【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肺高血圧症治療用の徐放性製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺高血圧症には一次性と二次性があり、一次性とはいわゆる原発性肺高血圧症のことで原因不明の難治性疾患で、二次性肺高血圧症は当該領域においては左右短絡を有する先天性心疾患を主とした原因による、いずれも進行性疾患である。二次性肺高血圧症においては原疾患の治療により肺高血圧の改善または進行抑制が得られるが、一次性肺高血圧症においては肺移植以外では対処療法のみである。現在の我が国の移植医療の状況からみて患者数に見合った十分な治療は行われておらず、一次性肺高血圧症の予後は悪い。また、二次性肺高血圧症においても、その原疾患の治療時期等で肺高血圧の改善度合いは異なり、進行は抑制できても肺高血圧自体は残存するケースも存在している。いずれにしても、患者の生命予後はもとより社会的予後もまだまだ悪いのが実情である。
【０００３】
肺高血圧症は、肺血管が部分的に縮小することにより血圧が高くなることを特徴とする疾患である。したがって、血管新生増殖因子を用いて血管新生を促進することにより、肺高血圧症の進行抑制・改善が得られることが期待される。このような血管新生増殖因子の例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ： ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ： ＨＧＦ）、他のＦＧＦ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、アドレノメジュリンなどの細胞増殖因子、インターロイキン、ケモカインなどの生理活性タンパク質およびペプチド、ならびにプロスタグランジンなどの生理活性低分子物質などが挙げられる。
【０００４】
ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； 塩基性繊維芽細胞増殖因子）は、繊維芽細胞（３Ｔ３）の増殖を促進する因子として最初に下垂体および脳から同定された成長因子である（Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０９， １−６，１９８９）。ｂＦＧＦは、種々の組織および臓器において、血管新生、平滑筋細胞成長、小食治癒、組織修復、造血、神経細胞の分化等の多岐にわたる機能を有することが見いだされている（Ｂｉｋｆａｌｖｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．， １８， ２６−４５， １９９７）。ｂＦＧＦは虚血性心疾患の血管新生療法に、欧米では臨床治療レベルで、日本では皮膚科領域では既に皮膚潰瘍治療薬として商品化され、整形外科領域への展開が始まっている。
【０００５】
ＶＥＧＦの遺伝子治療が米国で臨床応用されている。これは、ＶＥＧＦタンパク質の徐放化が不可能であることから、ＶＥＧＦのプラスミドＤＮＡを細胞に導入させ、細胞からのＶＥＧＦタンパク質の徐放化を期待したものである。ＨＧＦ、ｂＦＧＦのプラスミドＤＮＡを用いた遺伝子治療による血管新生治療法も行われているが、これも、これらのタンパク質の徐放化が実用化されていないためであり、徐放化技術が開発されれば遺伝子治療の必要性はないと考えられる。他のタンパク質においても状況は同様である。その他のペプチド、低分子物質では徐放化は不可欠であり、徐放化技術がなければ血管新生治療効果は期待できない。所定の作用を得るためにこれまで行われてきた唯一の方法は大量投与である。この場合には、生理活性が認められる場合もあるが、主作用以外の副作用を回避することが困難であり、治療法としては不適切である。
【０００６】
ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：肝細胞増殖因子）は、１９８４年に中村らにより、成熟ラット初代培養肝細胞に対する増殖因子として肝再生中のラット血液から部分精製された増殖因子であり、その遺伝子はクローニングされている（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， １２２， １４５０（１９８４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ，８３， ６４８９（１９８６） 、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ， ２２， ３１１（１９８７） 、Ｎａｔｕｒｅ， ３４２， ４４０（１９８９） 、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ８７， ３２００ （１９９０） ）。ＨＧＦは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において肝再生因子として障害肝の修復再生に働く増殖促進作用だけでなく、さまざまな標的細胞に対する遊走促進、形態形成誘導、抗アポトーシスなどの極めて多岐にわたる性質を有すること、それによって臓器・組織の再生・維持因子として重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた（Ｓｙｍｐ． ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． ＢｉｏＬ．， ４７， ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ， ２２７−２３４（１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ． ， ９０， １９３７−１９４１（１９９３）， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９７， ３８１−３９０（１９９８））。ＨＧＦは下肢血管新生の臨床治験において使用されている。
【０００７】
しかしながら、投与部位から拡散により排泄、酵素分解により失活するため、ｂＦＧＦおよびＨＧＦは生体内半減期が短く、水溶液として全身投与あるいは病巣部位へ局所投与した場合、十分な生理活性効果を得ることができない。実際に、肺高血圧症のモデル動物にｂＦＧＦあるいはＨＧＦ水溶液を腹腔内投与しても、有意な治療効果は得られなかった。
【０００８】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
特開平８−３２５１６０
【特許文献２】
特開２００２−１４５７９７
【非特許文献１】
Ｂｉｋｆａｌｖｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．， １８， ２６−４５ （１９９７）
【非特許文献２】
Ｓｙｍｐ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． ＢｉｏＬ．， ４７， ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ， ２２７−２３４（１９９３）
【非特許文献３】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ． ， ９０， １９３７−１９４１（１９９３）
【非特許文献４】
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９７， ３８１−３９０（１９９８）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ等の血管新生増殖因子を肺血管に効率的に輸送しうる徐放性製剤を形成することにより、肺高血圧症の有用な治療剤を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ゼラチンハイドロゲルを用いて作製したｂＦＧＦおよびＨＧＦの徐放性製剤が、肺高血圧症モデルラットにおいて顕著な治療的効果を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ｂＦＧＦまたはＨＧＦおよびゼラチンハイドロゲルを含む肺高血圧症治療剤を提供する。
