ［１８２−２９１］およびΔ［１６２−２９１］は、Ａ_ｌａとほぼ同じ位置に溶出したのに対し、Δ［１３８−２９１］はＡ_ｌａより遅く溶出した。Δ［１３０−２９１］、Δ［１２２−２９１］およびΔ［１１４−２９１］はコール酸固定化カラムで、流出画分に溶出した。流出画分に溶出したものはコール酸との結合能を有さないものと考えられた。
【００５１】
以上の結果から、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのコール酸に対する結合には１３０〜１４５番目のアミノ酸残基が関係しており、特に１３０〜１３７番目のアミノ酸残基が重要であると考えられた。
更に、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのアミノ酸配列の中で１３０〜１３７番目の領域は疎水性残基に富んでいることから、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のうち１２９〜１３４番目のアミノ酸残基、すなわち配列番号１で表わされるアミノ酸配列を欠失させたデレーションミュータントであるΔ［１２９−１３４］を調製し、解析に供した。
第１表に示すように、Δ［１２９−１３４］はＡ_ｌａと比較して、コール酸固定化カラムにおいてかなり遅い分画番号の位置に溶出された。
【００５２】
実施例２　胆汁酸との高い親和性を有するペプチド領域の探索
実施例１と同様にして試料を作成し、以下の試験に供した。
本試験においては、各欠失変異体ペプチドのコール酸に対する親和性を以下に示す蛍光分析により求めたＫｄ値で比較した。
【００５３】
コール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、２Ｍ尿素、５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．０２％　ＮａＮ_３を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に各試料を溶解させ、コール酸濃度を変化させた場合の蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、分光蛍光強度計Ｆ−３０００（日立製作所社製）を用いて行った。励起波長；　２８０ｎｍ、蛍光波長；　３３０および３３７ｎｍで測定し、その比をもとに各試料のコール酸ナトリウムに対する解離定数（Ｋｄ値）を求めた。
結果を第２表に示す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
Δ［２５０−２９１］、Δ［１８２−２９１］、Δ［１６２−２９１］、Δ［１５４−２９１］およびΔ［１４６−２９１］のコール酸に対するＫｄ値は、Ａ_ｌａのコール酸に対するＫｄ値３３ｍＭと比べてほとんど差は認められなかった。
【００５６】
また、実施例１に記したようにコール酸固定化カラムで、Ａ_ｌａより遅く溶出されたΔ［１３８−２９１］のコール酸に対するＫｄ値は７４ｍＭであり、コール酸への親和性の減少が、蛍光の測定でも観察された。
一方、第１表において、コール酸固定化カラムに結合しなかったΔ［１３０−２９１］、Δ［１２２−２９１］およびΔ［１１４−２９１］は、コール酸に対して非常に低い親和性を示した。
【００５７】
また、Δ［１２９−１３４］のＫｄ値は１３０ｍＭであり、Ａ_ｌａのＫｄ値と比較して４倍低い値を示した。
以上の実施例１および２の結果から、大豆タンパク質のＡ_ｌａサブユニットのコール酸に対する結合においては、１２９〜１４５番目のアミノ酸残基、すなわち配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に、さらに配列番号２のＮ末端から連続した１１のアミノ酸が付加されたペプチドが重要であり、特に１２９〜１３４番目の疎水性残基、すなわち配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドが重要な役割を担っている活性部分であることが明らかになった。
【００５８】
これらの結果は、配列番号１で表わされるペプチドがコレステロール低減化活性の有効成分であることを示しており、これを含む本発明ペプチドが本発明のコレステロール低減化剤、飲食品、飼料、飲食品添加剤、および飼料添加剤がヒトおよび動物のコレステロール低減化に有用であることが期待できる。
【００５９】
実施例３
次の配合によりハンバーグ（２人前）を製造する。
たまねぎ　：　１／２個
ひき肉　　：　１００ｇ
水　　　　：　２９．２ｇ
ラード　　：　１１．８ｇ
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
卵　　　　：　１個
パン粉　　：　少量
調味料　　：　少量
【００６０】
実施例４
次の配合によりクッキー（３０個分）を製造する。
薄力粉　　：　１００ｇ
澱粉　　　：　　７４ｇ
水　　　　：　　１４ｇ
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
ベーキングパウダー　：　小さじ２
塩　　　　：　小さじ１／２
卵　　　　：　１個
バター　　：　　８０ｇ
牛乳　　　：　大さじ２
ハチミツ　：　少量
【００６１】
実施例５
次の配合により粉末飲料を製造する。
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　５００ｍｇ
カゼインナトリウム　：　１７．５ｇ
Ｌ−バリン　：　０．５ｇ
ピロリン酸第二鉄（鉄源）　　：　０．１ｇ
ホスカルＥＦＣ（カルシウム源；日興ファインプロダクツ社）　　：　１ｇ
ビタミンミックス（メルク社）　　：　１ｇ
飲料にする場合には、本品４ｇを水１８０ｍｌに分散させる。
【００６２】
実施例６
次の配合により粉末飲料を製造する。
配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　５００ｍｇ
カゼインナトリウム　：　１７．５ｇ
Ｌ−バリン　：　０．５ｇ
ピロリン酸第二鉄（鉄源）　　：　０．１ｇ
ホスカルＥＦＣ（カルシウム源；日興ファインプロダクツ社）　　：　１ｇ
ビタミンミックス（メルク社）　　：　１ｇ
飲料にする場合には、本品４ｇを水１８０ｍｌに分散させる。
【００６３】
実施例７
次の配合により錠剤（タブレット）を製造する。
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
粉糖　　　：　２．６ｇ
アスコルビン酸　：　１５０ｍｇ
クエン酸　：　０．１ｇ
ショ糖ステアリン酸エステル　：　１５０ｍｇ
香料　　　：　１５ｍｇ
【００６４】
実施例８
次の配合により錠剤（タブレット）を製造する。
配列番号７で表わされるアミノ酸からなるペプチド　：　１００ｍｇ
粉糖　　　：　２．６ｇ
アスコルビン酸　：　１５０ｍｇ
クエン酸　：　０．１ｇ
ショ糖ステアリン酸エステル　：　１５０ｍｇ
香料　　　：　１５ｍｇ
【００６５】
【発明の効果】
