JP2004097031A - Method for screening efflux pump inhibitor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a compound avoiding enhancement of resistance with a drug efflux pump or a method for screening a compound making the existing antimicrobial agent effective by inhibiting the drug efflux pump. <P>SOLUTION: The method for screening the efflux pump inhibitor comprises culturing a bacterium together with a test substance in the presence of a compound represented by formula I (wherein, R is a 2-14C linear or a 2-14C branched acyl group which may be substituted) and detecting the expression of a gene encoding the efflux pump in the bacterium. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

〔式中、Ｒは、炭素数２〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに細菌を培養し、該細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
（２）細菌染色体中の排出ポンプをコードする遺伝子の一部又は全部を、相同組換えによってレポーター遺伝子と置き換え、式Ｉ：
【化５】

〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに相同組換えのなされた細菌を培養し、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
（３）細菌が緑膿菌である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害物質。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害剤。
（６）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化６】

〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物、
ｂ）レポーター遺伝子を含むターゲティングベクター、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
アシル化ホモセリンラクトン類を含むオートインデューサーは、その濃度又は物性を変化させることにより、細胞内に存在するか又は膜に結合している調節タンパク質と結合し、その調節タンパク質により制御している一群の遺伝子の発現を制御する。オートインデューサーとは、生物内で産生され、細胞それ自身あるいは周辺の細胞に作用し、比較的低濃度で遺伝子の発現に影響を与える低分子の物質を意味する。
【００１１】
アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の代謝に対して、制御活性を有する可能性が示唆されていたが、その具体的な作用については十分解明されていなかった。本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現を促進する物質であり、当該化合物の排出ポンプ発現促進作用を阻害する物質が、薬剤耐性を有する細菌に対しても抗菌作用を有しうることを見出し、本発明のスクリーニング方法を完成させた。アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現に関与することは、以下に記載するような方法により実証された。
【００１２】
日和見感染菌である緑膿菌は、様々な抗生物質に耐性を示す多剤耐性菌の代表的株である。この主たる原因は、緑膿菌が発現する排出ポンプにあると考えられている。この原因となる排出ポンプをコードする遺伝子にレポーター遺伝子を導入し、そのレポーター遺伝子の活性を測定することで簡易的に排出ポンプの発現の状況をモニタリングした。相同組換えにより緑膿菌染色体上のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ遺伝子上にカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするレポーター遺伝子（ｘｙｌＥ）を導入し、レポーター遺伝子導入株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを構築した。その株を用いてアシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプの誘導効果を測定したところ、アシル化ホモセリンラクトン類の濃度を上昇させていくと、約２５μＭまでは濃度依存的に排出ポンプが誘導され、それ以降一定に保たれることを見出した。以上から、アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現を誘導していることが明らかとなった。
【００１３】
本明細書においては、式Ｉ：
【化７】

で表される化合物をアシル化ホモセリンラクトン類と称する。
【００１４】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数２〜１４、好ましくは４〜１２の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、並びに３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。
【００１５】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、プロピオニル基、３−オキソプロピオニル基、ブチリル基、３−オキソブチリル基、イソブチリル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基等が挙げられる。
【００１６】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（７−システトラデカノイル）−ホモセリンラクトン又はＮ−（３−ヒドロキシ−７−システトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン等を挙げることができ、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを用いるのが好ましい。
【００１７】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｐ．　Ｓｔｅａｄ，　Ｎ．　Ｊ．　Ｂａｉｎｔｏｎ，　Ｇ．　Ｐ．　Ｃ．　Ｓａｌｍｏｎｄ，　Ｇ．　Ｓ．　Ａ．　Ｂ．　Ｓｔｅｗａｒｔ，　Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　ａｎｄ　Ｂ．　Ｗ．　Ｂｙｃｒｏｆｔ，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　４６，　４４１−４５４，　１９９３、Ｚｈａｎｇ，　Ｌ．，　Ｐ．　Ｊ．　Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．　Ｋｅｒｒ，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｅ．　Ｔａｔｅ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３６２，　４４６−４４８，　１９９３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ　Ａ．Ｌ．，　Ｂ．　Ｌ．　Ｈａｎｚｅｌｋａ，　Ａ．　Ｅｂｅｒｈａｒｄ，　ａｎｄ　Ｅ．　Ｐ．　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７８，　２８９７−２９０１，　１９９６、Ｇａｏ，　Ｊ．−Ｇ．　ａｎｄ　Ｅ．　Ａ．　Ｍｅｉｇｈｅｎ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７５，　３８５６−３８６２，　１９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１８】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法を適用できる細菌としては、排出ポンプを有するものであれば特に限定されないが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルジニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレノトロホモナス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ブルコホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、フランキセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等に属するグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む広範囲の各種細菌が挙げられる。
【００２０】
具体的には、緑膿菌、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリジェネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、ストレノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ブルコホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアケエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スツアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ヘモリティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルジニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルジニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ）、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリテイクス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）３４５２Ａ同族群、バクテロイデス・ブルガトゥス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エガーチイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルレア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ハイイクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｍｕｌａｎｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・サッカロリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明は、シュードモナス属、特に緑膿菌、ブルコホルデリア属、特にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ、エルウィニア属、特にＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、エシェリキア属、特に大腸菌、リゾビウム属、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、ビブリオ属、特にＶｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉの排出ポンプを阻害する物質のスクリーニングにおいて好適に使用できる。さらに、緑膿菌に対する排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする場合は、ＰＡＯ１株、Ｎ１３５株、ｎａｌＢ株、ｎｆｘＢ株、ｎｆｘＣ株等の株を使用するのが好ましい。
また、遺伝子組換えにより、排出ポンプ遺伝子を導入した細菌を使用してもよい。
【００２２】
本発明において「排出ポンプ」とは、細胞の細胞質又は周辺細胞質から基質分子をエネルギー依存様式で輸出するタンパク質集合を意味する。したがって、排出ポンプは、典型的に、細胞の細胞膜中に位置している。グラム陰性細菌において、排出ポンプは周辺腔の範囲にわたることができ、外膜の範囲にわたる排出ポンプの部分も存在しうる。
