JP2004081033A

JP2004081033A - Method for detecting nucleic acid with carrier converted into solid phase of probe having tandem structure

Info

Publication number: JP2004081033A
Application number: JP2002243614A
Authority: JP
Inventors: Kentaro Nagamine; 長嶺　憲太郎; Yoko Kuzuhara; 葛原　陽子
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-03-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple and inexpensive means for more improving the detection sensitivity in a method for detecting a nucleic acid utilizing a solid-phase carrier. <P>SOLUTION: A carrier for detecting the nucleic acid is obtained by immobilizing a nucleic acid probe repetitively having a tandem structure containing a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and mutually complementary two sequences once or twice or more on a support. The method for detecting the nucleic acid utilizes the carrier. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を有する核酸プローブを固定した核酸検出用担体、及び該担体を利用した高感度な核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の検出は、サザンブロッティングやノーザンブロッティングにはじまり、ＲＴ−ＰＣＲ法、ディファレンシャルディスプレイ法など様々な方法が開発されている。最近では、数千あるいは数万の異なった遺伝子を簡便かつ高感度に検出できるという利点からＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等の固相担体が幅広く利用されている。
【０００３】
こうした固相担体は、標的核酸に相補的な複数のプローブをガラス基板等の固相担体上に高密度に固定して作製される。プローブの固定は、予め合成した核酸プローブを基板上にスポット（固定）する方法（Ｓｃｈｅｂａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：　４６７−４７０，　１９９５）と、光リソグラフィー技術を応用して、基板上で複数の核酸プローブを合成していく方法（Ｆｏｄｏｒ　ＳＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４：　５５５−５５６，　１９９３）の２つに大別される。ちなみに、ＤＮＡマイクロアレイとＤＮＡチップは同義に用いられる場合もあるが、狭義には、前者の方法で作製した担体をＤＮＡマイクロアレイ、後者の方法で作製した担体をＤＮＡチップという。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ等の固相担体を利用した検出方法では、通常蛍光色素で標識した試料（ターゲット）を担体上のプローブにハイブリダイズさせ、このハイブリダイズした標識ターゲットのシグナルを検出する。特に、細胞から抽出した全ｍＲＮＡ中に存在する微量な標的遺伝子を検出するためには、より感度の高い検出が望まれる。そのために、試料中のｃＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼでｃＲＮＡとして増幅し、さらにビオチン−アビジン系で増幅して用いられることもある。また、標識物質を使わず、電気化学的活性を有するインターカレーター（例えば、フォエロセン化ナフタレンジイミド）と走査型電気化学顕微鏡を用いて高感度の検出を可能にする方法（Ｓ．　Ｔａｋｅｎａｋａ，　Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．，　７４　（２），　２１７−２２４　（２００１），　Ｔ．　Ｎｏｊｉｍａ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　１，　１０５−１０６　（２００１））も開発されている。しかしながら、いずれの方法も、時間とコストがかかるという問題がある。
【０００５】
一方、発明者らは、ＰＣＲ法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功している（Ｎｏｔｏｍｉ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２８（１２）：ｅ６３（２０００）；ＷＯ　００／２８０８２）。ＬＡＭＰ法では、特有のプライマーを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。そして、この相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする別なプライマー（ループプライマー）による伸長反応によって、従来にない増幅効率で核酸の増幅が可能になる。発明者らは、このＬＡＭＰ法の高い増幅効率を利用して、目視による遺伝子の検出方法等（Ｍｏｒｉ　Ｙ．　Ｎａｇａｍｉｎｅ　Ｋ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｖｏｌ．２８９，Ｎｏ．１，　１５０−１５４，　２００１）を報告している。しかしながら、これまでＬＡＭＰ法をマイクロアレイ等の固相担体を用いた核酸検出法に応用したことはない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体を利用した核酸検出方法において、その検出感度をより向上させるための簡便かつ低廉な手段の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ産物に特有な、互いに相補的な配列を有する核酸プローブを固定化した担体では、従来の核酸プローブを固定化した担体よりもシグナル強度が２倍以上増強されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した、核酸検出用担体。
（２）　核酸プローブが、同一鎖上の互いに相補的な２つの配列間の少なくとも一部においてアニールすることによりループ形成していることを特徴とする、上記（１）記載の担体。
【０００９】
（３）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、少なくとも一部において重複していることを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の担体。
（４）　標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とが、重複していないことを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の担体。
【００１０】
（５）　核酸プローブが、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供されることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の担体。
（ａ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）　鋳型核酸上の増幅すべき配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【００１１】
（６）　増幅法がＬＡＭＰ法である、上記（５）記載の担体。
（７）　支持体が、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリーから選ばれるいずれか一つである、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の担体。
（８）　核酸プローブ中に、タンデム構造が１〜２０回反復して含まれていることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の担体。
（９）　核酸プローブが、１００〜１００００塩基長である、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の担体。
（１０）　上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の担体を用いた核酸の検出方法。
【００１２】
（１１）　以下の工程を含む、核酸の検出方法。
１）試料中の核酸を標識物質で標識する工程；
２）標識された核酸を上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の担体にハイブリダイズさせる工程；
３）ハイブリダイズした標識核酸量を標識物質のシグナル強度により検出する工程：
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．用語の定義
核酸：本明細書中における「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。該核酸には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びＰＮＡ等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
標的核酸：本明細書中における「標的核酸」とは、検出すべき核酸分子を意味する。
【００１４】