本発明によれば、新規ペプチドを有効成分として含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低下能を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤が提供される。
【００６６】
【配列表】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および２において使用したデレーションミュータント。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel peptide, a cholesterol-lowering agent containing the peptide, a food or drink having a cholesterol-reducing activity, a feed, a food or drink additive, and a feed additive.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the mortality rate due to adult diseases, particularly cardiovascular diseases, has increased rapidly. The correlation between the incidence and blood cholesterol concentration has been pointed out. Under such circumstances, attempts have been made to reduce blood cholesterol levels by using food components. For example, soy protein (for example, see Non-Patent Document 1), whey protein (for example, see Non-Patent Document 2), whey protein (for example, see Patent Document 1), etc., are known as proteins that reduce blood cholesterol levels. Have been.
[0003]
In particular, soybean protein is expected to have a blood cholesterol-reducing effect and is easily available at a low cost. Therefore, soybean protein has been widely used in recent years as a part of dietary treatment or in a form blended with health foods. In addition, it has been shown that a mixture of oligopeptides having a molecular weight of 200 to 1,500 obtained by hydrolyzing soybean protein with an enzyme has an even higher blood cholesterol-reducing effect (for example, see Patent Document 2).
In order to ingest an amount that can be expected to reduce blood cholesterol, it is necessary to incorporate a large amount of the compound into food or drink. If so blended in a large amount, soybean protein or flavor was not sufficiently used because the flavor characteristic of soybean or the bitterness caused by hydrolysis hindered the soybean protein.
[0004]
In addition, the lack of clarification of the active region in these soybean proteins hinders their use as pharmaceuticals requiring high purity, and their use in foods and drinks that are required to be distinguished from other coexisting peptides. Is making it difficult. Therefore, it has been an issue to clarify the active region from a known protein or peptide mixture having cholesterol lowering activity.
[0005]
Under such circumstances, the active fraction in soybean protein, which is considered to have a high correlation with the blood cholesterol lowering effect, has been studied using the affinity for bile acid as an index. Peptides that exhibit high affinity for bile acids can reduce cholesterol in the body by inhibiting the reabsorption of bile acids in the intestinal tract or by reducing the solubility of cholesterol in micelles containing bile acids. It is reported that this can be expected (for example, see Non-Patent Document 3). And soy protein A _la Subunit (hereinafter simply A _la ), A region of Ile114-Arg161 having high binding ability to bile acids is found (for example, see Non-patent Document 4).