【００２３】
緑膿菌に存在する排出ポンプには、緑膿菌ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ又は緑膿菌株Ｋ３８５によって過発現される排出ポンプ又は緑膿菌株ＰＡＯ４０９８Ｅによって過発現される排出ポンプの一部分であるポリペプチドと少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドが含まれる。
【００２４】
ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは、緑膿菌野生株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡＯ１）で構成的に発現しているＲＮＤファミリーの膜タンパク質である。ＭｅｘＡは、内膜にアンカリングしているペリフェラルタンパク質であり、ＭｅｘＢは、内膜を１２回貫通した内膜タンパク質であり、ＯｐｒＭは外膜に存在するチャンネルタンパク質である。これら３つのサブユニットでＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは構成されている。この排出ポンプの基質として、現在までに各種の抗生物質、例えば、βラクタム剤、キノロン剤、クロラムフェニコールなど、有機溶媒、オートインデューサーの１つである３ｏｘｏＣ−１２ＨＳＬが知られており、また、この排出ポンプは、抗生物質や有機溶媒に対する耐性、さらには緑膿菌の二次代謝産物（毒素、プロテアーゼ、色素など）の産生に深く関わっていることも知られている。ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ、及びその塩基配列については、Ｐｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１０（３），　５２９−５４４，　１９９３及びＰｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７５（２２），　７３６３−７３７２，　１９９３等に記載されている。
【００２５】
その他の排出ポンプとしては、ＲＮＤファミリー、ＭＦＳファミリー、ＳＭＲファミリー、ＡＢＣファミリー、ＭＡＴＥファミリーに属するタンパク質が挙げられる。具体的には、ＲＮＤファミリーに属するものとしては、緑膿菌のＭｅｘＥ−ＭｅｘＦ−ＯｐｒＮ排出ポンプ（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｔ．ら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２３，　３４５−３５４，　１９９７）、ＭｅｘＸ−ＭｅｘＹ排出ポンプ（Ｍｉｎｅ．　Ｔ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　４３，　４１５−４１７，　１９９９）、ＭｅｘＣ−ＭｅｘＤ−ＯｐｒＪ排出ポンプ（Ｐｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１　（４），　７１３−７２４，　１９９６）、ＭＦＳファミリーに属するものとしては、大腸菌のＭｄｆＡ排出ポンプ（Ｅｄｇａｒ　Ｒ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．　１７９，　２２７４−２２８０，　１９９７）、ＭＡＴＥファミリーに属するものとしては、大腸菌のＹｄｈＥ（Ｍｏｒｉｔａ　Ｙ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　４２，　１７７８−１７８２，　１９９８）、ＡＢＣファミリーに属するものとしては、大腸菌のＨｌｙＢＤ（Ｄｉｎｈ　Ｔ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７６，　３８２５−３８３１，　１９９４）を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、「排出ポンプ阻害物質」とは、排出ポンプの発現を阻害する物質、好ましくは、アシル化ホモセリンラクトン類が排出ポンプの発現を促す機構を阻害する物質を意味する。緑膿菌においては、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＬａｓＲタンパク質と、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＲｈＩＲと結合して、下流の遺伝子群の調節を行っていると考えられる。そして、ＲｈＩＲとアシル化ホモセリンラクトン類の複合体が排出ポンプを発現させると考えられる。この複合体は、直接に排出ポンプの転写を促進する、排出ポンプ調節遺伝子の発現量を変化させて排出ポンプ遺伝子の発現を促す、又は排出ポンプの調節遺伝子の質的変化を促すことによって排出ポンプ遺伝子の発現を促すものと考えられる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、例えば、アシル化ホモセリンラクトン類を分解することによって、アシル化ホモセリンラクトン類とその調節タンパク質との結合を阻害することによって、又はアシル化ホモセリンラクトン類とその調節タンパク質との複合体が認識するタンパク質との結合を阻害することによって、排出ポンプの発現を阻害すると考えられる。本発明においては、抗菌剤を含む幅広い基質範囲を有する排出ポンプの発現を阻害する物質が好ましい。
【００２７】
本発明によってスクリーニングする被検物質が含まれうる試料としては、特に限定されないが、動物（カビ、放射菌等の微生物を含む）及び植物の抽出物、並びに人工合成物が挙げられる。
【００２８】
本発明において、細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出する方法としては、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の存在下、被検物質とともに細菌を培養した時に、被検物質の存在によって、当該排出ポンプ遺伝子の発現が変化するかどうかを検出することができるものであれば特に限定されず、当技術分野の当業者であれば適宜選択することができる。そのような方法としては、特に限定されないが、例えば、遺伝子ターゲティング（相同組換えを利用したレポーター遺伝子の導入）、排出ポンプの基質である各種抗生物質に対する感受性の変化のモニタリング、排出ポンプによって排出される蛍光物質又は染色物質の排出に伴う供試菌の色調変化及びＲＴ−ＰＣＲによる排出ポンプ遺伝子の転写量の測定等が挙げられる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、遺伝子ターゲティングを使用して排出ポンプの発現を検出する。すなわち、この実施形態では、まず、排出ポンプをコードする遺伝子の全部又は一部を相同組換えを用いてレポーター遺伝子と置き換えることによってレポーター遺伝子を細菌染色体中に導入する。次に、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の存在下、被検物質とともに相同組換えのなされた細菌を培養し、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする。
【００３０】
以下に遺伝子ターゲティングを用いた本発明のスクリーニング方法の一態様について説明する。
【００３１】
レポーター遺伝子は、相同組換えにより排出ポンプ遺伝子のプロモーターの下流に導入する。相同組換えによる遺伝子ターゲティングにおいて用いられるターゲティングベクターは、内在性染色体ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列の上流の染色体ＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列、及び該標的ＤＮＡ配列の下流の染色体ＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列を各々の末端に有し、当該２つの相同なＤＮＡ配列の間にレポーター遺伝子、マーカー遺伝子などの外来性遺伝子を含む基本構造を有する。外来遺伝子と内在性染色体ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせるためには、レポーター遺伝子の２つの相同領域は各々少なくとも約０．５Ｋｂの塩基長が必要とされる。従って、ターゲティングベクターにおける相同領域の作成は、概ね下記（１）〜（５）のような操作工程で行われる。
【００３２】
（１）標的ＤＮＡ配列の一部の塩基配列を基に該配列を含むＤＮＡにハイブリダイズする少なくとも約２００ｂｐ以上の塩基長を有するプローブを作製し、該プローブを放射性標識し、プラークハイブリダイゼーション用の標識プローブを調製する。
（２）該放射性標識プローブ及び市販又は必要に応じて調製した染色体ＤＮＡのλファージライブラリーを用いてプラークハイブリダイゼーションを行い、該標的ＤＮＡ配列を含む長鎖染色体ＤＮＡがクローニングされている陽性λファージプラークを同定、取得する（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７２，　３９６１，　１９７５）。
（３）該陽性クローンを複数の適当な制限酵素の組み合わせで消化して得られる染色体ＤＮＡ断片を電気泳動に供して各々の染色体ＤＮＡ断片の遺伝子の大きさを解析する。
（４）下記工程（５）で調製する２つの染色体ＤＮＡ断片を調製するための必要な遺伝子情報を得るために、該解析結果を基に該長鎖染色体ＤＮＡの制限酵素地図を作成する。
（５）該標的ＤＮＡ配列の上流及び下流に位置する各々少なくとも約０．５Ｋｂの遺伝子長を有する染色体ＤＮＡ断片が得られるように、該制限酵素地図を基に、該長鎖染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。ここで得られた２つの染色体ＤＮＡ断片を、相同組換え用ターゲティングＤＮＡの両端に各々配置する相同ＤＮＡ配列として用いる。
【００３３】
あるいは、相同領域は、標的ＤＮＡ配列内における上流領域及び下流領域の配列でもよい。この場合、まず、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに標的ＤＮＡ配列を挿入する。続いて、標的ＤＮＡ配列内に存在する適当な制限酵素部位で標的ＤＮＡ配列を切断して、当該部位にレポーター遺伝子等の外来遺伝子を挿入することにより、ターゲティングベクターを作成することもできる。
【００３４】
また、ＰＣＲ法を用いることでも相同領域を取得することができる。標的ＤＮＡ配列の一部の塩基配列をもとにプライマーを設計し、テンプレートとして標的ＤＮＡを含む溶液を用いてＰＣＲを行い、目的相同領域を特異的に増幅させ、それを適当なベクターにクローニングすることで相同組換えに必要な相同領域を取得することが可能である。
【００３５】
ターゲティングベクターは、レポーター遺伝子及び上記の相同ＤＮＡ配列の他に、レポーター遺伝子が相同組換えにより導入された細菌株を選択するための要素、例えば、マーカー遺伝子及び致死遺伝子等を含むように設計する。ターゲティングベクターを接合伝達により導入する場合は、さらに、プラスミド伝播に必要な領域、例えば、ＭＯＢ領域を含むのが好ましい。
【００３６】
ベクターにレポーター遺伝子及び上記の相同ＤＮＡ配列等を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３７】
ターゲティングベクターを作成するために用いることができる染色体導入型ベクターとしては、宿主生物中の染色体に組み込み可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などが挙げられる。ターゲティングベクターを接合伝達により導入する場合は、接合伝達用ベクター、例えば、ｐＮＯＴ１９を使用するのが好ましい。
【００３８】
レポーター遺伝子としては、特に限定されないが、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ヒスチジン遺伝子（ｈｉｓ３）、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子、カテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＥ）、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子などが用いられる。本発明では、カテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子を用いるのが好ましい。
【００３９】
マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
致死遺伝子としては、ｓａｃＢ−ｓａｃＲ遺伝子が挙げられる。
【００４０】
細菌へのベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン法、エレクトロポレーション法、接合伝達法などが挙げられる。接合伝達に用いる伝達用宿主は、目的の細菌に接合するものであれば特に限定されないが、大腸菌を用いるのが好ましく、大腸菌Ｓ１７−１を用いるのが特に好ましい。
【００４１】
染色体にレポーター遺伝子が導入された細菌株は、導入したターゲティングベクターに含まれるマーカー遺伝子及び致死遺伝子を利用して、選択することができる。
【００４２】
