JP2004081215A - Esterase gene - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing esterase of a transformed body microorganism introduced with a plasmid containing an esterase gene by connecting a ribosome binding site suitable for exhibiting the gene (i.e. SD-1 or SD-2) at upstream of the esterase gene. <P>SOLUTION: A polynucleotide comprising the ribosome binding site having a base sequence of a double strand DNA fragment of one of SD-1 or SD-2, a polynucleotide connected to the above-mentioned polynucleotide at upstream of one of an esterase gene encoding an amino acid sequence shown with amino acid number 1 to 362 in bacteria-originating specific amino acid sequences or an esterase gene encoding an amino acid sequence shown with base number 1 to 1086 in specific amino acid sequences and the like are provided. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

２．配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列をコードするエステラーゼ遺伝子、又は、配列番号２で示される塩基配列のうち、少なくとも１番目から１０８６番目で示される塩基配列を有するエステラーゼ遺伝子、のいずれか一方の遺伝子の上流に前項１記載のリポソーム結合領域であるポリヌクレオチドを連結してなることを特徴とするポリヌクレオチド；
３．前項１または前項２記載のポリヌクレオチドを有するプラスミド；
を提供するものである。
尚、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列をコードするエステラーゼ遺伝子を、以下、本遺伝子と記すこともあり、（２）該遺伝子を含有するプラスミドを、以下、本プラスミドと記すこともあり、（３）該プラスミドを含有する微生物を、以下、本微生物と記すこともあり、（４）該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造方法を、以下、本製造方法と記すこともある。
【０００５】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本遺伝子は、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物
由来のものであり、これがコードするエステラーゼは、以下の性質を有する。
分子量：３９３４８，ｐＩ：３．　９，反応至適ｐＨ：９．　０、反応至適温度：４０℃　　さらに本酵素はグルタル酸ジメチル、アジピン酸ジメチル、ピメリン酸ジメチル、シス−イミダゾリシンジカルボン酸メチルエステルなどのカルボン酸エステル類，トリプロピオニンなどのトリグリセライドエステル類あるいはグルタミン酸ジエチルエステルなどのアミノ酸エステル類の化合物に対して活性を示す。なお、クロモバクテリウム属に属する微生物は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＳＣ−ＹＭ−１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１４００９）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００６】
本遺伝子は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　、　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラークローニング　第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）　、コールドスプリング　ハーバー　　ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じて得られる。
すなわち、エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するためには、微生物を通常の培養方法によって培養し、該微生物が産生するエステラーゼを精製する。なお、培養は、例えば、培地としてグルコース，デンプン加水分解物，糖蜜等の炭素源、酵母エキス，肉エキス，ポリペプトン，トリプトン等の窒素源、無機イオンさらに必要に応じ硫酸塩、リン酸塩等を含有する通常のものを用いて、好気条件下、適宜培地のｐＨおよび温度を調節することにより行うことができる。培養時間は培地中のエステラーゼ活性が最高になるところまで行うことが望ましいが、必ずしもその必要はない。得られた培養菌体を超音波破砕し、硫安分画した後、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた通常の単離・精製の方法によりエステラーゼを精製する。得られたエステラーゼをアミノ酸配列アナライザーにかけ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列情報から合成ＤＮＡプローブを作製する。
別に培養して得た微生物菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊し、そしてプロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλｇｔ１１、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。それを例えば、エステラーゼに対する抗体を用いた免疫学的方法、エステラーゼの部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、エステラーゼの活性を測定する方法等のスクリーニング法により、本遺伝子を取得することができる。この様にして取得した本遺伝子を利用すれば、通常の遺伝子工学的方法に準じて、エステラーゼを大量に製造、取得することができる。より詳細には、本遺伝子が宿主微生物細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主微生物細胞に導入して形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。　　上記のプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物細胞からの単離・精製が容易であり、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本遺伝子を導入したものを好ましくあげることができる。なお、発現ベクターは各種のものが既に市販されており、これに本遺伝子を導入するために用いられる発現ベクター切断用制限酵素も市販されている。例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（これらは、発現ベクターとしてあるいはプロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社より市販されている）を用いることができる。さらには本遺伝子上流にリボゾーム結合領域を連結することにより、より高発現が可能となる。リボゾーム結合領域としてはＧｕａｒｅｎｔｅ．Ｌら（Ｃｅｌｌ　２０　ｐ５４３（１９８０））による報告や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｐ２０２　（１９８２）　講談社）による報告のものが知られているが、望ましくは、たとえば後述のＳＤ−１やＳＤ−２をあげることができる。このように、本遺伝子の発現に適したリボゾーム結合領域を設計し、合成してもよい。　宿主微生物細胞に上記プラスミドを導入するには、通常の遺伝子工学的方法が用いられる。
宿主微生物細胞としては、真核生物および原核生物のいずれも用いることができ、好ましくは、例えば大腸菌等を挙げることができる。
前記のプラスミドを導入した宿主微生物細胞は、該微生物において通常用いられる培養方法によって培養することができる。たとえば、大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む通常の培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気攪拌された液体培養方法をあげることができる。
この様にして得られた本微生物の培養菌体からのエステラーゼの採取は、適宜通常の単離・精製の方法を組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養終了後、菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せしめ、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良い。　　こうして製造したエステラーゼを産生する組換え菌体は、エステル加水分解を行うバイオリアクターとして、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物の生産に利用することが可能である。
また、本微生物を培養することによってエステラーゼを大量に蓄積させた培養菌体を得て、これをそのままエンザイムリアクターとして利用することもできる。
【０００７】
【実施例】
以下に、実施例をあげ、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０００８】
実施例１　　（エステラーゼの分離およびＮ末端アミノ酸配列の決定）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＳＣ−ＹＭ−１　を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）　、Ｋ_２　ＨＰＯ_４　０．　１％（Ｗ／Ｖ）　、ＭｇＳＯ_４　０．　０２％（Ｗ／Ｖ）　、ｐＨ７．　３）で、３０℃、２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）　、Ｋ_２　ＨＰＯ_４　０．　１％（Ｗ／Ｖ）　、ＭｇＳＯ_４　０．　０２％（Ｗ／Ｖ）　、ｐＨ７．　３）に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ　６６０　　が１０に達するまで培養し、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収した。回収された菌体を０．　１Ｍリン酸緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ_２　、ｐＨ７．　５）８００ｍｌに懸濁し、フレンチプレス処理（２０００ｐｓｉ）により破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）し、その上清を得た。さらにこれを超遠心分離（１１００００ｇ、６０分、４℃）して、その上清を得た。この上清液に硫安（２５％（Ｗ／Ｖ）　飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）によって除去した。続いて得られた上清にさらに硫安（５５％（Ｗ／Ｖ）　飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）し、沈澱物を回収した。この沈澱物を０．　０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　５）に懸濁した後、これを１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔｆｌｏｗ、ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０．　１５Ｍ　ＮａＣｌ＋０．　０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０．　１５−　０．　３５Ｍ　ＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌ−　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％（Ｗ／Ｖ）　（ＮＨ_４　）_２　ＳＯ_４　＋０．　０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０−　０％（Ｗ／Ｖ）　飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００、ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、０．　０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　５）で溶出させた。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。
なお、エステラーゼ活性は、一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する活性を測定した。活性測定は２％（Ｗ／Ｖ）　アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０．　１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。
精製エステラーゼ１ｎｇを蒸留水３０μｌに溶解し、気相シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製モデル３７３Ａ）にてＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、下記の通りのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、２番目から３２番目で示されるもの）であった。
Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ
【０００９】
実施例２　　（本遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡの調製）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＳＣ−ＹＭ−１　を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）　、Ｋ_２　ＨＰＯ_４　０．　１％（Ｗ／Ｖ）　、ＭｇＳＯ_４　０．　０２％（Ｗ／Ｖ）　、ｐＨ７．　３）で、３０℃　２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）　、Ｋ_２　ＨＰＯ_４　０．　１％（Ｗ／Ｖ）　、ＭｇＳＯ_４　０．　０２％（Ｗ／Ｖ）　、ｐＨ７．　３）に接種し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ　６６０　　が３．　４に達した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ　６６０　　が１０に達するまで培養を継続した。
遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．　０）、２５％（Ｗ／Ｖ）　ショ糖溶液に卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。次に１０ｍｌの１０％（Ｗ／Ｖ）　ＳＤＳを添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し、核酸を沈澱させ、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）した。得られた核酸を乾燥後、２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．　３）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超遠心分離（２７５０００ｇ、１８時間、２５℃）し、ＤＮＡのバンドを回収し、それをトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．　３）に対し透析し、約５．　４ｍｇ　　のゲノムＤＮＡを得た。
【００１０】
実施例３　　（本遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製）　　実施例２で得たゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製制限酵素）で消化し、ゲノムＤＮＡ断片を得た。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮＡ断片と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６℃一夜反応した。
つぎにこの反応液をインビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（キットに添付）にパッケージングし、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１１】
実施例４　　（本遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
▲１▼合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識
実施例１で決定されたエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとに下記に示す４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（混合プローブ）を合成した。

オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプライド　バイオシステムズ　　モデル３８０Ａ）を用いて行った。
このプローブＤＮＡ５０ｐｍｏｌに３μｌの０．　５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．　１Ｍ　ＭｇＣｌ_２　、０．　０５Ｍ　ＤＴＴ、０．　００１Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｕｎｉｔｓＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）、１０μｌ［γ^３２Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社製）を混合し、３７℃、６０分反応させた後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過を行うことによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを調製した。
▲２▼ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例３で示したように、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ファージで感染させた大腸菌をプレーティングし、プレートを４℃に冷やした後、表面にニトロセルロースフィルターを密着させてファージをフィルター上に移した。フィルターを１．　５Ｍ　　ＮａＣｌ−　０．　５Ｍ　　ＮａＯＨ溶液に浸し、付着したＤＮＡを変性させ、ついで１．　５Ｍ　　ＮａＣｌ−　０．　５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．　０）溶液で中和した。その後０．　３６Ｍ　　ＮａＣｌ−　２０ｍＭ　ＮａＨ_２　ＰＯ_４　（ｐＨ７．　５）−　２ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．　５）でフィルターを洗浄した後、乾燥させた。
次に、上記のようにして調製したエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプローブを用いて、実施例３で作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを以下の方法に従いプラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、フィルターを１）４ｘＳＳＣ，１％（Ｗ／Ｖ）　ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０．　２％（Ｗ／Ｖ）　フィコール、０．　２％（Ｗ／Ｖ）　ポリビニルピロリドン、０．　２％（Ｗ／Ｖ）　ウシ血清アルブミン）を含む溶液で６０℃、３０分インキュベートした後、２）５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液で、６０℃、５時間インキュベートし、反応を行った。ハイブリダイゼーションは、プラスティックバックにフィルターと上記２）の溶液を加え、アイソトープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約５ｘ１０^５　ｃｐｍ　　添加して、６０℃で一夜行った。
ハイブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘＳＳＣ、０．　５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含む溶液で６０℃、１５分　２）２ｘＳＳＣ、０．　５％（Ｗ／Ｖ）　ＳＤＳを含む溶液で２５℃、３０分　３）２ｘＳＳＣ、０．　５％ＳＤＳ（Ｗ／Ｖ）　を含む溶液で６０℃、１５分の順に洗浄した後、風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ　ＲＸ）と増感紙をあて、−８０℃、一夜オートラジオグラムをとった。この結果、ポジティブシグナルを与えるｐＣＣ３株を得た。
ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した結果、得られたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコードしてはいなかった。そこでその配列の一部をＤＮＡプローブとして再度、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、同様にλファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリーを使用した。
その結果、ポジティブシグナルを与える本遺伝子クローンを９株取得した。
【００１２】
実施例５　　（本遺伝子の制限酵素地図および全塩基配列の決定）
実施例４で得られた本遺伝子クローンについてインサートＤＮＡの制限酵素地図を作製した。
λＺＡＰＩＩにクローン化したインサートＤＮＡは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　、　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー　　クローニング　第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）　、コールドスプリング　ハーバー　　ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　発行、１９８９年等に記載される通常の方法を用いて、ヘルパーファージＲ４０８を感染させることにより、プラスミドベクターを含む形でｉｎ　ｖｉｖｏで切り出され、サブクローン化された。
この様にして得られたプラスミドｐＣＣ６（図４参照）を種々の制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル及び５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。種々のＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより制限酵素地図を作製した。
ベクターｐＣＣ６に存在するプローブＤＮＡと親和性のある領域を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片について、ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製）を用いて、塩基配列を決定した。
決定した塩基配列を図１から図３および配列番号２に示す。該塩基配列中から、オープンリーディングフレームを検索した結果、図１から図３および配列番号１に示すように、塩基番号３４３番目のＡＴＧから１４５２番目のＧＡＣまでが唯一のオープンリーディングフレームであることが判明した。
また、実施例１によって決定されたエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列と、上記のオープンリーディングフレームの開始コドン以下のアミノ酸配列が一致したことから、このオープンリーディングフレームがエステラーゼをコードするものであることが明かになった。その結果、エステラーゼは３７０アミノ酸残基からなる分子量３９３４８の蛋白質であることが判明した。
【００１３】
実施例６　　（本遺伝子を含有する発現プラスミド）
発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ｂｏｙｅｒ　ら、　Ｐｒｏｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２１ー２５（１９８３）　、ファルマシア社製）をＢａｍＨＩ　により部分分解し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、ライゲーションを行うことによりＢａｍＨＩ　部位を１カ所欠失させたｐＫＫ２２３−４を作製した。
一方、本遺伝子の開始コドン周辺とその５’上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列に変換するため、下記の塩基配列のＤＮＡ断片をアプライド社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成した。
ＬＰ−１　　（配列番号３に示す）
ＬＰ−２　　（配列番号４に示す）
ＥＳ−１　　（配列番号５に示す）
ＥＳ−２　　（配列番号６に示す）
ＥＳ−３　　（配列番号７に示す）
ＥＳ−４　　（配列番号８に示す）
ＥＳ−５　　（配列番号９に示す）
ＥＳ−６　　（配列番号１０に示す）
ＥＳ−７　　（配列番号１１に示す）
合成したＬＰ−２，ＥＳ−１，ＥＳ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およびＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化し、それぞれの未処理の断片とライゲーション、アニーリングを行って、下記の２種類の２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）を作製した。作製した２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）は、その両端をリン酸化した。

