【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成されたタンパク質を用いてタンパク質間相互作用を検出する方法に関し、より詳細には、無細胞タンパク合成されたシグナル伝達系タンパク質を用いるタンパク質間相互作用解析およびその応用に関する。また、無細胞タンパク質合成法を用いて得られた、修飾の度合いの低いタンパク質および他のタンパク質により活性化されたタンパク質にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は外界からの刺激に対し、増殖、分化、形態変化、細胞死等の応答を示す。外界からの刺激は、主にストレス刺激、細胞増殖因子、細胞分化因子などがあるが、これらの刺激を情報として伝達し、細胞応答へ結びつけるのが、細胞内シグナル伝達機構である。シグナル伝達機構が正常に機能することにより、細胞の増殖や分化は、極めて厳密な制御の下に置かれているが、この機構がひとたび破壊されると、細胞は制御されることなく成長分裂することとなる。そのような細胞は無限に増殖を続け、ときに腫瘍を形成するに至る。このようなことから、シグナル伝達機構の研究は、腫瘍形成のメカニズムを解明するのに必要不可欠であるとされてきた。
【０００３】
細胞内でこれらのシグナルを伝達する手段としては、タンパク質のアセチル化や、サイクリックＡＭＰ等の二次メッセンジャーによる機構、また、そのなかでも特に主要なシステムとして、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化による機構があげられる。細胞は、ある一つの刺激に対して、いくつもの伝達機構を活性化させる。そのシグナル伝達経路は、ときに枝分かれし、あるいは合流し、ときにはある特定の因子が、一見関係のみられない複数の経路の情報伝達に関わっていたりと、極めて複雑な様相を呈している。そのため、この分野は古くから研究がなされ、非常に多くの知見が得られているにもかかわらず、未だ不明な点が数多く残されている。
【０００４】
シグナル伝達に関与するタンパク質は、それぞれ単独あるいは複数の特定の因子と相互作用することにより、情報の伝達を行っている。一例を挙げると、タンパク質リン酸化酵素の一種であるＭＡＰキナーゼは、別のタンパク質リン酸化酵素ＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受ける。ＭＡＰキナーゼはＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受けて初めて活性化し、ＭＡＰキナーゼの標的タンパク質であるＭＡＰＫＡＰＫ（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化して活性化させたり、あるいは転写因子をリン酸化して活性化させ、その転写因子が関わる遺伝子の発現制御を行ったりしている。ＭＡＰキナーゼをリン酸化する責任タンパク質、あるいはＭＡＰキナーゼがリン酸化する標的タンパク質の特異性は厳密であり、ＭＡＰキナーゼは他種のタンパク質リン酸化酵素による制御を受けることはなく、またあるいはＭＡＰキナーゼ自身が特定の標的タンパク質以外をリン酸化して活性を制御することもない。
【０００５】
ＭＡＰキナーゼを活性化する経路を上流にたどると、さらにＭＡＰキナーゼキナーゼをリン酸化して活性を制御する、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼが存在している。ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼもまた、上流の因子により制御を受けている存在であり、その活性化にはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼと呼ばれるタンパク質や、低分子量Ｇタンパク質と呼ばれるタンパク質が関与していると言われているが、その機構は未だ完全には解明されていない。
【０００６】
ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼの活性化に関わっているタンパク質の一種として、プロテインキナーゼＣが挙げられているが、このプロテインキナーゼＣは元々別の研究によりその存在が明らかになったタンパク質であり、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼとの関連は後の研究により判明したものである。ＭＡＰキナーゼも、プロテインキナーゼＣも、シグナル伝達の分野では比較的古くから知られていたものではあるが、このように、個々の分子がどのような経路でお互いに関与しているのかについては、未解明な点が多い。
【０００７】
シグナル伝達に関わるタンパク質は、現在までにその機能がある程度判明しているとされるものに限定しても、その数は膨大なものにのぼっている。それぞれのタンパク質のシグナル伝達経路における関連性を探索する研究が、これまでにも数多く行われてきた。しかしながら、未解明な伝達経路が多いばかりか、シグナル伝達系に関与するとされる新規な因子が、現在もなお続々と同定されており、それらの関連性の全貌を明らかにする容易ではなく、今後も多大なる労力が必要とされると推測される。
【０００８】
シグナル伝達系のタンパク質の研究には、そのタンパク質が発現している生体組織から抽出精製、あるいは大腸菌や動物細胞等の他の宿主に遺伝子を導入してタンパク質を大量合成し、それを抽出精製して試験管内でその特性を検討するといった方法が用いられてきた。しかしながら、タンパク質の抽出、精製には、時間、労力ともに多大に費やされ、当然ながら検討できるタンパク質の数も限定されてしまう。
【０００９】
また、大腸菌を用いたタンパク質合成法の一般的な特徴として、タンパク合成時に凝集しやすいタンパク質は、インクルージョンボディを形成して不溶化してしまい、タンパク質としての活性を失ってしまうことや、宿主細胞に対して毒性を示すようなタンパク質は合成が困難であったことなどの欠点があった。
【００１０】
さらに、シグナル伝達系のタンパク質を合成するに際しては、特に発現しようとするタンパク質の由来する生物種と同一または近縁の細胞を用いる場合においては、宿主細胞に固有に発現している他のシグナル伝達系タンパク質による望ましくない影響、例えばリン酸化や脂肪酸付加などの影響が不可避であり、合成されたタンパク質を、いわゆるインタクトな状態で回収するには、信頼性が低いと言わざるを得ない状況であった。またこれは、生体組織から目的タンパク質を単離精製する場合にも同じことが言える。
【００１１】
また、目的の遺伝子をその由来する細胞において過剰発現させ、その表現型を観察することによって目的遺伝子の機能を解析するといった方法が一般に用いられている。ただ、この方法では、そのタンパク質の関与の効果がシグナル伝達経路の末端に影響が現れることが多いため、そのタンパク質自体が他のタンパク質と直接的にどのように相互作用するかを解析する目的には不向きであるといえる。その上、過剰発現することによって、生体内では本来起こり得ないような影響が現れることも多々あり、本来の機能を解析するのに支障をきたすこともある。
【００１２】
逆に、目的遺伝子を欠失させる遺伝子ノックアウト法と呼ばれる方法もあり、細胞レベルではなく、実際にその遺伝子型を持つ個体を生育させて表現形を観察するといった方法をとるが、過剰発現法と同じような問題点があった。
【００１３】
更に、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムも近年盛んに使用される相互作用の解析方法である。ただ、この方法にも様々な制限があり、相互作用が測定できない場合や、偽陽性が生じやすいなどの問題点が多くあった。
【００１４】
前述のような細胞の系を用いたタンパク質の合成法の欠点を克服する方法として、近年、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成法が注目を浴びるようになってきた。現在、無細胞タンパク質合成系は、生体細胞からの抽出液を用いたものが主流であり、その中でも、大腸菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球に由来するものが特に広く用いられている。特に大腸菌に由来する系は、原料の供給が比較的容易であることもあり、他の二つの系と比較してもより一般的に用いられている。しかしながら、大腸菌は原核細胞であり、真核細胞由来のタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を合成しようとした場合、合成システムがうまく適合せずに合成に失敗する例が数多く見られる。特に、シグナル伝達に関与するタンパク質の合成は、経験則的に大腸菌由来の無細胞系では合成が困難であるとされてきた。
【００１５】
一方、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系と比較して、コムギ由来のタンパク質合成系は、コムギが真核生物であることから、ヒトのタンパク質合成により適しているとされている。また、ウサギ網状赤血球と比較しても、材料が遥かに容易に供給されることもあり、無細胞タンパク合成系の中でも特に期待が持たれていた。しかしながらこれまで、内在性のタンパク質合成阻害物質の混入により、その合成効率は芳しいものではなかった。最近、”トリチン”と呼ばれるＲＮＡグリコシダーゼがタンパク質の合成を阻害していることが明らかになり、また、この”トリチン”はコムギ種子の胚乳成分に大量に局在していることが分かった。そこで、コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系における効率を上昇させる手段として、胚芽より胚乳成分を洗浄によってほぼ完全に除去することにより、タンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されている（Ｍａｄｉｎ Ｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