上記のようにして得られたレポーター遺伝子導入株を、当該細菌に好適な条件で培養する。培養した菌体を新たな培地に植菌し、３７℃にて数時間培養後、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を２０μＭ以上、好ましくは５０〜１０００μＭの濃度になるように培養液に添加する。排出ポンプは、アシル化ホモセリンラクトン類２０μＭ以上で十分誘導されるからである。その際、１種あるいは数種の被検物質を含んでいる試料溶液を同時に添加する。その後さらに２〜１０時間、好ましくは３〜５時間培養し、集菌した後、導入したレポーター遺伝子の発現を、導入したレポーター遺伝子に適した方法で検出する。
【００４３】
試料溶液に排出ポンプ阻害物質、すなわちアシル化ホモセリンラクトン類の排出ポンプ発現促進作用を阻害する物質が含まれる場合、試料溶液を添加しないときと比べ、レポーター遺伝子の発現は減少する。一方、試料溶液に排出ポンプ阻害物質が含まれない場合は、試料溶液を添加しないときと比べ、レポーター遺伝子の発現には変化がないことになる。レポーター遺伝子の発現は排出ポンプ遺伝子の発現を意味するので、試料溶液にアシル化ホモセリンラクトン類に対する阻害物質が含まれる場合は、排出ポンプの発現が抑制され、含まれない場合は排出ポンプの発現には変化がないことになる。アシル化ホモセリンラクトン類の排出ポンプ発現促進作用を阻害し、細菌における排出ポンプの発現を阻害する物質が存在すると、菌体内に存在する各種薬剤を排出することができないので、当該物質は、薬剤耐性を獲得した細菌に対しても抗菌作用を有することになる。上記のような方法により排出ポンプ阻害物質のスクリーニング及びその阻害効果を評価することができる。
【００４４】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法によって同定された排出ポンプ阻害物質に関する。このような物質としては、特に限定されず、天然物及び合成物の双方が含まる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、単独で、又は従来の抗菌剤とともに使用することによって、抗菌剤として使用できる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、公知の抗菌剤とともに用いた場合に、排出ポンプの発現によって薬剤耐性を獲得した細菌に対しても、抗菌剤の作用を増強できる点において有利である。本発明の排出ポンプ阻害物質とともに用いることができる公知の抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ペニシリン（ペナム）系抗生物質、セファロスポリン（セフェム）系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質、サルファ剤、パラアミノサリチル酸製剤、イソニコチン酸ヒドラジド製剤及びキノロン系合成抗菌剤などを挙げることができる。
【００４５】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。該キットは、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類、レポーター遺伝子を含むターゲティングベクター、レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬としては、カテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性を評価するためのカテコールなどが挙げられる。該キットはまた、ｐＨ７．５の１０×リン酸カリウム溶液（５００ｍＭリン酸カリウム溶液）及びコントロール用のｘｙｌＥ遺伝子を含む大腸菌等を含んでいてもよい。
【００４６】
【実施例】
実施例１．アシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプ発現促進
緑膿菌の排出ポンプであるＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプをコードする遺伝子ｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭオペロン内にレポーター遺伝子であるｘｙｌＥ遺伝子を導入した株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを、ＬＢ培地（１％　トリプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ）中、３７℃にて一晩培養した。その培養液２０μｌを新たなＬＢ培地４ｍｌに植菌し、３時間培養した。続いて、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを最終濃度が０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００μＭの濃度になるように培養液に添加した。その後、さらに３時間培養した後に集菌した。得られた菌体をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム溶液に懸濁し、超音波により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心することで未破壊菌体及び菌体残渣を除き、粗酵素溶液を調製する。この粗酵素溶液を適宜５０ｍＭリン酸カリウム溶液で希釈し、９９０μｌに対し１０μｌの１００ｍＭカテコール溶液を添加し、カテコールの分解に伴う３７５ｎｍの吸光の増加を測定することでカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性を測定した。その結果、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度が２５μＭになるまでは、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度に依存してｘｙｌＥ遺伝子産物であるカテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性が上昇し、それ以上の濃度では、一定の高い活性値のままであった。結果を図１に示す。
【００４７】
実施例２ 　 排出ポンプ阻害物質のスクリーニング
実施例１によりＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプの発現がＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンにより誘導されることが明らかになった。そこで、この排出ポンプの発現を指標に阻害剤の検索を行うこと、又は阻害剤の評価を行うことが可能になる。
【００４８】
レポーター遺伝子導入株の作成
ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプの発現を検出するため、緑膿菌の染色体ｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ遺伝子内にカテコール２，３ジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子を導入した。
【００４９】
すなわち、大腸菌用ベクターｐＮＯＴ１９に、緑膿菌ＰＡＯ１株の染色体由来のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ排出ポンプ遺伝子をクローニングした。このベクターのｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ上にカナマイシン耐性遺伝子を含むレポーター遺伝子カセットｘｙｌＥを導入し、ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢベクターを構築した。このｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢベクターを大腸菌の接合伝達用株である大腸菌Ｓ１７−１に導入し、大腸菌Ｓ１７−１（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）を作成した。
【００５０】
次に、緑膿菌ＰＡＯ１株と大腸菌Ｓ１７−１（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）をＬＢ培地において３７℃にて一晩培養し、前者１ｍｌと後者０．５ｍｌを混合し、５０００ｒｐｍで２分間遠心して集菌し、その後上清を捨て、新しい０．１ｍｌのＬＢ培地に細胞を懸濁した。その後、その懸濁液をＬＢ寒天培地上に置いたニトロセルロース膜の上に静置し、再度３７℃で３時間培養後、下記の組成を有するＶＢＭＭ液体培地１ｍｌで膜上の細胞を回収し、１００〜１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン若しくはスルベニシリンを含むＶＢＭＭ寒天培地に塗布した後に、３７℃で３日間培養した。
【００５１】
ＶＢＭＭ培地の組成（１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　　　　　　　０．２ｇ
クエン酸３ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ　　　　２ｇ
Ｋ_２ＨＰＯ_４　　　　　　　　　　　　１０ｇ
ＮａＮＨ_４ＨＰＯ_４・４Ｈ_２Ｏ　　　　　　　３．５ｇ
【００５２】
寒天培地上に生育してきたコロニーをＬＢ培地で３７℃にて一晩培養し、１０％のスクロースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育してきたコロニーをＰＡＯ１−Ｘｙｌ候補株とし、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法を用いて、染色体のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ排出ポンプ遺伝子内にｘｙｌＥ遺伝子が導入されていることを確認し、これをレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）として選択した。
【００５３】
レポーター遺伝子導入株の培養
上記にようにして得られたレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）をＬＢ培地（１％　トリプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ）で３７℃にて１５時間培養し、培養後の菌体を１／２００量の新たなＬＢ培地に植菌し、３時間培養する。その後Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを約５０μＭの濃度になるように培養液に添加する。その際、１種あるいは複数の物質を含んでいる試料溶液Ａを同時に添加する。さらに、３時間培養した後集菌する。
【００５４】
カテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性の測定
上記のように培養した菌体をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム溶液に懸濁し、超音波により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心することで未破壊菌体及び菌体残渣を除き、粗酵素溶液を調製する。この粗酵素溶液を適宜５０ｍＭリン酸カリウム溶液で希釈し、９９０μｌに対し１０μｌの１００ｍＭカテコール溶液を添加し、カテコールの分解に伴う３７５ｎｍの吸光の増加を測定することでカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性を測定する。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によって、細菌の排出ポンプの発現を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、同定された排出ポンプ阻害物質を従来の抗菌薬と同時に使えば、抗菌薬の効果を数倍〜数十倍高められるため、薬剤耐性を有する細菌に対する抗菌剤の効果を高めることができると同時に、抗菌剤による副作用を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）とＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンとを培養したときの、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度とカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性の関係を表すグラフである。
【図２】実施例２におけるターゲティングベクター（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）の作成方法を表す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for screening a substance that inhibits the activity of a drug-resistant bacterium.
[0002]
[Prior art]