However, this region is also a large peptide fragment composed of 48 amino acid residues, cannot be said to be an active region, and is still not sufficient for application as a medicine or food or drink.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-5-176713
[Patent Document 2]
JP-A-60-11425
[Non-patent document 1]
Proc. Nutr. Soc. , 41 , 19, (1982)
[Non-patent document 2]
Agric. Biol. Chem. , 55 , 813 (1991)
[Non-Patent Document 3]
J. Nutr. , 129 , 1725 (1999)
[Non-patent document 4]
Agric. Biol. Chem. , 54 , 511 (1990).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a cholesterol-lowering agent containing a novel peptide as an active ingredient, a food or drink, a feed, a food additive, and a feed additive having a cholesterol-reducing activity.
[0008]
[Means to solve the problem]
The present invention relates to (1) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Selected from the group consisting of a peptide to which 11 to 11 amino acids have been added, and a peptide having one or more amino acids added to the N-terminus of the amino acid sequence of the peptide according to (1) or (2) and having cholesterol reducing activity. (Hereinafter, also referred to as the peptide of the present invention), a cholesterol-lowering agent, a food and drink, a feed, a food additive and a feed additive containing the polypeptide of the present invention.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The peptide of the present invention is as described above, but is preferably a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Further, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 1 to 11 consecutive amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 were added to the C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 As long as the peptide has cholesterol-reducing activity, one or more, preferably one to several tens, and more preferably one to several amino acids may be added to the N-terminal of the amino acid sequence of the peptide. . The one or more amino acids added to the N-terminal of the amino acid sequence of the peptide include, for example, one or more amino acids starting from the C-terminal (Gly) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and continuing toward the N-terminal (Phe) Amino acids. In addition, SEQ ID NO: 4 is A of soybean protein. _la It is the amino acid sequence of the Phe1-Gly128 region of the subunit.
[0010]
The peptide of the present invention is decomposed with a suitable enzyme from naturally occurring proteins, particularly soybean proteins, and then separated and purified (Agric. Biol. Chem., 54 , 511 (1990)) and can be obtained by chemical synthesis (peptide synthesis, Maruzen (1975)). Further, it can also be obtained by incorporating a plasmid constructed based on gene template information and expressing it in an appropriate host by a molecular biological technique (Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 1989)).
[0011]
Cholesterol-lowering agent containing the peptide of the present invention (hereinafter also referred to as cholesterol-lowering agent of the present invention), and food and drink, feed, food and drink additive and feed additive containing the peptide and having cholesterol-lowering activity (Hereinafter also referred to as food and drink, feed, food and drink additive and feed additive of the present invention, respectively) are shown below.
[0012]
The cholesterol-lowering agent of the present invention contains the peptide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof, and may contain one or more pharmacologically acceptable carriers as necessary. Good. The cholesterol-lowering agent of the present invention may contain any other component effective for reducing cholesterol.
[0013]
Other components effective for reducing cholesterol (hereinafter also simply referred to as other active components) include, for example, pravastatin sodium, simvastatin, fluvastatin sodium, atorvastatin calcium hydrate, clofibrate, clofibrate aluminum, clinofibrate, Symfibrate, bezafibrate, fenofibrate, nicomol, niceritrol, cholestyramine, colestimide, probucol, dextran sodium sulfate sodium, polyenphosphatidylcholine, elastase, ethyl icosapentate, lovastatin, monacolin K, riboflavin butyrate, plant sterol, plant sterol ester, chitosan sterol ester Dextrin, low molecular weight sodium alginate, saponin and the like. These components may be a purified product, a component-containing product or an extract.
[0014]
The cholesterol-lowering agent of the present invention comprises a peptide of the present invention, preferably a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a pharmacologically acceptable salt thereof. It can be mixed with one or more physiologically acceptable carriers and produced by any method well-known in the technical field of pharmaceuticals (Pharmaceutics (Rev. 2nd edition), Nankodo (1995)). .
[0015]
The administration route of the cholesterol-lowering agent of the present invention can be, for example, oral administration or parenteral administration such as intravenous administration.
Examples of the administration form include tablets, powders, granules, pills, suspensions, emulsions, dips, capsules, syrups, injections, solutions, elixirs and the like.
[0016]
Liquid preparations suitable for oral administration, such as syrups, include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, and the like. It can be produced using a diluent, a preservative such as p-hydroxybenzoic acid esters, a paraoxybenzoic acid derivative such as methyl parahydroxybenzoate, a preservative such as sodium benzoate, and a fragrance such as strawberry flavor and peppermint.