一方、ｐＣＣ６中のＳａｃＩ断片（約３．　５ｋｂｐ）をｐＵＣ１１８（宝酒造社製）へサブクローニングしたｐＣＣ３０を作製した。このｐＣＣ３０をＥｃｏ５２Ｉ、およびＳａｃＩで消化することによりエステラーゼの翻訳領域（約１．　２Ｋｂｐ）を切り出した。一方ｌａｃプロモーターを有するｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に、前記ＤＮＡ断片（ＳＤ−１あるいはＳＤ−２）および、本遺伝子翻訳領域を含むＥｃｏ５２ＩーＳａｃＩ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結することにより、ｐＣＣ１００およびｐＣＣ１０１を作製した（図５参照）。続いてこのｐＣＣ１００およびｐＣＣ１０１をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、エステラーゼの翻訳領域（約１．３Ｋｂｐ）を切り出した。一方、ｔａｃプロモーターを有するｐＫＫ２２３−４をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＫＫ２２３−４のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、エステラーゼ翻訳領域を含むＥｃｏＲＩーＨｉｎｄＩＩＩ断片（１．３Ｋｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連
結することにより、ｐＣＣ２００およびｐＣＣ２０１を作製した（図５参照）。
この様にしてｌａｃおよびｔａｃプロモーターの下流に改変された５’末端塩基配列を有する４種類の大腸菌用発現プラスミドｐＣＣ１００（ＳＤ−１，ｐＵＣ１１８）、ｐＣＣ１０１（ＳＤ−２，ｐＵＣ１１８）、ｐＣＣ２００（ＳＤ−１，ｐＫＫ２２３−４）およびｐＣＣ２０１（ＳＤ−２，ｐＫＫ２２３−４）を得た。
構築した発現フ゜ラスミト゛名／改変５’末端塩基配列名／ヘ゛クター名
ｐＣＣ１００／ＳＤ−１／ｐＵＣ１１８
ｐＣＣ１０１／ＳＤ−２／ｐＵＣ１１８
ｐＣＣ２００／ＳＤ−１／ｐＫＫ２３３−４
ｐＣＣ２０１／ＳＤ−２／ｐＫＫ２２３−４
【００１４】
実施例７　　（本遺伝子を導入した形質転換体微生物によるエステラーゼ生産）
実施例６で得られた４種類の発現プラスミドをそれぞれ通常の遺伝子工学的方法に準じて、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、組換え体微生物を作製した。組換え体微生物をＬＢ培地（トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．　５％（Ｗ／Ｖ）　、ＮａＣｌ０．　５％（Ｗ／Ｖ）　）に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラーゼの発現を誘導した。
培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約４万の位置に、エステラーゼが主バンドとして認められ、微生物内で該酵素がいずれも高発現していることが判明した。
そこで、エステラーゼの一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する、これらの形質転換体微生物のエステラーゼ生産量を測定した。生産量測定は２％（Ｗ／Ｖ）　アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０．　１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．　２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。その結果を表１に示す。
【表１】

さらに前記の４種類の発現プラスミドをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０５およびＪＭ１０３に形質転換し、同様にして、ＬＢ培地に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラーゼの発現を誘導した。
これらの形質転換体微生物体のエステラーゼ生産量を上記と同様の方法にて測定した。その結果を表２に示す。
【表２】