プローブとターゲット：本明細書中における「プローブ（核酸プローブ）」とは、標的核酸を検出するためにの固相担体上に固定化される核酸断片を意味する。これに対し、「ターゲット」とは、担体上に固定されたプローブにハイブリダイズさせる試料中の核酸断片を意味する。（文献によっては、プローブとターゲットの呼称を逆に用いる例もあるが、本明細書中では　［Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，　２１（１）　ｓｕｐｌ．　：１，　１９９９］に従い、上記のように定義する。）
タンデム構造：本明細書中における「タンデム（縦列）構造」とは、２以上の配列が縦列した構造、すなわち該配列が同一鎖上に存在する構造を意味する。このタンデム構造については、次項で詳述する。
【００１５】
鋳型と相補鎖：本明細書中における「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。
【００１６】
アニール：「アニール」と「ハイブリダイズ」は、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく相補的塩基対結合によって２本鎖を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が同一鎖上にあっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、アニール、あるいはハイブリダイズである。本発明において、アニールとハイブリダイズは、核酸が塩基対結合による２本鎖構造を構成する点で同義である。
【００１７】
２．　核酸検出用担体
本発明の核酸検出用担体は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する核酸プローブを支持体上に固定した固相担体である。
【００１８】
２．１　核酸プローブ
（１）核酸プローブの構造
本発明の核酸検出用担体で用いられる核酸プローブ（以下、「本発明のプローブ」という）は、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列と、互いに相補的な２つの配列とを含むタンデム構造を、１回又は２回以上反復して有する。ここで、タンデム構造とは、前述したように「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」が同一鎖上に存在する構造を意味する。
【００１９】
該タンデム構造において、「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」は、少なくとも一部において重複していてもよい。すなわち、両配列のそれぞれ一部が他方に含まれていてもよいし、一方が他方に完全に包含されていてもよい。例えば、後記する本発明の実施態様のように、標的核酸上の特定の配列を選択し、これを「互いに相補的な２つの配列」として含むプローブを合成することもできる。
【００２０】
また、「標的核酸の一部又は全部に相補的な配列」と「互いに相補的な２つの配列」は、本発明のプローブ上で全く重複していなくてもよい。すなわち、標的核酸の一部又は全部に相補的な配列とは無関係の配列を、「互いに相補的な２つの配列」として含むプローブであってもよい。
【００２１】
本発明のプローブ中には、前記タンデム構造が１回、又は２回以上繰り返し含まれる。プローブ中に含まれるタンデム構造の数は特に限定されないが、通常１〜５０回程度、好ましくは１〜２０回程度である。また、プローブの塩基長も特に限定されないが、好ましくは１００〜１００００塩基長、より好ましくは２００〜４０００塩基長である。
【００２２】
本発明のプローブ中に含まれる標的核酸の配列は、標的核酸の一部であっても、全部であってもよい。含まれる領域は、標的核酸に特異的な配列を選択して用いることが好ましく、例えば、構造遺伝子ならば繰り返し配列を含まない、ｍＲＮＡ３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分等を好適に用いることができる。
【００２３】
また「互いに相補的な２つの配列」とは、例えば、５’−ａｇｔｔｃａｔｃ−３’とその相補的配列３’−ｔｃａａｇｔａｇ−５’を意味するが、これらは同一鎖上に含まれるため、後者は５’−ｇａｔｇａａｃｔ−３’として逆方向に配置される。この互いに相補的な２つの配列は少なくとも一部において、鎖内アニール（同一鎖内でアニール）することによってループ構造を形成しうる。そして、このループ形成は本発明のプローブに特異な２次（あるいは３次）構造を与える。例えば、同一鎖上の両端にループが形成されると、本発明のプローブはダンベル型構造となり、同一鎖上に多数のループが形成されれば、該プローブはカリフラワー型構造となる。後述するように、本発明のプローブを固定した固相担体が従来のプローブを固定した固相担体よりも強いシグナル強度を示すメカニズムは明らかではないが、前記した特異な構造も一部では寄与していることが考えられる。例えば、標的核酸以外の領域によるリンカー効果、ターゲットとの結合点の増加が挙げられる。リンカー効果とは、プローブ末端に付加したリンカー配列により、プローブがターゲットとハイブリダイズしやすくなる効果をいう。これは、プローブをリンカー配列部分で固相に結合させると、標的配列が固相から浮き上がった状態になり、ターゲットとのハイブリダイズが容易になるためである。すなわち、本発明のプローブには、標的核酸以外の領域が繰り返し現れるが、この領域がリンカー配列として標的配列を浮き上がらせ、ターゲットとのハイブリダイズをより容易にしている可能性がある。また、通常ＰＣＲ産物をプローブとして固定した固相担体（特にＵＶ架橋で固定した場合）では、洗浄工程でプローブが支持体から剥がれることがある。しかし、本発明のプローブは比較的長鎖であるため、洗浄工程で支持体からはがれ難く、そのために従来の固相担体よりも高い検出感度を示すことも考えられる。
【００２４】
本発明で用いられるプローブは、当該技術分野で公知の適当な修飾を施されていてもよい。そのような修飾は、支持体上での固定性の向上、安定性の向上、標的核酸への結合性の向上（例えば、ペプチドＤＮＡ）等を目的として行われる。
【００２５】
（２）核酸プローブの合成
本発明のプローブは、光リソグラフィー等の公知の技術を用いて支持体上で合成するもの（Ｆｏｄｏｒ　ＳＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６４：　５５５−５５６，　１９９３）、ラテックス等の支持体に固定したプライマーからの増幅（合成）反応によって合成するもの（特願２００１−１６１４８６号）、予め合成したものを支持体上に固定するもの（Ｓｃｈｅｂａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：　４６７−４７０，　１９９５）のいずれであってもよい。特に、本発明においてはプローブの長さと構造上の特徴から、後の２つの方法が好ましい。これらの方法において、プローブは化学的合成等の公知の核酸合成法や、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法等の核酸増幅法を用いて調製できるが、特に、後述するＸ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法等）を利用すれば、効率的に合成することができる。
【００２６】
（３）Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法
本発明のプローブは、Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法によって効率的に合成することができる。
Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。
（ａ）　鋳型核酸鎖上の増幅すべき配列の３’側から当該鋳型核酸鎖上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）　鋳型核酸鎖上の増幅すべき配列の５’側から当該鋳型核酸鎖上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
なお、上記プライマーは（ａ）（ｂ）をペアとして用いてもよいし、（ａ）（ｂ）どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。
【００２７】
鋳型核酸としては、標的核酸の一部又は全部を構成する配列を用いる。該鋳型核酸において、Ｆ１ｃ　Ｆ２ｃ　Ｒ１　Ｒ２をすべて標的核酸上に選択すると、増幅産物はその末端に生成する「互いに相補的な２つの配列」も含めてすべて標的核酸由来のものとなる。
増幅反応は、例えば上記プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド基質及びＤＮＡ（ＲＮＡ）ポリメラーゼを用いて、通常のＰＣＲ法により達成できる。
【００２８】
さらに、前記増幅反応はポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば、等温条件下で行うこともできる。これは、プライマーがＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はＸ１ｃ＋（Ｘ２＋）Ｘ１の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された２本鎖核酸上に１本鎖部分を生成するためである。すなわち、２本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するＬＡＭＰ法を参照されたい。
【００２９】
なお、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。
【００３０】
（４）ＬＡＭＰ法
１）ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の概要