【００１１】
本発明の肺高血圧症治療剤を用いて治療することができる適応症としては、特に、原発性肺高血圧症、アイゼンメンガー症候群、心室中隔欠損症や心内膜床欠損症あるいは心房中隔欠損症などに続発する肺高血圧、僧帽弁膜症に合併する肺高血圧症、および慢性・急性の左心不全に合併する肺高血圧症が挙げられる。
【００１２】
本発明にしたがって、ｂＦＧＦあるいはＨＧＦをゼラチンハイドロゲルに含浸させた粒子を腹腔内投与して徐放させることにより、肺高血圧抑制効果を得られ、生命予後の改善が得られる。ｂＦＧＦあるいはＨＧＦによるこのような肺高血圧抑制効果は、主としてｂＦＧＦあるいはＨＧＦの血管新生促進効果によるものと考えられるが、ｂＦＧＦおよびＨＧＦのいずれも、生体内において血管新生の促進に加えて上述したような種々の生物学的活性を有することが知られており、これらの他の活性またはそれらの組み合わせも肺高血圧抑制に寄与しているかもしれない。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるゼラチンとは、以下の物性：
コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０〜約２０万ダルトンであり、
水溶液中のジータ電位が、約−１５〜約−２０ｍＶである
を有するゼラチンであり、市販のゼラチンとは異なるものである。
【００１４】
市販のゼラチンとして例えば、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンがあるが、水溶液中のジータ電位が以下のように異なっている。
シグマ社製タイプＡゼラチン：約０〜約５ｍＶ
和光社製ゼラチン：約−５〜約−２ｍＶ
ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度であり、本発明におけるｂＦＧＦまたはＨＧＦと静電的複合体を形成するゼラチンの指標としては好適なものと考えられる。
【００１５】
本発明のゼラチンは牛を始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの部分あるいはコラーゲンあるいはコラーゲンとして用いられている物質からアルカリ加水分解して得られるものである。好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンであり、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ
【００１６】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤と縮合させて得られるハイドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、縮合剤を用いることができる。好ましいものとしては、グルタルアルデヒドを用いることが挙げられる。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても架橋化することもできる。
【００１７】
ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、所望の含水率に応じて適宜選択すれば良いが、ゼラチン濃度は、１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度は、０．０１〜１ｗ／ｗ％が挙げられる。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。
【００１８】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。
【００１９】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００２０】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ ｍｉｎｉＤ．Ｃ． スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中こて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００２１】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００２２】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００２３】
本発明のゼラチンハイドロゲルは、その含水率が徐放性に大きく影響することが明らかとなっており、好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％が挙げられる。さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。この架橋度の測定可能な指標に含水率がある。含水率が大きければ架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がｂＦＧＦおよびＨＧＦの徐放（徐々に放出）を左右する。
【００２４】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００２５】
本発明で使用されるｂＦＧＦおよびＨＧＦはいずれも公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができ、また既に市販されている製品（例えば、東洋紡ＣｏｄｅＮｏ．ＨＧＦ−１０１等）を使用してもよい。ｂＦＧＦおよびＨＧＦの製造法としては、例えば、ｂＦＧＦまたはＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ｂＦＧＦまたはＨＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法こよりｂＦＧＦまたはＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えｂＦＧＦまたはＨＧＦを得ることもできる。（例えば、Ｎａｔｕｒｅ， ３４２， ４４０（１９８９）、特開平５−１１１３８２号公報、 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６３， ９６７（１９８９）などを参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。このようにして得られたｂＦＧＦおよびＨＧＦは、天然型ｂＦＧＦおよびＨＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００２６】
本発明のｂＦＧＦまたはＨＧＦ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、上記の酸性ゼラチンハイドロゲルにｂＦＧＦまたはＨＧＦの水溶液を含浸させることにより得ることができる。ｂＦＧＦおよびＨＧＦは分子表面に塩基性の高い部位をもつタンパク質であるため、酸性ゼラチンハイドロゲルと主として静電的相互作用を介した複合体を形成する。しかし、イオン強度の異なる溶液中においても、一度相互作用したｂＦＧＦおよびＨＧＦのゼラチンハイドロゲルからの脱着はほとんど変化しない。このことは、ｂＦＧＦおよびＨＧＦゼラチン（ハイドロゲル）複合体には、静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していることを示している。
【００２７】
ゼラチンに対するｂＦＧＦまたはＨＧＦの重量比は約５倍量以下であることが好ましい。さらに好ましくは、ゼラチンに対してｂＦＧＦまたはＨＧＦは約５〜約１／１０４倍量の重量比である。
【００２８】
本発明のｂＦＧＦおよびＨＧＦ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ｂＦＧＦおよびＨＧＦの徐放性効果と安定化効果を持つため、ｂＦＧＦおよびＨＧＦの機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、ｂＦＧＦおよびＨＧＦの血管新生促進機能が肺血管において効果的に発揮され、肺高血圧症の治療剤として有効に作用することができる。
