JP2004089092A

JP2004089092A - Nucleic acid for detecting point mutation of human cytochrome p4502c19 gene and method for detecting the point mutation of human cytochrome p4502c19 gene using the nucleic acid

Info

Publication number: JP2004089092A
Application number: JP2002255876A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Kudo; 工藤　英之; Kazuo Takemura; 竹村　一男; Ryuji Kawaguchi; 川口　竜二
Original assignee: SRL Inc
Current assignee: SRL Inc
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: JP4267881B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for quickly detecting point mutations m1 and m2 in human cytochrome P2C19. <P>SOLUTION: The method for quickly detecting the point mutations m1 and m2 involves making good use of a nucleic acid amplifying method using a forward primer for detecting m1 having a specific base sequence, a forward primer for detecting m2 having a specific base sequence, a reverse primer for detecting m2 having a specific base sequence, a set of probes for detecting m1 each having a specific base sequence and a set of probes for detecting m2 each having a specific base sequence. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子（以下、「ＣＹＰ２Ｃ１９」ということがある）の点突然変異の検出用核酸及びそれを用いたＣＹＰ２Ｃ１９の点突然変異の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗痙攣剤である（Ｓ）−メフェニトインの代謝能力には遺伝的多型が見られる。この遺伝的多型は（Ｓ）−メフェニトインの代謝だけではなく、臨床的に重要なジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾール及びプロプラノロール並びに選択的セロトニン再取込み阻害剤（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｒｅｕｐｔａｋｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の酸化的代謝能力とともに遺伝的に分離するので、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常を調べることは臨床的に重要である。
【０００３】
従来、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常は、被検者に（Ｓ）−メフェニトインを経口投与し、８時間後に排泄される尿中に含まれる４’−ヒドロキシメフェニトインを定量することにより行われていた。しかしながら、この方法は時間がかかる上に被検者に無用の薬剤を投与しなければならない。
【０００４】
（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常の遺伝的な原因は、少なくとも日本人については明らかになっている。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン５中のＧがＡになる点突然変異（部位は、ＣＹＰ２Ｃ１９のｃＤＮＡの６８１ｎｔ（すなわち、図１の塩基配列の１１７ｎｔ）、本明細書においてこの点突然変異を「ｍ１」という）（Ｓｏｎｉａ　Ｍ．Ｆ．　ｄｅ　Ｍｏｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２６９，　Ｎｏ．　２２，　ｐｐ．１５４１９−１５４２２，　１９９４及びＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン４中のＧがＡになる点突然変異（部位は、ＣＹＰ２Ｃ１９のｃＤＮＡの６３６ｎｔ（すなわち、図２の塩基配列の２３４ｎｔ）、本明細書においてこの点突然変異を「ｍ２」という）（Ｓｏｎｉａ　Ｍ．Ｆ．　ｄｅ　Ｍｏｒａｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｏｃｌｏｇｙ，　４６：５９４−５９８，１９９４の少なくともどちらかによって（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常が起きることがわかっている。従って、ＣＹＰ２Ｃ１９のエクソン５及び４中の上記ｍ１及びｍ２を調べることにより、（Ｓ）−メフェニトインの代謝異常を検査することができ、さらには、その遺伝子型を分類（ジェノタイピング）することもできる。
【０００５】
上記各文献には、それぞれ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりｍ１及びｍ２を検出する方法が記載されている。すなわち、エクソン５及びエクソン４のそれぞれについて各一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素で消化して電気泳動で分離することにより、突然変異の有無に応じて異なるサイズの断片が検出される。
【０００６】
さらに、本出願人の先の出願である特開平１０−１４５８５号公報には、プライマーを改良することにより、ｍ１とｍ２とを単一のＰＣＲにより検出可能にしたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるｍ１とｍ２の同時検出方法が記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、制限酵素による消化及び電気泳動による増幅断片の分離等の操作が必要であり、多数の検体について限られた時間内に検査を行わなければならない病院や臨床検査センター等では、より迅速に検査を行うことができる方法が望まれる。
【０００８】
従って、本発明の目的は、迅速にＣＹＰ２Ｃ１９中の点突然変異ｍ１及びｍ２を検出することができる方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、最近用いられ始めた、キャピラリーチューブ内でＰＣＲによる増幅を行うと共に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ））を利用した一組のプローブを増幅産物にハイブリダイズさせ、該ハイブリッドの融解温度を測定することにより、点突然変異を検出する方法を用いて、ｍ１及びｍ２を検出できないかと考えた。キャピラリーチューブ内でのＰＣＲによる増幅は、変性、アニーリング、伸長の各工程が従来のＰＣＲよりもはるかに短時間に行われ、全体として増幅反応が従来のＰＣＲの数分の１の時間で行える点が有利な特徴である。しかしながら、各工程が短時間であるので、適切にプライマーを設定しないと増幅がほとんど起きず、点突然変異の検出を行うことができない。本願発明者らは、ｍ１及びｍ２検出用の公知のプライマーや、市販のコンピューターソフトにより推奨されるプライマーを用いてｍ１及びｍ２の検出を試みたが、成功しなかった。