前記増幅法の好適な態様として、ＬＡＭＰ法による増幅法を用いることができる。「ＬＡＭＰ法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、２種、４種或いは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡ又はＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の概要については、文献：Ｎｏｔｏｍｉ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２８（１２）：ｅ６３（２０００）、特許：国際公開ＷＯ　００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／）を参照されたい。
【００３１】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、本発明のタンデム構造を有するプローブ核酸を効率的に合成できる。
【００３２】
２）ＬＡＭＰ法用プライマー
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３３】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３４】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００３５】
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、２本鎖（Ｆ及びＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００３６】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００３７】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００３８】
３）増幅用鋳型核酸
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織又は細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
【００３９】
４）反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００４０】
５）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）　インナープライマー２種、或いはさらにアウタープライマー２種、或いはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）　鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）基質ヌクレオチド
【００４１】
２．２　支持体
本発明の核酸検出用担体に用いられる支持体は、核酸プローブを固定可能な固相であれば特に限定されず、例えば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリー等を用いることができる。
【００４２】
支持体は、核酸プローブを固定化するために、適当な表面処理を施すことが好ましい。例えば、ポリＬ−リシンコーティング（Ｓｃｈｅｎａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：１０６１４−１０６１９，　１９９６）、シランコーティング（ＤｅＲｉｓｉ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１４：４５７−４６０，　１９９６）等が当該技術分野で公知である。また、市販の表面処理済みガラス板（例えば、カルボステーション^ＴＭ（日清紡製）、アルミニウム＆アミノシランコーティンググラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等）を用いてもよい。
【００４３】
３．　核酸検出用担体の作製
本発明の核酸検出用担体は、上記支持体に本発明の核酸プローブを固定して作製される。前記したように、プローブは光リソグラフィー技術等により支持体上で合成してもよいが、予め合成したプローブを支持体上に固定する方法、あるいは支持体（ラテックス粒子等）に固定したプライマーからＬＡＭＰ反応を行う方法（特願２００１−１６１４８６号）が、本発明の核酸検出用担体の作製には好ましい。以下、これらの方法について説明する。
【００４４】
（１）シランコーティング−ＵＶ架橋
シランコーティングを施した支持体上に核酸プローブをスポッティングし、ＵＶ照射してプローブを支持体上のシランコーティングに共有結合（架橋）させて固定する。ＵＶ架橋は、市販のＵＶクロスリンカー（例えば、ＳＰＥＣＴＲＯ　ＬＩＮＫＥＲ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）等）を用いて、５０ｍＪ〜１５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶ照射を行って実施する。シランコーティングは公知の技術（ＤｅＲｉｓｉ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−４６０，　１９９６）にしたがって実施してもよいし、市販のシランコーティンググラス（例えば、アルミニウム＆アミノシランコーティンググラス（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等）を用いてもよい。支持体上への核酸プローブのスポッティングは、市販のスポッター（又はアレイヤーともいう）を用いて行うことができる。市販のスポッターとしては、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＩＩ、日本レーザー電子製　ＳＴＡＭＰ　ＭＡＮ、日立ソフトウェアエンジニアリング製　ＳＰＢＩＯ２０００等、任意のものを用いることができる。
【００４５】
（２）ポリＬ−リシンコーティング−ＵＶ架橋
ポリＬ−リシンコーティングを施した支持体上に核酸プローブをスポッティングし、ＵＶ照射してプローブを支持体上のポリＬ−リシンコーティングに共有結合（架橋）させて固定する。ＵＶ架橋は前項と同様に実施すればよいが、架橋前に１００〜１５０℃に支持体を加熱すると、プローブの固定率がより向上する。ポリＬ−リシンコーティングは、公知の技術（Ｓｃｈｅｎａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：１０６１４−１０６１９，　１９９６）に従って実施してもよいし、市販の表面処理済みガラスを用いてもよい。支持体上への核酸プローブのスポッティングは前項と同様にして実施すればよい。架橋後の支持体は、後処理溶液（マイクロアレイキットの添付品等）に浸漬後、洗浄して乾燥する。
【００４６】
（３）ビオチン−アビジン結合
ビオチン−アビジン結合を利用した支持体上への核酸プローブの固定化方法である。例えば、支持体上にアビジンを固定し、このアビジンにビオチン化ヌクレオチドを導入した核酸プローブを、ビオチン−アビジン結合を介して結合させる方法等が公知である（Ｃａｒｌ　Ｆ．　Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　２５：　４９０７−４９１４（１９９７））。
【００４７】
（４）ナイロンメンブレンへの固定（ドットブロット法）
ドットブロット法では核酸プローブを固定したメンブレンを核酸検出用担体として用いる。メンブレンの素材や大きさは特に限定されず、目的に応じて適宜選択されるが、特にナイロン製メンブレンが好適に用いられる。
【００４８】
メンブレンへのプローブの付着方法は特に限定されず、ピペットで一つずつ付着させても、市販の９６穴のドットブロット装置を用いてもよいが、ピンの先端にプローブを付着させて写し取る器具を用いるとより効率的である。ただし、検出の精度を高めるために、付着させるＤＮＡ量をそろえることが必要で、そのために、プローブ濃度やメンブレンに移す液量を一定にすることが重要となる。
【００４９】
（５）支持体に固定したプライマーからのＬＡＭＰ反応
前述のＬＡＭＰ法におけるインナープライマーあるいはループプライマーを支持体上に固定しておき、そこから増幅反応を行ることにより、プローブが固定された固相担体を作製する方法である（特願２００１−１６１４８６参照）。例えば、ラテックス粒子にループプライマーの５’末を結合させたものを用いてＬＡＭＰ反応を行う。これによりラテックス粒子に固定されたＬＡＭＰ産物が合成できる。
【００５０】
４．核酸検出用担体による核酸の検出
本発明の核酸検出用担体を用いた核酸検出の手順は、従来の核酸検出用担体を用いた場合の手順と基本的に変わらない。すなわち、標識したターゲットをプローブにハイブリダイズさせ、その標識物質のシグナル強度によりターゲット量を検出する方法等が挙げられる。
以下、本発明の核酸検出用担体を用いた核酸検出方法について具体的に説明する。
【００５１】
４．１　試料（ターゲット）の調製
まず、検出対象である試料を調製する。試料は標的核酸を含むものであれば特に限定されない。例えば、生物試料中の特定遺伝子の検出であれば、周知の方法に従って細胞より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡとして増幅し、ターゲットとして用いることができる。解析対象とする核酸量が少ない場合には、さらに前記ｃＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってｃＲＮＡとして増幅して用いてもよい。
【００５２】
４．２　ターゲットの標識
調製したターゲットは、通常検出のために適当な試薬で標識する。標識物質としては、例えば、蛍光色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、ＤＮＰ）、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）等を挙げることができる。
【００５３】
標識は、前項に記載した増幅と同時に行うこともできる。例えば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡ増幅時に　標識ヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３／Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製等）、ＤＮＰ−ｄＣＴＰ、ＤＩＧ−ｄＣＴＰ等）を加えて増幅すれば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＮＰ又はＤＩＧ標識されたｃＤＮＡターゲットを得ることができる。