【００２９】
この徐放のメカニズムは、ｂＦＧＦまたはＨＧＦが、ハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。この状態では、因子は、ハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、固定化されているｂＦＧＦまたはＨＧＦが放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解によって、ｂＦＧＦまたはＨＧＦの徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、ｂＦＧＦまたはＨＧＦがゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。
【００３０】
本発明のｂＦＧＦまたはＨＧＦゼラチンハイドロゲル製剤は、薬学的に許容しうる水性注射溶液中に懸濁させることにより、注射用製剤として非経口的に使用することができる。例えば、気道内、気管内、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内、特に胸腔内、結合組織内、骨内膜あるいは障害臓器等に投与することができる。
【００３１】
本発明のｂＦＧＦまたはＨＧＦ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが考えられる。
【００３２】
本発明製剤中のｂＦＧＦまたはＨＧＦの用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常成人患者当たり約０．０１〜約５００μｇの範囲、好ましくは、約０．１〜約２００μｇの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３４】
実施例１．ｂＦＧＦ及びＨＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルの作製
１０ｗｔ％濃度の酸性ゼラチンをグルタルアルデヒドにより化学架橋した後、架橋剤を不活性化した。次に蒸留水にて数回洗浄し、架橋含水率９０．３％ゼラチンハイドロゲルを得た。続いて１００μｇのｂＦＧＦあるいは５０μｇのＨＧＦを含む０．０５Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４， ＰＢＳ ５００μｌ）を滴下し、ｂＦＧＦあるいはＨＧＦ水溶液をゼラチンハイドロゲルへ浸み込ませることによってｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルおよびＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。
【００３５】
実施例２．ラット・モノクロタリン誘導肺高血圧症モデルの作製
体重２５０−３００ｇのウイスター・ラット（Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ）を用いて、エーテルによる吸入麻酔下、モノクロタリン６０ｍｇ／ｋｇを背部皮下注射を行なうことによりモデルを作製した。本法は最も繁用されるモデル作製法であり、この単回投与により進行性の肺高血圧症が誘導され、通常の自然経過では投与後４−６週間で肺高血圧症で死亡する。
【００３６】
実施例３．ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを用いた治療と評価
モノクロタリン投与一週間後、ラットにｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルの腹腔内投与を開始し、投与開始３週間後に組織学的検討を行った。具体的な比較グループ分けは以下の通りである。
グループＡ（ｎ＝２０）：モノクロタリン投与後無処置（コントロール群）
グループＢ（ｎ＝１４）：ｂＦＧＦ（１００μｇ）含浸ゼラチンハイドロゲル腹腔内投与（単回投与）
結果は図１および図２に示される。
【００３７】
図１は、ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲル投与群とコントロール群における右心室と左心室＋心室中隔の重量比を示す。肺高血圧症においては二次的に右心室への負荷がかかり、それに伴い右心室の壁肥厚、重量増加を呈してくる。すなわち、図１は、ｂＦＧＦ治療群が有意に右心室重量増加を抑えたことを示す。
【００３８】
図２は肺血管の中膜肥厚の度合いを示す。肺高血圧症においては組織学上、血管平滑筋の肥厚により中膜肥厚を呈する。すなわち、図２は、ｂＦＧＦ治療群が有意に中膜肥厚を抑制したことを示す。
【００３９】
以上のように、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲル投与により、モノクロタリン誘導肺高血圧症モデルにおいて、有意な治療効果が得られた。
【００４０】
実施例４．ＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを用いた治療と評価
モノクロタリン投与一週間後、ＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルの腹腔内投与を開始し、投与開始３週間後に組織学的検討を行った。具体的な比較グループ分けは以下の通りである。
グループＡ（ｎ＝２０）：モノクロタリン投与後無処置（コントロール群）
グループＢ（ｎ＝１０）：ＨＧＦ（１５０μｇ）含浸ゼラチンハイドロゲル腹腔内投与（１回投与あたり５０μｇ、週一回、三週間投与）
グループＣ（ｎ＝１６）：ＨＧＦ（３００μｇ）含浸ゼラチンハイドロゲル腹腔内投与（１回投与あたり５０μｇ、週二回、三週間投与）
結果を図３−５に示す。
【００４１】
図３は、図１と同じ評価法である。グループＢおよびＣのＨＧＦ治療群はグループＡの無治療群に対して、有意に右心室重量増加を抑えた。また、グループＢとＣの間にも有意差（Ｐ＜０．０００１）があり、用量増加に伴い右心室重量増加の抑制効果が強くなっていることを示す。
【００４２】
図４において測定しているエンドセリン−１とはサイトカインの一種であり、肺高血圧症による右心室への負荷がかかった際に、その壁応力に伴い上昇する。つまり、これは右心室への負荷の度合いを反映しており、通常、肺高血圧症ではこのレベルが上昇する。図４は治療群がエンドセリン−１の上昇を有意に抑制し、右心室の付加を抑制したことを示す。
【００４３】
図５は、図２と同じ評価法である。治療群が有意に中膜肥厚を抑制したことを示す。
【００４４】
以上のように、ＨＧＦ含有ゼラチンハイドロゲル投与により、モノクロタリン誘導肺高血圧症モデルにおいて、有意な治療効果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける右心室と左心室＋心室中隔の重量比を示す。
【図２】図２は本発明のｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける肺血管の中膜肥厚の度合いを示す。
【図３】図３は、本発明のＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける右心室と左心室＋心室中隔の重量比を示す。
【図４】図４は、本発明のＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおけるエンドセリン−１のレベルを示す。
【図５】図５は、本発明のＨＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける肺血管の中膜肥厚の度合いを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a sustained-release preparation for treating pulmonary hypertension.
[0002]
[Prior art]