上に述べたような理由から、シグナル伝達に係わるタンパク質を中心として、簡便かつ再現性の良い、相互作用パートナーをスクリーニングする方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は簡便かつ再現性のよいタンパク質相互作用解析法、スクリーニング法を提供することである。また、不純物が少なく、状態の変化、特に活性の変化の測定を容易にかつ正確に行うことができるタンパク質間相互作用検出用タンパク質を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、二種以上のシグナル伝達系タンパク質を無細胞タンパク質合成系により同時または別個に合成して相互に反応させることにより、該タンパク質のうち一方の活性により該タンパク質のうちの他方を活性化または不活性化させ、活性化または不活性化された該タンパク質の活性を測定することにより、各タンパク質間の相互作用の有無を判定する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち本発明は以下の項目よりなる。
（１）無細胞タンパク質合成を用いて一種以上のレポータータンパク質を得し、該タンパク質を用いて他の候補タンパク質とのタンパク質間相互作用を検出することを特徴とするタンパク質間相互作用の検出方法。
【００１９】
（２）一種以上のレポータータンパク質と該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補タンパク質を無細胞タンパク質合成により同時または別個に合成、反応させ、該レポータータンパク質の状態の変化を測定することにより、該レポータータンパク質と相互作用する候補タンパク質をスクリーニングする方法。
【００２０】
（３）レポータータンパク質が酵素またはレセプターであることを特徴とする（２）に記載の方法。
【００２１】
（４） レポータータンパク質がシグナル伝達に関与するタンパク質であることを特徴とする（２）または（３）に記載の方法。
【００２２】
（５） 無細胞タンパク質合成が、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液および、網状赤血球抽出液の少なくとも１つを用いることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（６） 活性型もしくは不活性型のタンパク質と、該タンパク質と相互作用するタンパク質を無細胞タンパク質合成方法にて同時または別個に合成、反応させ、不活性化もしくは活性化された該タンパク質を取得する方法。
【００２４】
（７）活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質が変異導入により活性化されたタンパク質であることを特徴とする（６）に記載の方法。
【００２５】
（８）無細胞タンパク質合成を用いて合成されたタンパク質間相互作用検出用タンパク質。
【００２６】
（９）活性型もしくは不活性型のタンパク質と、該タンパク質と相互作用するタンパク質を無細胞タンパク質合成方法にて同時または別個に合成、反応させて得られたことを特徴とする活性化または不活性化されたタンパク質。
【００２７】
（１０）合成されたタンパク質がシグナル伝達系タンパク質であることを特徴とする（９）に記載のタンパク質。
【００２８】
（１１）シグナル伝達系タンパク質が、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、レセプターおよび、転写因子であることを特徴とする（１０）に記載のタンパク質。
【００２９】
【発明の実施の形態】
ます、本発明は、無細胞タンパク質合成を用いて一種以上のタンパク質（レポータータンパク質）取得し、該タンパク質を用いて他のタンパク質（候補タンパク質）とのタンパク質間相互作用を検出することを特徴とするタンパク質間相互作用の検出方法である。ここで、レポータータンパク質とは候補タンパク質によって相互作用を受けるタンパク質を意味し、また、候補タンパク質とはレポータータンパク質に対して相互作用を与えることを期待するタンパク質を意味する。
【００３０】
本発明におけるレポータータンパク質としては特に限定されないが、何らかの形で状態の変化が測定可能であるものが好ましい。
ここで言う状態の変化とは、会合し、結合による複合体形成、タンパク質の立体構造の変化等の物理学的変化、タンパク質分子の修飾、脱修飾等の化学的変化、活性の変化等の他の物質との相互作用の度合いの変化などが挙げられる。
これら状態の変化を測定することにより、レポータータンパク質と他のタンパク質との相互作用の有無を検出する。
【００３１】
本発明でいう相互作用とは、上記のようにレポータータンパク質が他のタンパク質から何らかの形で状態の変化を受けることを言う。
相互作用の検出は、簡便性の面からタンパク質としての活性の変化により検出することが好ましい。
【００３２】
上記のことから、レポータータンパク質としては、測定の簡便さから、活性測定可能なタンパク質が好ましく、具体的には酵素もしくはレセプターが好ましい。酵素としては特に限定されないが、プロテインキナーゼやプロテインホスファターゼなどのシグナル伝達系酵素、プロテアーゼなどを挙げることが出来る。また、レセプターとしては、相互作用によって、酵素活性の増減がみられるものが好ましく用いられる。例えば、ＡＴＰａｓｅ活性を有するレセプターなどが好ましい。
【００３３】
また、本発明では、レポータータンパク質、候補タンパク質の少なくとも一方、特には両方を無細胞タンパク合成系で取得することが好ましい。
本発明における無細胞タンパク質合成系とは、細胞を用いずに核酸類内に含まれる情報を元にタンパク質やポリペプチドを合成する技術を言い、具体的にはｍＲＮＡを添加してタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞翻訳系、あるいはＤＮＡからの情報を元にしてｍＲＮＡを合成し、さらにタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞転写翻訳共役系のいずれでもよい。
【００３４】
さらに、本発明における無細胞タンパク質合成系においては、コムギ胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、網状赤血球抽出液が好適に使用される。
【００３５】
更に好ましくはコムギ胚芽抽出液が使用される。最近、タンパク質合成阻害物質を除去することによりタンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されており（Ｍａｄｉｎ Ｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４）、その原理を用いた製品が販売されていることから（ＰＲＯＴＥＩＯＳ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製）、それを用いることが好ましいといえる。
【００３６】
無細胞タンパク質合成方法を用いてタンパク質を合成する方法としては公知の方法をそのまま用いることができ、市販キットを用いる場合にはその説明書に従って合成することができる。
【００３７】
無細胞タンパク質合成方法により得られたレポータータンパク質や候補タンパク質などのタンパク質間相互作用検出用タンパク質は、他のタンパク質や物質との相互作用を受けておらず、修飾がされていないか修飾のレベルが低い。ここで言う修飾のレベルが低いとは、修飾されたタンパク質の分子数の割合が、修飾されていないものに比べて圧倒的に少なく、活性の変化等が検出できないか、あるいは無視できるほど小さいことを言う。
【００３８】
すなわち、無細胞タンパク質合成により得られたタンパク質は他のタンパク質の活性による活性化または不活性化されおらず、他のタンパク質との相互作用を調べるうえで非常に好ましい。
また、無細胞タンパク質合成により得られたタンパク質は不純物が少ないため、その状態の変化、特に活性の変化の測定を容易にかつ正確に行うことができる。
なお、無細胞タンパク質合成により得られたタンパク質間相互作用検出用タンパク質はタンパク質シグナル伝達系タンパク質であることが好ましい。
【００３９】
ここでいうシグナル伝達系タンパク質とは、細胞内シグナル伝達経路に関与する一連のタンパク質の総称またはその一部を指す。具体的には、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、レセプター、転写因子などが好ましく、さらに具体的には、プロテインキナーゼとしては、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、非受容体型チロシンキナーゼなど、プロテインフォスファターゼとして、カルシニューリン、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼなど、レセプターとして、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターなど、転写因子として、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎなどを用いることができる。