[0017]
Tablets, powders and granules suitable for oral administration include sugars such as lactose, sucrose, glucose, sucrose, mannitol, sorbitol, starch such as potato, wheat, corn, calcium carbonate, calcium sulfate, sodium hydrogencarbonate, chloride, etc. Inorganic substances such as sodium, excipients such as crystalline cellulose, licorice powder, plant powder such as gentian powder, starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, carmellose sodium, carmellose calcium, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium alginate Disintegrants such as magnesium stearate, talc, hydrogenated vegetable oils, macrogol, lubricants such as silicone oil, polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, carmellose, gelatin, Binders such as powdered glue solution, surfactants such as fatty acid esters, it can be prepared by using a plasticizer such as glycerin.
[0018]
Formulations suitable for parenteral administration comprise sterile aqueous solutions containing the active compound which are preferably isotonic with the blood of the recipient. For example, in the case of an injection, a solution for injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution or a mixture of saline and a glucose solution.
[0019]
Also in these parenteral preparations, one selected from diluents, preservatives, preservatives, fragrances, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. exemplified in the oral preparations Or more auxiliary components can be added.
The cholesterol-lowering agent of the present invention varies depending on the dosage form, the age and weight of the patient, and the nature or severity of the condition to be treated. 0.01 to 10 g, preferably 0.05 to 2 g, is administered once to several times a day. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, 0.01 to 10 g, preferably 0.1 to 2 g, as a dry weight of the peptide of the present invention per adult is usually administered once to several times a day.
[0020]
By continuously administering the cholesterol-lowering agent of the present invention, the cholesterol level in the body can be reduced.
The cholesterol-lowering agent of the present invention can be used not only for humans but also for animals other than humans. When used for animals, 0.01 to 10 g / kg, preferably 0.05 g to 2 g / kg, as a dry weight of the peptide of the present invention, is administered once to several times a day.
[0021]
Examples of the food or drink or feed of the present invention include those in which the peptide of the present invention is used as it is as food or drink, or those in which the peptide is added to the food or drink or feed. The food or drink or feed has a cholesterol-reducing activity and is used for maintaining and improving health.
[0022]
The food or drink or feed of the present invention can be produced by using a general method of producing a food or drink or feed except for adding the peptide of the present invention as it is or as necessary, other active ingredients. .
The food or drink or feed may be processed by a processing method such as molding and granulation used for general food or drink or feed. As a processing method, fluidized-bed granulation, stirring granulation, extrusion granulation, tumbling granulation, airflow granulation, compression molding granulation, crushing granulation, spray granulation, granulation methods such as spray granulation, Coating methods such as pan coating, fluidized bed coating, and dry coating; puff drying, excess steam method, foam matting method, and expansion method such as microwave heating method.
[0023]
The food or drink or feed of the present invention is added so that the peptide of the present invention is usually contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
Examples of the food and drink of the present invention include health foods, health drinks, juices, soft drinks, soups, teas, lactic acid bacteria drinks, fermented milk, frozen desserts, butter, cheese, yogurt, processed milk, skim milk and the like. Products, meat products such as ham, sausage, hamburgers, fish meat refining products, egg rolls, egg products such as egg tofu, cookies, jellies, snacks, confectionery such as chewing gum, breads, noodles, pickles, smoked products, Dried fish, tsukudani, seasonings, etc. can be mentioned.
[0024]
Examples of the form of the food or drink include powdered food, sheet food, bottled food, canned food, retort food, capsule food, tablet food, liquid food, drink and the like.
The foods and drinks of the present invention include, if necessary, sweeteners, coloring agents, preservatives, thickeners, antioxidants, color formers, bleaching agents, fungicides, gum bases, bitterness used in general foods and drinks. Additives such as ingredients, enzymes, brighteners, acidulants, seasonings, emulsifiers, enhancers, manufacturing agents, flavors, spice extracts, etc. may be added.
[0025]
Sweeteners include aspartame, liquorice, stevia, xylose, lakanca, and the like.
Examples of the coloring agent include a carotenoid pigment, a turmeric pigment, a flavonoid, a caramel pigment, a silicon pigment, a spirulina pigment, chlorophyll, a purple potato pigment, a purple potato pigment, a perilla pigment, and a blueberry pigment.
[0026]
Examples of the preservatives include sodium sulfite, benzoic acids, udo extract, sesame extract, sagebrush extract, sorbic acids, propionic acids, and the like.
