【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白色腐朽菌によるポリクロロジクロロジベンゾダイオキシン等のダイオキシン類を無機物に分解する方法や、ダイオキシン類を効率よく無機物に分解する作用を有する新規な白色腐朽菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ダイオキシンによる環境汚染が問題になっている。ダイオキシン類は一般的に毒性が高く、化学的に安定で、分解されにくいばかりではなく、脂溶性が高いため、生体組織中に蓄積しやすいといわれている。そのため、人間活動が生み出した史上最強の毒物と言われ、発癌性、体重減少、胸腺萎縮、皮膚障害、肝障害、催奇形成などの強い毒性をもつとともに、その化学的安定性による環境中での蓄積が懸念されている。また、現在では焼却灰中に混入しているダイオキシン類がそのまま焼却灰の最終処分場に運ばれることにより、ダイオキシン類の環境中への拡散、特に地下水等の汚染、土壌中への蓄積が世界的に深刻な問題となっている。
【０００３】
ダイオキシン類は、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素原子によって結び付けられた骨格構造をもつ化合物（ジベンゾフラン又はジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）の総称であり、理論的にはそれぞれ１３５、及び７５種類の異性体が存在する（例えば、非特許文献１参照。）。ダイオキシン類の発生源は主に焼却によるものであり、一般廃棄物や産業廃棄物の焼却、金属精錬、石油添加剤（潤滑油）、たばこの煙、回収黒液ボイラー、木材や廃材の焼却、自動車排ガスなどが含まれる。その他、晒クラフトパルプ製造などにおける漂白工程や、ＰＣＮＢ等の農薬製造過程などにおいてもダイオキシン類は発生する。中でも一般廃棄物の焼却によるダイオキシン類の発生は、例えば日本においては年間４０００ｇＴＥＱを超えており、ダイオキシン総排出量の約８割を占めていると見積られている。すでに先進国では焼却炉からの排出濃度が規制されるなど法規制が進みつつあり、装置面でも燃焼効率の改善、排ガス処理の高度化が進められ、効果をあげている。しかし、すでに環境中に排出されたダイオキシン類による土壌汚染、最終処分場で埋め立て処分された焼却灰や飛灰による浸出水のダイオキシン汚染は問題であり、早急にダイオキシン類分解対策を取る必要がある。
【０００４】
このような難分解性のダイオキシン類を分解する公知技術として、完全燃焼法（溶融固化処理法）、熱分解処理法（加熱脱塩素化処理法）、ペレット化焼成法、光分解法、各種化学的分解法、及び超臨界水処理法などが報告されている。しかし、汚染土壌中あるいは焼却灰の最終処分場周辺などのダイオキシン処理には、その微量で広範囲に分散しているといった特徴から、前記公知技術の適用は困難であるとされている。また、これら公知技術はエネルギー消費量が大きく、別途の環境問題にも発展し兼ねず、これらの方法に替わる方法として、近年、環境中に放出された汚染物質を除去する手段の一つとしてバイオレメディエーションが注目されている。バイオレメディエーションとは、微生物機能により環境汚染物質を最終的に無害物質にまで変換させて、汚染された環境を修復する技術であり、バイオスティミュレーション（Ｂｉｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）とバイオアーギュメンテーション（Ｂｉｏａｒｇｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の２つに分類される。前者は汚染された環境に存在する微生物に対して栄養塩の添加、エアレーション等により微生物機能の活性を高める手法であり、後者は、浄化機能を有する微生物を汚染された環境中に導入する手法である。そして、微生物によるダイオキシン類の分解は、バクテリアによる好気的分解、嫌気性菌による還元的脱塩素、担子菌による分解の３種類に大別されている。
【０００５】
担子菌による分解の中でも、特に白色腐朽菌によるダイオキシン類の分解については、ファネロカエテ・キリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）がジベンゾダイオキシン（ＤＤ）（例えば、非特許文献２参照。）、２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，７−ＤｉＣＤＤ）（例えば、非特許文献３参照。）及び２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ｔｅｔｒａＣＤＤ）（例えば、非特許文献４参照。）を分解することが報告されている。本発明者らは、Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ及びファネロカエテ・ソルディダ（ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）がポリクロロジベンゾダイオキシンやポリクロロジベンゾパラダイオキシンを分解することを報告している（例えば、非特許文献５参照。）。また、本発明者らは、腐朽木材からダイオキシン類を分解する白色腐朽菌をスクリーニングし、カーク（Ｋｉｒｋ）液体培地（ＨＣＬＮ）やポテトデキストロース（ＰＤＢ）培地で培養することが可能であるＭＺ−３４０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６４）を単離し、このＭＺ−３４０株を用いて、焼却灰中のダイオキシン類を分解する新たな系の構築を行い、液相系および固相系の両方において、焼却灰中のダイオキシン類を効果的かつ効率的に分解する技術を開発している（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第００／１５３６１号パンフレット
【非特許文献１】
紙パルプ技協誌４５（８），ｐ８８７，１９９１年
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１０９６９−１０９７６．（１９９４）
【非特許文献３】
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，２１３１−２１３７．（１９９２）
【非特許文献４】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８，１４３４−１４３６．（１９８５）
【非特許文献５】