【００４０】
また、本発明では、これらのレセプタータンパク質の活性変化を測定することにより、容易に候補タンパク質をスクリーニングすることができる。
【００４１】
一方で、本発明でいう候補タンパク質としては、特に限定されず、レポータータンパク質に相互作用すると思われるタンパク質全般を含む。スクリーニングの際には、候補タンパク質を単独であっても良いし、複数の候補タンパク質を同時に作用させても良く、さらには候補タンパク質が含まれるであろうライブラリーなどのようなものでも良い。
【００４２】
また、具体的にスクリーニングする方法としては、ライブラリーをいくつかのグループに分け、レポータータンパク質と個々のグループのタンパク質を共発現させ、それぞれグループ毎にレポータータンパク質の活性を測定し、まずどのグループに目的の候補タンパク質が含まれるかを推定し、更にグループを分割して解析して行く方法が挙げられる。また、タンパク質の発現は、レポータータンパク質と候補タンパク質は分けて行い、合成後に混合して状態の変化を調べても良い。
【００４３】
後述する実施例では、ＭＡＰキナーゼをレポータータンパク質として、候補タンパク質としてＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体（Ｂｒｕｎｅｔ Ａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９， ３３７９−３３８７）を用いて行ったが、ＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体が候補タンパク質のグループのうち約１／１００存在するだけでも、レポータータンパク質（ＭＡＰキナーゼ）の活性化を測定することが可能であったことから、本発明はスクリーニングに非常に有効であることが示された。
【００４４】
また、本発明は、活性型もしくは不活性型のタンパク質と該タンパク質と相互作用するタンパク質を無細胞タンパク質合成方法を用いて同時または別個に合成し、相互に反応させることにより、不活性化または活性化されたタンパク質を取得する方法を提供する。
【００４５】
ここで言う、活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質とは、活性型もしくは不活性化のタンパク質と相互作用し、活性状態のタンパク質であれば不活性化させ、不活性状態のタンパク質であれば活性化させるタンパク質である。
【００４６】
活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質としては、野生型タンパク質を用いても良いが、そのタンパク質自身も活性化が必要な場合があり、必要に応じて変異を導入して、活性化して用いることができる。変異としては、点突然変異、欠失などを挙げることができる。実際本発明の有意性を示す実施例には、プロテインキナーゼの一種であるＭＥＫ１に、２箇所のアミノ酸置換と１箇所の欠失を導入することにより、ＭＥＫ１を他のタンパク質からの制御を受けない構成的活性型変異体を作成し、これを用いてプロテインキナーゼの一種であるＥＲＫ２の活性化を示した。 ＥＲＫ２は変異型のＭＥＫ１により活性化され、本発明の有意性が示された。
【００４７】
また、本発明は、上記方法に従って合成された活性化または不活性化されたタンパク質である。タンパク質としてはシグナル伝達系タンパク質が好ましい。
この方法を用いることにより、従来法では非常に煩雑であった活性化もしくは不活性化タンパク質の調整を非常に短時間で終わらせることができ、また、不純物が少なく、解析に用いるのに適したタンパク質を容易に得ることができる。
従って、このタンパク質を用いることにより、タンパク質の活性、不活性状態での構造変化、修飾変化などの解析を行うことも容易となる。
【００４８】
以下、本発明におけるタンパク質相互作用のスクリーニング法について詳細に説明する。
本発明に使用される無細胞抽出液は、通常のいかなる組成のものを用いてもよい。しかし、タンパク合成効率や、取扱の簡便さを考慮すると、コムギ胚芽由来抽出液を用いるのが望ましい。無細胞タンパク質合成反応液には、無細胞抽出液のほか、目的のタンパク質をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、緩衝液、ＡＴＰまたはＧＴＰなどのエネルギー源、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ等のＡＴＰ再生系、安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を適量加える。反応温度は、２３−２６℃が適している。
【００４９】
タンパク質合成の鋳型となるｍＲＮＡは、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により提供される。本発明に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、通常のいかなる構造の物を用いてもよい。しかし、ｍＲＮＡ転写効率や、取扱の簡便さを考慮すると、市販のＴ７、ＳＰ６等のウィルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望ましい。
【００５０】
本発明に用いられる鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモータ配列と、その下流に目的遺伝子のオープンリーディングフレームが配置される構造を持つ。望ましくは、プロモータとオープンリーディングフレームとの間に翻訳増強配列が含まれるものが良い。また、適当なベクター上に配置されたプラスミドＤＮＡの形態であることが望ましい。本発明におけるＤＮＡの転写は、合成するタンパク質をコードするＤＮＡを全て混合した状態で一反応系で行ってもよいし、、もちろん、各タンパク質をコードする遺伝子から別個にＲＮＡを合成し、合成後に任意の割合で各ＲＮＡを混合しても良い。
【００５１】
本発明に用いられる候補タンパク質の遺伝子は、レポータータンパク質に対して相互作用する可能性が示唆される既知タンパク質の遺伝子もしくは構造的に作用を及ぼす可能性が高い機能的に未知なタンパク質の遺伝子を任意に選択したものであってもよいし、ランダムもしくは網羅的にあらゆる遺伝子を包含したものであってもよい。
【００５２】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
ヒト由来ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）遺伝子のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＡＰＫ１−Ｆ（配列番号１）とアンチセンスプライマーＭＡＰＫ１−Ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２５サイクルの温度で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、無細胞タンパク質合成キット「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属の専用ベクターｐＥＵ３−ＮＩＩのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングを行い、プラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を構築した。
【００５４】
実施例２
ヒト由来ＭＥＫ１遺伝子の構成的活性型変異体のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、５ステップのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことにより、ＭＥＫ１遺伝子の増幅と構成的活性型変異の導入を同時に行った。