Examples of the thickening stabilizer include gums such as gum arabic and xanthan gum, alginic acids, chitin, chitosan, kidachialoe extract, guar gum, hydroxypropylcellulose, sodium caseinate, corn starch, carboxymethylcellulose, gelatin, agar, dextrin, methylcellulose, Examples thereof include polyvinyl alcohol, microfibrous cellulose, microcrystalline cellulose, seaweed cellulose, sodium polyacrylate, sodium polyphosphate, carrageenan, yeast cell wall, konjac extract, nata de coco, mannan and the like.
[0027]
Antioxidants include vitamin C, sodium ethylenediaminetetraacetate, calcium ethylenediaminetetraacetate, erythorbic acid, oryzanol, catechin, quercetin, clove extract, enzyme-treated rutin, apple extract, sesame oil extract, dibutylhydroxytoluene, fennel extract Stuff, horseradish extract, seri extract, tea extract, tempeh extract, dokudami extract, tocotrienol, tocopherols, rapeseed oil extract, green coffee bean extract, sunflower seed, ferulic acid, butylhydroxyanisole, blueberry Leaf extract, propolis extract, Hego ginkgo extract, hesperetin, pepper extract, balsam extract, gallic acid, bayberry extract, eucalyptus extract, rosemary extract and the like.
[0028]
Examples of the color former include sodium nitrite.
Examples of the bleaching agent include sodium sulfite.
Examples of the fungicide include orthophenylphenol.
Examples of the gum base include methyl acetyl ricinoleate, urushi wax, ester gum, eremi resin, aucucumber wax, ozokerite, opopanax resin, kauri gum, carnauba wax, guaiac resin, gutta kachu, gutta hankan, gutta percha, glycerin fatty acid eslu, gay wax, copaoba balsam, copal. Resin, rubber, rice bran wax, sugar cane wax, shellac, gelton, sucrose fatty acid ester, sorber, sorbitan fatty acid ester, talc, calcium carbonate, dammar resin, chicle, tilte, tunoe, low molecular rubber, paraffin wax, fabal balsam, propylene glycol fatty acid Ester, powdered pulp, powdered peach, jojoba wax, polyisobutylene, polybutene, microcrystal wax, mastic , Massa land bar chocolate, beeswax, calcium, and the like phosphoric acid.
[0029]
As the bittering agent, isoalpha-bitter acid, caffeine, Kawatake mushroom extract, kina extract, yellowfin extract, gentian extract, spice extract, enzyme-treated naringin, jamaican cassia extract, deobromine, naringin, nigaki extract, Examples include a bittersweet extract, Hioki-koshi extract, Himematsutake extract, Borapetto, methylthioadenosine, litchi extract, olive tea, daidai extract, hop extract, mugwort extract, and the like.
[0030]
Examples of the enzyme or enzyme source include amylase, trypsin, rennet, and lactic acid bacteria.
Examples of the brightening agent include shiro wax, mokuro and the like.
Examples of the acidulant include adipic acid, itaconic acid, citric acids, succinic acids, sodium acetate, tartaric acids, carbon dioxide, lactic acid, phytic acid, fumaric acid, malic acid, phosphoric acid, and the like.
[0031]
Examples of seasonings include amino acids such as asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, alanine, isoleucine, glycine, serine, cystine, tyrosine, leucine, and proline, sodium inosinate, sodium uridylate, sodium guanylate, sodium cytidylate, and ribonucleic acid. Nucleic acids such as nucleotide calcium and ribonucleotide sodium, organic acids such as citric acid and succinic acid, potassium chloride, saline sodium chloride solution, crude seawater potassium chloride, whey salt, tripotassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, phosphoric acid Examples include potassium dihydrogen, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, trisodium phosphate, chlorella extract and the like.
[0032]
Examples of the emulsifier include fatty acid monoglyceride, sorbitan fatty acid ester and the like.
Examples of the enhancer include zinc salts, vitamin C, various amino acids, 5-adenylic acid, iron chloride, hesperidin, various calcined calcium, various uncalcined calcium, dibenzoylthiamine, calcium hydroxide, calcium carbonate, thiamine hydrochloride, Dunaliella Carotene, tocopherol, nicotinic acid, carrot carotene, palm oil carotene, calcium pantothenate, vitamin A, hydroxyproline, calcium dihydrogen pyrophosphate, ferrous pyrophosphate, ferric pyrophosphate, ferritin, heme iron, menaquinone, folic acid And riboflavin.
[0033]
As manufacturing agents, acetone, processing aids such as ion exchange resins, fig leaf extract, rice straw ash extract, kaolin, glycerin fatty acid ester, mulberry extract, bone ash, perilla extract, ginger extract, various tannins, Phaffia extract, grape seed extract, ethanol and the like.