【００１５】
実施例８　（本遺伝子を導入した形質転換体微生物産生エステラーゼの精製およびその性質）
実施例７で示した方法で培養を行った組換え体微生物（ｐＣＣ１０１／ＪＭ１０５）を超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）後、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　ｆａｓｔｆｌｏｗ　ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０．　１５Ｍ　ＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．　５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０．　１５ー　０．　３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌー　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％（Ｗ／Ｖ）　の（ＮＨ_４　）_２　ＳＯ_４　＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．　５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０ー　０％（Ｗ／Ｖ）　飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。活性測定は実施例１に記載した方法に従った。得られた精製エステラーゼをＥＳＩ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）マススペクトルによる質量分析および酵素法によるＣ末端アミノ酸分析を行ったところ、分子量３９３４８の完全長エステラーゼ（以下Ｌ体と記す）と分子量３８５０８のＣ末端アミノ酸が８個欠失したエステラーゼ分解物（以下Ｓ体と記す）が検出された。
得られた完全長エステラーゼ（Ｌ体）を用い、下記の活性測定法により、各種脂肪酸エステル類、トリグリセライド類およびアミノ酸エステル類の化合物に対する基質特異性を調べた。加水分解活性測定は、それぞれの基質０．５Ｍを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．　０）に酵素液を加えて３５℃で反応させ、生成した脂肪酸、アミノ酸をフェノールフタレインを指示薬として、０．　０５Ｎ　　ＮａＯＨ溶液で滴定・定量することにより行った。活性は１分間に１μｍｏｌの脂肪酸・アミノ酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
その結果を表３に示す。なお表３における酵素活性は、グルタル酸ジメチルに対する活性を１００とした時の相対値（％）で示した。
また、得られたエステラーゼ分解物（Ｓ体）もほぼ同様な効果が得られた。
【表３】

【００１６】
【発明の効果】
本遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに組み込んだプラスミドを構築し、微生物に導入することにより、形質転換体微生物におけるエステラーゼの生産性を飛躍的に増大することに成功し、エステラーゼを効率良く製造することができるようになった。
【００１７】
【配列表】

【００１８】

【００１９】
配列番号　：３
配列の長さ：２０
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２０】
配列番号　：４
配列の長さ：２６
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２１】
配列番号　：５
配列の長さ：２９
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２２】
配列番号　：６
配列の長さ：３６
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２３】
配列番号　：７
配列の長さ：３０
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２４】
配列番号　：８
配列の長さ：４５
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２５】
配列番号　：９
配列の長さ：２９
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２６】
配列番号　：１０
配列の長さ：３７
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【００２７】
配列番号　：１１
配列の長さ：３０
配列の型　：核酸
鎖の数　　　　：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸　合成ＤＮＡ

【図面の簡単な説明】
【図１】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１番目から６４２番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。スクリーニングに用いたプローブＤＮＡは、塩基番号３４６から３９０番目に相当する。
【図２】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの６４３番目から１０７４番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１０７５番目から１６３９番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】プラークハイブリダイゼーションで得られたベクターｐＣＣ６の制限酵素地図を示す図である。図中白抜きは、クロモバクテリウム属に属する微生物由来の本遺伝子を、斜線部はエステラーゼの翻訳領域を示す。
【図５】本遺伝子を含有する発現プラスミドｐＣＣ１００、ｐＣＣ１０１、ｐＣＣ２００およびｐＣＣ２０１の構築ストラテジーを示す図である。図中、矢印はｌａｃあるいはｔａｃプロモーターを示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention provides a gene encoding an amino acid sequence of an esterase used in an ester hydrolysis reaction, an ester synthesis reaction, a transesterification reaction, a plasmid containing the gene, a microorganism containing the plasmid, and further culturing the microorganism. A ribosome binding region suitable for expression of the esterase gene (ie, SD-1, SD-2), etc., which relates to an invention relating to a method for producing an esterase, which comprises producing an esterase by the microorganism. It is.
[0002]
[Prior art]
In recent years, attempts to utilize enzymes such as esterase for organic synthesis reactions, for example, hydrolysis reactions, have been actively made. Examples of the microorganism-derived esterase used for this purpose include, for example, Arthrobacter globiformis IFO 12958 (Japanese Patent Laid-Open No. 1-181788) and Bacillus stearothermophilus (Archiv. Biochem. Biophys. Biol.Chem.37 (6), 1457-1464 (1973)), Pseudomonas aeruginosa (J. Biochem. 86, 643-656 (1979)), Pseudomonas fluorescens (J. Biochem4, 1947, 1047-95). ) Are known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, the productivity of enzymes in microorganisms producing them has not always been sufficient.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Under these circumstances, the present inventors have conducted intensive studies and found that a ribosome-binding region suitable for expression of a certain microorganism-derived esterase gene (ie, SD-1, SD- By ligating 2), the esterase productivity in the transformed microorganism into which the esterase gene-containing plasmid was introduced was significantly increased, and the present invention was completed.
That is, the present invention
1. A polynucleotide comprising a liposome-binding region, which comprises a base sequence of one of the following double-stranded DNA fragments:

2. Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an esterase gene encoding at least the amino acid sequence represented by the first to 362nd, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 represented by at least the first to 1086th position A polynucleotide comprising a polynucleotide which is a liposome-binding region according to the above-mentioned item 1 connected upstream of any one of an esterase gene having a base sequence;
3. A plasmid having the polynucleotide of the above item 1 or 2;
Is provided.
In addition, (1) the esterase gene encoding the amino acid sequence represented by at least the 1st to 362nd amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be referred to as the present gene, and (2) The contained plasmid may hereinafter be referred to as the present plasmid, (3) the microorganism containing the plasmid may be referred to as the present microorganism, (4) the microorganism is cultured, and esterase is removed by the microorganism. Hereinafter, a method for producing an esterase characterized by being produced may be referred to as the present production method.
[0005]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
This gene is a microorganism belonging to the genus Chromobacterium.
It is derived from and encodes an esterase having the following properties.
Molecular weight: 39348, pI: 3. 9. Optimal reaction pH: 9. 0, optimum reaction temperature: 40 ° C. Further, the enzyme is a carboxylate ester such as dimethyl glutarate, dimethyl adipate, dimethyl pimerate, methyl cis-imidazolysine dicarboxylate, a triglyceride ester such as tripropionin, or diethyl glutamate. It shows activity against amino acid ester compounds. The microorganism belonging to the genus Chromobacterium has been deposited as Chromobacterium SC-YM-1 (FERM P-1409) with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0006]
This gene is described in, for example, Sambrook, E.A. F. Fritsch, T .; Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, 1989, etc.
That is, in order to determine the N-terminal amino acid sequence of the esterase, the microorganism is cultured by a usual culture method, and the esterase produced by the microorganism is purified. The cultivation may be performed, for example, using a medium such as glucose, starch hydrolyzate, molasses or other carbon sources, yeast extract, meat extract, polypeptone, tryptone, or other nitrogen sources, inorganic ions, and, if necessary, sulfates, phosphates, etc. It can be carried out by adjusting the pH and temperature of the medium as appropriate under aerobic conditions using the contained normal substances. The cultivation time is preferably, but not necessarily, up to the point where the esterase activity in the medium is maximized. The obtained cultured cells are sonicated and fractionated with ammonium sulfate, and then the esterase is purified by a usual isolation / purification method using various types of chromatography such as ion exchange, hydrophobicity and gel filtration. The obtained esterase is subjected to an amino acid sequence analyzer to determine the N-terminal amino acid sequence, and a synthetic DNA probe is prepared from the amino acid sequence information.
Microbial cells obtained by separately culturing are destroyed by a usual method such as ultrasonic crushing, and after a protease treatment or the like, genomic DNA is extracted. A genomic DNA library is prepared by cleaving the obtained genomic DNA with an appropriate restriction enzyme and inserting it into, for example, phage vector λgt11 or plasmid vector pUC19 using ligase. The gene was obtained by a screening method such as an immunological method using an antibody against the esterase, a hybridization method using a synthetic DNA probe corresponding to the partial amino acid sequence of the esterase, and a method for measuring the activity of the esterase. can do. By using the gene obtained in this manner, esterase can be produced and obtained in a large amount according to ordinary genetic engineering methods. More specifically, a plasmid capable of expressing the present gene in a host microorganism cell may be prepared, introduced into the host microorganism cell, transformed, and the transformed microorganism may be cultured. The above-mentioned plasmid contains a replicable genetic information in a host microbial cell, is capable of autonomous growth, is easily isolated and purified from the host microbial cell, and has an expression having a detectable marker. A vector into which the present gene has been introduced can be preferably used. In addition, various expression vectors are already commercially available, and restriction enzymes for cutting the expression vector used for introducing the present gene into them are also commercially available. For example, for expression in Escherichia coli, an expression vector containing a promoter such as lac, trp, or tac (these are commercially available as an expression vector or as a promoter cartridge from Pharmacia PL) can be used. Furthermore, by connecting a ribosome binding region upstream of this gene, higher expression can be achieved. Guarente. L. et al. (Cell 20 p543 (1980)) and Taniguchi et al. (Genetics of Industrial Microorganisms p202 (1982) Kodansha) are known, but desirably, for example, SD-1 and SD-2 described below. Can be given. Thus, a ribosome binding region suitable for expression of the present gene may be designed and synthesized. In order to introduce the above-mentioned plasmid into the host microorganism cells, a usual genetic engineering method is used.
Eukaryotes and prokaryotes can be used as the host microbial cells, and preferred examples include Escherichia coli.
The host microorganism cells into which the above plasmid has been introduced can be cultured by a culture method generally used for the microorganism. For example, in the case of Escherichia coli, the cultivation is performed in a normal medium appropriately containing a micronutrient such as an appropriate carbon source, nitrogen source and vitamin. As the culture method, either solid culture or liquid culture is possible, but preferably, a liquid culture method with aeration and stirring can be used.
The esterase may be collected from the cultured cells of the microorganism obtained in this manner by appropriately combining ordinary isolation and purification methods.For example, after completion of the culture, the cells are centrifuged or the like. It may be collected, crushed or lysed, and purified by a combination of various chromatographic processes such as ion exchange, hydrophobicity, and gel filtration. The recombinant cells producing esterase thus produced can be used as a bioreactor for ester hydrolysis, for example, for producing useful compounds such as intermediates of pharmaceuticals and agricultural chemicals.
Further, by culturing the present microorganism, it is possible to obtain a cultured cell body in which a large amount of esterase is accumulated, and use the cell body as it is as an enzyme reactor.
[0007]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0008]
Example 1 (Separation of esterase and determination of N-terminal amino acid sequence)
Chromobacterium SC-YM-1 which is a strain belonging to the genus Chromobacterium was cultured in 5 ml of a pre-culture medium (glucose 1% (W / V), yeast extract 1% (W / V), K ₂ HPO ₄ 0. 1% (W / V), MgSO ₄ 0. 02% (W / V), pH7. 3) After shaking culture at 30 ° C. for 24 hours, the obtained culture solution was diluted with 1000 ml of a main culture medium (glucose 1% (W / V), yeast extract 1% (W / V), K ₂ HPO ₄ 0. 1% (W / V), MgSO ₄ 0. 02% (W / V), pH7. 3), inoculated at 30 ° C., cultured until OD 660 reached 10, and collected by centrifugation (8000 g, 10 minutes, 4 ° C.). The collected cells are placed in 0. 1 M phosphate buffer (1 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ PH7. 5) The suspension was suspended in 800 ml and crushed by French press treatment (2000 psi). The cell lysate was centrifuged (8000 g, 10 minutes, 4 ° C.) to obtain a supernatant. This was further subjected to ultracentrifugation (110000 g, 60 minutes, 4 ° C.) to obtain the supernatant. Ammonium sulfate (25% (W / V) saturation) was added to the supernatant, left at 4 ° C. for 2 hours, and the resulting precipitate was removed by centrifugation (10000 g, 15 minutes, 4 ° C.). Subsequently, ammonium sulfate (55% (W / V) saturated) was further added to the obtained supernatant, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours. The resulting precipitate was centrifuged (10000 g, 15 minutes, 4 ° C.), The thing was collected. The precipitate is added to 0. After suspending in a 01 M phosphate buffer (pH 7.5), 150 ml of the suspension was passed through a column filled with 200 ml of an anion exchange resin (DEAE-Sepharose fastflow, manufactured by Pharmacia) to adsorb the target enzyme onto the carrier. . 0. 15M NaCl + 0. After thoroughly washing the column with a 01M phosphate buffer (pH 7.5) to remove non-adsorbed components, the column was washed with 0.1M phosphate buffer. 15-0. The target enzyme was eluted by a 35M NaCl linear concentration gradient method. The active fraction of the esterase as the target enzyme was collected and passed through a column filled with 200 ml of a hydrophobic resin (Butyl-Toyopearl 650S, manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.). 10% (W / V) (NH ₄ ) ₂ SO ₄ +0. The column was sufficiently washed with a 01 M phosphate buffer (pH 7.5) to remove non-adsorbed components, and then the target enzyme was eluted by a linear gradient method of 10-0% (W / V) saturated ammonium sulfate. The active fraction of the esterase, which is the target enzyme, was collected, and subjected to gel filtration (SephacrylS-200, manufactured by Pharmacia) column chromatography. Elution was carried out with 01M phosphate buffer (pH 7.5). The active fractions of the target enzyme, esterase, were collected to obtain purified esterase.
In addition, the esterase activity measured the activity with respect to p-nitrophenyl acetate (pNPA) which is a general substrate. The activity measurement was carried out using 40 μM of the substrate dissolved in 2% (W / V) acetone. The enzyme solution was added to a 1 M phosphate buffer (pH 7.2), incubated at 37 ° C, and the amount of released p-nitrophenol was measured from the increase in absorbance at 405 nm. The activity was defined as 1 unit of the enzyme which liberated 1 μmol of p-nitrophenol per minute.
1 ng of the purified esterase was dissolved in 30 μl of distilled water, and the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas-phase sequencer (Model 373A manufactured by Applied Biosystems). The amino acid sequence was as follows (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). Of these, those shown from the second to the 32nd).
Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg Leu Thr Val Asn Ile Leu Glu Arg Ala Arp Asp Asp Pro
[0009]
Example 2 (Isolation of the present gene clone: preparation of genomic DNA)
Chromobacterium SC-YM-1 which is a strain belonging to the genus Chromobacterium was cultured in 5 ml of a pre-culture medium (glucose 1% (W / V), yeast extract 1% (W / V), K ₂ HPO ₄ 0. 1% (W / V), MgSO ₄ 0. 02% (W / V), pH7. After shaking culture at 30 ° C. for 24 hours in 3), the obtained culture solution was subjected to 1000 ml of main culture medium (glucose 1% (W / V), yeast extract 1% (W / V), K ₂ HPO ₄ 0. 1% (W / V), MgSO ₄ 0. 02% (W / V), pH7. 3) and inoculated at 30 ° C. At that time, OD 660 is 3. At the time of reaching 4, penicillin G was added to a final concentration of 2 units / ml culture solution, and the culture was continued until OD 660 reached 10.
The cells were collected by centrifugation (8000 g, 10 minutes, 4 ° C.) and added to egg white lysozyme (manufactured by Seikagaku Corporation) in 80 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 25% (W / V) sucrose solution. ) Was added to a final concentration of 5 mg / ml and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Next, 10 ml of 10% (W / V) SDS was added, and protease K (manufactured by Boehringer) was further added to a final concentration of 200 μg / ml, followed by incubation at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, extraction was performed three times with an equal volume of 0.1 M tris-saturated phenol and twice with ether, and then twice the volume of ethanol was added to the aqueous layer to precipitate nucleic acids, followed by centrifugation (12000 g, 30 minutes, 4 ° C). After drying the obtained nucleic acid, it was dissolved in 20 ml of Tris EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.3), and subjected to CsCl-EtBr equilibrium density gradient ultracentrifugation (275000 g, 18 hours, 25 ° C.). The DNA band was collected and dialyzed against Tris EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.3) to give about 5. 4 mg of genomic DNA were obtained.
[0010]
Example 3 (Isolation of the present gene clone: preparation of genomic DNA library) 100 µg of the genomic DNA obtained in Example 2 was digested with XhoI (a restriction enzyme manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain a genomic DNA fragment. On the other hand, 1 μg of λ phage λZAPII (manufactured by Stratagene) was similarly digested with XhoI, mixed with the genomic DNA fragment, added with ligase (manufactured by Takara Shuzo), and reacted at 16 ° C. overnight.
Next, this reaction solution was packaged in an E. coli XL-1blue strain (attached to the kit) using an in vitro packaging kit (manufactured by Stratagene) to prepare a genomic DNA library.
[0011]
Example 4 (Isolation of the present gene clone: screening of genomic DNA library)
(1) Preparation of synthetic DNA probe and labeling of isotope
Based on the esterase N-terminal amino acid sequence determined in Example 1, a 44-mer oligonucleotide (mixed probe) shown below was synthesized.