そこで、鋭意研究の結果、独自にキャピラリーチューブ内でのＰＣＲを用いても、鋭敏にｍ１及びｍ２を検出できる、増幅効率の極めて優れたプライマー、及び検出感度の高い一組のプローブを見つけ出すことに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用フォワードプライマーを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用フォワードプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換したから成る、核酸増幅法によるヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用リバースプライマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１検出用の一組のプローブを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されている、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２検出用の一組のプローブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１を含む増幅産物を生成するリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１の検出方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２の検出方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブがハイブリダイズする増幅産物を生成するリバースプライマーと、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のリバースプライマーと、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブと、上記本発明のｍ２検出用の一組のプローブとの存在下において、被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に前記それぞれの一組のプローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することを含む、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１及び該遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２を同時に検出する方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の、ｍ１検出用のフォワードプライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する２３ｍｅｒの核酸（以下、「フォワードプライマー１」ということがある）から成る。なお、上記した置換は、できるだけ少ない方が好ましく、置換がないことが最も好ましく、置換がある場合でも１塩基、とりわけ、５’末端又はその近傍に置換があることが比較的好ましい。このことは、置換を許容している後述のｍ２検出用のフォワードプライマー及びリバースプライマーにもあてはまる。ｍ１検出用のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上４３塩基以下（配列番号１は４３塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。なお、図１に、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、イントロン４とエクソン５の境界近傍の塩基配列並びにフォワードプライマー１及び後述する他のプライマー並びにプローブがハイブリダイズする領域を示す（図１に示される塩基配列は配列番号１８に示す）。
【００１２】
本発明の、ｍ２検出用のフォワードプライマーは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号６に示す塩基配列を有する１８ｍｅｒの核酸（以下、「フォワードプライマー２」ということがある）から成る。ｍ２検出用のフォワードプライマーのサイズは、１５塩基以上３８塩基以下（配列番号４は３８塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。なお、図２に、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、エクソン４とイントロン４の境界近傍の塩基配列並びにフォワードプライマー２及び後述する他のプライマー並びにプローブがハイブリダイズする領域を示す（図２に示される塩基配列は配列番号１９に示す）。
【００１３】
本発明の、ｍ２検出用のリバースプライマーは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換した核酸、好ましくは、配列表の配列番号７に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号８に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、さらに好ましくは、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する２２ｍｅｒの核酸（以下、「リバースプライマー２」ということがある）から成る。ｍ２検出用のリバースプライマーのサイズは、１５塩基以上４２塩基以下（配列番号７は４２塩基）であるが、１８塩基〜３０塩基程度が好ましい。
【００１４】
上記したｍ１又はｍ２検出用フォワードプライマー並びにｍ２検出用リバースプライマーは、核酸増幅法におけるプライマーとして用いられるものである。核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、代表的なものとしてＰＣＲ法を挙げることができる。ＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、容易に実施することができる。なお、本発明のプライマーは、キャピラリーチューブ（内径が通常０．５ｍｍ〜１ｍｍ程度、内容積が通常１０〜２０μｌ程度の毛管）内でＰＣＲを行う、迅速なＰＣＲ法に用いる場合に最も威力を発揮するが、核酸増幅法による増幅効率が極めて高いプライマーであるので、必ずしも、キャピラリーチューブ内で行うＰＣＲに限定されるものではなく、通常のＰＣＲにも適用できる。また、核酸増幅法は、ＰＣＲ法に限定されるものではなく、他の核酸増幅法に用いることも可能である。
【００１５】
核酸増幅法は、また、増幅産物をリアルタイムで測定する、リアルタイム核酸増幅法によっても行うことができる。リアルタイム核酸増幅法の代表例はリアルタイム検出ＰＣＲ法であり、被検ｍＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型として、周知の方法により行うことができる。リアルタイム検出ＰＣＲ法には、インターカレーション法、ＴａｑＭａｎ（商品名）プローブ法、Ｓｕｎｒｉｓｅユニプライマー（商品名）（モレキュラービーコン法）及びハイブリダイゼーションプローブ法等があるが、上記本発明のプライマーは、これらのいずれにも用いることができ、好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブ法に用いることができる。これらのリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は、周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。ＰＣＲ反応は、マイクロチューブ内で行ってもよいが、より容積の小さいキャピラリーチューブ内で行うと、反応液の温度変更をより迅速、的確に行うことができ好ましい。キャピラリーチューブ及びこれを用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行うための装置は、ライトサイクラーの商品名でＲｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されている。
【００１６】
本発明は、さらに、上記本発明のプライマーを用いて増幅された増幅産物の測定に有用なプローブをも提供する。本発明のｍ１検出用の一組のプローブは、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１０に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン５中の点突然変異ｍ１が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されているものであり、好ましくは、配列表の配列番号１１（配列番号１１に示す塩基配列は、配列番号１０に示す塩基配列の一部である）に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする一組のプローブであり、さらに好ましくは、１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１２に示す塩基配列を有する２０ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ１」ということがある）であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１３に示す塩基配列を有する３３ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ２」というこがある）一組のプローブである。ここで、ＦＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）であり、ＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素の組み合わせは周知であり、市販もされている。ドナー蛍光色素の例として、フルオレッセイン、アクセプター蛍光色素の例として、ＬＣ　Ｒｅｄ６４０、ＬＣ　Ｒｅｄ７０５等を挙げることができる。これらの蛍光色素は、ハイブリダイゼーションプローブ法のための市販のキットに含まれている。各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域、好ましくは末端のヌクレオチドに結合される。例えば、プローブがアンチセンス鎖とハイブリダイズする場合、上流の領域（センス鎖を基準として）にハイブリダイズするプローブの３’末端にドナー色素（又はアクセプター色素）を結合し、下流の領域にハイブリダイズするプローブの５’末端にアクセプター色素（又はドナー色素）を結合する。このようにすることにより、一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプター色素とが近接して存在するので、これらが共働してＦＲＥＴ効果が起きるので、プローブ、ひいては増幅産物の測定が可能になる。各プローブのサイズは１５塩基以上であるが、１８塩基〜３５塩基程度が好ましい。本発明の一組のプローブは、特に、ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ法に好ましく用いられるが、リアルタイム検出ではない核酸増幅法による増幅産物の測定に用いることもできる。