Pulmonary hypertension has a primary and a secondary, primary is so-called primary pulmonary hypertension and is an intractable disease of unknown cause, and secondary pulmonary hypertension has a left-right short circuit in this area All are progressive diseases, mainly due to congenital heart disease. In secondary pulmonary hypertension, treatment of the primary disease can improve or suppress the progression of pulmonary hypertension, but in primary pulmonary hypertension, there is only coping therapy other than lung transplantation. In view of the current situation of transplantation medicine in Japan, sufficient treatment has not been performed in proportion to the number of patients, and the prognosis of primary pulmonary hypertension is poor. Also in secondary pulmonary hypertension, the degree of improvement in pulmonary hypertension differs depending on the timing of treatment of the underlying disease and the like, and in some cases pulmonary hypertension itself remains even though its progression can be suppressed. In any case, the social prognosis as well as the patient's life prognosis is still poor.
[0003]
Pulmonary hypertension is a disease characterized by an increase in blood pressure due to a partial shrinkage of pulmonary blood vessels. Therefore, it is expected that progression of pulmonary hypertension can be suppressed or improved by promoting angiogenesis using angiogenic growth factors. Examples of such angiogenic growth factors include basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocyte growth factor (HGF), other FGF, and vascular endothelial growth factor (HGF). VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF), cell growth factors such as angiopoietin, angiostatin, adrenomedullin, bioactive proteins and peptides such as interleukins and chemokines, and prostaglandins Physiologically active low molecular substances.
[0004]
bFGF (basic fibroblast growth factor) is a growth factor that was first identified from the pituitary and brain as a factor that promotes the growth of fibroblasts (3T3) (Rifkin and Moscatelli, J. Cell Biol. 109, 1-6, 1989). bFGF has been found to have a wide variety of functions in various tissues and organs, including angiogenesis, smooth muscle cell growth, healing of small foods, tissue repair, hematopoiesis, differentiation of nerve cells, and the like (Bikfalvi, et al., Endocrine Rev., 18, 26-45, 1997). bFGF has already been commercialized as a therapeutic agent for angiogenesis of ischemic heart disease in Europe and the United States at the clinical treatment level, and in Japan as a skin ulcer therapeutic agent in the dermatology field, and has begun to expand into the orthopedic field.
[0005]
VEGF gene therapy has clinical applications in the United States. Since it is impossible to release VEGF protein sustainedly, it is expected that VEGF plasmid DNA is introduced into cells, and that the release of VEGF protein from cells is sustained. Angiogenesis therapy by gene therapy using HGF and bFGF plasmid DNAs has also been performed, but this is also because the sustained release of these proteins has not been put into practical use. If so, gene therapy would not be necessary. The situation is similar for other proteins. For other peptides and low molecular substances, sustained release is indispensable, and without the sustained release technology, a therapeutic effect on angiogenesis cannot be expected. The only way that has been done to achieve a given effect is by large doses. In this case, a physiological activity may be observed in some cases, but it is difficult to avoid side effects other than the main effect, which is inappropriate as a therapeutic method.