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２， ４３２３−４３２８．（１９９６）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように白色腐朽菌はダイオキシン類の分解に有用であるが、二次汚染を防止し、ダイオキシン類を効率よく二酸化炭素、水、塩素イオン等への変換、即ち完全に無機化する能力を有する微生物は未だ報告されていない。本発明の課題は、白色腐朽菌によるポリクロロジクロロジベンゾダイオキシン等のダイオキシン類を効率よく無機物に分解する方法や、ダイオキシン類を効率よく無機物に分解する作用を有する新規な白色腐朽菌株を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ダイオキシンの分解に有用な白色腐朽菌についての研究を鋭意行っており、ダイオキシンの分解能に優れた微生物菌株を多数分離・同定している。そこで、ダイオキシン類の分解性のみならず、分解生成物の毒性についても十分配慮し、白色腐朽菌１３６株からＤＤの分解能の高い白色腐朽菌１２株をまず選抜し、選抜された１２菌株を用いて、ラジオアイソトープでラベルしたダイオキシン類モデル化合物を処理し、生成する二酸化炭素の放射能を測定し、ダイオキシン分解の二次汚染を防ぐことが可能な従来公知のダイオキシン分解菌よりも高いダイオキシン無機化能を有するＭＺ−２２７株等を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、ダイオキシン類に白色腐朽菌ＭＺ−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８）、Ｐｈｌｅｂｉａ ｌｉｎｄｔｎｅｒｉＧＢ−１０２７又はＰｈｌｅｂｉａ ｓｐ．ＭＧ−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１８０２５）を作用させることを特徴とするダイオキシン類を無機物に分解する方法（請求項１）や、ダイオキシン類が、ポリクロロジクロロジベンゾダイオキシンであることを特徴とする請求項１記載のダイオキシン類を無機物に分解する方法（請求項２）や、ポリクロロジクロロジベンゾダイオキシンが、２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであることを特徴とする請求項２記載のダイオキシン類を無機物に分解する方法（請求項３）に関する。
【００１０】
また本発明は、ダイオキシン類を無機物に分解する作用を有することを特徴とする白色腐朽菌ＭＺ−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８）（請求項４）や、ダイオキシン類が、ポリクロロジクロロジベンゾダイオキシンであることを特徴とする請求項４記載の白色腐朽菌ＭＺ−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８）（請求項５）や、ポリクロロジクロロジベンゾダイオキシンが、２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであることを特徴とする請求項５記載の白色腐朽菌ＭＺ−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８）（請求項６）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のダイオキシン類を無機物に分解する方法としては、ダイオキシン類に白色腐朽菌ＭＺ−２２７（ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８）や、Ｐｈｌｅｂｉａ ｌｉｎｄｔｎｅｒｉＧＢ−１０２７（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＶＡ，ＵＳＡ）やＰｈｌｅｂｉａ ｓｐ．ＭＧ−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１８０２５）を作用させ、ダイオキシン類を二酸化炭素、水、塩素イオン等の無機物に分解する方法であれば特に制限されるものではなく、上記ダイオキシン類としては、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素によって結ばれた骨格構造を有するジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＤＤ）、ジベンゾフラン（ＤＦ）、２，７−ＤｉＣＤＤ、２，３，７，８−ｔｅｔｒａＣＤＤ等の塩素化合物や、コプラナーＰＣＢを含むポリ塩化ビフェニル等を例示することができ、これらの中でも、ポリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンやポリクロロジベンゾフラン、特に、２，７−ＤｉＣＤＤや２，３，７，８−ｔｅｔｒａＣＤＤを好適に例示することができる。
【００１２】
また、本発明は白色腐朽菌ＭＺ−２２７に関し、この新規な白色腐朽菌株ＭＺ−２２７は、ポリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン等のダイオキシン類、特に２，７−ＤｉＣＤＤを二酸化炭素、水、塩素イオン等の無機物に分解する作用を有する。この新規な白色腐朽菌株ＭＺ−２２７は腐朽木材から単離し、ポテトデキストロース寒天培地や麦芽エキス寒天培地で継体培養が可能で、この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１４８として寄託されている。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤの合成）
２，７−ｄｉＣＤＤはＡｃｃｕＳｔａｎｄａｒｄ社から、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＤＤ）及びジベンゾフラン（ＤＦ）は和光純薬工業株式会社から入手した。［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤは、［Ｕ−１４Ｃ］２，４−ジクロロフェノールから、Ａｎｉｌｉｎｅの方法（Ａｄｖ． Ｃｈｅｍ． Ｓｅｒ． １２０， １２６−１３５ （１９７３））を改良することにより調製した。銅（Ｕｌｍａｎｎ）触媒はＡｎｉｌｉｎｅの方法に準じて調製した。２，４−ジクロロフェノール（１ｍｍｏｌ）を、１．２ｍｌのメタノールを含む０．５Ｎの水酸化カリウム中に溶解し、減圧下で乾燥した。この乾燥物を０．５ｍｌのｂｉｓ−エトキシルエチル−エーテル、５μｌのエチレンジアセート及び０．５ｍｇのクーパー触媒と混合した。混合物は２００℃で１５時間還流した。合成された［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤを、シリカゲルカラムクロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、メタノールを用いた再結晶化によって精製した。得られた精製物（収率１２．９％）が［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤであることの同定は、ＨＰＬＣのスパイクテストにより実施した。また、ＨＰＬＣ／液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ、Ｗａｌｌａｃ １４１０， Ｗａｌｌａｃ社製）により、その純度を９８％以上と推定した。なお、Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ ＥＸ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を、シンチレーション混合物として利用した。
【００１４】