【００１７】
本発明のｍ２検出用の一組のプローブは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖に、１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする、それぞれ１５塩基以上の一組の核酸であって、各核酸は、配列表の配列番号１４に示す塩基配列又はその相補鎖の領域と同一の塩基配列を有し、いずれか一方の核酸は、ヒトチトクロムＰ４５０　２Ｃ１９遺伝子のエクソン４中の点突然変異ｍ２が生じる部位を含む領域とハイブリダイズするものであり、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働してＦＲＥＴ効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合されているものであり、好ましくは、配列表の配列番号１５（配列番号１５に示す塩基配列は配列番号１４に示す塩基配列の一部である）に示す塩基配列又はその相補鎖にハイブリダイズする一組のプローブであり、さらに好ましくは、１つのプローブの核酸が、配列表の配列番号１６に示す塩基配列を有する１９ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ３」ということがある）であり、他のプローブの核酸が、配列表の配列番号１７に示す塩基配列を有する３１ｍｅｒの核酸（以下、「プローブ４」というこがある）一組のプローブである。他の説明については、上記したｍ１検出用の一組のプローブと同様である。
【００１８】
本発明のｍ１の検出方法は、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマーと、該フォワードプライマーと共働して、ｍ１を含む増幅産物を生成するｍ１検出用リバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む。ｍ１検出用リバースプライマーとしては、公知のものを用いることができ、例えば、配列番号２０に示す２２ｍｅｒの核酸から成るリバースプライマー（以下、「リバースプライマー１」と言うことがある）を用いることができる。増幅産物は、公知のＲＦＬＰ法に付して突然変異の有無を調べたり、ダイレクトシークエンスによることも可能であるが、上記した本発明のｍ１検出用の一組のプローブとハイブリダイズさせ、得られたハイブリッドの融解温度を測定する方法が簡便で好ましい。上記した本発明のｍ１検出用の一組のプローブのうちの一方のプローブは、ｍ１の部位を含む、野生型の遺伝子の領域と同一の塩基配列を有しているので、野生型の遺伝子とのハイブリッドの融解温度は、該プローブとのミスマッチを含む、変異型の遺伝子とのハイブリッドの融解温度よりも高くなる。従って、この融解温度を測定することにより点突然変異の検出を行うことができる。しかも、遺伝子が、野生型と変異型のヘテロ接合になっている場合には、２つの融解温度が測定されるので、ヘテロ接合かホモ接合かの区別もできる。従って、この方法によれば、ジェノタイプをも調べることができる。なお、融解温度の測定は、温度を徐々に上げながら蛍光を測定することにより行うことができる。一組のプローブのうち、少なくともいずれか一方のプローブが、増幅産物から離れるとＦＲＥＴが起きなくなるので、蛍光が出なくなる。温度を横軸に取り、蛍光を縦軸に取って得られる曲線の傾きを測定し、温度を横軸に取り、該傾きを縦軸に取ってプロットするとピークが描かれる。そのピークの温度が融解温度である。ヘテロ接合の場合には、このピークが２つ描かれる。なお、ＦＲＥＴ効果を発揮する一組のプローブを用いて、増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定することにより点突然変異を検出する手法自体は周知であり、上記したライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）のような市販のキット及び装置を用いて容易に行うことができる。
【００１９】
本発明のｍ２の検出方法は、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマーと、上記本発明のｍ２検出用リバースプライマーとを用いて核酸増幅法により被検核酸を増幅することを含む。増幅産物は、公知のＲＦＬＰ法に付して突然変異の有無を調べたり、ダイレクトシークエンスによることも可能であるが、上記した本発明のｍ２検出用の一組のプローブとハイブリダイズさせ、得られたハイブリッドの融解温度を測定する方法が簡便で好ましい。他の説明は、上記したｍ１の検出方法と同様である。
【００２０】
本発明の好ましい方法では、上記本発明のｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ１検出用リバースプライマー、上記本発明のｍ２検出用フォワードプライマー、上記本発明のｍ２検出用リバースプライマー、上記本発明のｍ１検出用の一組のプローブ及び上記本発明のｍ２検出用の一組のプローブの存在下において被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に前記それぞれの一組のプローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定する。この方法によれば、１つの操作で、ｍ１及びｍ２の検出を行うことができる。なお、この場合、ｍ１検出用プローブとｍ２検出用プローブのアクセプター色素として、識別可能な異なる色素を用いれば、ｍ１及びｍ２を区別して検出することができる。単一の操作で、ｍ１及びｍ２の両者の検出が可能なようにプライマー及びプローブを設定するのは容易なことではなく、本発明の１つの顕著な効果である。
【００２１】
なお、本発明の方法は、用いるプライマー又は用いるプライマーとプローブに特徴があり、核酸増幅法自体は、市販のキット及び装置を用いて周知の方法により行うことができる。とりわけ、キャピラリーチューブ内でＰＣＲを行う方法が、迅速で好ましい。この方法は、上記のように、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）のような市販のキット及び装置を用いて容易に行うことができる。また、チトクロム遺伝子は、種々の細胞に普遍的に存在するので、被検試料は、ヒトの任意の組織由来のＤＮＡであってよい。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１、比較例１〜４
（１）　概要
上記したフォワードプライマー１（配列番号３）、リバースプライマー１（配列番号２０）、フォワードプライマー２（配列番号６）、リバースプライマー２（配列番号９）をプライマーとして用い、さらに上記したプローブ１（配列番号１２、３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合）、プローブ２（配列番号１３、５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ７０５を結合、３’末端はリン酸化）プローブ３（配列番号１６、３’末端にドナー色素であるフルオレッセインを結合）、プローブ４（配列番号１７、５’末端にアクセプター色素であるＬＣ　Ｒｅｄ６４０を結合、３’末端はリン酸化）をハイブリダイゼーションプローブとして用いた、ハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲを行い、さらにプローブと増幅産物とのハイブリッドの融解温度測定した（実施例１）。被検試料は、ｍ１及びｍ２を含む、ヘテロ接合体であることがわかっているヒトＤＮＡであった。一方、比較のため、市販のコンピューターソフトを駆使し、該コンピューターソフトが推奨する適切なプライマー及びプローブを用いたことを除き、実施例１と全く同様にして測定を行った（比較例１〜４）。比較例で用いたｍ１検出用フォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー１’」）、ｍ２検出用フォワードプライマー（以下、「フォワードプライマー２’」）及びｍ２検出用リバースプライマー（以下、「リバースプライマー２’」）の塩基配列を、配列番号２１、２２及び２３にそれぞれ示す。比較例１〜４では、これらのプライマーを、実施例１で用いたプライマー及びプローブと組み合わせて用いた。各例で用いたプライマー及びプローブの組み合わせを下記表１に示す。
【００２４】
【表１】
表１