[0006]
Hepatocyte growth factor (HGF) is a growth factor partially purified from rat blood during liver regeneration by Nakamura et al. As a growth factor for primary cultured hepatocytes in 1984, and its gene is cloned. (Biochem Biophys Res Commun, 122, 1450 (1984), Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489 (1986), FEBS Letter, 22, 311 (1987), Nature 40, 342, 342). Natl. Acad. Sci, USA, 87, 3200 (1990)). HGF has an extremely wide variety of properties, such as promotion of migration to various target cells, induction of morphogenesis, and anti-apoptosis, as well as a proliferation-promoting effect that acts as a liver regeneration factor in vitro to repair and regenerate damaged liver in vitro. It has been clarified that it plays an important role as an organ / tissue regeneration / maintenance factor (Symp. Soc. Exp. BioL., 47, cell behavior, 227-234 (1993), Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 90, 1937-1941 (1993), Circulation, 97, 381-390 (1998)). HGF has been used in clinical trials of lower limb angiogenesis.
[0007]
However, since bFGF and HGF are excreted from the administration site by diffusion and inactivated by enzymatic degradation, bFGF and HGF have a short half-life in vivo, and when administered systemically as an aqueous solution or locally administered to a lesion site, a sufficient bioactive effect can be obtained. Can not. Actually, even if bFGF or HGF aqueous solution was intraperitoneally administered to a pulmonary hypertension model animal, no significant therapeutic effect was obtained.
[0008]
Prior art document information related to the present invention is as follows.
[Patent Document 1]
JP-A-8-325160
[Patent Document 2]
JP-A-2002-145797
[Non-patent document 1]
Bikfalvi, et al. , Endocrine Rev .; , 18, 26-45 (1997)
[Non-patent document 2]
Symp. Soc. Exp. BioL. , 47, cell behavior, 227-234 (1993).
[Non-Patent Document 3]
Proc. Natl. Acad. Sci, USA. , 90, 1937-1941 (1993).
[Non-patent document 4]
Circulation, 97, 381-390 (1998).
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a useful therapeutic agent for pulmonary hypertension by forming a sustained-release preparation capable of efficiently transporting angiogenic growth factors such as bFGF and HGF to pulmonary blood vessels. I do.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that a sustained-release preparation of bFGF and HGF prepared using a gelatin hydrogel has a remarkable therapeutic effect in a pulmonary hypertension model rat, and completed the present invention. That is, the present invention provides a therapeutic agent for pulmonary hypertension comprising bFGF or HGF and a gelatin hydrogel.
[0011]
Indications that can be treated using the therapeutic agent for pulmonary hypertension of the present invention include, in particular, primary pulmonary hypertension, Eisenmenger syndrome, ventricular septal defect or endocardial bed defect or atrial septal defect Pulmonary hypertension secondary to pulmonary hypertension, pulmonary hypertension associated with mitral valvular disease, and pulmonary hypertension associated with chronic / acute left heart failure.
[0012]
According to the present invention, the particles impregnated in gelatin hydrogel with bFGF or HGF are intraperitoneally administered and slowly released, whereby an effect of suppressing pulmonary hypertension can be obtained, and the prognosis of life can be improved. Such a pulmonary hypertension-suppressing effect of bFGF or HGF is considered to be mainly due to the angiogenesis-promoting effect of bFGF or HGF, and both bFGF and HGF have the above-described effects in addition to the promotion of angiogenesis in vivo. It is known to have a variety of biological activities, and these other activities or combinations thereof may also contribute to pulmonary hypertension suppression.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Gelatin used in the present invention has the following physical properties:
An acidic gelatin obtained by an alkaline hydrolysis treatment from collagen,
Has a molecular weight of about 10 to about 200,000 daltons under non-reducing conditions of SDS-PAGE;
A gelatin having a zeta potential in an aqueous solution of about -15 to about -20 mV, which is different from commercially available gelatin.
[0014]
Commercially available gelatin includes, for example, type A gelatin manufactured by Sigma and gelatin manufactured by Wako, but the zeta potential in the aqueous solution is different as follows.
Sigma Type A gelatin: about 0 to about 5 mV
Wako gelatin: about -5 to about -2 mV
The zeta potential is a measure of the degree of electrostatic charge of a substance (gelatin), and is considered to be suitable as an indicator of gelatin forming an electrostatic complex with bFGF or HGF in the present invention.
[0015]
The gelatin of the present invention is obtained by alkaline hydrolysis of skin, bones, tendons and other parts of various animal species including cows, or collagen or a substance used as collagen. Preferably, it is an acidic gelatin prepared by subjecting bovine bone-derived type I collagen to alkaline treatment, and can also be obtained as a sample isoelectric point (IEP) 5.0 from Nitta Gelatin. The basic gelatin prepared by the acid treatment can also be obtained as a sample IEP 9.0 of Nitta Gelatin Co., but the zeta potential is greatly different as follows.