[0034]
Examples of the fragrance include the fragrances described above.
Examples of the spice extract include pepper extract, garlic extract and the like.
The intake of the food or drink of the present invention is usually 0.01 to 10 g, preferably 0.05 to 2 g, as a dry weight of the peptide of the present invention per adult per day. However, this intake amount is only a guide, and can be appropriately adjusted to a suitable range according to the degree of the symptom, age, weight, and the like of the user.
[0035]
The food or drink of the present invention is taken once or several times a day. By continuously ingesting the food or drink, cholesterol in the body can be reduced.
The feed to which the peptide of the present invention is added is used as feed for animals such as mammals, birds, reptiles, amphibians, and fish, preferably mammals. For example, the feed of the present invention is used as a feed for pets such as dogs, cats and rats, a feed for livestock such as cattle and pigs, a feed for poultry such as chickens and turkeys, a feed for cultured fish such as Thailand and hamachi, and the like. Preferably, it is used as pet feed or livestock feed.
[0036]
The feed of the present invention can be produced by appropriately mixing the peptide of the present invention with feed raw materials. Examples of feed materials include cereals, alga, vegetable oil cakes, animal feed materials, other feed materials, refined products and the like.
Examples of the cereals include milo, wheat, barley, oats, oats, brown rice, buckwheat, foam, cane, barley, corn, and soybeans.
[0037]
Algae include, for example, rice bran, defatted rice bran, bran, starch, wheat germ, wheat bran, corn bran, corn germ, and the like.
Vegetable oil cakes include, for example, soybean oil cake, kinako, linseed oil cake, cottonseed oil cake, peanut oil cake, safflower oil cake, palm oil cake, palm oil cake, sesame oil cake, sunflower oil cake, and rapeseed oil cake , Kapok oil cake, mustard oil cake and the like.
[0038]
Animal feed materials include, for example, fish meal (north sea meal, imported meal, whole meal, coastal meal, etc.), fish solvable, meat meal, meat-and-bone meal, blood meal, decomposed hair, bone meal, livestock processing by-products, feather meal, silkworm , Skim milk powder, casein, dried whey and the like.
[0039]
Other feed ingredients include plant foliage (alfalfa, hay cube, alfalfa leaf meal, false acacia powder, etc.), corn processing by-products (corn gluten, meal, corn gluten feed, corn staple liquor, etc.), processed starch, sugar, Fermented industrial products (yeast, beer grounds, malt roots, alcohol grounds, soy grounds, etc.), agricultural production by-products (citrus processed grounds, tofu grounds, coffee grounds, cocoa grounds, etc.), other (cassava, broad beans, guamir, seaweed, krill) , Spirulina, chlorella, minerals, etc.).
[0040]
The purified products include proteins (casein, albumin, etc.), amino acids, carbohydrates (starch, cellulose, sucrose, glucose, etc.), minerals, vitamins, etc.
The amount of the feed of the present invention to be taken into an animal is usually 0.01 to 10 g, preferably 0.05 to 2 g per day as 1 kg of animal body weight per day as the dry weight of the peptide of the present invention. However, this intake amount is only a guide and can be appropriately adjusted to a suitable range according to the kind, age, body weight, etc. of the animal.
[0041]
Cholesterol in the body can be reduced by continuously ingesting the feed of the present invention to animals.
The food or drink additive or feed additive of the present invention contains the peptide of the present invention, preferably a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and optionally includes the sweeteners and coloring agents exemplified in the aforementioned food and drink. Ingredients, preservatives, thickening stabilizers, antioxidants, color formers, bleaching agents, fungicides, gum bases, bittering agents, enzymes, brighteners, acidulants, seasonings, emulsifiers, strengthening agents, manufacturing agents, flavor Additives such as spice extract may be added. In addition, one or more auxiliary agents selected from diluents, preservatives, preservatives, fragrances, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and the like exemplified in the oral preparations Components can also be added.
[0042]
The dietary food additive of the present invention generally consumes 0.01 to 10 g, preferably 0.05 to 2 g, of the peptide of the present invention as a dry weight per day for an adult. However, this intake amount is only a guide, and can be appropriately adjusted to a suitable range according to the degree of the symptom, age, weight, and the like of the user.
[0043]
The food and drink additive of the present invention is usually added to food and drink at a ratio of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
The food or drink additive of the present invention is added to food or drink and ingested once or several times a day. Cholesterol in the body can be reduced by continuously ingesting food or drink containing the food or drink additive of the present invention.