【００２５】
（２）　具体的な方法
（ｉ）　被検ＤＮＡの調製
ヒトの血液及び組織から、常法により全ＤＮＡを抽出し、被検ＤＮＡとして用いた。
（ｉｉ）　ライトサイクラー（商品名）を用いたハイブリダイゼーションプローブ法によるリアルタイム検出ＰＣＲ
下記表２に示す組成を有するＰＣＲマスター混合物を調製した。
【００２６】
【表２】
表２

【００２７】
ライトサイクラー（商品名）に付属するキャピラリーに、上記ＰＣＲマスター混合物１５μｌを入れ、（ｉ）で得られたｃＤＮＡ溶液又はネガティブコントロールとして水５μｌを加えた。キャピラリーチューブに栓をし、ライトサイクラー（商品名）装置にセットして、９５℃、１０秒間の変性工程後、９５℃、１０秒間の変性工程、６０℃、１０秒間のアニーリング工程、及び６５℃、１５秒間の伸長工程から成るサイクルを繰り返した。増幅反応中、蛍光をリアルタイムで測定し、ＣＰ値を測定した。なお、ＣＰ値は、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした場合に、蛍光強度が急激に立ち上がるサイクル数を意味し、被検核酸の量が同一である場合には、これが小さいほど増幅効率が高い。
【００２８】
増幅後、反応液の温度を４０℃まで冷却し、次いで、蛍光を測定しながら、０．２℃／秒の速度で昇温した。商品に添付のコンピューターソフトを用いて、温度を横軸、蛍光強度を縦軸にした曲線を描き、同ソフトを用いて各温度における該曲線の傾きを求め、各温度と該傾きとの関係を描く曲線のピークから、プローブと増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定した。
【００２９】
（３）　結果
結果を下記表３に示す。
【００３０】
【表３】
表３

【００３１】
表３から明らかなように、コンピューターソフトが推奨するｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ２検出用フォワードプライマー及びｍ２検出用リバースプライマーを１つでも用いたものは、ｍ１を含むエクソン５領域又はｍ２を含むエクソン４領域の増幅が認められず、点突然変異の検出もできなかった。これに対し、本発明のｍ１検出用フォワードプライマー、ｍ２検出用フォワードプライマー及びｍ２検出用リバースプライマーを用いた実施例１では、野生型と変異型のヘテロ接合であることが明確に検出された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のプライマーは、増幅効率が極めて高いので、キャピラリーチューブ内でＰＣＲを行う場合でも、被検核酸を増幅することができる。よって、本発明により、迅速にｍ１及びｍ２の検出を行うことが可能になった。
【００３３】
【配列表】

【００３４】

【００３５】

【００３６】

【００３７】

【００３８】

【００３９】

【００４０】

【００４１】

【００４２】

【００４３】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、イントロン４とエクソン５の境界近傍の塩基配列並びに塩基配列並びに実施例及び比較例で用いたプライマー及びプローブがハイブリダイズする位置を示す図である。
【図２】ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子中の、エクソン４とイントロン４の境界近傍の塩基配列並びに塩基配列並びに実施例及び比較例で用いたプライマー及びプローブがハイブリダイズする位置を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid for detecting a point mutation in a human cytochrome P450 2C19 gene (hereinafter, sometimes referred to as “CYP2C19”) and a method for detecting a CYP2C19 point mutation using the nucleic acid.
[0002]
[Prior art]
There is a genetic polymorphism in the metabolic capacity of (S) -mephenytoin, an anticonvulsant. This genetic polymorphism is associated not only with the metabolism of (S) -mephenytoin, but also with the oxidative metabolic capacity of the clinically important diazepam, imipramine, omeprazole and propranolol and the selective serotonin reuptake inhibitor. Therefore, it is clinically important to examine the metabolic abnormality of (S) -mephenytoin.
[0003]
Conventionally, the metabolic abnormality of (S) -mephenytoin is determined by orally administering (S) -mephenytoin to a subject and quantifying 4′-hydroxymephenytoin contained in urine excreted 8 hours later. It was done. However, this method is time consuming and requires administration of unnecessary drugs to the subject.
[0004]
The genetic cause of (S) -mephenytoin metabolic abnormalities has been elucidated, at least for the Japanese. That is, a point mutation in which G in exon 5 of CYP2C19 becomes A (the site is 681 nt of the CYP2C19 cDNA (that is, 117 nt of the nucleotide sequence in FIG. 1), and this point mutation is herein referred to as “m1”. (Sonia MF de Morais et al., The Journal of Biological Chemistry Vol. 269, No. 22, pp. 15419-15422, 1994, and G in the exon 4 of the CYP2C19 mutation at exon 4) Refers to 636 nt of the CYP2C19 cDNA (ie, 234 nt of the nucleotide sequence in FIG. 2; this point mutation is referred to herein as “m2”) (Sonia MF de Morais et al., Molecular Pharmacrocloth). gy, 46: 594-598, 1994. It is known that abnormal metabolism of (S) -mephenytoin occurs due to at least one of the above-mentioned m1 and m2 in