上記［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤの精製は以下のように行った。シリカゲルカラム（３．０ｇのシリカ・ゲル、１．０ｃｍ ｉ．ｄ）クロマトフラフィーにおいては、１５０ｍｌのｎ−ヘキサンでカラムより溶出した。ＨＰＬＣにはＷａｔｅｒｓ ６２６ ｐｕｍｐ上でＷａｔｅｒｓ ９９６フォトダイオードアレイデテクターと共に使用し、内径１５０×４．６ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）に適合させた。また、ＤＤ分析のためのＨＰＬＣの溶出については、６０％のアセトニトリル（ＡＮ）を含む０．１％のＴＦＡを、流速１ｍｌ／ｍｉｎで使用した。［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤの精製のために、溶出剤をまず８０％のアセトニトリル水溶液で、次いで直線勾配的に濃度を８０〜１００％に増加させたＡＮで１０分以上、１００％で１０分間保持した。
【００１５】
実施例２（供試菌類）
１９属、６０種の６８株を大阪醗酵研究所、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ、ヴァージニア州、マナサス）、財団法人日本きのこセンター・菌蕈研究所（鳥取）とアメリカ合衆国農務省から入手した。Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ ｓｐ．ＭＺ−３４０株、Ｐ． ｓｏｒｄｉｄａ株ＹＫ−６２４株、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐ ＭＧ−６０株及び未同定の６５株を含む６８株を、森林から入手した腐朽木材から単離した（Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０，４３５９−４３６３．（１９９４）、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０，９２１−９２６．（１９９４））。これらの菌類を、ポテトデキストロース寒天培地又は麦芽エキス寒天斜面培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で、培養物として維持した。
【００１６】
実施例３（ＤＤ分解能による白色腐朽菌のプレスクリーニング）
本実験ではＴｉｅｎ、ＫｉｒｋによるＬｏｗ−ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓａｌ ＩＩＩ（ＬＮ）培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６１，２３８−２４９．（１９８３））を使用した。培地は１％グルコース、１．２ｍＭ酒石酸アンモニウム及び２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を含む。全ての菌類をポテトデキストロース寒天培地又は麦芽エキス寒天培地で２５℃又は３０℃で培養し、菌糸体の端部に穴を開け、直径６ｍｍのディスクを得た。５つのディスクを１０ｍｌのＬＮ培地を含む１００ｍＬの三角フラスコに置いた。菌株を３０℃の外気のもとで静置培養した。５日間培養した後、２５ｍＭのＤＤ溶液を含む４０μｌのＮＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、植菌した各フラスコに加え、上部から酸素を噴霧し、それぞれのフラスコをガラス栓とガムテープで密封し、培養をさらに５日間続けた。培養終了後、内部標準（ＤＦ）を培養物に加え、液体窒素中で培養物中の菌糸体を粉砕した。アセトン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を均質化した。３０００×ｇで１５分間遠心分離し、バイオマスを取り除いた。膜フィルター（０．２２μｍ）による濾過後に、ＤＤの定量を行うため、得られた上澄液をＨＰＬＣにより分析した。
【００１７】
実施例４（２，７−ＤｉＣＤＤの無機化作用を有する白色腐朽菌のスクリーニング）
インサイチュウ（ｉｎ ｓｉｔｕ）での微生物分解研究のための代表的なモデル汚染物質として、［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤを使用した。供試菌株の培養は上記の通り行った。５日間の培養後、５０μｌの５ｍＭ［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤ（ＤＭＦ溶液）を植菌した各フラスコ（３１５−ｋｄｐｍ／フラスコ）に加えた。１４ＣＯ２のトラッピングはＫｉｒｋらの方法に従い行った（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１７，２２７−２８５．（１９７８））。フラスコは３日毎にフラッシュし、１０ｍｌのエタノールアミンを含むシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ Ｅｘ：メタノール：エタノールアミン＝５：４：１）内に１４ＣＯ２をトラップした。ＬＳＣ上の１４Ｃ放射能により、トラップされた１４ＣＯ２を測定した。
【００１８】
実施例５（プレスクリーニング結果）
ＤＤの消失を指標とした白色腐朽菌のプレスクリーニングを行った。スクリーニングに用いた供試菌株数は、１９属、６６種の７４株、および未同定の６２株であり、これらは、本発明者らの研究室に保管されている。同定されている株はすべてａｐｈｙｌｌｏｐｏｒａｌｅｓ目に属しており、Ａｌｅｕｒｏｄｉｓｃｕｓ属（３種、３株）、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属（１種、１株）、Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ属（５種、６株）、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属（４種、４株）、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属（７種、１０株）、Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ属（１種、２株）、Ｇｌｏｅｐｈｙｌｌｕｍ属（１種、１株）、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ属（２種、２株）、Ｍｅｒｕｌｉｕｓ属（１種、１株）、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ属（１種、１株）、Ｎｉｇｒｏｐｕｒｕｓ属（１種、１株）、Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ属（２種、２株）、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｓｅ属（１３種、１３株）、Ｐｈｌｅｂｉａ属（１６種、１９株）、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属（１種、１株）、Ｐｕｎｕｓ（１種、１株）、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ属（１種、１株）、Ｓｔｅｒｅｕｍ属（４種、４株）およびＴｙｒｏｍｙｃｅｓ属（１種、１株）であった。本実験条件ではすべての供試菌株のうち２７株が成長しなかった。