With the spread of chemotherapy, especially antibiotics, the drastic reduction of bacterial infections such as tuberculosis and dysentery has been remarkable, and its contribution to public health has not been measured. However, with the increase in the use of antibiotics, so-called drug-resistant bacteria which do not work with antibiotics have begun to appear since the late 1950's, and have been rapidly increasing in recent years. Recently, especially drug-resistant bacteria represented by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) have become widespread as hospital-acquired bacteria. Important pathogens such as Mycobacterium tuberculosis, Shigella, and Staphylococci are many multidrug-resistant bacteria that are resistant to many kinds of drugs. If these pathogenic bacteria are pathogenic, and the pathogenic bacteria are pathogenic, it is expected to be the most difficult-to-treat intractable severe infection, which poses a major problem in performing infectious disease chemotherapy. Has become. Because of the increase in drug-resistant bacteria, the life cycle of antibiotics is generally short, and pharmaceutical manufacturers must supply new antibiotics to the market one after another at enormous costs. It reaches a huge amount that can not be ignored from the viewpoint of.
[0003]
On the other hand, in recent years, the existence of a drug efflux pump as a drug efflux mechanism of bacteria has been recognized by analysis research on the resistance mechanism of resistant bacteria. In 1980, a pump that specifically excretes a tetracycline-based antibacterial drug out of cells was identified by the Levy group in 1980 (see Non-Patent Document 1), and it was noted as a main factor of tetracycline resistance. More recent studies have reported the presence of multidrug efflux pumps in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, staphylococci, pneumococci and gonococci. Among them, four types of multidrug efflux pumps have been reported as drug efflux pumps of Pseudomonas aeruginosa having homology, and recently the entire genome sequence of Pseudomonas aeruginosa has been elucidated. The sequence confirms the presence of a further 5 to 6 new multidrug discharge pumps, a total of 10 types. And it has been considered that Pseudomonas aeruginosa is a factor of drug low sensitivity as originally indicated (see Non-Patent Documents 2 to 5).
[0004]
For example, a drug efflux pump of Pseudomonas aeruginosa discharges a variety of drugs including β-lactam, tetracycline, chloramphenicol or quinolone, etc., out of the cells and contributes to drug resistance of Pseudomonas aeruginosa. I have. In order to remedy this problem, it is desired to develop a compound that can avoid the resistance caused by the drug efflux pump, which is the cause of resistance, or a compound that inhibits the function of the drug efflux pump and makes the existing antibacterial agent effective. Was.
[0005]
However, it was not clear how such a drug discharge pump works to discharge foreign substances and drugs out of the cells, and it was difficult to find such compounds.
[0006]
[Non-patent document 1]
L. {McMurry,} Proc. {Natl. {Acad. {Sci. U. S. A. , $ 77, $ 3974, $ 1980
[Non-patent document 2]
K. Pool et al., J. {Bacteriol. , $ 175, $ 7363, $ 1993
[Non-Patent Document 3]
K. Poole et al. {Microbiol. , $ 21, $ 713, $ 1996
[Non-patent document 4]
T. Kohler et al. {Microbiol. , $ 23, $ 345, $ 1997
[Non-Patent Document 5]
T. {Mine et al., Antimicrob. {Agents} Chemother. , $ 43, $ 415, $ 1999
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method of screening for a compound capable of avoiding the resistance of bacteria by a drug efflux pump or a compound which inhibits the drug efflux pump and thereby makes an existing antibacterial agent effective.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that acylated homoserine lactones represented by the following formula I are involved in the expression of a bacterial efflux pump. The present inventors have found that the above problem can be solved by detecting the expression of an efflux pump gene in bacteria in the presence of, and have completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 2 to 14 carbon atoms]
A method for screening for an efflux pump inhibitor by culturing a bacterium together with a test substance in the presence of a compound represented by the formula: and detecting the expression of a gene encoding an efflux pump in the bacterium.
(2) replacing part or all of the gene encoding the efflux pump in the bacterial chromosome with a reporter gene by homologous recombination,
Embedded image

[Wherein, R is as defined above]
A method for screening for an efflux pump inhibitor by culturing a bacterium that has undergone homologous recombination with a test substance in the presence of the compound represented by formula (I) and measuring the expression of the reporter gene.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the bacterium is Pseudomonas aeruginosa.
(4) An efflux pump inhibitor identified by the screening method according to any one of (1) to (3).
(5) An efflux pump inhibitor identified by the screening method according to any one of (1) to (3).
(6) A kit for use in the screening method according to any one of (1) to (3), comprising the following elements.
a) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R is as defined above]
A compound represented by
b) a targeting vector containing a reporter gene,
c) Reagent for evaluating reporter gene expression.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
A group of autoinducers containing acylated homoserine lactones bind to a regulatory protein present in a cell or bound to a membrane by changing its concentration or physical properties, and are controlled by the regulatory protein. Controls the expression of the gene. Autoinducer means a low molecular substance that is produced in an organism, acts on the cell itself or surrounding cells, and affects gene expression at a relatively low concentration.