具体的には、ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−Ｆ（配列番号３）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ反応を行った（第一ステップ）。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２０サイクルの温度で反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＲ（配列番号５）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＦ（配列番号６）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第二ステップ）。ＭＥＫ１−ＣＡＦとＭＥＫ１−ＣＡＲには、アミノ酸置換（Ｓｅｒ２１８Ｇｌｕ、Ｓｅｒ２２２Ｇｌｕ）を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第三ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＲ（配列番号７）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＦ（配列番号８）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第四ステップ）。ＭＥＫ１−ＡａＦとＭＥＫ１−ＡａＲには、５２５位のＡａｔ Ｉ切断部位を破壊するサイレント変異を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第五ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を、前述のｐＥＵ３−ＮＩＩベクターのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングし、中間体プラスミドｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＸＥを構築した。このプラスミドを２箇所のＡａｔ Ｉサイトで切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応で再び連結することによって、その間のＤＮＡ断片を欠失させ、ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを構築した。
【００５５】
実施例３
ＥＲＫ２とＭＥＫ１構成的活性型変異体の無細胞タンパク質合成系による合成
上記の２種類のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１およびｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＭＡＰＫ１およびｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来の２種類の精製ｍＲＮＡ等量混合液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００５６】
実施例４
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図１に示す。ＥＲＫ２単独で合成を行った場合と比べ、ＭＥＫ１と同時に合成をおこなったＥＲＫ２は、１０００倍を超える活性の増強が確認された。この結果はＥＲＫ２がＭＥＫ１により活性化されたことを強く示唆しており、この２種類のタンパク質が相互作用する関係にあることが改めて証明されるに至った。この結果は、本発明が、相互の関係が不明確である２種類のタンパク質の相互作用の有無を証明するのに有効な手段であることを示す好例であると考えられ、他の種類のシグナル伝達系タンパク質への応用が可能になると期待される。
【００５７】
実施例５
他のタンパク質共存化におけるＭＥＫ１構成的活性型変異体によるＥＲＫ２活性化上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１と、同じくｐＥＵ３−ＮＩＩベクターにクローニングした無関係の遺伝子９９種類と上記のｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡをそれぞれ等量混合したプラスミド混合液（以下、ライブラリ）を、１：１の割合で混合したものを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成を行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＭＡＰＫ１およびｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来の２種類の精製ｍＲＮＡ等量混合液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００５８】
実施例６
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成系により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図２に示す。ＥＲＫ２とＭＥＫ１を等量で発現させた場合におけるＥＲＫ２の活性を１００とした場合、ライブラリとの等量混合で発現させた場合の活性は、１８となった。ＭＥＫ１の発現量はＥＲＫ２の１／１００前後と推察されるが、等量に発現させた場合には及ばないものの、明らかにＭＥＫ１がＥＲＫ２に作用していることが示された。この結果から、１プールあたり１００クローンからなる遺伝子発現ライブラリを用いて、ＥＲＫ２に相互作用を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。またこの結果を応用して、ある特定のシグナル伝達系タンパク質に影響を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、あるタンパク質の活性を制御するタンパク質のハイスループットなスクリーニングが可能となった。さらに本発明の方法を用いることにより、活性化または不活性化されたタンパク質を効率的かつ簡便に調整できるようになった。従って本発明によれば、目的タンパク質を活性化または不活性化するうようなタンパク質を容易にスクリーニングすることができ、また、活性化または不活性化さらたタンパク質を簡便に調整できる。
【００６０】
【配列表】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＲＫ２タンパク質を、単独あるいはＭＥＫ１構成的活性型変異体と共発現させた場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
縦軸にＥＲＫ２の活性（基質ペプチドへの３２Ｐの付加活性）を、横軸にサンプルの希釈率を示す。（単独）：ＥＲＫ２遺伝子ｍＲＮＡを単独発現、（共発現）：ＥＲＫ２遺伝子ｍＲＮＡとＭＥＫ１構成的活性型変異体遺伝子ｍＲＮＡとを等量発現、（コントロール）：ｍＲＮＡを添加せずに合成。
【図２】ＭＥＫ１構成的活性型変異体遺伝子を含むライブラリをＥＲＫ２と共発現させた場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
横軸にＥＲＫ２の相対活性を示す。ＥＲＫ２とＭＥＫ１−ＣＡを共発現させた場合（ＭＥＫ１−ＣＡ）のＥＲＫ２の活性値を１００とし、ＥＲＫ２とライブラリを共発現させた場合（ライブラリ）、ＥＲＫ２単独で発現させた場合（コントロール）の相対値を示す。[0001]
[Technical field to which industry belongs]
The present invention relates to a method for detecting a protein-protein interaction using a cell-free protein-synthesized protein, and more particularly to a protein-protein interaction analysis using a cell-free protein-synthesized signal transduction protein and its application. . The present invention also relates to a protein with a low degree of modification and a protein activated by another protein, which is obtained by using a cell-free protein synthesis method.
[0002]
[Prior art]
Cells respond to external stimuli such as proliferation, differentiation, morphological changes, and cell death. Stimuli from the outside world mainly include stress stimuli, cell growth factors, cell differentiation factors, and the like. The intracellular signal transduction mechanism transmits these stimuli as information and links them to cell responses. Proper functioning of the signaling mechanism places cell proliferation and differentiation under very strict control, but once this mechanism is disrupted, cells grow and divide without control. It will be. Such cells continue to grow indefinitely, sometimes leading to tumor formation. For this reason, it has been considered that studying the signal transduction mechanism is indispensable for elucidating the mechanism of tumor formation.