このプレスクリーニングにおけるＤＤ濃度は、前記非特許文献２に記載のＰ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍにおける場合の４倍の濃度である１００μＭにしたにもかかわらず、ＤＤの２０％以上が４種の属に属する８株および４種の未同定株の計１２株により消失したことが観察され（図１）、Ａｌｅｕｒｏｄｉｓｃｕｓ ｄｉｓｃｉｆｏｒｍｉｓＩＦＯ−６２８０、Ｃｅｒｉｐｏｒｉａ ｓｐ．ＭＺ−３４０、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｌｅ ｓｕｂｃｅｒａｃｅａＴＭＩＣ３２０５４、Ｐｈｌｅｂｉａ ｌｉｎｄｔｎｅｒｉＧＢ−１０２７、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｕｂｓｅｒｉａｌｉｓＨＨＢ−９６７８−Ｓｐ、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｕｂｏｃｈｒｅｃｅａＨＨＢ−８４９８−Ｓｐ、Ｐｈｌｅｂｉａ ｔｒｅｍｅｌｌｏｓｕｓＴＭＩＣ３０５１１、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐ．ＭＧ−６０、未同定株ＨＳ−０１０、ＫＤ−０７０、ＭＺ−２２７、およびＯＫ−１９０を選択し、以下の実験に使用した。なお、前記Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ及びＰ． ｓｏｒｄｉｄａにおけるＤＤ消失は２０％よりも低かった
【００１９】
実施例６（スクリーニング結果）
上記１２株（ｎ＝４）を［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤの存在下それぞれ３０日間インキュベーションした。そのときの［Ｕ−１４Ｃ］２，７−ｄｉＣＤＤからの１４ＣＯ２の全放出量を図２に示す。ＭＺ−２２７菌、Ｐｈｌｅｂｉａ Ｓｐ．ＭＧ−６０およびＰ． ｌｉｎｄｔｎｅｒｉが他の９株に比べて高い累積１４ＣＯ２放出率を示した。高い累積１４ＣＯ２放出率を示した上記３株の１４ＣＯ２放出の時間経過を図３に示す。ＭＺ−２２７（△）は、培養後６日目に無機化が始まり、９〜１８日間の培養期間中に１０〜１３ｎｍｏｌ／日に達した。Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐ．ＭＧ−６０（□）は、培養後３日目に無機化が始まり、３〜６日後に１０〜１３ｎｍｏｌ／日でピークに達し、その後急速に減少した。Ｐ． ｌｉｎｄｔｎｅｒｉ（○）は、培養後３日目に無機化が始まり、３〜１８日間の培養期間中に４〜９ｎｍｏｌ／日に達した。これらすべての菌において、２４日以降無機化は３ｎｍｏｌ／日以下に減少した。ＭＺ−２２７、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐ． ＭＧ−６０およびＰ． ｌｉｎｄｔｎｅｒｉはそれぞれ３０日間の培養期間中に、２５０ｎｍｏｌの２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２、７−ｄｉＣＤＤ）を、それぞれ１９６、１５５および１４９ｎｍｏｌの１４ＣＯ２に変換した。無接種コントロールでは、初回追加後、Ｏ２フラッシュがごくわずかの揮発性放射能を示した。白色腐食菌によるダイオキシンの無機化は、Ｂｕｍｐｕｓ ｅｔ ａｌ．の非特許文献４に記載されており、彼らは、１．２５ｎｍｏｌの２，３，７，８−テトラＣＤＤを含む培養液（１０ｍｌ）において、３０日の培養期間中に、Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍが２，３，７，８−テトラＣＤＤを２７．９ｐｍｏｌの１４ＣＯ２に変換することを報告しているが、それと比べて、白色腐朽菌ＭＺ−２２７、Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐ．ＭＧ−６０、及びＰ． ｌｉｎｄｔｂｅｒｉは２，７−ｄｉＣＤＤのより高い無機化活性を示すことがわかった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によると、すでに報告されている白色腐朽菌株よりも高いダイオキシン分解能力及び／又は無機化能力を有する白色腐朽菌株を用いることにより、ダイオキシン類を効率よく二酸化炭素、水、塩素イオン等の無機物質に変換、無毒化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】白色腐朽菌１２株によるジベンゾダイオキシンの分解結果を示す図である。
【図２】白色腐朽菌１２株による２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの無機化作用の結果を示す図である。
【図３】白色腐朽菌３株による２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの無機化作用の経時変化を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for decomposing dioxins such as polychlorodichlorodibenzodioxin into inorganic substances by a white rot fungus, and a novel white rot strain having an action of efficiently decomposing dioxins into inorganic substances.
[0002]
[Prior art]
In recent years, environmental pollution by dioxins has become a problem. It is said that dioxins are generally highly toxic, chemically stable, not easily decomposed, and have a high fat solubility, and therefore easily accumulate in living tissues. Therefore, it is said to be the strongest poison in history created by human activities, and has strong toxicity such as carcinogenicity, weight loss, thymus atrophy, skin disorder, liver disorder, teratogenesis, and its chemical stability in the environment. Accumulation is a concern. In addition, dioxins that are present in the incineration ash are transported to the final disposal site of the incineration ash, and as a result, the diffusion of dioxins into the environment, especially pollution of groundwater, etc., and accumulation in soil are increasing worldwide. Is a serious problem.