[0011]
It has been suggested that acylated homoserine lactones may have a regulatory activity on bacterial metabolism, but their specific effects have not been fully elucidated. The present inventors have reported that acylated homoserine lactones are substances that promote the expression of a bacterial efflux pump, and substances that inhibit the efflux pump expression-promoting action of the compound have an antibacterial action against drug-resistant bacteria. And completed the screening method of the present invention. The involvement of acylated homoserine lactones in the expression of bacterial efflux pumps was demonstrated by the method described below.
[0012]
Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic infectious bacterium, is a representative strain of multidrug-resistant bacteria that are resistant to various antibiotics. The major cause of this is thought to be the efflux pump expressed by Pseudomonas aeruginosa. A reporter gene was introduced into the gene encoding the efflux pump that caused this, and the expression status of the efflux pump was easily monitored by measuring the activity of the reporter gene. A reporter gene (xylE) encoding a catechol 2,3 dioxygenase gene was introduced into the mexA-mexB-oprM gene on the P. aeruginosa chromosome by homologous recombination to construct a reporter gene-introduced strain PAO1-Xyl. The strain was used to measure the effect of inducing the efflux pump by acylated homoserine lactones. As the concentration of the acylated homoserine lactone was increased, the efflux pump was induced in a concentration-dependent manner up to about 25 μM. Since then, I have found that it is kept constant. From the above, it was revealed that acylated homoserine lactones induced the expression of bacterial efflux pump.
[0013]
As used herein, Formula I:
Embedded image

Are referred to as acylated homoserine lactones.
[0014]
In the formula I, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 2 to 14 carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms. Examples of the substituent include a hydroxyl group and an oxo group. No. An unsubstituted saturated aliphatic acyl group and a saturated aliphatic acyl group having an oxo group at the 3-position are preferred.
[0015]
Specific examples of R include, but are not particularly limited to, for example, acetyl, propionyl, 3-oxopropionyl, butyryl, 3-oxobutyryl, isobutyryl, heptanoyl, 3-oxoheptanoyl, valeryl, 3-oxovaleryl group, isovaleryl group, 3-oxoisovaleryl group, nonanoyl group, 3-oxononanoyl group, pivaloyl group, hexanoyl group, 3-oxohexanoyl group, octanoyl group, 3-oxooctanoyl group, lauroyl group, Examples thereof include a 3-oxododecanoyl group, a palmitoyl group, a 3-oxopalmitoyl group, a stearoyl group, a 3-oxostearoyl group, a myristoyl group, and a 3-oxomyristoyl group.
[0016]
Specific examples of the acylated homoserine lactone represented by the formula I include, but are not particularly limited to, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-hydroxybutyryl) -L-homoserine lactone, N- Hexanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N-octanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxooctanoyl) -L-homoserine lactone, N-decanoyl- L-homoserine lactone, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (7-cistetradecanoyl) -homoserine lactone or N- ( 3-hydroxy-7-cistetradecanoyl) -L-homoserine lactone and the like Bets can be preferably used N- butyryl -L- homoserine lactone.
[0017]
The acylated homoserine lactone of the present invention can be synthesized, for example, by forming an amide bond between an aliphatic carboxylic acid or an ester thereof and a cyclic amino acid. Acylated homoserine lactones are described, for example, in Chhabra, S. R. , P. Stead, N. {J. Bainton, G. P. C. Salmond, G. S. A. B. Stewart, P. Williams, {and} B. W. Bycroft, J. {Antibiot. , $ 46, $ 441-454, $ 1993, Zhang, $ L. , P. {J. {Murphy, A .; Kerr, and M. E. {Tate, @Nature, $ 362, $ 446-448, $ 1993, Schaeffer} A. L. , B. L. Hanzelka, A. Eberhard, and E. P. Greenberg, J. {Bacteriol. 178, 2897-2901, 1996, Gao, JJ. -G. {And} E. A. {Meighen. {J. {Bacteriol. , 175, 3856-3862, 1993, and the like.
[0018]
Further, since the acylated homoserine lactone of the present invention is biosynthesized by a microorganism, it can be separated and purified from a culture obtained by culturing the microorganism by a method generally used in the art.
[0019]
The bacterium to which the screening method of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it has an efflux pump. The genus Pseudomonas, the genus Escherichia, the genus Salmonella, the genus Shigella, and Klebsiella are available. Genus (Klebsiella), genus Proteus, genus Morganella, genus Providencia, genus Citrobacter, genus Bacteroides, genus Streptococcus, Streptococcus, Streptococcus (Streptococcus) Genus Enterobacter, Serratia (Se <RTIgt; ratia, </ RTI> Acinetobacter, Yersinia, Haemophilus, Pasteurella, Branhamella, Helicobacter Bacteria, Helicobacter Bacteria, Helicobacter Bacteria Genera, Vibrio, Legionella, Listeria, Neisseria, Gardnerella, Clostridium, Mycobacterium, Mycobacterium Corynebac genus, genus Enterococcus, genus Strenotrophomonas, genus Burkholderia, genus Aeromonas, genus Francisella, genus Borciella, Riel, Bordetella (R) (Rhizobium) and a wide variety of bacteria including Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria.
[0020]
More specifically, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas phosmonad phosmonad phosmonad phosmonad phosmonad phosmonas phosmonad phosmonad phosmonad phosmonas phomonas phosmonad phosmonas phosmonas phosmonad phosmonas phosmonad phosmonas phosmonas phosmonas phosmonas phos. Philia (Strenotrophomonas maltophilia), Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophilia, Escherichia coli, Citrobacter acter freundii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enterigeris germ, and Shigella s. (Shigella sonei), Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca iella @ oxytoca, Serratia @ marcescens, F. serrata (Francisella @ tularensis), Morganella moriganii (Morganellaeni morisiis, Proteus milaviris, Proteus milaviris, Proteus milaviris, Proteus milaviris) ), Providencia lettgeri, Providencia stuartii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetto Bacter haemolytics (Acinetobacter @ haemolyticus), Erzinia enterolytica (Yersinia @ enterocolitica), Yersinia @ pestis, Pseudotuberculosis eruginia (Yersinia @ pseudoercinia) B. pertussis (Bordetella @ parapertussis), B. bronchiseptica (B. bronchiseptica), H. influenzae (Haemophilus @ influenzae), H. parainfluenzae (Haemophilus @ par) influenzae), Haemophilus Hemoritikusu (Haemophilus haemolyticus), Haemophilus para f Mori Politics (Haemophilus parahaemolyticus), Haemophilus ducreyi (Haemophilus ducreyi), Pasteurella multocida (Pasteurella multocida), Pasteurella haemolytica (Pasteurella haemolytica), catarrh aureus (Branhamella haemolytica ), Catharcoccus (Branhamella catarrhalis), Helicobacter pylori, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Borrelia burgdorferi, Vibrio choleraeio lipeio variegio lipeio variego lipeio variego lipoergioe lipoergioe lipo phiero gioe phia oleo gio phiero gioerre gio phiero gioe phia eo phierio tyre Ｖ ヘ ｊ ン ピ ロ ピ ロ ン ン. pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Gardnerella vaginalis, Gardnerella vaginalis Fragilis (Bacteroides fragilis), Bacteroides Disutasonisu (Bacteroides distasonis), Bacteroides (Bacteroides) 3452A cognate group, Bacteroides Burugatusu (Bacteroides vulgatus), Bacteroides Obarusu (Bacteroides ovalus), Bacteroides thetaiotaomicron (Bacteroides thetaiotaomicron), Bacteroides Uniformis (Bacteroides @ uniformis), Bacteroides @ eggerthiii, Bacteroides @ splannicics ), Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, Mycobacterium erium bacterium, and the like. diphtheriae), Corynebacterium ulcerans (Corynebacterium ulcerans), Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae), Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes (Streptococcus pyogenes), Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Enterococcus faecium (Enterococcus faecium), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus epidermidis), Staphylococcus support profilin Genetics (Staphylococcus saprophyticus ), Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyycus, Staphylococcus simulans (Stapyl) ococcus simulans), Staphylococcus Hemoritikusu (Staphylococcus haemolyticus), Staphylococcus hominis (Staphylococcus hominis), Staphylococcus Sacca Lori Genetics (Staphylococcus saccharolyticus), Erwinia Karutobora (Erwinia carotovora), Rhizobium leguminosarum (Rhizobium leguminosarum ) And the like.