exons

5 and 4 of CYP2C19. Metabolic abnormalities of (S) -mephenytoin can be examined, and its genotype can be classified (genotyping).
[0005]
Each of the above documents describes a method for detecting m1 and m2 by the PCR-RFLP method. That is, PCR is performed for each of exon 5 and exon 4 using each pair of primers, and the amplified product is digested with a restriction enzyme and separated by electrophoresis, whereby fragments having different sizes depending on the presence or absence of the mutation are obtained. Is detected.
[0006]
Further, Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-14585, which was an earlier application of the present applicant, discloses that m1 and m2 can be detected by a single PCR by improving primers so that m1 and m2 can be detected by a single PCR. Are described.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the PCR-RFLP method requires operations such as digestion with restriction enzymes and separation of amplified fragments by electrophoresis, and requires a large number of samples to be tested within a limited time, such as hospitals and clinical test centers. Then, a method that can perform the inspection more quickly is desired.
[0008]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method capable of rapidly detecting point mutations m1 and m2 in CYP2C19, and a primer and a probe therefor.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors perform amplification by PCR in a capillary tube, which has recently been used, and hybridize a set of probes using FRET (fluorescence resonance energy transfer) to an amplification product. By measuring the melting temperature of the hybrid, it was considered whether m1 and m2 could be detected using a method for detecting point mutation. Amplification by PCR in a capillary tube is such that the denaturation, annealing, and extension steps are performed in a much shorter time than conventional PCR, and the overall amplification reaction can be performed in a fraction of the time of conventional PCR. Is an advantageous feature. However, since each step is a short time, amplification is hardly performed unless primers are properly set, and point mutation cannot be detected. The present inventors have attempted to detect m1 and m2 using known primers for detection of m1 and m2 and primers recommended by commercially available computer software, but have not succeeded. Therefore, as a result of intensive research, we have found a primer with extremely high amplification efficiency and a set of probes with high detection sensitivity that can detect m1 and m2 sharply even using PCR in a capillary tube independently. Succeeded and completed the present invention.
[0010]
That is, the present invention relates to a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, or a human having a nucleic acid amplification method comprising 10% or less of the nucleotides substituted. A forward primer for detecting a point mutation m1 in exon 5 of the cytochrome P450 2C19 gene is provided. In addition, the present invention relates to a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, or a human having a nucleic acid amplification method comprising 10% or less of the nucleotides substituted. A forward primer for detecting a point mutation m2 in exon 4 of the cytochrome P450 2C19 gene is provided. Furthermore, the present invention relates to a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing, or a human having a nucleic acid amplification method comprising 10% or less of the nucleotides substituted. A reverse primer for detecting a point mutation m2 in exon 4 of the cytochrome P450 2C19 gene is provided. Furthermore, the present invention relates to a set of nucleic acids each having 15 bases or more, each of which hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing or a complementary strand thereof at intervals of 1 to 5 bases, Has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or a region complementary thereto, and one of the nucleic acids has a point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene. Of the human cytochrome P450 2C19 gene, which hybridizes with the region containing the site, and in the hybridized state, a fluorescent dye which produces a FRET effect in cooperation with the terminal regions adjacent to each other in the hybridized state. A set of probes for the detection of point mutation m1 in exon 5 is provided. Furthermore, the present invention relates to a set of nucleic acids each having 15 bases or more, each of which hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing or a complementary strand thereof at intervals of 1 to 5 bases, Has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing or a region complementary thereto, and one of the nucleic acids has a point mutation m2 in exon 4 of the human cytochrome P450 2C19 gene. Of the human cytochrome P450 2C19 gene, which hybridizes with the region containing the site, and in the hybridized state, a fluorescent dye which produces a FRET effect in cooperation with the terminal regions adjacent to each other in the hybridized state. A set of probes for the detection of point mutation m2 in exon 4 is provided. Further, the present invention provides a forward primer for detecting m1 of the present invention, and a reverse primer which, in cooperation with the forward primer, generates an amplification product containing a point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene. And a method for detecting a point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene, comprising amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification method using Further, the present invention provides an exon 4 of the human cytochrome P450 2C19 gene, which comprises amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification method using the m2 detection forward primer of the present invention and the reverse primer of the present invention. And a method for detecting the point mutation m2. Further, the present invention provides a forward primer for m1 detection according to the present invention, and a reverse primer which, in cooperation with the forward primer, generates an amplification product to which the set of probes for m1 detection of the present invention hybridizes. The presence of the forward primer for detecting m2 of the present invention, the reverse primer of the present invention, a set of probes for detecting m1 of the present invention, and a set of probes for detecting m2 of the present invention. Amplifying the test nucleic acid and hybridizing the respective set of probes to the respective amplification products obtained, and measuring the melting temperature thereof, comprising the steps of: A method is provided for simultaneously detecting a mutation m1 and a point mutation m2 in exon 4 of the gene.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The forward primer for m1 detection of the present invention is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of bases of the nucleic acid are substituted, Preferably, a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, more preferably a continuous base of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing It is composed of a nucleic acid having a sequence, more preferably a 23-mer nucleic acid having a base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing (hereinafter, sometimes referred to as “forward primer 1”). In addition, the above-mentioned substitution is preferably as small as possible, most preferably without substitution, and even if substitution is present, it is relatively preferred that there is substitution at one base, especially at or near the 5 'end. This is also true for the forward primer and the reverse primer for detecting m2 described below, which allow substitution. The size of the forward primer for detecting m1 is 15 bases or more and 43 bases or less (43 bases in SEQ ID NO: 1), and preferably about 18 bases to 30 bases. FIG. 1 shows the base sequence in the CYP2C19 gene near the boundary between intron 4 and exon 5, and the region where the forward primer 1 and other primers and probes described below hybridize (the base sequence shown in FIG. (Shown in SEQ ID NO: 18).
[0012]
The forward primer for detecting m2 of the present invention is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of bases of the nucleic acid are substituted, Preferably, a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, and more preferably a continuous base of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing It is composed of a nucleic acid having a sequence, more preferably an 18-mer nucleic acid having a base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (hereinafter, sometimes referred to as “forward primer 2”). The size of the forward primer for detecting m2 is 15 bases or more and 38 bases or less (38 bases in SEQ ID NO: 4), and preferably about 18 to 30 bases. FIG. 2 shows the base sequence in the CYP2C19 gene near the boundary between exon 4 and intron 4, and the region where the forward primer 2 and other primers and probes described below hybridize (the base sequence shown in FIG. SEQ ID NO: 19).
[0013]
The reverse primer for m2 detection of the present invention is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of bases of the nucleic acid are substituted, Preferably, a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing, more preferably a continuous base of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing It is composed of a nucleic acid having a sequence, more preferably a 22-mer nucleic acid having a base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (hereinafter sometimes referred to as “reverse primer 2”). The size of the reverse primer for detecting m2 is 15 to 42 bases (42 bases in SEQ ID NO: 7), and preferably about 18 to 30 bases.
[0014]
The forward primer for detecting m1 or m2 and the reverse primer for detecting m2 are used as primers in a nucleic acid amplification method. The nucleic acid amplification method itself is well known in this field, and a typical example is a PCR method. The PCR method itself is well known, and kits and apparatuses for the PCR method are commercially available, so that it can be easily implemented. The primer of the present invention is most effective when used in a rapid PCR method in which PCR is performed in a capillary tube (capillary tube having an inner diameter of usually about 0.5 mm to 1 mm and an inner volume of usually about 10 to 20 μl). However, since the primers have extremely high amplification efficiency by the nucleic acid amplification method, they are not necessarily limited to PCR performed in a capillary tube, and can be applied to ordinary PCR. Further, the nucleic acid amplification method is not limited to the PCR method, but can be used for other nucleic acid amplification methods.
[0015]