[0003]
Dioxins are a general term for compounds having a skeleton structure in which two benzene rings are linked by one or two oxygen atoms (dibenzofuran or dibenzo-p-dioxin), and are theoretically 135 and 75, respectively. There are various types of isomers (for example, see Non-Patent Document 1). The sources of dioxins are mainly from incineration; incineration of general and industrial waste, metal refining, petroleum additives (lubricating oil), tobacco smoke, black liquor boilers, incineration of wood and waste materials, Includes automobile exhaust gas. In addition, dioxins are also generated in a bleaching process in the production of bleached kraft pulp and the like, and in a process of producing an agricultural chemical such as PCNB. Above all, the generation of dioxins due to the incineration of general waste exceeds 4,000 g TEQ per year in Japan, for example, and is estimated to account for about 80% of total dioxin emissions. Laws and regulations are already advancing in developed countries, such as restrictions on the concentration of emissions from incinerators. Improvements in combustion efficiency and advanced exhaust gas treatment are also being made on the equipment side, and this has been effective. However, soil pollution due to dioxins already discharged into the environment and dioxin contamination of leachate from incinerated ash and fly ash landfilled at final disposal sites are problems, and it is necessary to take immediate measures to decompose dioxins. .
[0004]
Known techniques for decomposing such hard-to-decompose dioxins include a complete combustion method (melt solidification method), a thermal decomposition method (heat dechlorination method), a pelletizing firing method, a photolysis method, and various chemicals. And a supercritical water treatment method are reported. However, it is said that it is difficult to apply the above-mentioned known technology to dioxin treatment in contaminated soil or in the vicinity of a final disposal site of incinerated ash because of its small amount and widespread dispersion. In addition, these known techniques consume a large amount of energy and may lead to a separate environmental problem. As an alternative to these methods, bioreactive materials have recently been used as one of means for removing pollutants released into the environment. Mediation is attracting attention. Bioremediation is a technique for restoring a polluted environment by converting environmental pollutants into harmless substances by microbial functions, and includes biostimulation and bioargumentation. Are classified into two types. The former is a method to increase the activity of microbial functions by adding nutrients to the microorganisms present in the contaminated environment, by aeration, etc., and the latter is a method of introducing microorganisms having a purification function into the contaminated environment. is there. Decomposition of dioxins by microorganisms is roughly classified into three types: aerobic decomposition by bacteria, reductive dechlorination by anaerobic bacteria, and decomposition by basidiomycetes.