[0021]
The present invention relates to the genus Pseudomonas, in particular Pseudomonas aeruginosa, Burcoholderia, in particular Burkholderia cepacia, Erwinia, in particular Erwinia ｒｏ carotovora, Escherichia, in particular Escherichia coli, Rhizobium, especially Rhizobium ｍｉｎ leguminosarium, and Vibrio visibrio, especially in the genus Vibrio It can be suitably used in screening for substances to be used. Furthermore, when screening for an efflux pump inhibitor against Pseudomonas aeruginosa, it is preferable to use strains such as PAO1, N135, nalB, nfxB, and nfxC.
Alternatively, a bacterium into which an efflux pump gene has been introduced by genetic recombination may be used.
[0022]
In the present invention, “efflux pump” means a set of proteins that exports substrate molecules in an energy-dependent manner from the cytoplasm or peripheral cytoplasm of a cell. Thus, efflux pumps are typically located in the cell's cell membrane. In Gram-negative bacteria, the efflux pump can span the peripheral cavity, and there can also be a portion of the efflux pump that spans the outer membrane.
[0023]
The efflux pumps present in Pseudomonas aeruginosa include those that are part of the efflux pump overexpressed by Pseudomonas aeruginosa MexA-MexB-OprM or Pseudomonas aeruginosa strain K385 or efflux pump overexpressed by Pseudomonas aeruginosa strain PAO4098E. Polypeptides having at least 30% amino acid sequence similarity to the peptide are included.
[0024]
The MexA-MexB-OprM efflux pump is a membrane protein of the RND family that is constitutively expressed in the Pseudomonas aeruginosa wild type strain (Pseudomonas aeruginosa PAO1). MexA is a peripheral protein anchoring to the inner membrane, MexB is an inner membrane protein that has penetrated the inner membrane 12 times, and OprM is a channel protein present in the outer membrane. These three subunits constitute the MexA-MexB-OprM discharge pump. As a substrate for this efflux pump, various antibiotics, for example, β-lactam agent, quinolone agent, chloramphenicol, etc., an organic solvent, 3oxoC-12HSL which is one of auto-inducers, are known. It is also known that this efflux pump is deeply involved in the resistance to antibiotics and organic solvents, and the production of secondary metabolites (toxins, proteases, pigments, etc.) of Pseudomonas aeruginosa. For the MexA-MexB-OprM efflux pump and its base sequence, see Poole, K. Et al., {Mol. {Microbiol. $ 10 (3), $ 529-544, $ 1993 and Poole, $ K. J. et al. {Bacteriol. No. 175 (22), No. 7363-7372, No. 1993 and the like.
[0025]
Other efflux pumps include proteins belonging to the RND family, MFS family, SMR family, ABC family, MATE family. Specifically, as those belonging to the RND family, Pexobacterium aeruginosa MexE-MexF-OprN efflux pump (Kohler, T. et al., Mol. Microbiol. 23, 345-354, 1997), MexX-MexY efflux pump ( M. T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43, 415-417, 1999), MexC-MexD-OprJ discharge pump (Poole, K. et al., Mol. Microbiol. 21 (4), 713-724, 1996). As members belonging to the MFS family, E. coli MdfA efflux pumps (Edgar R. et al., J. Bacterial. 179, 2274-2280, 1997) and those belonging to the MATE family As a member of the ABC family, Escherichia coli HlyBD (Dinh T. et al., J. Bacteriol. 176, 3825) belongs to the ABC family, and Escherichia coli YdhE (Morita Y. et al., Antimicrob. -3831, @ 1994).
[0026]
In the present invention, the term “efflux pump inhibitor” means a substance that inhibits expression of an efflux pump, preferably a substance that inhibits the mechanism by which acylated homoserine lactones promote expression of an efflux pump. In Pseudomonas aeruginosa, it is considered that N-dodecanoyl-L-homoserine lactone binds to the LasR protein and N-butyryl-L-homoserine lactone binds to RhIR to regulate downstream genes. Then, it is considered that the complex of RhIR and the acylated homoserine lactone expresses an efflux pump. This complex can directly promote the transcription of the efflux pump, change the expression level of the efflux pump regulatory gene to promote the expression of the efflux pump gene, or promote the qualitative change of the efflux pump regulatory gene to thereby increase the efflux pump. It is thought to promote gene expression. The efflux pump inhibitor of the present invention, for example, by degrading acylated homoserine lactones, by inhibiting the binding of acylated homoserine lactones and their regulatory proteins, or acylated homoserine lactones and their regulatory proteins It is thought that the expression of the efflux pump is inhibited by inhibiting the binding to the protein recognized by the complex with the protein. In the present invention, substances that inhibit the expression of efflux pumps having a wide substrate range, including antimicrobial agents, are preferred.
[0027]
Samples that can contain a test substance to be screened by the present invention include, but are not particularly limited to, animal (including microorganisms such as mold and radionuclides) and plant extracts, and artificially synthesized products.
[0028]
In the present invention, as a method for detecting the expression of a gene encoding an efflux pump in bacteria, when the bacteria are cultured together with the test substance in the presence of an acylated homoserine lactone represented by the formula I, There is no particular limitation as long as it can detect whether or not the expression of the efflux pump gene is changed by its presence, and a person skilled in the art can appropriately select it. Examples of such a method include, but are not particularly limited to, gene targeting (introduction of a reporter gene using homologous recombination), monitoring of changes in sensitivity to various antibiotics that are substrates of an efflux pump, and efflux by an efflux pump. Change in the color of the test bacterium due to the discharge of the fluorescent substance or the staining substance, and measurement of the transcription amount of the efflux pump gene by RT-PCR.
[0029]
In one embodiment of the invention, gene targeting is used to detect efflux pump expression. That is, in this embodiment, first, the reporter gene is introduced into the bacterial chromosome by replacing all or part of the gene encoding the efflux pump with the reporter gene using homologous recombination. Next, in the presence of an acylated homoserine lactone represented by the formula I, a bacterium subjected to homologous recombination is cultured together with a test substance, and the expression of the reporter gene is measured to screen for an efflux pump inhibitor. I do.