【００５４】
ビオチン標識の場合は、ヌクレオチドのビオチン誘導体を酵素反応でターゲット鎖内に取り込ませる方法や、光活性型ビオチン誘導体や市販のビオチン標識試薬（カルボビオチン^ＴＭ（日清紡製）等）をターゲットに添加し反応させる方法により、ビオチン標識ターゲットを得ることができる。
【００５５】
４．３　ハイブリダイゼーション
次に標識したターゲットを核酸検出用担体にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件（温度や時間等）やウォッシングの条件は、用いる核酸検出用担体やターゲットの種類に応じて、適宜決定される。ハイブリダイゼーションは市販の自動機器（例えば、ＡＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて行っても良い。
【００５６】
ビオチン標識ターゲットの場合は、ハイブリダイズの後に、例えばアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンやアルカリフォスファターゼ抗ビオチン抗体を反応させ、さらに発光基質を反応させて化学発光させる。同様に、ＤＩＧ標識の場合も、例えば、アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を結合後、さらに発光基質を反応させて化学発光させる。
【００５７】
４．４　検出と解析
最後に、核酸検出用担体にハイブリダイズした標識ターゲットによる蛍光や化学発光をシグナル強度として検出する。シグナルはスキャナー（例えば、ＧＴＭＡＳ　Ｓｃａｎ　ＩＩ　（日本レーザー電子製）等）で読み取り、解析ソフト（例えば、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（日本レーザー電子製）等）を用いて画像化し、数値化する。スキャナーで読み取ったシグナルは必要に応じて、誤差の調整や各試料毎のばらつきの正規化を行ってもよい。正規化は、ハウスキーピング遺伝子等各サンプルで共通に発現している遺伝子を基準に行うことができる。さらに、信頼性限界ラインを特定して、相関性の低いデータを除いてもよい。
【００５８】
４．５　二蛍光標識法
２つの試料における核酸の発現量を比較したい場合には、比較したい２つの試料を蛍光波長の異なる２つの蛍光物質で標識する二蛍光標識法が簡便で好ましい。この際、２つの蛍光物質には蛍光波長の重なりがないことが必要で、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５を好適に用いることができる。Ｃｙ３とＣｙ５を用いる場合、一方の試料をＣｙ３標識し、他方の試料をＣｙ５標識して、同時に核酸検出用担体にハイブリダイズさせてＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度をスキャナーで読み取る。Ｃｙ３とＣｙ５の蛍光を重ね合わせた擬似色調を解析すれば、２つの試料間における核酸発現量差を簡便に検出することができる。
【００５９】
４．６　本発明の核酸検出用担体の効果
後述する実施例に示すように、互いに相補的な２つの配列を含むタンデム構造を有するプローブを固定した本発明の核酸検出用担体は、従来のプローブを固定した担体に比較して、同一試料について２倍以上高いシグナル強度を検出できる。
すなわち、本発明の核酸検出用担体を用いることにより、従来の方法よりも高感度に標的核酸を検出することが可能になる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＤＮＡマイクロアレイの調製
マウスのＧＡＰＤＨ、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ、γ−ａｃｔｉｎの３種の遺伝子を鋳型とするＬＡＭＰ産物、及びＰＣＲ産物をそれぞれプローブとするＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００６１】
１．プローブの調製
マウスＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ（配列番号１）、マウスＨａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　ｃＤＮＡ（配列番号２）、マウスγ−ａｃｔｉｎ　ｃＤＮＡ（配列番号３）の配列をもとに、ＬＡＭＰ用プライマーを設計し、ＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、表１に示す反応液組成にて、６５℃、２時間反応させた。Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　は　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　社製の８　Ｕ／μｌ　のものを用いた。
同様に、ＰＣＲ用プライマーを設計し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃，　１分に引き続き、９４℃，　３０秒、６５℃，　３０秒、６８℃，　３０秒を３０サイクル行った。得られる産物量が少ないため、この操作を３回繰り返した。
【００６２】
【表１】

【００６３】
【表２】

【００６４】
ＧＡＰＤＨ　　ＬＡＭＰ用プライマー：
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴ（配列番号４）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴ（配列番号５）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＡＡＡＣＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧ（配列番号６）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号７）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＣＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号８）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴ（配列番号９）
ＧＡＰＤＨ　　ＰＣＲ用プライマー：
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴ（配列番号１０）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴ（配列番号１１）
Ｈａｐｔｏｇｒｏｂｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー：
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号１２）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧ（配列番号１３）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧ（配列番号１４）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号１５）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＡＣＴＣＴ（配列番号１６）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号１７）
Ｈａｐｔｏｇｒｏｂｉｎ　　ＰＣＲ用プライマー：
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号１８）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧ（配列番号１９）
γ−ａｃｔｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡ（配列番号２０）
Ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡ（配列番号２１）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧ（配列番号２２）
Ｏｕｔｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＣＡＣＡＣＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧ（配列番号２３）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧ（配列番号２４）
Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＴＡＣＧＣ（配列番号２５）
γ−ａｃｔｉｎ　　ＬＡＭＰ用プライマー
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＡ（配列番号２６）
Ｐｒｉｍｅｒ（Ｒ）：ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡ（配列番号２７）
反応終了後、アルコール沈澱によってＡ１溶液に溶解した。
【００６５】
２．プローブの固定化
（株）日本レーザー電子に委託し、調製したプローブをガラス板上に固定して、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。
（１）装置及び試薬
ＤＮＡスタンピング装置：ＳＴＡＭＰ　ＭＡＮ　（日本レーザー電子製）、マイクロプレート用遠心分離機（久保田製作所製）、ホットプレート（井内盛栄堂製）、ＵＶクロスリンカー（コスモバイオ製）、インキュベーター：Ｈｙｂｒｉ　Ｃａｎｍｂｅｒ　（日本レーザー電子製）
ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｋｉｔ：ＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　専用スライドグラス、ＤＮＡ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｏｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、カバーガラス専用ゴムのり等含む（日本レーザー電子製）、カバーガラス：１８ｍｍ×１８ｍｍ（松浪ガラス製）、精製水：Ｍｉｌｌｉ　Ｑ
【００６６】
（２）作製方法（全工程をクリーンルーム内で実施）
まず、以下の条件でＤＮＡのスタンピングをおこなった。
パターン：１　ブロック
スポットサイズ：２００　μｍ
スポットエリア：約　０．５　ｃｍ^２
ドット：　４８ト゛ット／スライト゛カ゛ラス
【００６７】
次に、スタンピングしたスライドガラスを約　６０　℃の温水の上にスポット面が下になるようにかざし、約３〜５秒間蒸気にあてた後、８０　℃のホットプレートにのせて約　１時間インキュベートした。その後、スライドガラスに６０　ｍＪ　のＵＶ　照射を行い、ＤＮＡにＵＶ架橋を施した。
【００６８】
最後に、以下のようにしてブロッキングを行った。まず表３の組成でブロッキング溶液を調整し、スライドガラスをこのブロッキング溶液中で４〜５回上下させた後、約１５分間インキュベートした。次いで、９５℃の蒸留水で洗浄後、キットに添付されたＡ５溶液で洗浄し、乾燥のため　５００ｒｐｍ、１分間遠心分離を行った。
【００６９】
【表３】

【００７０】
〔実施例２〕　ハイブリダイゼーションアッセイ
実施例１で作製した３種の遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ、γ−ａｃｔｉｎ）検出用ＤＮＡマイクロアレイに、ＧＡＰＤＨ（配列番号１）、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ（配列番号２）、γ−ａｃｔｉｎ（配列番号３）の配列をもとに作製した試料（ターゲット）をハイブリダイズさせ、蛍光強度を測定した。なお、この検出及び解析は（株）日本レーザー電子に委託した。
【００７１】
１．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション用試料（ターゲット）として、実施例２で設計したＰＣＲプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ）：すなわち、ＧＡＰＤＨは配列番号１０、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎは配列番号１８、γ−ａｃｔｉｎは配列番号２６の塩基配列を有するＤＮＡ）の５’末端をＣｙ５で標識したものを作製した。実施例１と同様に、このプライマーを用いてＰＣＲ増幅したものをハイブリダイゼーション用試料とした。各ターゲット核酸は５０ｎｇ／μｌとなるようにＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【００７２】
スライドグラス（ＤＮＡマイクロアレイ）のスポット上に、調製したハイブリダイゼーション溶液　１０μｌ　を滴下し、空気が入らないようにカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスの淵をゴムのりで密閉し、温度６５　℃，湿度８０　％に設定したＨｙｂｒｉ　Ｃｈａｍｂｅｒ　にスライドグラスを入れ、１６　時間インキュベートした。
【００７３】
次に、ポストハイブリダイゼーションを行った。スライドグラスは、密閉用ゴムのり除去後、４２℃に温めたＢ４　溶液に浸してカバーガラスを外した。次いで、Ｂ５　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄、Ｂ６　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄し、Ｂ７　溶液（４２℃）中で数回上下した後１分間インキュベートし洗浄した。最後に乾燥のため　５００ｒｐｍ、１分間遠心分離をおこなった。
【００７４】
２．スキャニング及び解析
スキャナー：ＧＴＭＡＳ　Ｓｃａｎ　ＩＩ　（日本レーザー電子製）を用いてスライドガラス上の蛍光強度をスキャンし、解析ソフト：Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（日本レーザー電子製）を用いてＣｙ５　発色量の解析をおこなった。測定は各々２サンプルについて行い、その結果を図１〜図３に示した。
【００７５】
３．結果
いずれの試料においても、ＬＡＭＰ産物をプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイはＰＣＲ産物をプローブとして固定したＤＮＡマイクロアレイに比較して、２〜３倍程度高い蛍光強度を示した。
【００７６】
〔実施例３〕　ドットブロット法による検出感度の検討
１．ドットブロット
実施例１と同様の方法で調製したマウスＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡのＰＣＲ産物及びＬＡＭＰ産物、それぞれ１００　ｎｇ　をナイロンメンブレン上にスポットとした。試料（ターゲット）として、ＤＩＧラベルしたＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片（配列番号１０）の１０倍、及び　１００倍希釈液を、ハイブリダイゼーション溶液１　ｍｌに１μｌ添加したものを調製　（各々１０　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ，　１　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）し、前記ナイロンメンブレン上にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、６０℃、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔで行い、反応後、０．１　ｘ　ＳＳＣ，　０．５％　ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で、４５分洗浄した。検出は、ＤＩＧ　ｌａｂｅｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ社製）　を用いて行った。結果を図４に示す。
【００７７】
２．結果
図４から明らかなように、ＬＡＭＰ産物を固定した担体では、１０倍希釈試料（１０　ｐｌｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）、１００倍希釈試料　（１　ｐｌ　ｔａｒｇｅｔ／１　ｍｌ）　のいずれをも検出することができたが、ＰＣＲ産物を固定した担体では１００倍希釈試料を検出することはできなかった。
【００７８】
以上の結果より、ＬＡＭＰ産物をスポットした担体は、従来のＰＣＲ産物をスポットした単体に比較して、少量の試料を感度よく検出できることが確認された。すなわち、本発明の核酸検出用担体は、発現量の少ない遺伝子の検出に極めて有効であることが確認できた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によれば、少量の核酸を感度よく検出することができる。しかも、本発明の核酸検出用担体は、ＬＡＭＰ法を利用することにより、容易かつ低廉に作製することができる。
【００８０】
【配列表】

【００８１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
配列番号６−人工配列の説明：プライマー
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プライマー
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プライマー
配列番号１５−人工配列の説明：プライマー
配列番号１６−人工配列の説明：プライマー
配列番号１７−人工配列の説明：プライマー
配列番号１８−人工配列の説明：プライマー
配列番号１９−人工配列の説明：プライマー
配列番号２０−人工配列の説明：プライマー
配列番号２１−人工配列の説明：プライマー
配列番号２２−人工配列の説明：プライマー
配列番号２３−人工配列の説明：プライマー
配列番号２４−人工配列の説明：プライマー
配列番号２５−人工配列の説明：プライマー
配列番号２６−人工配列の説明：プライマー
配列番号２７−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、ＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片の検出結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　ｃＤＮＡ断片の検出結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＬＡＭＰ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイとＰＣＲ産物を固定したＤＮＡマイクロアレイによる、γ−ａｃｔｉｎの断片の検出結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＬＡＭＰ産物とＰＣＲ産物による、ＤＩＧ標識ＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ断片のドットブロットの結果を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a nucleic acid detection carrier on which a nucleic acid probe having a tandem structure containing a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and two sequences complementary to each other is immobilized, and high sensitivity using the carrier And a method for detecting nucleic acids.