The nucleic acid amplification method can also be performed by a real-time nucleic acid amplification method in which an amplification product is measured in real time. A typical example of the real-time nucleic acid amplification method is a real-time detection PCR method, which can be performed by a known method using cDNA of a test mRNA as a template. The real-time detection PCR method includes an intercalation method, a TaqMan (trade name) probe method, a Sunrise Uniprimer (trade name) (molecular beacon method), a hybridization probe method, and the like. And preferably used for the hybridization probe method. These real-time detection PCR methods themselves are well known, and kits and apparatuses for the real-time detection PCR method are commercially available, and thus can be easily performed. Although the PCR reaction may be performed in a microtube, it is preferable to perform the PCR reaction in a smaller-capacity capillary tube because the temperature of the reaction solution can be changed more quickly and accurately. A capillary tube and an apparatus for performing real-time detection PCR using the same are commercially available from Roche Diagnostics under the trade name of Lightcycler.
[0016]
The present invention further provides a probe useful for measuring an amplification product amplified using the primer of the present invention. One set of probes for m1 detection of the present invention is a set of 15 bases or more, each of which hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or its complementary strand at an interval of 1 to 5 bases. Each nucleic acid has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or the region of the complementary strand thereof, and one of the nucleic acids is in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene. Hybridizes with the region containing the site where the point mutation m1 occurs, and in the hybridized state, the fluorescent dyes that cooperate with each other and generate the FRET effect are bound to the terminal regions adjacent to each other in each nucleic acid. And preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 is a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10) or a nucleotide sequence thereof. And more preferably, the nucleic acid of one probe is a 20-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing (hereinafter, referred to as “probe 1”). And a nucleic acid of the other probe is a set of probes of a 33-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing (hereinafter, sometimes referred to as “probe 2”). Here, FRET is a fluorescence resonance energy transfer, and a combination of fluorescent dyes that produce the FRET effect is well known and commercially available. Examples of the donor fluorescent dye include fluorescein, and examples of the acceptor fluorescent dye include LC Red 640 and LC Red 705. These fluorescent dyes are included in commercial kits for the hybridization probe method. Each fluorescent dye is bound to a terminal region adjacent to each nucleic acid, preferably a terminal nucleotide, in a state of being hybridized with the amplification product. For example, when the probe hybridizes to the antisense strand, a donor dye (or acceptor dye) is bound to the 3 ′ end of the probe that hybridizes to the upstream region (based on the sense strand), and hybridizes to the downstream region. An acceptor dye (or donor dye) is bound to the 5 ′ end of the probe to be used. By doing so, in a state where a set of probes is hybridized to the amplification product, the donor dye and the acceptor dye are present in close proximity, and they cooperate to produce a FRET effect. Amplification products can be measured. The size of each probe is 15 bases or more, preferably about 18 bases to 35 bases. The set of probes of the present invention is particularly preferably used for real-time detection PCR by the hybridization probe method, but can also be used for measurement of an amplification product by a nucleic acid amplification method other than real-time detection.
[0017]
One set of probes for detecting m2 of the present invention is a set of 15 bases or more, each of which hybridizes to the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing or its complementary strand at an interval of 1 to 5 bases. Each nucleic acid has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 of the sequence listing or the region of the complementary strand thereof, and one of the nucleic acids is in exon 4 of the human cytochrome P450 2C19 gene. Hybridizes with the region containing the site where the point mutation m2 occurs. In the hybridized state, fluorescent dyes that cooperate with each other to generate a FRET effect are bound to the terminal regions adjacent to each other in each nucleic acid. And preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 is a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14) or a sequence thereof It is a set of probes that hybridize to the complementary strand, and more preferably, the nucleic acid of one probe is a 19-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing (hereinafter, may be referred to as “probe 3”. ), And the nucleic acid of the other probe is a set of probes of a 31-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing (hereinafter, sometimes referred to as “probe 4”). The other description is the same as the above-described pair of probes for detecting m1.
[0018]
The method for detecting m1 of the present invention is a nucleic acid amplification method using the above-described forward primer for detecting m1 of the present invention and a reverse primer for detecting m1 that cooperates with the forward primer to generate an amplification product containing m1. Amplifying the test nucleic acid. As the reverse primer for m1 detection, a known reverse primer can be used. For example, a reverse primer consisting of a 22-mer nucleic acid shown in SEQ ID NO: 20 (hereinafter, may be referred to as “reverse primer 1”) can be used. . The amplification product can be subjected to a known RFLP method to check for the presence or absence of mutation, or by direct sequencing, but can be obtained by hybridizing with the above-described set of probes for detecting m1 of the present invention. The method of measuring the melting temperature of the hybrid is simple and preferable. One of the above-described set of probes for detecting m1 of the present invention has the same nucleotide sequence as that of the wild-type gene, including the m1 site. Has a melting temperature higher than the melting temperature of the hybrid with the mutant gene, including a mismatch with the probe. Therefore, the point mutation can be detected by measuring the melting temperature. In addition, when a gene is heterozygous for wild type and mutant type, two melting temperatures are measured, so that it is possible to distinguish between heterozygous and homozygous. Therefore, according to this method, the genotype can also be examined. The melting temperature can be measured by measuring fluorescence while gradually increasing the temperature. When at least one of the probes in the set is separated from the amplification product, FRET does not occur, so that no fluorescence is emitted. The temperature is plotted on the abscissa, the fluorescence is plotted on the ordinate, and the slope of the curve is measured. The temperature is plotted on the abscissa, and the slope is plotted on the ordinate, and a peak is drawn. The temperature at the peak is the melting temperature. In the case of a heterojunction, two peaks are drawn. The technique of detecting a point mutation by measuring the melting temperature of a hybrid with an amplification product using a set of probes exhibiting a FRET effect is well known, and is described in the light cycler (Roche Diagnostics, Inc.). ) Can be easily carried out using a commercially available kit and device.
[0019]
The method for detecting m2 of the present invention includes amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification method using the above-described forward primer for detecting m2 of the present invention and the reverse primer for detecting m2 of the present invention. The amplification product can be subjected to a known RFLP method to check for the presence or absence of mutation, or can be obtained by direct sequencing, but can be obtained by hybridizing with the above-described set of probes for detecting m2 of the present invention. The method of measuring the melting temperature of the hybrid is simple and preferable. The other description is the same as the above-described method of detecting m1.
[0020]
In a preferred method of the present invention, the forward primer for detecting m1 of the present invention, the reverse primer for detecting m1; the forward primer for detecting m2 of the present invention; the reverse primer for detecting m2 of the present invention; Amplifying the test nucleic acid in the presence of one set of probes and the one set of probes for m2 detection of the present invention, and allowing the respective one set of probes to hybridize to each obtained amplification product, Measure the melting temperature. According to this method, m1 and m2 can be detected by one operation. Note that, in this case, if different identifiable dyes are used as the acceptor dyes of the m1 detection probe and the m2 detection probe, m1 and m2 can be distinguished and detected. It is not easy to set primers and probes so that both m1 and m2 can be detected by a single operation, which is one remarkable effect of the present invention.
[0021]
The method of the present invention is characterized by the primers used or the primers and probes used, and the nucleic acid amplification method itself can be performed by a known method using a commercially available kit and apparatus. In particular, a method of performing PCR in a capillary tube is quick and preferable. This method can be easily performed using a commercially available kit and apparatus such as a light cycler (manufactured by Roche Diagnostics) as described above. In addition, since the cytochrome gene is universally present in various cells, the test sample may be DNA derived from any human tissue.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0023]
Example 1, Comparative Examples 1-4
(1) Outline Using the above-described forward primer 1 (SEQ ID NO: 3), reverse primer 1 (SEQ ID NO: 20), forward primer 2 (SEQ ID NO: 6), and reverse primer 2 (SEQ ID NO: 9) as primers, and further using the above-described probe Probe 1 (SEQ ID NO: 12, 3 'end bound with fluorescein as a donor dye), Probe 2 (SEQ ID NO: 13, 5' end bound with LC Red705 as an acceptor dye, 3 'end is phosphorylated) Probe 3 (SEQ ID NO: 16, fluorescein as a donor dye is bound to the 3 ′ end), and Probe 4 (SEQ ID NO: 17, LC Red640 as an acceptor dye is bound to the 5 ′ end, phosphorylation at the 3 ′ end) Real-time detection PCR by hybridization probe method used as a probe There was further melting temperature measurements of the hybrid between the probe and an amplification product (Example 1). The test sample was human DNA known to be heterozygous, including m1 and m2. On the other hand, for comparison, measurement was performed in the same manner as in Example 1 except that commercially available computer software was used and appropriate primers and probes recommended by the computer software were used (Comparative Examples 1 to 4). ). The forward primer for detecting m1 (hereinafter, “forward primer 1 ′”), the forward primer for detecting m2 (hereinafter, “forward primer 2 ′”), and the reverse primer for detecting m2 (hereinafter, “reverse primer 2 ′”) used in Comparative Examples ") Are shown in SEQ ID NOs: 21, 22, and 23, respectively. In Comparative Examples 1 to 4, these primers were used in combination with the primers and probes used in Example 1. The combinations of primers and probes used in each example are shown in Table 1 below.
[0024]
[Table 1]
Table 1