[0030]
Hereinafter, one embodiment of the screening method of the present invention using gene targeting will be described.
[0031]
The reporter gene is introduced downstream of the promoter of the efflux pump gene by homologous recombination. A targeting vector used in gene targeting by homologous recombination is a DNA sequence homologous to a chromosomal DNA sequence upstream of a target DNA sequence in endogenous chromosomal DNA, and a DNA sequence homologous to a chromosomal DNA sequence downstream of the target DNA sequence. At each end, and has a basic structure including a foreign gene such as a reporter gene and a marker gene between the two homologous DNA sequences. In order to cause homologous recombination between a foreign gene and endogenous chromosomal DNA, each of the two homologous regions of the reporter gene requires a base length of at least about 0.5 Kb. Therefore, creation of a homologous region in a targeting vector is generally performed by the following operation steps (1) to (5).
[0032]
(1) A probe having a base length of at least about 200 bp or more that hybridizes to a DNA containing the target DNA sequence based on a partial base sequence of the target DNA sequence is prepared, the probe is radioactively labeled, and used for plaque hybridization. Prepare a labeled probe.
(2) Plaque hybridization using the λ phage library of the radiolabeled probe and a commercially available or optionally prepared chromosomal DNA to clone a long chromosomal DNA containing the target DNA sequence. Plaques are identified and obtained (Crunstein, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 72, 3961, 1975).
(3) A chromosomal DNA fragment obtained by digesting the positive clone with a combination of a plurality of appropriate restriction enzymes is subjected to electrophoresis to analyze the gene size of each chromosomal DNA fragment.
(4) In order to obtain genetic information necessary for preparing two chromosomal DNA fragments prepared in the following step (5), a restriction enzyme map of the long-chain chromosomal DNA is created based on the analysis result.
(5) The long chain chromosomal DNA is appropriately transformed based on the restriction enzyme map so that chromosomal DNA fragments each having a gene length of at least about 0.5 Kb located upstream and downstream of the target DNA sequence are obtained. Cleave with restriction enzymes. The two chromosomal DNA fragments obtained here are used as homologous DNA sequences to be arranged at both ends of the targeting DNA for homologous recombination.
[0033]
Alternatively, the homologous region may be a sequence of an upstream region and a downstream region in the target DNA sequence. In this case, first, a target DNA sequence is inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of an appropriate vector. Subsequently, a targeting vector can also be prepared by cleaving the target DNA sequence at an appropriate restriction enzyme site present in the target DNA sequence and inserting a foreign gene such as a reporter gene into the site.
[0034]
The homologous region can also be obtained by using the PCR method. Primers are designed based on a part of the base sequence of the target DNA sequence, PCR is performed using a solution containing the target DNA as a template, the target homologous region is specifically amplified, and it is cloned into an appropriate vector. This makes it possible to obtain a homologous region required for homologous recombination.
[0035]
The targeting vector is designed to include, in addition to the reporter gene and the above homologous DNA sequence, elements for selecting a bacterial strain into which the reporter gene has been introduced by homologous recombination, such as a marker gene and a lethal gene. When the targeting vector is introduced by conjugative transfer, it preferably further contains a region necessary for plasmid propagation, for example, a MOB region.
[0036]
To insert a reporter gene and the above homologous DNA sequence into a vector, first, the purified DNA is cut with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector restriction enzyme site or a multiple cloning site, and ligated to the vector. And the like.
[0037]
The chromosome transfer type vector that can be used to prepare the targeting vector is not particularly limited as long as it can be integrated into the chromosome in the host organism. For example, plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, yeast Artificial chromosome DNA (YAC: yeast @ chromosome). When the targeting vector is introduced by conjugation transfer, it is preferable to use a conjugation transfer vector, for example, pNOT19.
[0038]
The reporter gene is not particularly limited, but includes β-galactosidase gene (lacZ), histidine gene (his3), luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, catechol 2,3 dioxygenase gene (xylE), green fluorescent protein Genes, blue fluorescent protein genes and the like are used. In the present invention, it is preferable to use a catechol 2,3 dioxygenase gene.
[0039]
Examples of the marker gene include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a gentamicin resistance gene and the like.
The lethal gene includes the sacB-sacR gene.
[0040]
The method for introducing the vector into the bacterium is not particularly limited, and examples thereof include a calcium ion method, an electroporation method, and a conjugation transfer method. The host for transfer used for conjugative transfer is not particularly limited as long as it is conjugated to the target bacterium, but Escherichia coli is preferred, and Escherichia coli S17-1 is particularly preferred.
[0041]
Bacterial strains in which a reporter gene has been introduced into the chromosome can be selected using marker genes and lethal genes contained in the introduced targeting vector.
[0042]
The reporter gene-introduced strain obtained as described above is cultured under conditions suitable for the bacterium. The cultured cells are inoculated into a new medium, cultured at 37 ° C. for several hours, and then the acylated homoserine lactone of the present invention is added to the culture solution to a concentration of 20 μM or more, preferably 50 to 1000 μM. . This is because the efflux pump is sufficiently induced with 20 μM or more of acylated homoserine lactones. At that time, a sample solution containing one or several test substances is added simultaneously. Thereafter, the cells are further cultured for 2 to 10 hours, preferably 3 to 5 hours, and after the cells are collected, the expression of the introduced reporter gene is detected by a method suitable for the introduced reporter gene.
[0043]
When the sample solution contains an efflux pump inhibitor, that is, a substance that inhibits the efflux pump expression promoting action of acylated homoserine lactones, the expression of the reporter gene decreases as compared with the case where the sample solution is not added. On the other hand, when the sample solution does not include the efflux pump inhibitor, the expression of the reporter gene does not change compared to when the sample solution is not added. Since the expression of the reporter gene means the expression of the efflux pump gene, the expression of the efflux pump is suppressed when the sample solution contains an inhibitor for acylated homoserine lactones. Will not change. If there is a substance that inhibits the efflux pump expression promoting action of acylated homoserine lactones and inhibits the expression of the efflux pump in bacteria, various substances present in the cells cannot be excreted. Will also have an antibacterial effect on bacteria that have acquired Screening of an efflux pump inhibitor and its inhibitory effect can be evaluated by the above method.
[0044]
The present invention also relates to an efflux pump inhibitor identified by the screening method as described above. Such a substance is not particularly limited, and includes both natural products and synthetic products. The efflux pump inhibitor of the present invention can be used as an antibacterial agent either alone or by using it together with a conventional antibacterial agent. The efflux pump inhibitor of the present invention, when used together with a known antibacterial agent, is advantageous in that the action of the antibacterial agent can be enhanced even for bacteria that have acquired drug resistance due to the expression of an efflux pump. Known antibacterial agents that can be used together with the efflux pump inhibitor of the present invention are not particularly limited, and include, for example, penicillin (penam) antibiotics, cephalosporin (cephem) antibiotics, oxacephem antibiotics, Penem antibiotics, carbapenem antibiotics, monobactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, chloramphenicol antibiotics, tetracycline antibiotics, glycopeptide antibiotics, fosfomycin antibiotics, Examples include lincomycin antibiotics, sulfa drugs, paraaminosalicylic acid preparations, isonicotinic acid hydrazide preparations, and quinolone synthetic antibacterial agents.