[0002]
[Prior art]
Various methods such as RT-PCR and differential display have been developed for nucleic acid detection, starting with Southern blotting and Northern blotting. Recently, solid-phase carriers such as DNA microarrays and DNA chips have been widely used because of the advantage that thousands or tens of thousands of different genes can be detected easily and with high sensitivity.
[0003]
Such a solid support is prepared by immobilizing a plurality of probes complementary to a target nucleic acid on a solid support such as a glass substrate at a high density. The probe is immobilized by spotting (immobilizing) a nucleic acid probe synthesized in advance on the substrate (Schebba M, et al., Science 270: 467-470, 1995) and by applying photolithography technology to the substrate. Methods of synthesizing a plurality of nucleic acid probes (Fodor @ SP, @ et @ al., Nature @ 364: $ 555-556, 1993) are roughly classified. Incidentally, the DNA microarray and the DNA chip may be used synonymously, but in a narrow sense, the carrier produced by the former method is called a DNA microarray, and the carrier produced by the latter method is called a DNA chip.
[0004]
In a detection method using a solid-phase carrier such as a DNA microarray or a DNA chip, a sample (target) labeled with a fluorescent dye is usually hybridized to a probe on the carrier, and the signal of the hybridized labeled target is detected. In particular, in order to detect a trace amount of a target gene present in all mRNAs extracted from cells, more sensitive detection is desired. For this purpose, the cDNA in the sample may be amplified as cRNA with T7 RNA polymerase and further amplified with a biotin-avidin system. Also, a method that enables high-sensitivity detection using an intercalator having electrochemical activity (for example, phoerosenated naphthalenediimide) and a scanning electrochemical microscope without using a labeling substance (S. @Takenaka, Bull. @Chem) {Soc.} Jpn., {74} (2), {217-224} (2001), {T. Nojima, et al, Nucleic Acid Research Supplement, {1, 105-106} (2001)) have also been developed. However, each of these methods has a problem that it takes time and costs.
[0005]
On the other hand, the inventors have succeeded in developing a new nucleic acid amplification method that does not require complicated temperature control which is indispensable in the PCR method: LAMP method (Loop-mediated isothermal amplification) (Notomi, {Tet et al. : Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 (2000); WO 00/28082). In the LAMP method, an amplification product having sequences complementary to each other on the same chain end is generated by using a unique primer. The nucleic acid can be amplified with unprecedented amplification efficiency by the extension reaction starting from the loop formed by annealing between the complementary sequences and the extension reaction using another primer (loop primer) that anneals to the loop. become. The present inventors have utilized the high amplification efficiency of the LAMP method to visually detect genes and the like (Mori Y. Nagamine K., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 289, No. 1, No. 1, 150-154, etc.). 2001). However, the LAMP method has never been applied to a nucleic acid detection method using a solid-phase carrier such as a microarray.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple and inexpensive means for further improving the detection sensitivity in a nucleic acid detection method using a solid phase carrier.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, a carrier on which a nucleic acid probe having a sequence complementary to each other, which is specific to a LAMP product, is immobilized more than a carrier on which a conventional nucleic acid probe is immobilized. The inventors have found that the strength is enhanced by a factor of two or more, and completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides the following (1) to (11).
(1) A nucleic acid probe having a tandem structure containing a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and two sequences complementary to each other once or twice or more is immobilized on a support. , A carrier for nucleic acid detection.
(2) The carrier according to the above (1), wherein the nucleic acid probe forms a loop by annealing at least a part between two mutually complementary sequences on the same strand.
[0009]
(3) The above (1) or (2), wherein the sequence complementary to part or all of the target nucleic acid and the two sequences complementary to each other at least partially overlap. Carrier.
(4) The carrier according to the above (1) or (2), wherein the sequence complementary to a part or all of the target nucleic acid and the two sequences complementary to each other do not overlap.
[0010]
(5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the nucleic acid probe is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b). Carrier.
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are selected in order from the 3 ′ side of the sequence to be amplified on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the F1c And a primer comprising, in this order, a sequence F2 complementary to F2c from 5 ′ to 3 ′
(B) {circle around (3)} When the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the sequence to be amplified on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, Containing, in this order, a sequence R1c complementary to R2 and a sequence R2 identical to R2 from 5 ′ to 3 ′
[0011]
(6) The carrier according to the above (5), wherein the amplification method is a LAMP method.
(7) The above (1) to (6), wherein the support is any one selected from a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, a latex, a microbead, a silicon chip, and a capillary. The carrier according to any one of claims 1 to 4.
(8) The carrier according to any one of (1) to (7) above, wherein the nucleic acid probe contains a tandem structure repeated 1 to 20 times.
(9) The carrier according to any one of (1) to (8) above, wherein the nucleic acid probe has a length of 100 to 10,000 bases.
(10) A method for detecting a nucleic acid using the carrier according to any one of (1) to (9).