Acidic gelatin (Nitta Gelatin Co., sample IEP 5.0): about -15 to about -20 mV
Basic gelatin (Nitta Gelatin Co., sample IEP 9.0): about +12 to about +15 mV
[0016]
The gelatin hydrogel used in the present invention is a hydrogel obtained by condensing the above gelatin with various chemical crosslinking agents. As the chemical crosslinking agent, for example, glutaraldehyde, for example, a water-soluble carbodiimide such as EDC, for example, propylene oxide, a diepoxy compound, and a condensing agent can be used. Preferred is to use glutaraldehyde. Gelatin can also be cross-linked by heat treatment or ultraviolet irradiation.
[0017]
The concentration of gelatin and the cross-linking agent at the time of preparing the gelatin hydrogel may be appropriately selected according to the desired water content, but the gelatin concentration is 1 to 20 w / w%, and the cross-linking agent concentration is 0.01 to 1 w / w%. The cross-linking reaction conditions are not particularly limited, but can be, for example, 0 to 40 ° C. for 1 to 48 hours.
[0018]
The shape of the gelatin hydrogel is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, and a particle shape. Cylindrical, prismatic, sheet, and disk-shaped ones are usually used as embedding pieces, and spherical, particulate, and paste-shaped ones can be administered by injection.
[0019]
Columnar, prismatic, sheet-like, and disk-shaped gelatin hydrogels are prepared by adding an aqueous solution of a cross-linking agent to an aqueous solution of gelatin, or adding gelatin to an aqueous solution of a cross-linking agent, and pouring the mixture into a mold having a desired shape to perform a crosslinking reaction. Can be prepared. Further, an aqueous solution of a crosslinking agent may be added to the molded gelatin gel as it is or after drying. To stop the cross-linking reaction, a low molecular substance having an amino group such as ethanolamine or glycine is brought into contact, or an aqueous solution having a pH of 2.5 or less is added. The obtained gelatin hydrogel is washed with distilled water, ethanol, 2-propanol, acetone or the like, and is used for preparation of a preparation.
[0020]
The spherical and particulate gelatin hydrogels are, for example, a stirring motor (for example, Three One Motor, EYELA miniDC Stirrer, etc., manufactured by Shinto Kagaku) fixed to a three-necked round bottom flask and a propeller for Teflon (registered trademark). The gelatin solution is put in a device fixed together with the flask, and oil such as olive oil is added thereto, and the mixture is stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to form a W / O emulsion, to which an aqueous solution of a crosslinking agent is added. Alternatively, a pre-emulsified (eg, using a vortex mixer, Advantec TME-21, homogenizer, polytron PT10-35, etc.) pre-emulsifying a gelatin aqueous solution in olive oil was dropped into olive oil, and W / Prepare an O-type emulsion, add aqueous solution of crosslinking agent After the reaction, the gelatin hydrogel is recovered by centrifugation, washed with acetone, ethyl acetate or the like, and further immersed in 2-propanol, ethanol or the like to stop the cross-linking reaction. The obtained gelatin hydrogel particles are successively washed with distilled water containing 2-propanol and Tween 80, distilled water, and the like, and provided for preparation of a preparation. When the gelatin hydrogel particles aggregate, for example, addition of a surfactant or the like or ultrasonic treatment (preferably within about 1 minute under cooling) may be performed.
[0021]
The average particle size of the obtained gelatin hydrogel particles is from 1 to 1000 μm, and particles having a necessary size may be appropriately sieved and used according to the purpose. Further, by pre-emulsifying, a fine gelatin hydrogel having a particle size of 20 μ or less can be obtained.
[0022]
Another method for preparing a spherical or particulate gelatin hydrogel is as follows. Olive oil is put into the same apparatus as in the above method, stirred at a speed of about 200 to 600 rpm, and a gelatin aqueous solution is added dropwise to prepare a W / O emulsion. After cooling, acetone, ethyl acetate and the like are added. In addition, the mixture is stirred, and the uncrosslinked gelatin particles are recovered by centrifugation. The collected gelatin particles are further washed with acetone, ethyl acetate or the like, then with 2-propanol, ethanol or the like, and then dried. The dried gelatin particles are suspended in a cross-linking agent aqueous solution containing 0.1% Tween 80, and subjected to a cross-linking reaction with gentle stirring, and depending on the cross-linking agent used, a 100 mM aqueous glycine solution containing 0.1% Tween 80 or 0.1 mM Tween 80 is used. Gelatin hydrogel particles can be prepared by washing with 0.004N HCl containing, for example,% Tween 80 and stopping the crosslinking reaction. The average particle size of the gelatin hydrogel particles obtained by this method is the same as in the above method.