[0045]
The present invention also relates to a kit for use in the above-described screening method. The kit includes an acylated homoserine lactone represented by the formula I, a targeting vector containing a reporter gene, and a reagent for evaluating expression of the reporter gene. Examples of the reagent for evaluating the expression of the reporter gene include catechol for evaluating the activity of catechol 2,3 dioxygenase. The kit may also contain a 10 × potassium phosphate solution (500 mM potassium phosphate solution) at pH 7.5 and Escherichia coli containing the xylE gene for control.
[0046]
【Example】
Embodiment 1 FIG. Enhanced efflux pump expression by acylated homoserine lactones
A gene PAO1-Xyl, in which a reporter gene xylE gene was introduced into a mexA-mexB-oprM operon encoding a MexA-MexB-OprM efflux pump, which is an efflux pump for Pseudomonas aeruginosa, was transformed into an LB medium (1% @ tryptone, 0%). The cells were cultured overnight at 37 ° C. in 0.5% yeast extract, 1% NaCl). 20 μl of the culture was inoculated into 4 ml of a new LB medium and cultured for 3 hours. Subsequently, N-butyryl-L-homoserine lactone was added to the culture solution to a final concentration of 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM. Then, after further culturing for 3 hours, the cells were collected. The obtained cells were suspended in a 50 mM potassium phosphate solution having a pH of 7.5, the cells were disrupted by ultrasonication, and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to remove undestructed cells and cell residues, thereby obtaining crude cells. Prepare enzyme solution. The crude enzyme solution was appropriately diluted with a 50 mM potassium phosphate solution, 10 μl of a 100 mM catechol solution was added to 990 μl, and the increase in absorbance at 375 nm due to the decomposition of catechol was measured to determine the catechol 2,3 dioxygenase activity. It was measured. As a result, until the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone becomes 25 μM, the activity of xylE gene product, catechol 2,3 dioxygenase, increases depending on the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone. At higher concentrations, it remained at a constant high activity value. The results are shown in FIG.
[0047]
Example 2 　 Screening of efflux pump inhibitors
Example 1 revealed that the expression of the MexA-MexB-OprM efflux pump was induced by N-butyryl-L-homoserine lactone. Therefore, it becomes possible to search for an inhibitor using the expression of the efflux pump as an index, or to evaluate the inhibitor.
[0048]
Creating reporter transgenic strains
To detect expression of the MexA-MexB-OprM efflux pump, the xylE gene encoding catechol 2,3 dioxygenase was introduced into the chromosome mexA-mexB-oprM gene of Pseudomonas aeruginosa.
[0049]
That is, the mexA-mexB-oprM efflux pump gene derived from the chromosome of Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain was cloned into the E. coli vector pNOT19. A reporter gene cassette xylE containing a kanamycin resistance gene was introduced into mexA-mexB-oprM of this vector to construct a pMex :: Xyl-MOB vector. This pMex :: Xyl-MOB vector was introduced into Escherichia coli S17-1 which is a strain for conjugative transfer of Escherichia coli, to prepare Escherichia coli S17-1 (pMex :: Xyl-MOB).
[0050]
Next, Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain and Escherichia coli S17-1 (pMex :: Xyl-MOB) were cultured overnight in an LB medium at 37 ° C., and 1 ml of the former and 0.5 ml of the latter were mixed, and the mixture was centrifuged at 5000 rpm for 2 minutes. The cells were harvested with care, the supernatant was discarded, and the cells were suspended in fresh 0.1 ml of LB medium. Thereafter, the suspension was allowed to stand on a nitrocellulose membrane placed on an LB agar medium, cultured again at 37 ° C. for 3 hours, and cells on the membrane were collected with 1 ml of a VBMM liquid medium having the following composition. After coating on a VBMM agar medium containing 100 to 150 mg / L kanamycin or sulbenicillin, the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days.
[0051]
Composition of VBMM medium (per liter)
MgSO₄・ 7H₂O 0.2g
Trisodium citrate 2H₂O 2g
K₂HPO₄$ 10g
NaNH₄HPO₄・ 4H₂O 3.5g
[0052]
The colony growing on the agar medium was cultured overnight at 37 ° C. in the LB medium, applied to an LB agar medium containing 10% sucrose, and the growing colony was used as a PAO1-Xyl candidate strain. Using a hybridization method, it was confirmed that the xylE gene had been introduced into the chromosome mexA-mexB-oprM efflux pump gene, and this was selected as a reporter gene-introduced strain (PAO1-Xyl strain).
[0053]
Culture of reporter transgenic strain
The reporter gene-introduced strain (PAO1-Xyl strain) obtained as described above is cultured in an LB medium (1% {tryptone, 0.5%} yeast extract, 1% NaCl) at 37 ° C for 15 hours. The cells are inoculated into a 1/200 volume of a new LB medium and cultured for 3 hours. Thereafter, N-butyryl-L-homoserine lactone is added to the culture solution to a concentration of about 50 μM. At this time, a sample solution A containing one or more substances is added simultaneously. After further culturing for 3 hours, the cells are collected.
[0054]
Measurement of catechol 2,3 dioxygenase activity
The cells cultivated as described above are suspended in a 50 mM potassium phosphate solution at pH 7.5, the cells are crushed by ultrasonic waves, and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to remove unbroken cells and cell residues. Remove and prepare a crude enzyme solution. The crude enzyme solution was appropriately diluted with a 50 mM potassium phosphate solution, 10 μl of a 100 mM catechol solution was added to 990 μl, and the increase in absorbance at 375 nm due to the decomposition of catechol was measured to determine the catechol 2,3 dioxygenase activity. Measure.
[0055]
【The invention's effect】
By the screening method of the present invention, a substance that inhibits the expression of a bacterial efflux pump can be screened. Also, if the identified efflux pump inhibitor is used simultaneously with a conventional antibacterial agent, the effect of the antibacterial agent can be increased several times to several tens times, so that the effect of the antibacterial agent on bacteria having drug resistance can be enhanced. At the same time, side effects due to the antibacterial agent can be reduced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the concentration of N-butyryl-L-homoserine lactone and the concentration of catechol 2,3 di when a reporter gene-introduced strain (PAO1-Xyl strain) and N-butyryl-L-homoserine lactone in Example 1 were cultured. It is a graph showing the relationship of oxygenase activity.
FIG. 2 is a diagram showing a method for producing a targeting vector (pMex :: Xyl-MOB) in Example 2.

Claims (6)

Formula I:

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 2 to 14 carbon atoms]
A method for screening for an efflux pump inhibitor by culturing a bacterium together with a test substance in the presence of a compound represented by the formula: and detecting the expression of a gene encoding an efflux pump in the bacterium. Replacing part or all of the gene encoding the efflux pump in the bacterial chromosome with a reporter gene by homologous recombination, formula I:

[Wherein, R is as defined above]
A method for screening for an efflux pump inhibitor by culturing a bacterium that has undergone homologous recombination with a test substance in the presence of the compound represented by formula (I) and measuring the expression of the reporter gene. The method according to claim 1 or 2, wherein the bacterium is Pseudomonas aeruginosa. An efflux pump inhibitor identified by the screening method according to claim 1. An efflux pump inhibitor identified by the screening method according to claim 1. A kit comprising the following components for use in the screening method according to claim 1.
a) Formula I:

[Wherein, R is as defined above]
A compound represented by
b) a targeting vector containing a reporter gene,
c) Reagent for evaluating reporter gene expression

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