[0003]
Means for transmitting these signals in the cell include acetylation of proteins and mechanisms by second messengers such as cyclic AMP, and among them, as a particularly major system, by phosphorylation / dephosphorylation of proteins. Mechanism. Cells activate several transmission mechanisms in response to one stimulus. The signaling pathways have a very complex appearance, sometimes branching or merging, and sometimes certain factors are involved in the signaling of multiple seemingly unrelated pathways. For this reason, although this field has been studied for a long time and has obtained a great deal of knowledge, there are still many unknown points.
[0004]
Proteins involved in signal transduction transmit information by interacting with one or more specific factors. For example, MAP kinase, which is a kind of protein kinase, is phosphorylated by another protein kinase, MAP kinase kinase. MAP kinase is activated only after phosphorylation by MAP kinase kinase, and activates by phosphorylating MAPKAPK (MAP kinase activated protein kinase), which is the target protein of MAP kinase, or phosphorylating transcription factors. And regulates the expression of genes related to the transcription factor. The specificity of the protein responsible for phosphorylating MAP kinase or the target protein that MAP kinase phosphorylates is strict, and MAP kinase is not regulated by other types of protein kinases, or MAP kinase itself is There is no phosphorylation other than the specific target protein to control the activity.
[0005]
Following the MAP kinase activation pathway upstream, there are MAP kinase kinase kinases that further phosphorylate MAP kinase kinases to regulate activity. MAP kinase kinase kinase is also controlled by upstream factors, and its activation is said to involve a protein called MAP kinase kinase kinase kinase and a protein called low molecular weight G protein. However, its mechanism has not yet been fully elucidated.
[0006]
Protein kinase C is mentioned as one of the proteins involved in the activation of MAP kinase kinase, and protein kinase C is a protein whose existence has been clarified from another study. The association with the kinase was found in later studies. Although both MAP kinase and protein kinase C have been known for a relatively long time in the field of signal transduction, it is not clear how the individual molecules are involved in each other. There are many unclear points.
[0007]
The number of proteins involved in signal transduction is enormous, even if limited to those whose functions are known to some extent. There have been many studies exploring the relevance of each protein in signal transduction pathways. However, not only are there many unclear pathways, but new factors that are thought to be involved in the signal transduction system are still being identified one after another. It is presumed that a great deal of labor is required.
[0008]
Signal transduction proteins are studied by extracting and purifying them from living tissues in which the proteins are expressed, or by introducing genes into other hosts such as Escherichia coli and animal cells, synthesizing large amounts of proteins, and extracting and purifying them. A method of examining the characteristics in a test tube has been used. However, protein extraction and purification require a great deal of time and effort, and naturally limit the number of proteins that can be studied.
[0009]
Also, a general feature of the protein synthesis method using Escherichia coli is that a protein that easily aggregates during protein synthesis forms an inclusion body and becomes insoluble, losing its activity as a protein, On the other hand, proteins that show toxicity have disadvantages such as difficulty in synthesis.
[0010]
Furthermore, when synthesizing a protein of the signal transduction system, particularly when using cells that are the same as or closely related to the species of organism from which the protein to be expressed is derived, other signal transductions that are inherently expressed in the host cell. Undesirable effects of system proteins, such as the effects of phosphorylation and fatty acid addition, are unavoidable, and in order to recover the synthesized protein in a so-called intact state, it must be said that the reliability is low. Was. The same can be said for the case of isolating and purifying the target protein from living tissue.
[0011]
In addition, a method of overexpressing a target gene in a cell derived from the gene and observing its phenotype to analyze the function of the target gene is generally used. However, in this method, the effect of the protein involved often affects the end of the signal transduction pathway, so the purpose of this method is to analyze how the protein itself directly interacts with other proteins. Is unsuitable. In addition, overexpression often causes effects that cannot occur in vivo, which may hinder the analysis of the original functions.
[0012]
Conversely, there is also a method called gene knockout method to delete the target gene, which is not a cell level but a method of actually growing an individual having the genotype and observing the phenotype, but overexpression method and There was a similar problem.
[0013]
Furthermore, the Two-hybrid system is an interaction analysis method that has been actively used in recent years. However, this method has various limitations, and there are many problems such as a case where an interaction cannot be measured and a case where a false positive is easily generated.
[0014]
As a method for overcoming the drawbacks of the protein synthesis method using a cell system as described above, a protein synthesis method using a cell-free protein synthesis system has recently attracted attention. At present, cell-free protein synthesis systems using extracts from living cells are the mainstream, and among them, those derived from Escherichia coli, wheat germ, and rabbit reticulocytes are particularly widely used. In particular, a system derived from Escherichia coli may be relatively easy to supply a raw material, and is more commonly used than the other two systems. However, Escherichia coli is a prokaryotic cell, and when synthesizing a protein derived from a eukaryotic cell, in particular, a protein derived from a human, there are many examples in which synthesis fails due to improper adaptation of the synthesis system. In particular, the synthesis of proteins involved in signal transduction has been empirically determined to be difficult in a cell-free system derived from Escherichia coli.
[0015]
On the other hand, compared to an E. coli-derived cell-free protein synthesis system, a wheat-derived protein synthesis system is considered to be more suitable for human protein synthesis because wheat is a eukaryote. In addition, compared to rabbit reticulocytes, the material can be supplied much more easily, and it has been particularly expected among cell-free protein synthesis systems. However, the synthesis efficiency has not been satisfactory until now due to the contamination of endogenous protein synthesis inhibitors. Recently, it was revealed that an RNA glycosidase called "tritin" inhibits protein synthesis, and that "tritin" was found to be localized in large amounts in the endosperm component of wheat seeds. Therefore, as a means to increase the efficiency in a cell-free protein synthesis system using a wheat germ extract, the protein synthesis efficiency can be dramatically improved by removing the endosperm component from the germ almost completely by washing. (Madin K et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564).
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
For the reasons described above, there has been a demand for a simple and reproducible method for screening interaction partners, mainly for proteins involved in signal transduction. That is, an object of the present invention is to provide a simple and reproducible protein interaction analysis method and screening method. Another object of the present invention is to provide a protein for detecting a protein-protein interaction, which has a small amount of impurities and can easily and accurately measure a change in a state, particularly a change in an activity.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive studies and synthesized two or more signal transduction proteins simultaneously or separately by a cell-free protein synthesis system and reacted with each other, Activate or inactivate the other of the proteins by the activity of one of them, and determine the presence or absence of the interaction between the proteins by measuring the activity of the activated or inactivated protein A method was found, and the present invention was completed.