Oligonucleotide synthesis was performed using an automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems Model 380A).
To 50 pmol of this probe DNA, 3 μl of 0. 5M Tris-HCl (pH 7.6), 0.1M 1M MgCl ₂ , 0. 05M DTT, 0. 001M EDTA, 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo), 10 μl [γ ³² After mixing P] ATP (manufactured by Amersham) and reacting at 37 ° C. for 60 minutes, the mixture was subjected to gel filtration with Sephadex G-50 (manufactured by Pharmacia) to prepare an isotope-labeled DNA probe.
(2) Screening of genomic DNA library
As shown in Example 3, phage-infected E. coli was plated using an in vitro packaging kit (manufactured by Stratagene), the plate was cooled to 4 ° C., and a nitrocellulose filter was adhered to the surface. And transferred the phage onto the filter. Filter 1. 5M NaCl-0. Immerse in 5M NaOH solution to denature the attached DNA. 5M NaCl-0. Neutralized with 5M Tris-HCl (pH 8.0) solution. Then 0. 36M NaCl- 20mM NaH ₂ PO ₄ (PH 7.5)-The filter was washed with 2 mM EDTA (pH 7.5) and then dried.
Next, using the isotope-labeled DNA probe corresponding to the N-terminal amino acid sequence of esterase prepared as described above, genomic DNA library prepared in Example 3 was subjected to plaque hybridization according to the following method. . That is, 1) 4xSSC, 1% (W / V) SDS, 10x Denhardt (0.2% (W / V) ficoll, 0.2% (W / V) polyvinyl pyrrolidone, 0.2% (W / V) After incubating with a solution containing bovine serum albumin) at 60 ° C. for 30 minutes, 2) Incubating with a solution containing 5 × SSC, 5 × Denhardt, 100 μg / ml salmon testis DNA at 60 ° C. for 5 hours to perform a reaction. For hybridization, the filter and the solution described in 2) above were added to a plastic bag, and an isotope-labeled DNA probe was added to the filter at about 5 × 10 5 per filter. ⁵ Cpm was added and the reaction was performed at 60 ° C. overnight.
The filters subjected to hybridization were 1) 2xSSC, 0. 5% (W / V) solution containing SDS at 60 ° C. for 15 minutes 2) 2 × SSC, 0.1% 5% (W / V) solution containing SDS at 25 ° C. for 30 minutes 3) 2 × SSC, 0.1% After washing with a solution containing 5% SDS (W / V) in the order of 60 ° C. and 15 minutes, air-dry, apply an X-ray film (FUJI RX) and an intensifying screen, and take an autoradiogram at −80 ° C. overnight. Was. As a result, a pCC3 strain giving a positive signal was obtained.
The nucleotide sequence was determined by the dideoxy method. As a result, the obtained clone strain did not encode the full length of the esterase gene. Therefore, screening by plaque hybridization was performed again using a part of the sequence as a DNA probe. At that time, a library prepared by partially digesting genomic DNA with Sau3AI and ligating it to λ phage λZAPII (Stratagene) in the same manner was used.
As a result, nine strains of the gene which gave a positive signal were obtained.
[0012]
Example 5 (Determination of restriction map and total nucleotide sequence of this gene)
For the gene clone obtained in Example 4, a restriction map of the insert DNA was prepared.
Insert DNA cloned into λZAPII is described in J. Am. Sambrook, E.A. F. Fritsch, T .; By infecting the helper phage R408 using the usual method described in Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, etc., by Maniatis, Molecular Cloning 2nd edition. It was excised in vivo containing the plasmid vector and subcloned.
The thus obtained plasmid pCC6 (see Fig. 4) was digested with various restriction enzymes, and the DNA fragment was analyzed by 1% agarose gel and 5% polyacrylamide gel electrophoresis. Restriction enzyme maps were prepared by comparing the chain lengths of various DNA fragments.
The nucleotide sequence of a DNA fragment of about 1.8 kbp containing a region having an affinity for the probe DNA present in the vector pCC6 was determined using a DEAZA sequence kit (Takara Shuzo).
The determined base sequence is shown in FIGS. 1 to 3 and SEQ ID NO: 2. As a result of searching for an open reading frame from the nucleotide sequence, as shown in FIGS. 1 to 3 and SEQ ID NO: 1, it was found that the ATG from the nucleotide number 343 to the GAC at the nucleotide number 1452 is the only open reading frame. found.
In addition, since the amino acid sequence at the N-terminus of the esterase determined in Example 1 and the amino acid sequence below the start codon of the above open reading frame were identical, it can be concluded that this open reading frame encodes an esterase. It became clear. As a result, it was found that esterase was a protein consisting of 370 amino acid residues and having a molecular weight of 39,348.
[0013]
Example 6 (Expression plasmid containing the present gene)
Expression vector pKK223-3 (Boyer et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21-25 (1983), manufactured by Pharmacia) is partially digested with BamHI, followed by blunt-ending with T4 DNA polymerase, and ligation. As a result, pKK223-4 in which one BamHI site was deleted was prepared.
On the other hand, in order to convert the base sequence around the start codon of the present gene and its 5 ′ upstream side into a sequence suitable for gene expression in Escherichia coli, a DNA fragment having the following base sequence was converted using an Applied DNA synthesizer model 380A. Synthesized.
LP-1 (shown in SEQ ID NO: 3)
LP-2 (shown in SEQ ID NO: 4)
ES-1 (shown in SEQ ID NO: 5)
ES-2 (shown in SEQ ID NO: 6)
ES-3 (shown in SEQ ID NO: 7)
ES-4 (shown in SEQ ID NO: 8)
ES-5 (shown in SEQ ID NO: 9)
ES-6 (shown in SEQ ID NO: 10)
ES-7 (shown in SEQ ID NO: 11)
The 5 ′ end of the synthesized LP-2, ES-1, ES-2, ES-3, ES-5, ES-6 and ES-7 fragments was phosphorylated, and each untreated fragment was ligated and annealed. As a result, the following two types of double-stranded DNA fragments (SD-1 and SD-2) were prepared. The prepared double-stranded DNA fragments (SD-1, SD-2) were phosphorylated at both ends.