[0044]
The feed additive of the present invention is fed with the peptide of the present invention in a dry weight of 1 kg of animal body weight, usually 0.01 to 10 g, preferably 0.05 to 2 g per day. However, this intake amount is only a guide and can be appropriately adjusted to a suitable range according to the kind, age, body weight, etc. of the animal.
[0045]
The cholesterol in the body can be reduced by adding the feed additive of the present invention to the feed and continuously ingesting the animal.
The amount of the feed additive of the present invention added to the feed is usually 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples.
【Example】
[0046]
Example 1 Search for a peptide region having high bile acid binding ability
A of soybean protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 _la Among the subunits, the region of Ile114-Arg161 represented by SEQ ID NO: 5 which has been confirmed to have bile acid binding ability (Agric. Biol. Chem., 54 , 511 (1990)), and the active fraction contained in the region was clarified by the method described below.
[0047]
Ale of soybean protein, centering on Ile114-Arg161 _la Various deletion mutant peptides (deletion mutants) shown in FIG. 1 in which amino acid residues were sequentially deleted from the C-terminal of the subunit were designed. Each mutant was prepared by PCR based on the information of the gene template (knowledge and hint to expand the possibility of revised PCR Tips, Shujunsha (1999)), incorporated into an expression plasmid, and used for E. coli BL21 (DE3). (Novagen). After sonication of the Escherichia coli, the precipitated fraction was subjected to a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.2 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 mM (p-amidinophenyl) -methylsulfonyl fluoride, 1 μM pepstatin A and 2 μM leupeptin. The sample was washed twice with 0), dissolved in a 6 M urea solution, and used as a sample for evaluation. Using a column of cholic acid immobilization obtained by the method described below, the binding strength to bile acids was measured using the elution rate as an index.
[0048]
Cholic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was bound to EAH Sepharose 4B (manufactured by Amersham Pharmacia) using N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and this was combined with an HR10 / 10 column (Amersham). (Pharmacia) to prepare a column of immobilized cholic acid. After each deletion mutant peptide (sample) dissolved in urea solution was applied to the cholic acid-immobilized column prepared as described above, first, 0.15 M NaCl, 5 mM 2-mercaptoethanol and 0.02% NaN ₃ The column was washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing After washing again with the same buffer containing 1 M NaCl, the sample adsorbed on the column was eluted and fractionated in the above buffer containing sodium cholate with a sodium cholate concentration gradient of 0 to 70 mM. The amount of protein in each fraction was measured to determine the elution rate.
The results are shown in Table 1.
[0049]
[Table 1]

[0050]
A _la Eluted at the position of fraction number 23. Δ [250-291] (a deletion mutant obtained by deleting the 250th to 291st amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3), Δ [182-291] and Δ [162-291] are as follows: A _la [138-291] eluted at almost the same position as _la Eluted later. Δ [130-291], Δ [122-291] and Δ [114-291] were eluted in the effluent fraction on the column of immobilized cholic acid. Those eluted in the effluent fraction were considered to have no binding ability to cholic acid.
[0051]
From the above results, A of soybean protein _la Amino acid residues 130 to 145 are involved in the binding of the subunit to cholic acid, and the amino acid residues 130 to 137 were considered to be particularly important.
In addition, soy protein A _la Since the region at positions 130 to 137 in the amino acid sequence of the subunit is rich in hydrophobic residues, the amino acid residue at positions 129 to 134 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, ie, SEQ ID NO: 1, Δ [129-134], a deletion mutant in which the amino acid sequence represented was deleted, was prepared and subjected to analysis.
As shown in Table 1, Δ [129-134] is A _la In comparison with, it was eluted at the position of the fraction number which was considerably slower on the cholic acid immobilized column.
[0052]
Example 2 Search for a peptide region having high affinity for bile acids
A sample was prepared in the same manner as in Example 1, and subjected to the following tests.
In this test, the affinity of each deletion mutant peptide for cholic acid was compared by the Kd value obtained by the following fluorescence analysis.
[0053]
Sodium cholate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 M urea, 50 mM NaCl and 0.02% NaN ₃ Each sample was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing and the fluorescence intensity when the cholic acid concentration was changed was measured. The fluorescence intensity was measured using a spectrofluorimeter F-3000 (manufactured by Hitachi, Ltd.). Excitation wavelength: 280 nm, fluorescence wavelength: 330 and 337 nm, and the dissociation constant (Kd value) of each sample with respect to sodium cholate was determined based on the ratio.