[0005]
Among the decomposition by basidiomycetes, particularly for the decomposition of dioxins by white rot fungi, Fanerochaete chrysosporium is dibenzodioxin (DD) (for example, see Non-Patent Document 2) and 2,7-dichlorodibenzo-. p-dioxin (2,7-DiCDD) (for example, see Non-Patent Document 3) and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-tetraCDD) (for example, Decomposition is reported. The present inventors have found that P.S. It has been reported that chrysosporium and phanerochaete sordida degrade polychlorodibenzodioxin and polychlorodibenzoparadioxin (for example, see Non-Patent Document 5). In addition, the present inventors screened for white rot fungi that decompose dioxins from decayed wood, and cultivated MZ-340 in Kirk liquid medium (HCLN) or potato dextrose (PDB) medium. Strain (FERM BP-6864) was isolated, and a new system for decomposing dioxins in the incineration ash was constructed using this MZ-340 strain. A technology for effectively and efficiently decomposing dioxins therein has been developed (for example, see Patent Document 1).
[0006]
[Patent Document 1]
WO 00/15361 pamphlet [Non-patent document 1]
Paper and Pulp Technical Journal 45 (8), p887, 1991 [Non-Patent Document 2]
Biochemistry 33, 10969-10976. (1994)
[Non-Patent Document 3]
J. Bacteriol. 174, 2131-2137. (1992)
[Non-patent document 4]
Science 228, 1434-1436. (1985)
[Non-Patent Document 5]
Appl. Environ. Microbiol. 62, 4323-4328. (1996)
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, white rot fungi are useful for decomposing dioxins, but they prevent secondary pollution and efficiently convert dioxins to carbon dioxide, water, chloride ions, etc., that is, have the ability to completely mineralize. No microorganisms have been reported yet. An object of the present invention is to provide a method for efficiently decomposing dioxins such as polychlorodichlorodibenzodioxin by white rot fungi into inorganic substances, and to provide a novel white rot fungus having an action of efficiently decomposing dioxins into inorganic substances. It is in.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors are intensively researching white rot fungi useful for the decomposition of dioxin, and have isolated and identified a large number of microorganism strains having excellent dioxin resolution. Therefore, in consideration of not only the degradability of the dioxins but also the toxicity of the decomposition products, first, 12 white rot fungi having a high DD resolution were selected from 136 white rot fungi, and the 12 selected strains were used. By treating a radioisotope-labeled dioxin model compound, measuring the radioactivity of the generated carbon dioxide, and dioxin mineralization higher than conventionally known dioxin-degrading bacteria capable of preventing secondary contamination of dioxin decomposition MZ-227 strains and the like having an ability were found, and the present invention was completed.
[0009]
That is, the present invention relates to dioxins containing white-rot fungi MZ-227 (FERM BP-8148), Phlebia Lindtneri GB-1027 or Phlebia sp. A method for decomposing dioxins into inorganic substances characterized by the action of MG-60 (FERM P-18025) (claim 1), wherein the dioxins are polychlorodichlorodibenzodioxin. The method for decomposing dioxins into inorganic substances according to claim 1 or claim 2, wherein the polychlorodichlorodibenzodioxin is 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin. The present invention relates to a method for decomposing inorganic substances (claim 3).
[0010]
In the present invention, the white rot fungus MZ-227 (FERM BP-8148) (Claim 4), which has an action of decomposing dioxins into inorganic substances, and the dioxins are polychlorodichlorodibenzodioxins. The white rot fungus MZ-227 (FERM BP-8148) according to claim 4 (claim 5) or the polychlorodichlorodibenzodioxin is 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin. The present invention relates to a white rot fungus MZ-227 (FERM BP-8148) according to claim 5 (claim 6).
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As a method for decomposing the dioxins into inorganic substances, the white rot fungus MZ-227 (FERM BP-8148), Phlebia Lindtneri GB-1027 (United States Department of Contract, United States of America, WashAsh, United States of America), and the like. sp. There is no particular limitation as long as MG-60 (FERM P-18025) is allowed to act to decompose dioxins into inorganic substances such as carbon dioxide, water, and chloride ions. Chlorine such as dibenzo-p-dioxin (DD), dibenzofuran (DF), 2,7-DiCDD, 2,3,7,8-tetraCDD having a skeleton structure in which a benzene ring is linked by one or two oxygen atoms Examples thereof include compounds and polychlorinated biphenyls including coplanar PCB. Among these, polychlorodibenzo-p-dioxin and polychlorodibenzofuran, particularly 2,7-DiCDD and 2,3,7,8- TetraCDD can be preferably exemplified.