On the other hand, pCC30 was prepared by subcloning the SacI fragment (about 3.5 kbp) in pCC6 into pUC118 (Takara Shuzo). This pCC30 was digested with Eco52I and SacI to cut out the esterase translation region (about 1.2 Kbp). On the other hand, pUC118 having a lac promoter was digested with EcoRI and SacI and treated with alkaline phosphatase. Next, the DNA fragment (SD-1 or SD-2) and the Eco52I-SacI fragment containing the present gene translation region were ligated between the EcoRI and SacI sites of pUC118 using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). Thus, pCC100 and pCC101 were produced (see FIG. 5). Subsequently, the pCC100 and pCC101 were digested with EcoRI and HindIII to cut out the esterase translation region (about 1.3 Kbp). On the other hand, pKK223-4 having a tac promoter was digested with EcoRI and HindIII, and treated with alkaline phosphatase. Next, an EcoRI-HindIII fragment (1.3 Kbp) containing an esterase translation region was inserted between the EcoRI and HindIII sites of pKK223-4 using a DNA ligation kit (Takara Shuzo).
By ligating, pCC200 and pCC201 were produced (see FIG. 5).
In this way, four types of E. coli expression plasmids pCC100 (SD-1, pUC118), pCC101 (SD-2, pUC118), and pCC200 (SD-) having the 5 'terminal nucleotide sequence modified downstream of the lac and tac promoters. 1, pKK223-4) and pCC201 (SD-2, pKK223-4).
Constructed expression plasmid name / modified 5 'terminal nucleotide sequence name / vector name
pCC100 / SD-1 / pUC118
pCC101 / SD-2 / pUC118
pCC200 / SD-1 / pKK233-4
pCC201 / SD-2 / pKK223-4
[0014]
Example 7 (Esterase production by a transformant microorganism into which the present gene has been introduced)
Escherichia coli JM109 was transformed with each of the four types of expression plasmids obtained in Example 6 according to a conventional genetic engineering method to prepare a recombinant microorganism. After inoculating the recombinant microorganism into an LB medium (1% (W / V) of tryptone, 0.5% (W / V) of yeast extract, 0.5% (W / V) of NaCl), the cells were cultured at 37 ° C. During the growth phase, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM to induce esterase expression.
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (8000 g, 10 minutes, 4 ° C.), and a part of the cells was subjected to SDS-PAGE. It was found that all of the enzymes were highly expressed in the microorganism.
Therefore, the amount of esterase produced by these transformant microorganisms with respect to p-nitrophenyl acetate (pNPA), which is a general esterase substrate, was measured. Production measurements were performed with 2% (W / V) 40 μM substrate dissolved in acetone. The enzyme solution was added to a 1 M phosphate buffer (pH 7.2), incubated at 37 ° C, and the amount of released p-nitrophenol was measured from the increase in absorbance at 405 nm. The activity was defined as 1 unit of the enzyme which liberated 1 μmol of p-nitrophenol per minute. Table 1 shows the results.
[Table 1]