[0012]
(11) A method for detecting a nucleic acid, comprising the following steps.
1) labeling a nucleic acid in a sample with a labeling substance;
2) a step of hybridizing the labeled nucleic acid to the carrier according to any one of the above (1) to (9);
3) Step of detecting the amount of hybridized labeled nucleic acid by the signal intensity of the labeling substance:
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Definition of terms
Nucleic acid: As used herein, "nucleic acid" may be natural or artificially synthesized. The nucleic acid includes all of DNA, cDNA, RNA, cRNA, PNA and the like. In addition, it includes both single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids. Furthermore, nucleotide derivatives that are partially modified or wholly entirely composed of artificial structures are included in the nucleic acids of the present invention as long as they can form base pairing. In addition, the term gene (nucleic acid that carries a specific function or information related to life) is also included in nucleic acid. In the present invention, the number of constituent bases of the nucleic acid is not limited.
Target nucleic acid: As used herein, "target nucleic acid" refers to a nucleic acid molecule to be detected.
[0014]
Probe and target: As used herein, the term "probe (nucleic acid probe)" refers to a nucleic acid fragment immobilized on a solid support for detecting a target nucleic acid. On the other hand, the term “target” means a nucleic acid fragment in a sample to be hybridized to a probe immobilized on a carrier. (Depending on the document, there is an example in which the names of the probe and the target are used in reverse, but in the present specification, they are defined as described above according to {[Nature @ Genet., {21 (1)} supl.}: 1, $ 1999).
Tandem structure: As used herein, the term “tandem (tandem) structure” means a structure in which two or more sequences are arranged in tandem, that is, a structure in which the sequences are present on the same chain. This tandem structure will be described in detail in the next section.
[0015]
Template and complementary strand: "Template" in the present specification means a nucleic acid on the side that serves as a template for complementary strand synthesis. A “complementary strand” having a base sequence complementary to a template has a meaning as a strand corresponding to the template, but the relationship between the two is merely relative.
[0016]
Annealing: "Annealing" and "hybridizing" mean that the nucleic acid forms a duplex through complementary base pairing based on the Watson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strands forming the base pairing are on the same strand, if the complementary base sequence in the molecule forms a base pairing, the nucleic acid is annealed or hybridized. In the present invention, annealing and hybridization are synonymous in that a nucleic acid forms a double-stranded structure by base pairing.
[0017]
2.担体 Carrier for nucleic acid detection
The carrier for nucleic acid detection of the present invention includes a nucleic acid probe having a tandem structure containing a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and two sequences complementary to each other once or twice or more times. It is a solid support immobilized on a support.
[0018]
2.1 Nucleic acid probe
(1) Structure of nucleic acid probe
The nucleic acid probe used in the nucleic acid detection carrier of the present invention (hereinafter, referred to as “probe of the present invention”) is a tandem nucleic acid comprising a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and two sequences complementary to each other. The structure has one or more repetitions. Here, the tandem structure means a structure in which a “sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid” and “two mutually complementary sequences” exist on the same strand as described above.
[0019]
In the tandem structure, the “sequence complementary to part or all of the target nucleic acid” and the “two sequences complementary to each other” may at least partially overlap. That is, a part of each of the two sequences may be included in the other, or one may be completely included in the other. For example, as in an embodiment of the present invention described below, a specific sequence on a target nucleic acid can be selected, and a probe containing this as “two sequences complementary to each other” can be synthesized.
[0020]
Further, the “sequence complementary to a part or the whole of the target nucleic acid” and the “two sequences complementary to each other” may not overlap at all on the probe of the present invention. That is, the probe may include a sequence irrelevant to a sequence complementary to a part or all of the target nucleic acid as “two mutually complementary sequences”.
[0021]
In the probe of the present invention, the tandem structure is repeated once or twice or more. The number of tandem structures contained in the probe is not particularly limited, but is usually about 1 to 50 times, preferably about 1 to 20 times. In addition, the base length of the probe is not particularly limited, but is preferably 100 to 10000 base length, more preferably 200 to 4000 base length.
[0022]
The sequence of the target nucleic acid contained in the probe of the present invention may be part or all of the target nucleic acid. It is preferable to select and use a sequence specific to the target nucleic acid, for example, a region that does not include a repetitive sequence in the case of a structural gene, a portion having high sequence specificity existing in the mRNA 3 ′ untranslated region, and the like are preferable. Can be used.
[0023]
“Two sequences complementary to each other” means, for example, 5′-agttcatc-3 ′ and its complementary sequence 3′-tcaagtag-5 ′, since these are contained on the same chain, Is arranged in the reverse direction as 5′-gatgaact-3 ′. The two sequences complementary to each other can form, at least in part, a loop structure by annealing in a chain (annealing in the same chain). This loop formation gives the probe of the present invention a unique secondary (or tertiary) structure. For example, when loops are formed at both ends on the same strand, the probe of the present invention has a dumbbell structure, and when a large number of loops are formed on the same strand, the probe has a cauliflower structure. As described below, the mechanism by which the solid-phase carrier on which the probe of the present invention is immobilized exhibits a stronger signal intensity than the solid-phase carrier on which the conventional probe is immobilized is not clear, but the above-described unique structure also contributes in part. It is thought that it is. For example, there are a linker effect due to a region other than the target nucleic acid, and an increase in the number of bonding points with the target. The linker effect refers to an effect that a probe is easily hybridized to a target by a linker sequence added to a probe end. This is because, when the probe is bound to the solid phase at the linker sequence portion, the target sequence is raised from the solid phase, and hybridization with the target is facilitated. That is, in the probe of the present invention, a region other than the target nucleic acid repeatedly appears, and this region may raise the target sequence as a linker sequence, which may facilitate hybridization with the target. Further, in the case of a solid-phase carrier on which a PCR product is usually immobilized as a probe (particularly when immobilized by UV crosslinking), the probe may be peeled off from the support in the washing step. However, since the probe of the present invention has a relatively long chain, it is difficult for the probe to be separated from the support in the washing step, so that it may be possible to exhibit higher detection sensitivity than a conventional solid phase carrier.
[0024]
The probe used in the present invention may be provided with an appropriate modification known in the art. Such modification is performed for the purpose of improving fixation on a support, improving stability, improving binding to a target nucleic acid (for example, peptide DNA), and the like.