[0012]
In addition, the present invention relates to a white rot fungus MZ-227. The novel white rot fungus strain MZ-227 is a dioxin such as polychlorodibenzo-p-dioxin, particularly 2,7-DiCDD is converted to carbon dioxide, water, and chloride ion. Has the effect of decomposing into inorganic substances such as This new white rot strain MZ-227 can be isolated from decayed wood and subcultured on potato dextrose agar medium or malt extract agar medium. This strain is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary. Deposited as FERM BP-8148.
[0013]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 ([U- 14 C] Synthesis of 2,7-diCDD)
2,7-diCDD was obtained from AccuStandard, and dibenzo-p-dioxin (DD) and dibenzofuran (DF) were obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [U- 14 C] 2,7-diCDD from [U- 14 C] 2,4- dichlorophenol, the method of Aniline (Adv. Chem. Ser. 120, 126-135 (1973)) to improve the Prepared by The copper (Ulmann) catalyst was prepared according to the method of Aniline. 2,4-Dichlorophenol (1 mmol) was dissolved in 0.5 ml of potassium hydroxide containing 1.2 ml of methanol and dried under reduced pressure. This dried product was mixed with 0.5 ml of bis-ethoxyl-ethyl-ether, 5 μl of ethylene diacetate and 0.5 mg of Cooper's catalyst. The mixture was refluxed at 200 ° C. for 15 hours. The synthesized [U- 14 C] 2,7-diCDD , silica gel column chromatography, reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC), was purified by recrystallization with methanol. The resulting purified product (12.9% yield) of [U- 14 C] Identification of being 2,7-diCDD was performed by spiking test HPLC. In addition, the purity was estimated to be 98% or more by HPLC / liquid scintillation counter (LSC, Wallac 1410, manufactured by Wallac). In addition, Ultima gold EX (manufactured by Packard Instrument) was used as a scintillation mixture.
[0014]
The [U- 14 C] Purification of 2,7-diCDD was carried out as follows. In a silica gel column (3.0 g silica gel, 1.0 cm id) chromatography, the column was eluted with 150 ml of n-hexane. The HPLC was used on a Waters 626 pump with a Waters 996 photodiode array detector and adapted to an Inertsil ODS-3 column (GL Sciences) with an inner diameter of 150 x 4.6 mm. In addition, for elution by HPLC for DD analysis, 0.1% TFA containing 60% acetonitrile (AN) was used at a flow rate of 1 ml / min. [U- 14 C] for purification of 2,7-diCDD, first with 80% aqueous acetonitrile eluent, then a linear gradient to at AN increasing concentrations 80-100% 10 minutes or more, 100 % For 10 minutes.
[0015]
Example 2 (test fungi)
68 strains of 19 genera and 60 species were obtained from Osaka Fermentation Research Institute, American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA), Japan Mushroom Center and Fungus Research Institute (Tottori) and the United States Department of Agriculture. Ceriporia sp. MZ-340 strain; 68 strains, including Sordida strain YK-624, Phlebia sp MG-60 and 65 unidentified strains, were isolated from decaying wood obtained from forests (Environ. Microbiol. 60, 4359-4363. (1994), Environ. Microbiol. 60, 921-926. (1994)). These fungi were maintained as cultures on potato dextrose agar or malt extract agar slant (Difco).
[0016]
Example 3 (Pre-screening of white rot fungi by DD resolution)
In this experiment, a Low-nitrogen basal III (LN) medium by Tien and Kirk (Methods Enzymol. 161, 238-249. (1983)) was used. The medium contains 1% glucose, 1.2 mM ammonium tartrate and 20 mM sodium acetate (pH 4.5). All the fungi were cultured at 25 ° C. or 30 ° C. on a potato dextrose agar medium or a malt extract agar medium, and a hole was made at an end of the mycelium to obtain a disk having a diameter of 6 mm. Five disks were placed in a 100 mL Erlenmeyer flask containing 10 ml of LN medium. The strain was statically cultured at 30 ° C. in the open air. After culturing for 5 days, 40 μl of NN-dimethylformamide (DMF) containing a 25 mM DD solution was added to each inoculated flask, oxygen was sprayed from the top, and each flask was sealed with a glass stopper and gum tape. Culture was continued for another 5 days. After completion of the culture, an internal standard (DF) was added to the culture, and the mycelium in the culture was pulverized in liquid nitrogen. Acetone (10 mL) was added and the mixture was homogenized. Centrifugation was performed at 3000 × g for 15 minutes to remove biomass. After filtration through a membrane filter (0.22 μm), the obtained supernatant was analyzed by HPLC in order to quantify DD.