[0018]
That is, the present invention includes the following items.
(1) A method for detecting protein-protein interaction, comprising obtaining one or more reporter proteins using cell-free protein synthesis, and detecting protein-protein interactions with other candidate proteins using the protein.
[0019]
(2) Simultaneously or separately synthesizing and reacting one or more reporter proteins and one or more candidate proteins expected to interact with the reporter protein by cell-free protein synthesis, and measuring a change in the state of the reporter protein. Screening for candidate proteins that interact with the reporter protein.
[0020]
(3) The method according to (2), wherein the reporter protein is an enzyme or a receptor.
[0021]
(4) The method according to (2) or (3), wherein the reporter protein is a protein involved in signal transduction.
[0022]
(5) The method according to any one of (2) to (4), wherein the cell-free protein synthesis uses at least one of a wheat germ extract, an Escherichia coli extract, and a reticulocyte extract.
[0023]
(6) An active or inactive protein and a protein interacting with the protein are simultaneously or separately synthesized and reacted by a cell-free protein synthesis method to obtain an inactivated or activated protein. Method.
[0024]
(7) The method according to (6), wherein the protein interacting with the active or inactive protein is a protein activated by mutation introduction.
[0025]
(8) A protein for protein-protein interaction detection synthesized using cell-free protein synthesis.
[0026]
(9) Activation or inactivation obtained by simultaneously or separately synthesizing and reacting an active or inactive protein and a protein interacting with the protein by a cell-free protein synthesis method. Protein.
[0027]
(10) The protein according to (9), wherein the synthesized protein is a signal transduction protein.
[0028]
(11) The protein according to (10), wherein the signal transduction system protein is a protein kinase, a protein phosphatase, a receptor, and a transcription factor.
[0029]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
First, the present invention is characterized in that one or more proteins (reporter proteins) are obtained using cell-free protein synthesis, and the protein-protein interaction with another protein (candidate protein) is detected using the proteins. This is a method for detecting protein-protein interaction. Here, the reporter protein means a protein which is interacted by the candidate protein, and the candidate protein means a protein which is expected to give an interaction to the reporter protein.
[0030]
The reporter protein in the present invention is not particularly limited, but is preferably a protein whose change in state can be measured in some form.
The term “state change” as used herein refers to physical changes such as complex formation due to association and binding, changes in the three-dimensional structure of proteins, chemical changes such as modification and demodification of protein molecules, and changes in activity. Change in the degree of interaction with the substance.
By measuring these changes in state, the presence or absence of interaction between the reporter protein and other proteins is detected.
[0031]
The interaction in the present invention means that the reporter protein undergoes some form of state change from other proteins as described above.
The interaction is preferably detected by a change in activity as a protein from the viewpoint of simplicity.
[0032]
From the above, as the reporter protein, a protein whose activity can be measured is preferable from the viewpoint of simplicity of measurement, and specifically, an enzyme or a receptor is preferable. The enzyme is not particularly limited, and examples thereof include signal transduction enzymes such as protein kinase and protein phosphatase, and proteases. As the receptor, those whose enzyme activity is increased or decreased by interaction are preferably used. For example, a receptor having ATPase activity is preferable.
[0033]
In the present invention, it is preferable to obtain at least one of the reporter protein and the candidate protein, particularly, both of them by a cell-free protein synthesis system.
The cell-free protein synthesis system in the present invention refers to a technology for synthesizing a protein or polypeptide based on information contained in nucleic acids without using cells, and specifically, a protein or polypeptide by adding mRNA. A cell-free translation system that synthesizes a chain, or a cell-free transcription-translation coupled system that synthesizes mRNA based on information from DNA and further synthesizes a protein or polypeptide chain may be used.
[0034]
Further, in the cell-free protein synthesis system of the present invention, a wheat germ extract, an E. coli cell extract, and a reticulocyte extract are preferably used.
[0035]
More preferably, a wheat germ extract is used. Recently, it has been reported that the protein synthesis efficiency can be dramatically improved by removing the protein synthesis inhibitor (Madin K et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 97, 559-564), since a product using the principle is sold (PROTEIOS cell-free protein synthesis kit: manufactured by Toyobo), it can be said that it is preferable to use it.
[0036]
As a method for synthesizing a protein using the cell-free protein synthesis method, a known method can be used as it is, and when a commercially available kit is used, the protein can be synthesized according to the instructions.
[0037]
Proteins for protein-protein interaction detection, such as reporter proteins and candidate proteins, obtained by the cell-free protein synthesis method have not been interacted with other proteins or substances, and have not been modified or have a modified level. Low. The term “low modification level” as used herein means that the ratio of the number of molecules of the modified protein is overwhelmingly smaller than that of the unmodified protein, and that a change in the activity cannot be detected or is negligibly small. Say
[0038]
That is, the protein obtained by cell-free protein synthesis is not activated or inactivated by the activity of another protein, and is very preferable for examining the interaction with another protein.
In addition, since the protein obtained by cell-free protein synthesis has few impurities, it is possible to easily and accurately measure the change in the state, particularly the change in the activity.
The protein for detecting protein-protein interaction obtained by cell-free protein synthesis is preferably a protein signal transduction protein.
[0039]
The term "signal transduction protein" as used herein refers to a generic name of a series of proteins involved in intracellular signal transduction pathways or a part thereof. Specifically, protein kinases, protein phosphatases, receptors, transcription factors and the like are preferable. For example, calcineurin, MAP kinase phosphatase and the like, EGF receptor, PDGF receptor and the like as receptors, c-Fos, c-Jun and the like as transcription factors can be used.
[0040]
Further, in the present invention, candidate proteins can be easily screened by measuring the change in activity of these receptor proteins.
[0041]
On the other hand, the candidate protein referred to in the present invention is not particularly limited, and includes all proteins that are considered to interact with the reporter protein. At the time of screening, a candidate protein may be used alone, a plurality of candidate proteins may be simultaneously acted on, or a library or the like which may contain the candidate protein may be used.
[0042]
As a specific screening method, the library is divided into several groups, the reporter protein and each group of proteins are co-expressed, and the activity of the reporter protein is measured for each group. There is a method of estimating whether or not the target candidate protein is contained, further dividing the group, and performing analysis. In addition, the expression of the protein may be performed separately for the reporter protein and the candidate protein, and mixed after synthesis to examine the change in state.