Furthermore, Escherichia coli JM105 and JM103 were transformed with the above four expression plasmids, respectively, and similarly inoculated into an LB medium, cultured at 37 ° C., and IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) during logarithmic growth. Was added to a final concentration of 1 mM to induce esterase expression.
Esterase production of these transformants was measured in the same manner as described above. Table 2 shows the results.
[Table 2]

[0015]
Example 8 (Purification and Properties of Esterase Produced by Transformant Microorganism Introducing the Gene)
The recombinant microorganism (pCC101 / JM105) cultured by the method described in Example 7 was sonicated (20 KHz, 15 minutes, 4 ° C.), and then centrifuged (12,000 g, 30 minutes, 4 ° C.). The supernatant was obtained. 150 ml of the obtained supernatant was passed through a column filled with 200 ml of an anion exchange resin (manufactured by DEAE-Sepharose fastflow Pharmacia) to adsorb the target enzyme onto the carrier. 0. The column was thoroughly washed with 15 M NaCl + 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to remove non-adsorbed components. 15-0. The target enzyme was eluted by the 35M NaCl linear concentration gradient method. The active fraction of the esterase as the target enzyme was collected and passed through a column filled with 200 ml of a hydrophobic resin (Butyl-Toyopearl 650S, manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.). 10% (W / V) of (NH ₄ ) ₂ SO ₄ The column was sufficiently washed with +10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to remove unadsorbed components, and then the target enzyme was eluted by a linear gradient method of 10% (W / V) saturated ammonium sulfate. The active fractions of the target enzyme, esterase, were collected to obtain purified esterase. The activity was measured according to the method described in Example 1. The obtained purified esterase was subjected to mass spectrometry by ESI (electrospray ionization) mass spectrometry and C-terminal amino acid analysis by enzymatic method. As a result, a full-length esterase having a molecular weight of 39348 (hereinafter referred to as L-form) and a C-terminal amino acid having a molecular weight of 38508 were found. Esterase digests with eight deletions (hereinafter referred to as S-isomer) were detected.
Using the obtained full-length esterase (L-form), the substrate specificity for various fatty acid esters, triglycerides and amino acid esters was examined by the following activity measurement method. The hydrolysis activity was measured by adding an enzyme solution to a 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.5 M of each substrate and reacting at 35 ° C., and using the resulting fatty acids and amino acids with phenolphthalein as an indicator. , 0. The determination was performed by titration and quantification with a 05N NaOH solution. The activity was defined as the amount of the enzyme that releases 1 μmol of fatty acid / amino acid per minute as 1 unit.
Table 3 shows the results. The enzyme activities in Table 3 are shown as relative values (%) when the activity with respect to dimethyl glutarate is taken as 100.
In addition, the obtained esterase hydrolyzate (S form) had almost the same effect.
[Table 3]

[0016]
【The invention's effect】
By constructing a plasmid into which a DNA fragment containing the present gene has been incorporated into a vector and introducing it into a microorganism, the productivity of esterase in the transformant microorganism has been drastically increased, and the esterase can be efficiently produced. Now you can do it.
[0017]
[Sequence list]

[0018]

[0019]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 20
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0020]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 26
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0021]
SEQ ID NO: 5
Sequence length: 29
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0022]
SEQ ID NO: 6
Sequence length: 36
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0023]
SEQ ID NO: 7
Sequence length: 30
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0024]
SEQ ID NO: 8
Sequence length: 45
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0025]
SEQ ID NO: 9
Sequence length: 29
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0026]
SEQ ID NO: 10
Sequence length: 37
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[0027]
SEQ ID NO: 11
Sequence length: 30
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single strand
Topology: linear
Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the first to 642nd base sequences of the insert DNA of vector pCC6 and the amino acid sequence of esterase deduced therefrom. The probe DNA used for the screening corresponds to nucleotides 346 to 390.
FIG. 2 is a diagram showing the base sequence from the 643th position to the 1074th position of the insert DNA of the vector pCC6 and the amino acid sequence of an esterase deduced therefrom.
FIG. 3 is a diagram showing the base sequence from the 1075th position to the 1639th position of the insert DNA of the vector pCC6 and the amino acid sequence of an esterase deduced therefrom.
FIG. 4 is a view showing a restriction map of a vector pCC6 obtained by plaque hybridization. In the figure, the white symbols indicate the present gene derived from a microorganism belonging to the genus Chromobacterium, and the shaded portions indicate the esterase translation regions.
FIG. 5 is a diagram showing a construction strategy of expression plasmids pCC100, pCC101, pCC200 and pCC201 containing the present gene. In the figure, arrows indicate the lac or tac promoter.

Claims (3)

A polynucleotide which is a liposome-binding region, comprising a base sequence of one of the following double-stranded DNA fragments:

Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an esterase gene encoding at least the amino acid sequence represented by the first to 362nds, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 represented by at least the 1st to 1086th position A polynucleotide comprising the polynucleotide as the liposome-binding region according to claim 1, which is linked upstream of any one of an esterase gene having a base sequence. A plasmid having the polynucleotide according to claim 1.

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