[0023]
It has been clarified that the water content of the gelatin hydrogel of the present invention greatly affects the sustained release property, and the water content exhibiting a preferable sustained release effect is about 80 to 99 w / w%. Even more preferred are those having about 95-98% w / w. An index that can measure the degree of crosslinking is the water content. If the water content is high, the degree of crosslinking is low, and it is easily decomposed. That is, the value of the water content determines the sustained release (gradual release) of bFGF and HGF.
[0024]
The gelatin hydrogel of the present invention can be suitably used after being cut into appropriate sizes and shapes, freeze-dried and sterilized. Freeze-drying is performed, for example, by putting a gelatin hydrogel in distilled water, freezing it in liquid nitrogen for 30 minutes or more, or at -80 ° C for 1 hour or more, and drying it for 1 to 3 days with a freeze dryer. Can be.
[0025]
Both bFGF and HGF used in the present invention are known substances, and may be those prepared by various methods as long as they are purified to the extent that they can be used as pharmaceuticals. Products (for example, Toyobo Code No. HGF-101, etc.) may be used. As a method for producing bFGF and HGF, for example, bFGF or HGF can be obtained by culturing primary cultured cells or cell lines that produce bFGF or HGF, and separating and purifying them from a culture supernatant or the like. Alternatively, a gene encoding bFGF or HGF is inserted into an appropriate vector from a genetic engineering technique, inserted into an appropriate host, and transformed, and the recombinant bFGF or HGF of interest is obtained from the culture supernatant of this transformant. You can also get (See, for example, Nature, 342, 440 (1989), JP-A-5-111382, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989)). The above host cells are not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, yeast, insects, rice plants, or animal cells can be used. The bFGF and HGF thus obtained may be substituted, deleted and / or added with one or more amino acids in the amino acid sequence thereof, as long as they have substantially the same action as natural bFGF and HGF. The sugar chain may be substituted, deleted and / or added.
[0026]
The bFGF or HGF sustained release gelatin hydrogel preparation of the present invention can be obtained by impregnating the above acidic gelatin hydrogel with an aqueous solution of bFGF or HGF. Since bFGF and HGF are proteins having a highly basic site on the molecular surface, they form a complex with an acidic gelatin hydrogel mainly through electrostatic interaction. However, even in solutions having different ionic strengths, the desorption of bFGF and HGF once interacting from the gelatin hydrogel hardly changes. This indicates that not only electrostatic interaction but also other interactions such as hydrophobic bond and hydrogen bond greatly contribute to the bFGF and HGF gelatin (hydrogel) complex.
[0027]
Preferably, the weight ratio of bFGF or HGF to gelatin is about 5 times or less. More preferably, the weight ratio of bFGF or HGF to gelatin is about 5 to about 1/10 4 times the weight of gelatin.
[0028]
Since the bFGF and HGF sustained release gelatin hydrogel preparation of the present invention has a sustained release effect and a stabilizing effect of bFGF and HGF, the functions of bFGF and HGF can be exhibited in a small amount for a long time. Therefore, the angiogenesis promoting function of bFGF and HGF is effectively exerted in pulmonary blood vessels, and can effectively act as a therapeutic agent for pulmonary hypertension.
[0029]
The mechanism of this sustained release is based on the fact that bFGF or HGF is physically immobilized on gelatin in a hydrogel. In this state, no factor is released from the hydrogel. As the hydrogel is degraded in vivo, the gelatin molecules become water-soluble, with the result that the immobilized bFGF or HGF is released. That is, the sustained release of bFGF or HGF can be controlled by the decomposition of the hydrogel. The degradability of the hydrogel can be changed by adjusting the degree of crosslinking during the preparation of the hydrogel. In addition, the interaction of bFGF or HGF with gelatin improves the stability in vivo, for example, resistance to enzymatic degradation.
[0030]
The bFGF or HGF gelatin hydrogel preparation of the present invention can be used parenterally as an injection preparation by suspending it in a pharmaceutically acceptable aqueous injection solution. For example, it can be administered to the respiratory tract, intratracheal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, and body cavities, particularly intrathoracic, connective tissue, endosteum, or damaged organs.
[0031]
The dosage form of the bFGF or HGF sustained-release gelatin hydrogel preparation or the complex thereof of the present invention can be appropriately devised according to each use. For example, it can be administered in the form of a sheet, stick, particle, rod, or paste. Administration methods include intradermal, subcutaneous, intramuscular, intracavitary, connective tissue, and endosteal administration.
[0032]
The dose of bFGF or HGF in the preparation of the present invention can be appropriately adjusted depending on the severity of the disease, the age of the patient, the weight, etc., but is usually in the range of about 0.01 to about 500 μg per adult patient, preferably The dose is selected from the range of about 0.1 to about 200 μg, and can be injected into the affected area or its surrounding area. When the effect is insufficient with one administration, the administration can be performed a plurality of times.