[0025]
(2) Specific method (i) Preparation of test DNA Total DNA was extracted from human blood and tissues by a conventional method and used as test DNA.
(Ii) Real-time detection PCR by hybridization probe method using light cycler (trade name)
A PCR master mixture having the composition shown in Table 2 below was prepared.
[0026]
[Table 2]
Table 2

[0027]
15 μl of the PCR master mixture was placed in a capillary attached to a light cycler (trade name), and 5 μl of the cDNA solution obtained in (i) or water as a negative control was added. Cap the capillary tube, set it on a LightCycler (trade name) apparatus, and after a denaturation step at 95 ° C for 10 seconds, a denaturation step at 95 ° C for 10 seconds, an annealing step at 60 ° C for 10 seconds, and 65 ° C. , A 15 second extension step was repeated. During the amplification reaction, the fluorescence was measured in real time and the CP value was measured. Note that the CP value means the number of cycles in which the fluorescence intensity sharply rises when the number of cycles is plotted on the horizontal axis and the fluorescence intensity is plotted on the vertical axis, and is small when the amounts of the test nucleic acids are the same. The higher the amplification efficiency, the higher the amplification efficiency.
[0028]
After the amplification, the temperature of the reaction solution was cooled to 40 ° C., and then the temperature was increased at a rate of 0.2 ° C./sec while measuring the fluorescence. Using computer software attached to the product, draw a curve with temperature on the horizontal axis and fluorescence intensity on the vertical axis, use the software to determine the slope of the curve at each temperature, and determine the relationship between each temperature and the slope. From the peak of the drawn curve, the melting temperature of the hybrid of the probe and the amplification product was measured.
[0029]
(3) Results The results are shown in Table 3 below.
[0030]
[Table 3]
Table 3