The results are shown in Table 2.
[0054]
[Table 2]

[0055]
The Kd values of Δ [250-291], Δ [182-291], Δ [162-291], Δ [154-291] and Δ [146-291] for cholic acid are A _la Hardly any difference was observed as compared with a Kd value of 33 mM for cholic acid.
[0056]
In addition, as described in Example 1, A _la The Kd value of Δ [138-291], which eluted later, was 74 mM for cholic acid, and a decrease in affinity for cholic acid was also observed in the fluorescence measurement.
On the other hand, in Table 1, Δ [130-291], Δ [122-291] and Δ [114-291] which did not bind to the cholic acid-immobilized column have very low affinity for cholic acid. Indicated.
[0057]
The Kd value of Δ [129-134] is 130 mM, and A _la Showed a value four times lower than the Kd value.
From the results of Examples 1 and 2 above, A _la In the binding of the subunit to cholic acid, a peptide obtained by adding 11 consecutive amino acids from the N-terminal of SEQ ID NO: 2 to the C-terminal of the amino acid sequence at positions 129 to 145, ie, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Importantly, it was revealed that a hydrophobic residue at positions 129 to 134, that is, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an active part that plays an important role.
[0058]
These results indicate that the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is an active ingredient having a cholesterol-reducing activity, and the peptide of the present invention containing the peptide is a cholesterol-lowering agent of the present invention, a food or drink, a feed, a food or drink. Additives and feed additives can be expected to be useful for reducing cholesterol in humans and animals.
[0059]
Example 3
A hamburger (2 servings) is manufactured with the following formulation.
Onions: 1/2
Minced meat: 100g
Water: 29.2 g
Lard: 11.8g
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: 100 mg
Eggs: 1
Bread crumbs: small amount
Seasoning: small amount
[0060]
Example 4
A cookie (30 pieces) is manufactured with the following composition.
Soft flour: 100g
Starch: 74g
Water: 14g
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: 100 mg
Baking powder: 2 tsp
Salt: 1/2 teaspoon
Eggs: 1
Butter: 80g
Milk: 2 tablespoons
Honey: small amount
[0061]
Example 5
A powdered beverage is manufactured with the following formulation.
Peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: 500 mg
Sodium caseinate: 17.5 g
L-valine: 0.5 g
Ferric pyrophosphate (iron source): 0.1 g
Foscal EFC (Calcium source; Nikko Fine Products): 1g
Vitamin mix (Merck): 1g
When making a drink, 4 g of this product is dispersed in 180 ml of water.
[0062]
Example 6
A powdered beverage is manufactured with the following formulation.
Peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6: 500 mg
Sodium caseinate: 17.5 g
L-valine: 0.5 g
Ferric pyrophosphate (iron source): 0.1 g
Foscal EFC (Calcium source; Nikko Fine Products): 1g
Vitamin mix (Merck): 1g
When making a drink, 4 g of this product is dispersed in 180 ml of water.
[0063]
Example 7
A tablet is prepared by the following formulation.
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: 100 mg
Powdered sugar: 2.6 g
Ascorbic acid: 150mg
Citric acid: 0.1 g
Sucrose stearic acid ester: 150mg
Fragrance: 15mg
[0064]
Example 8
A tablet is prepared by the following formulation.
Peptide consisting of amino acid represented by SEQ ID NO: 7: 100 mg
Powdered sugar: 2.6 g
Ascorbic acid: 150mg
Citric acid: 0.1 g
Sucrose stearic acid ester: 150mg
Fragrance: 15mg
[0065]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cholesterol-lowering agent containing a novel peptide as an active ingredient, food and drink, feed, food and drink additive, and feed additive with cholesterol lowering ability are provided.
[0066]
[Sequence list]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]

[0073]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a deletion mutant used in Examples 1 and 2.

Claims

A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A peptide in which 1 to 11 consecutive amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are added to the C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A peptide having one or more amino acids added to the N-terminus of the amino acid sequence of the peptide according to claim 1 or 2, and having cholesterol reducing activity.

A cholesterol-lowering agent comprising the peptide according to claim 1, 2 or 3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A food or drink comprising the peptide according to claim 1.

A feed comprising the peptide according to claim 1, 2 or 3.

A food or drink additive comprising the peptide according to claim 1, 2 or 3.

A feed additive comprising the peptide according to claim 1, 2 or 3.