[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0034]
Embodiment 1 FIG. Preparation of Gelatin Hydrogel Containing bFGF and HGF After chemically crosslinking acidic gelatin at a concentration of 10 wt% with glutaraldehyde, the crosslinking agent was inactivated. Next, it was washed several times with distilled water to obtain a gelatin hydrogel having a crosslinked water content of 90.3%. Subsequently, a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4, 500 μl of PBS) containing 100 μg of bFGF or 50 μg of HGF was added dropwise, and the bFGF or HGF aqueous solution was immersed in a gelatin hydrogel to obtain a bFGF-impregnated gelatin. A hydrogel and a gelatin hydrogel impregnated with HGF were obtained.
[0035]
Embodiment 2. FIG. Preparation of rat monocrotaline- induced pulmonary hypertension model By using a Wistar rat weighing 250-300 g, subcutaneous back injection of monocrotaline 60 mg / kg under inhalation anesthesia with ether. A model was created. This method is the most commonly used method for preparing a model. This single administration induces progressive pulmonary hypertension, and in a normal natural course, death occurs in 4 to 6 weeks after administration.
[0036]
Embodiment 3 FIG. Treatment and evaluation using bFGF-impregnated gelatin hydrogel One week after administration of monocrotaline, rats were started to intraperitoneally administer bFGF-impregnated gelatin hydrogel, and histological examination was performed 3 weeks after the start of administration. The specific comparison grouping is as follows.
Group A (n = 20): no treatment after monocrotaline administration (control group)
Group B (n = 14): bFGF (100 μg) impregnated gelatin hydrogel intraperitoneal administration (single administration)
The results are shown in FIGS. 1 and 2.
[0037]
FIG. 1 shows the weight ratio of right ventricle and left ventricle + ventricular septum in the bFGF-impregnated gelatin hydrogel administration group and the control group. In pulmonary hypertension, the load on the right ventricle is secondarily applied, and the wall thickness and the weight of the right ventricle are increased accordingly. That is, FIG. 1 shows that the bFGF treatment group significantly suppressed right ventricular weight increase.
[0038]
FIG. 2 shows the degree of medial thickening of pulmonary blood vessels. Histologically, pulmonary hypertension exhibits thickening of the media due to thickening of vascular smooth muscle. That is, FIG. 2 shows that the bFGF-treated group significantly suppressed the media thickness.
[0039]
As described above, significant therapeutic effects were obtained in the monocrotaline-induced pulmonary hypertension model by the administration of the bFGF-containing gelatin hydrogel.
[0040]
Embodiment 4. FIG. Treatment and evaluation using HGF-impregnated gelatin hydrogel One week after monocrotaline administration, intraperitoneal administration of HGF-impregnated gelatin hydrogel was started, and histological examination was performed three weeks after administration. The specific comparison grouping is as follows.
Group A (n = 20): no treatment after monocrotaline administration (control group)
Group B (n = 10): Intraperitoneal administration of gelatin hydrogel impregnated with HGF (150 μg) (50 μg per administration, once a week, for 3 weeks)
Group C (n = 16): Intraperitoneal administration of HGF (300 μg) impregnated gelatin hydrogel (50 μg per administration, twice a week, for 3 weeks)
The results are shown in FIGS. 3-5.
[0041]
FIG. 3 shows the same evaluation method as in FIG. The HGF-treated groups of Groups B and C significantly reduced right ventricular weight gain compared to the untreated group of Group A. In addition, there is also a significant difference (P <0.0001) between groups B and C, indicating that the effect of suppressing the increase in right ventricular weight increases with increasing dose.
[0042]
Endothelin-1 measured in FIG. 4 is a kind of cytokine, and increases when a load is applied to the right ventricle due to pulmonary hypertension due to the wall stress. That is, it reflects the degree of load on the right ventricle, which is usually elevated in pulmonary hypertension. FIG. 4 shows that the treatment group significantly suppressed the elevation of endothelin-1 and suppressed the addition of the right ventricle.
[0043]
FIG. 5 is the same evaluation method as FIG. This shows that the treatment group significantly suppressed the medial thickness.
[0044]
As described above, significant therapeutic effect was obtained in the monocrotaline-induced pulmonary hypertension model by administration of the HGF-containing gelatin hydrogel.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the weight ratio of right ventricle to left ventricle + ventricular septum in rats to which the bFGF-impregnated gelatin hydrogel of the present invention was administered.
FIG. 2 shows the degree of medial thickening of pulmonary blood vessels in rats to which the bFGF-impregnated gelatin hydrogel of the present invention was administered.
FIG. 3 shows the weight ratio of right ventricle to left ventricle + ventricular septum in rats to which the HGF-impregnated gelatin hydrogel of the present invention was administered.
FIG. 4 shows the level of endothelin-1 in rats administered with the HGF-impregnated gelatin hydrogel of the present invention.
FIG. 5 shows the degree of medial hyperplasia of pulmonary blood vessels in rats to which the HGF-impregnated gelatin hydrogel of the present invention was administered.