[0043]
In Examples described later, MAP kinase was used as a reporter protein, and a constitutively active mutant of MAP kinase kinase (Brunet A et al. (1994) Oncogene 9, 3379-3387) was used as a candidate protein. The present invention provides a screening method since the activation of a reporter protein (MAP kinase) can be measured even when a constitutively active mutant of kinase kinase is present in only about 1/100 of the group of candidate proteins. Has been shown to be very effective.
[0044]
Further, the present invention provides an inactive or active protein by simultaneously or separately synthesizing an active or inactive protein and a protein interacting with the protein by using a cell-free protein synthesis method and reacting with each other. The present invention provides a method for obtaining a converted protein.
[0045]
As used herein, a protein that interacts with an active or inactive protein refers to a protein that interacts with an active or inactivated protein, inactivates a protein in an active state, and inactivates a protein in an active state. Is a protein to be activated.
[0046]
As a protein that interacts with the active or inactive protein, a wild-type protein may be used.However, the protein itself may need to be activated. It can be used after conversion. Mutations can include point mutations, deletions, and the like. In fact, examples showing the significance of the present invention include that MEK1 is not controlled by other proteins by introducing two amino acid substitutions and one deletion into MEK1 which is a kind of protein kinase. Constitutively active mutants were generated and used to demonstrate the activation of ERK2, a type of protein kinase. ERK2 was activated by mutant MEK1, indicating the significance of the present invention.
[0047]
The present invention also relates to an activated or inactivated protein synthesized according to the above method. As the protein, a signal transduction protein is preferable.
By using this method, the preparation of an activated or inactivated protein, which was very complicated in the conventional method, can be completed in a very short time, and the amount of impurities is small, making it suitable for use in analysis. Protein can be easily obtained.
Therefore, by using this protein, it becomes easy to analyze the activity of the protein, structural change in an inactive state, modification change, and the like.
[0048]
Hereinafter, the screening method for protein interaction in the present invention will be described in detail.
The cell-free extract used in the present invention may be of any ordinary composition. However, in consideration of protein synthesis efficiency and simplicity of handling, it is desirable to use a wheat germ-derived extract. The cell-free protein synthesis reaction solution includes, in addition to a cell-free extract, DNA or RNA encoding a target protein, when using DNA, an RNA polymerase, an amino acid, a buffer, an energy source such as ATP or GTP, creatine phosphorus, ATP regeneration system such as acid, creatine kinase, stabilizer, RNase inhibitor and the like are added in appropriate amounts. The reaction temperature is suitably from 23 to 26 ° C.
[0049]
MRNA serving as a template for protein synthesis is provided by a transcription reaction from DNA with RNA polymerase. The RNA polymerase used in the present invention may have any ordinary structure. However, in consideration of mRNA transcription efficiency and simplicity of handling, commercially available RNA polymerases derived from viruses such as T7 and SP6 are preferable.
[0050]
The template DNA used in the present invention has a structure in which a promoter sequence to which RNA polymerase binds and an open reading frame of a target gene are arranged downstream thereof. Desirably, a translation enhancing sequence is included between the promoter and the open reading frame. It is also desirable that the DNA is in the form of a plasmid DNA arranged on an appropriate vector. The transcription of the DNA in the present invention may be performed in a single reaction system in a state where all the DNAs encoding the proteins to be synthesized are mixed, or, of course, RNA is separately synthesized from the genes encoding the respective proteins, and after the synthesis, Each RNA may be mixed at an arbitrary ratio.
[0051]
The gene of the candidate protein used in the present invention may be a gene of a known protein that is likely to interact with the reporter protein or a gene of a functionally unknown protein that is likely to have a structural effect. May be selected, or may randomly or exhaustively include all genes.
[0052]
【Example】
Examples of the present invention will be described in detail. The present invention is not limited by these examples.
[0053]
Example 1
Cloning of human-derived ERK2 (MAPK1) gene
HeLa cell-derived mRNA was isolated and purified, and cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using this as a template. Reverse Tra Ace (R) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used for the reverse transcription reaction. A PCR reaction was performed using the synthesized cDNA as a template and a sense primer MAPK1-F (SEQ ID NO: 1) and an antisense primer MAPK1-R (SEQ ID NO: 2). For the PCR reaction, KOD-Plus-DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. The reaction was carried out at a temperature of 94 ° C. for 2 minutes, [94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, 68 ° C. for 1 minute] × 25 cycles in a reaction system containing 1 unit of KOD-Plus-DNA polymerase and a final volume of 50 μl. The PCR product was purified and subcloned into the EcoRV site of the dedicated vector pEU3-NII attached to the cell-free protein synthesis kit "PROTEIOS (TM)" to construct a plasmid pEU-MAPK1.
[0054]
Example 2
Cloning of Constitutively Active Mutants of the MEK1 Gene from Human
Amplification of the MEK1 gene and introduction of a constitutively active mutation were simultaneously performed by performing 5-step nested-PCR using cDNA reversely transcribed from HeLa cell-derived mRNA as a template.
Specifically, mRNA derived from HeLa cells was isolated and purified, and cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using the mRNA as a template. Reverse Tra Ace (R) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used for the reverse transcription reaction. A PCR reaction was performed using the synthesized cDNA as a template and a sense primer MEK1-F (SEQ ID NO: 3) and an antisense primer MEK1-R (SEQ ID NO: 4) (first step). For the PCR reaction, KOD-Plus-DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. The reaction was carried out at a temperature of 94 ° C. for 2 minutes, [94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, 68 ° C. for 1 minute] × 20 cycles in a reaction system containing 1 unit of KOD-Plus-DNA polymerase and a final volume of 50 μl. Primers of two combinations of sense primer MEK1-F and antisense primer MEK1-CAR (SEQ ID NO: 5) and sense primer MEK1-CAF (SEQ ID NO: 6) and antisense primer MEK1-R using the amplified PCR product as a template Was used to perform a PCR reaction under the same reaction conditions as described above (second step). MEK1-CAF and MEK1-CAR contain a nucleotide sequence for introducing an amino acid substitution (Ser218Glu, Ser222Glu). A PCR reaction was performed using the two PCR products as templates and using the sense primer MEK1-F and the antisense primer MEK1-R under the same reaction conditions as described above (third step). Primers of two combinations of sense primer MEK1-F and antisense primer MEK1-AaR (SEQ ID NO: 7) and sense primer MEK1-AaF (SEQ ID NO: 8) and antisense primer MEK1-R using the amplified PCR product as a template Was used to perform a PCR reaction under the same reaction conditions as described above (fourth step). MEK1-AaF and MEK1-AaR contain a nucleotide sequence that introduces a silent mutation that disrupts the Aat I cleavage site at position 525. Using the two PCR products as templates, a PCR reaction was performed under the same reaction conditions as above using sense primer MEK1-F and antisense primer MEK1-R (fifth step). The amplified PCR product was subcloned into the EcoRV site of the aforementioned pEU3-NII vector to construct an intermediate plasmid pEU-MEK1-XE. This plasmid was cleaved at two Aat I sites and ligated again by a ligation reaction to delete a DNA fragment therebetween, thereby constructing pEU-MEK1-CA.