[0017]
Example 4 (Screening of white rot fungi having a 2,7-DiCDD mineralization effect)
As a typical model pollutants for microbial degradation studies of in situ (in situ), was used [U- 14 C] 2,7-diCDD . The test strain was cultured as described above. After 5 days of culture was added to 5mM of 50μl [U- 14 C] 2,7- diCDD each flask was inoculated with (DMF solution) (315-kdpm / flask). Trapping of 14 CO 2 was performed according to the method of Kirk et al. (Arch. Microbiol. 117, 227-285. (1978)). The flask was flushed every three days and 14 CO 2 was trapped in a scintillation solution containing 10 ml of ethanolamine (Ultima gold Ex: methanol: ethanolamine = 5: 4: 1). The trapped 14 CO 2 was measured by 14 C activity on the LSC.
[0018]
Example 5 (prescreening result)
Pre-screening of white rot fungi was performed using the disappearance of DD as an index. The number of test strains used in the screening was 19 genera, 66 strains of 74 strains, and 62 unidentified strains, which are stored in the laboratory of the present inventors. All of the identified strains belong to the order aphylloporales, and include the genera Aleurodicus (3 species, 3 strains), the genus Bjerkandera (1 species, 1 strain), the genus Ceriporia (5 species, 6 strains), and the genus Ceriporiopsis (4 species, (4 strains), Coriolus (7 species, 10 strains), Fomitopsis (1 species, 2 strains), Glophyllum (1 species, 1 strain), Hericium (2 species, 2 strains), Merulius (1 species, 1 strain) 1), Microporus (1 species, 1 strain), Nigropurus (1 species, 1 strain), Oligoporus (2 species, 2 strains), Phanerochase (13 species, 13 strains), Phlebia (16 species, 1 strain) 19 strains), Punctaria spp. (1 species, 1 strain), Punus (1 species, Ltd.), Pycnoporus genera (one per share), Stereum sp (4, 4 strains) and Tyromyces spp (one was 1 strain). Under these experimental conditions, 27 strains out of all the test strains did not grow. The DD concentration in this prescreening is determined by the P.C. Despite the concentration being 100 μM, which is four times the concentration in Chrysosporium, it was observed that more than 20% of DD was eliminated by a total of 12 strains of 8 strains belonging to 4 genera and 4 unidentified strains. (FIG. 1), Aleurodiscus disciformis IFO-6280, Ceriporia sp. MZ-340; MG-60, unidentified strains HS-010, KD-070, MZ-227, and OK-190 were selected and used in the following experiments. It should be noted that the above P.E. chrysosporium and P.C. DD loss in sorida was less than 20%.
Example 6 (Screening result)
The 12 strain (n = 4) [U- 14 C] was the presence of incubation each 30 days of 2,7-diCDD. FIG. 2 shows the total amount of 14 CO 2 released from [U- 14 C] 2,7-diCDD at that time. MZ-227, Phlebia Sp. MG-60 and P.I. Lindtneri showed a higher cumulative 14 CO 2 release rate than the other nine strains. FIG. 3 shows the time course of the 14 CO 2 release of the three strains showing a high cumulative 14 CO 2 release rate. MZ-227 (△) began to mineralize 6 days after culture and reached 10-13 nmol / day during the 9-18 day culture period. Phlebia sp. MG-60 (□) began to mineralize on the third day after culture, peaked at 10 to 13 nmol / day after 3 to 6 days, and rapidly decreased thereafter. P. Lindtneri (○) began to mineralize 3 days after culture and reached 4-9 nmol / day during the 3-18 day culture period. In all these bacteria, mineralization decreased to less than 3 nmol / day after 24 days. MZ-227, Phlebia sp. MG-60 and P.I. Lindtnerii converted 250 nmol of 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin (2,7-diCDD) to 196, 155 and 149 nmol of 14 CO 2 respectively during the 30-day culture period. In the no-inoculation control, after the initial addition, O 2 flash showed very little of the volatile radioactivity. Dioxin mineralization by white caustic bacteria is described in Bumpus et al. In a culture medium (10 ml) containing 1.25 nmol of 2,3,7,8-tetra-CDD during a 30-day culture period. chrysosporium reports the conversion of 2,3,7,8-tetra CDD to 27.9 pmol of 14 CO 2 , compared to white rot fungi MZ-227, Phlebia sp. MG-60, and P.I. It was found that Lindtberi showed higher mineralization activity of 2,7-diCDD.
[0020]
【The invention's effect】
According to the present invention, dioxins can be efficiently converted into inorganic substances such as carbon dioxide, water, and chloride ions by using a white rot strain having higher dioxin decomposition ability and / or mineralization ability than previously reported white rot strains. It can be converted into a substance and detoxified.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing the results of decomposition of dibenzodioxin by 12 white-rot fungi.
FIG. 2 is a graph showing the results of mineralization of 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin by 12 white-rot fungi.
FIG. 3 is a graph showing the time course of the mineralization of 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin by three white-rot fungi.