[0031]
As is apparent from Table 3, the exon 5 region containing m1 or the exon containing m2, which uses at least one of the forward primer for m1 detection, the forward primer for m2 detection and the reverse primer for m2 detection recommended by the computer software, No amplification of the four regions was observed, and no point mutation was detected. In contrast, in Example 1 using the forward primer for detecting m1, the forward primer for detecting m2, and the reverse primer for detecting m2 of the present invention, it was clearly detected that the heterozygote was a wild type and a mutant type.
[0032]
【The invention's effect】
Since the primer of the present invention has an extremely high amplification efficiency, a test nucleic acid can be amplified even when PCR is performed in a capillary tube. Therefore, according to the present invention, it has become possible to quickly detect m1 and m2.
[0033]
[Sequence list]

[0034]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038]

[0039]

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044]

[0045]

[0046]

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a base sequence and a base sequence near the boundary between intron 4 and exon 5 in the CYP2C19 gene, and positions where primers and probes used in Examples and Comparative Examples hybridize.
FIG. 2 is a diagram showing a base sequence in the CYP2C19 gene near the boundary between exon 4 and intron 4, a base sequence, and positions where primers and probes used in Examples and Comparative Examples hybridize.

Claims

Of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene by a nucleic acid amplification method, comprising a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of the base has been substituted. Forward primer for detecting point mutation m1 in exon 5.

2. The primer according to claim 1, comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

The primer according to claim 2, wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases among the base sequences shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

The primer according to claim 3, wherein the nucleic acid comprises a 23-mer nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

Of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene obtained by the nucleic acid amplification method, comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of the nucleic acid has been substituted. Forward primer for detecting point mutation m2 in exon 4.

The primer according to claim 5, comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides among the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.

The primer according to claim 6, wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases among the base sequences shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

The primer according to claim 7, wherein the nucleic acid comprises an 18-mer nucleic acid having a base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.

Of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene by a nucleic acid amplification method, comprising a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases among the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing, or a nucleic acid in which 10% or less of the base has been substituted Reverse primer for detecting point mutation m2 in exon 4.

10. The primer according to claim 9, comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence of 15 or more consecutive nucleotides among the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.

The primer according to claim 10, wherein the nucleic acid is a nucleic acid having a continuous base sequence of 15 or more bases among the base sequences shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.

The primer according to claim 11, wherein the nucleic acid comprises a 22-mer nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.

The primer according to any one of claims 1 to 12, which is a primer for a PCR method by a hybridization probe method.

A set of 15 or more nucleotides, each of which hybridizes to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 or its complementary strand at an interval of 1 to 5 nucleotides, wherein each nucleic acid has a sequence in the sequence listing. It has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in No. 10 or a region complementary thereto, and one of the nucleic acids hybridizes with the region containing the site where the point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene occurs. In the exon 5 of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene, which is a soybean, and a fluorescent dye which cooperates to generate a FRET effect is bound to a terminal region of each nucleic acid which is close to each other in a hybridized state. A set of probes for detecting point mutation m1.

15. A set of probes which hybridize to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing or a complementary strand thereof.

The nucleic acid of one probe is a 20-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing, and the nucleic acid of the other probe is a 33-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing. Item 15. A set of probes according to Item 15.

A set of 15 or more nucleotides each hybridizing to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 or a complementary strand thereof at intervals of 1 to 5 nucleotides, wherein each nucleic acid has a sequence in the sequence listing. It has the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence shown in No. 14 or its complementary strand region, and one of the nucleic acids hybridizes with the region containing the site where the point mutation m2 in exon 4 of the human cytochrome P450 2C19 gene occurs. A point mutation in exon 4 of the human cytochrome P450 @ 2C19 gene, which is a soybean, and in which the fluorescent dyes that cooperate to generate a FRET effect are bound to the adjacent terminal regions of each nucleic acid in a hybridized state. A set of probes for detecting mutation m2.

18. A set of probes which hybridize to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing or a complementary strand thereof.

The nucleic acid of one probe is a 19-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing, and the nucleic acid of the other probe is a 31-mer nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing. Item 19. A set of probes according to Item 18.

A forward primer according to any one of claims 1 to 4, and a reverse primer which cooperates with the forward primer to generate an amplification product containing a point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene. A method for detecting a point mutation m1 in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene, comprising amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification method using the method.

21. The method according to claim 20, comprising hybridizing the amplification product with a set of probes according to any one of claims 14 to 16 and measuring the melting temperature.

The method according to claim 21, wherein the nucleic acid amplification method is performed in the presence of the set of probes according to any one of claims 14 to 16.

Amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification method using the forward primer according to any one of claims 5 to 8 and the reverse primer according to any one of claims 9 to 12. A method for detecting a point mutation m2 in exon 4 of the human cytochrome P450 2C19 gene.

24. The method according to claim 23, comprising hybridizing the amplification product with the set of probes according to any one of claims 17 to 19, and measuring the melting temperature.

The method according to claim 24, wherein the nucleic acid amplification method is performed in the presence of the set of probes according to any one of claims 17 to 19.

A forward primer according to any one of claims 1 to 4, and an amplification product, which cooperates with the forward primer, to which the set of probes according to any one of claims 14 to 16 hybridize. The reverse primer to be generated, the forward primer according to any one of claims 5 to 8, the reverse primer according to any one of claims 9 to 12, and the one according to any one of claims 14 to 16. In the presence of a set of probes according to claim 1 and a set of probes according to any one of claims 17 to 19, the test nucleic acid is amplified and the respective amplification products obtained are added to the respective amplification products. A point in exon 5 of the human cytochrome P450 2C19 gene, comprising hybridizing a set of probes and measuring its melting temperature. Natural methods of detecting mutations m1 and point mutation m2 in exon 4 of the gene at the same time.

The method according to any one of claims 20 to 26, wherein the nucleic acid amplification reaction is performed in a capillary tube.