[0055]
Example 3
Synthesis of ERK2 and MEK1 Constitutively Active Mutants by a Cell-Free Protein Synthesis System
MRNA was synthesized using Thermo T7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo) using the above two types of plasmids, pEU-MAPK1 and pEU-MEK1-CA, as templates. The synthesized mRNA was purified using a G-25 micro spin column (manufactured by Amersham), buffer-substituted with a buffer mix solution attached to “PROTEIOS ™”, and cell-free protein synthesis was performed by the overlay method.
The overlay reaction was performed in a 96-well plate using 1.8 μl of sterile water, 2.0 μl of buffer # 2 included in “PROTEIOS ™”, 1.7 μl of creatine kinase (10 mg / ml) included in “PROTEIOS ™”, 1.0 μl of RNase inhibitor (40 U / μl, manufactured by Toyobo), 10.0 μl of wheat germ extract attached to “PROTEIOS ™”, two types of pEU-MAPK1 and pEU-MEK1-CA derived from buffer replacement The reaction was performed by overlaying a reaction mix solution consisting of 33.5 μl of a mixed solution (0.3 to 0.4 μg / μl) of an equal volume of purified mRNA under 250 μl of a buffer mix solution previously dispensed into a 96-well plate. The reaction was performed at 26 ° C. for 16 hours.
[0056]
Example 4
Measurement of enzyme activity of ERK2
The activity of ERK2 synthesized by cell-free protein synthesis was measured.
Specifically, the cell-free protein synthesis reaction end solution was subjected to MAP kinase buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM) using a G-25 micro spin column (manufactured by Amersham). EGTA, 0.05% Triton X-100) was replaced with a buffer. Activity was measured using the protein solution after the buffer replacement as a sample solution. For the activity measurement, p42 / p44 MAP Kinase Enzyme Assay System (manufactured by Amersham) was used.
The result is shown in FIG. Compared to the case where ERK2 was synthesized alone, the activity of ERK2 synthesized simultaneously with MEK1 was confirmed to be enhanced by more than 1000 times. This result strongly suggests that ERK2 was activated by MEK1, and has once again proved that the two proteins are in an interacting relationship. This result is considered to be a good example showing that the present invention is an effective means for demonstrating the presence or absence of the interaction between two types of proteins whose relationship is unclear. It is expected that it will be possible to apply it to transfer system proteins.
[0057]
Example 5
ERK2 Activation by MEK1 Constitutively Active Mutant in Coexistence of Other Proteins Equivalent amounts of plasmid pEU-MAPK1 above and 99 unrelated genes also cloned into pEU3-NII vector and pEU-MEK1-CA above MRNA was synthesized using Thermo T7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo) using a mixture of the mixed plasmid mixture (hereinafter, library) at a ratio of 1: 1 as a template. The synthesized mRNA was purified using a G-25 micro spin column (manufactured by Amersham), buffer-substituted with a buffer mix solution attached to “PROTEIOS ™”, and cell-free protein synthesis was performed by the overlay method.
The overlay reaction was performed in a 96-well plate using 1.8 μl of sterile water, 2.0 μl of buffer # 2 included in “PROTEIOS ™”, 1.7 μl of creatine kinase (10 mg / ml) included in “PROTEIOS ™”, 1.0 μl of RNase inhibitor (40 U / μl, manufactured by Toyobo), 10.0 μl of wheat germ extract attached to “PROTEIOS ™”, two types of pEU-MAPK1 and pEU-MEK1-CA derived from buffer replacement The reaction was performed by overlaying a reaction mix solution consisting of 33.5 μl of a mixed solution (0.3 to 0.4 μg / μl) of an equal volume of purified mRNA under 250 μl of a buffer mix solution previously dispensed into a 96-well plate. The reaction was performed at 26 ° C. for 16 hours.
[0058]
Example 6
Measurement of enzyme activity of ERK2
The activity of ERK2 synthesized by the cell-free protein synthesis system was measured.
Specifically, the cell-free protein synthesis reaction end solution was subjected to MAP kinase buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM) using a G-25 micro spin column (manufactured by Amersham). EGTA, 0.05% Triton X-100) was replaced with a buffer. Activity was measured using the protein solution after the buffer replacement as a sample solution. For the activity measurement, p42 / p44 MAP Kinase Enzyme Assay System (manufactured by Amersham) was used.
The result is shown in FIG. Assuming that the activity of ERK2 in the case where ERK2 and MEK1 are expressed in equal amounts is 100, the activity in the case where ERK2 and MEK1 are expressed in equal amounts with the library is 18. Although the expression level of MEK1 is estimated to be about 1/100 of that of ERK2, it is apparent that MEK1 acts on ERK2, though it is not as good as that of ERK2. From these results, it is easily inferred that a gene of an unknown or known protein that interacts with ERK2 can be identified using a gene expression library consisting of 100 clones per pool. It is easily presumed that the results can be applied to identify genes of unknown or known proteins that affect a specific signal transduction system protein.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention, high-throughput screening of proteins that regulate the activity of a certain protein has become possible. Furthermore, by using the method of the present invention, an activated or inactivated protein can be adjusted efficiently and easily. Therefore, according to the present invention, a protein that activates or inactivates a target protein can be easily screened, and an activated or inactivated protein can be easily prepared.
[0060]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the enzyme activity of ERK2 protein when ERK2 protein is expressed alone or in co-expression with a MEK1-constitutively active mutant.
The vertical axis shows the activity of ERK2 (the activity of adding 32P to the substrate peptide), and the horizontal axis shows the dilution ratio of the sample. (Single): ERK2 gene mRNA is expressed alone, (Co-expression): ERK2 gene mRNA and MEK1 constitutively active mutant gene mRNA are expressed in equal amounts, (Control): synthesized without adding mRNA.
FIG. 2 is a diagram showing the enzymatic activity of ERK2 protein when a library containing MEK1 constitutively active mutant genes is co-expressed with ERK2.
The horizontal axis shows the relative activity of ERK2. The activity value of ERK2 when ERK2 and MEK1-CA are co-expressed (MEK1-CA) is set to 100, and the relative value when ERK2 and library are co-expressed (library) and when ERK2 is expressed alone (control). Indicates a value.