[0025]
(2) Synthesis of nucleic acid probe
The probe of the present invention is one synthesized on a support using a known technique such as photolithography (Foodor SP, et al., Nature 364: 555-556, 1993), a primer fixed on a support such as latex. (Japanese Patent Application No. 2001-161486) and a product synthesized in advance and immobilized on a support (Schebba M, et al., Science 270: 467-470, 1995). Any of them may be used. Particularly, in the present invention, the latter two methods are preferable from the viewpoint of the length and structural characteristics of the probe. In these methods, the probe can be prepared by using a known nucleic acid synthesis method such as chemical synthesis, or a nucleic acid amplification method such as a PCR method or an SDA method. In particular, an amplification method using a primer having an X1c + X2 structure described later is used. If (for example, the LAMP method) is used, efficient synthesis can be achieved.
[0026]
(3) Amplification method using primer having X1c + X2 structure
The probe of the present invention can be efficiently synthesized by an amplification method using a primer having an X1c + X2 structure.
The primer having the X1c + X2 structure is specifically designed as follows.
(A) {circle around (3)} When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are selected in order from the 3 ′ side of the sequence to be amplified on the template nucleic acid chain toward the 3 ′ end on the template nucleic acid chain, A primer containing the same sequence as F1c and the sequence F2 complementary to F2c in this order from 5 ′ to 3 ′
(B) {circle around (3)} When a third arbitrary sequence R1 and a fourth arbitrary sequence R2 are sequentially selected from the 5 ′ side of the sequence to be amplified on the template nucleic acid chain toward the 5 ′ end on the template nucleic acid chain, A primer comprising a sequence R1c complementary to the R1 and a sequence R2 identical to the R2 from 5 ′ to 3 ′ in this order
The above primers may be used as a pair of (a) and (b), or one of (a) and (b) may be used as a pair with a normal primer.
[0027]
As the template nucleic acid, a sequence constituting a part or all of the target nucleic acid is used. In the template nucleic acid, if all of F1c２F2c R1 R2 are selected on the target nucleic acid, the amplification products are all derived from the target nucleic acid, including “two sequences complementary to each other” generated at the end.
The amplification reaction can be achieved by a usual PCR method using, for example, the above-mentioned primer, template nucleic acid, nucleotide substrate and DNA (RNA) polymerase.
[0028]
Furthermore, the amplification reaction can be performed under isothermal conditions by using a strand displacement DNA polymerase as the polymerase. This is because the extension product from the primer has an X1c + X2 structure,X1c+ (X2 +)X1(Underlined) to anneal within the strand to produce a single-stranded portion on the synthesized double-stranded nucleic acid. That is, a new starting point for a strand displacement reaction by intrachain annealing is provided on the extension product without dissociating the duplex at a high temperature. For the outline of this reaction, refer to the LAMP method described later.
[0029]
Examples of the strand displacement type DNA polymerase include BstＢ DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, and E. coli. E. coli DNA polymerase I Klenow fragment, Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase (excluding exonuclease activity from Vent DNA polymerase), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (from DeepVent DNA polymerase) Exonuclease activity), Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like.
[0030]
(4) LAMP method
1) Outline of LAMP (Loop-mediated @ isothermal @ amplification) method
As a preferred embodiment of the amplification method, an amplification method by a LAMP method can be used. The “LAMP method” is a method for amplifying nucleic acids developed by the present inventors, and includes two, four, or six specific primers including an inner primer pair or an outer primer pair and a loop primer pair. This is a method for rapidly and inexpensively amplifying DNA or RNA under isothermal conditions (around 65 ° C.) using a strand displacement polymerase and nucleotides as substrates. For an overview of the LAMP method, see the literature: Notomi, {T} et al. : Nucleic Acids Res. $ 28 (12): e63 (2000), Patent: International Publication WO00 / 28082, or the homepage of Eiken Chemical Co., Ltd. (http://www.eiken.co.jp/).
[0031]
In the LAMP method, mutually complementary sequences are generated at the same chain end of the amplification product, and these are annealed to form a hairpin-like loop, and an elongation reaction by a polymerase starting from the loop occurs. At the same time, a strand displacement extension reaction occurs from the primer annealed in the loop, and the extension product is dissociated into a single strand. This reaction occurs repeatedly because the dissociated single strand also has a complementary sequence at the end. Thus, in the LAMP method, since the extension reaction and the amplification reaction proceed simultaneously at a plurality of positions on the same strand of the amplification product, amplification of DNA is achieved in an exponential manner under isothermal conditions, and the tandem of the present invention is achieved. A probe nucleic acid having a structure can be efficiently synthesized.
[0032]
2) Primer for LAMP method
In the LAMP method, specific primers called inner primers, outer primers, and loop primers are used.
[0033]
The inner primer is an essential primer for the LAMP method. In each strand of the template DNA, when an arbitrary sequence X2c present on the 3 ′ side and an arbitrary sequence X1c 5 ′ therefrom are selected, the inner primer is complementary to the X2c. A primer comprising a target sequence X2 and the same sequence X1c as the X1c from the 3 ′ side to the 5 ′ side in this order (having a structure of X1c + X2). Functionally speaking, X2 on the inner primer is a portion that anneals specifically to the template to provide a starting point for complementary strand synthesis, and X1c is a complementary sequence for the amplification (extension) product to form a loop. give. Then, this loop becomes a starting point for new complementary strand synthesis.
[0034]
The outer primer is a primer that has a sequence complementary to the arbitrary sequence X3c outside (3 ′ side of the template) from the inner primer and can anneal to it (one for each of the two primers complementary to the double strand). ).
In order to facilitate annealing of the primer to the template nucleic acid, the length of X1 (X1c), X2 (X2c), and X3 (X3c) is preferably 5 to 100 bases, and more preferably 10 to 50 bases.
[0035]
The inner primer and the outer primer are required for each of the double strands (F and R), and two types of each of the inner primer (F1c + F2, R1c + R2) and the outer primer (F3, R3) are designed.
[0036]
Each arbitrary sequence is preferably selected so that the amplification product obtained by the LAMP method preferentially causes intramolecular annealing rather than intermolecular annealing to form a terminal hairpin structure. For example, in order to cause intramolecular annealing to occur preferentially, in selecting an arbitrary sequence, it is important to consider the distance between the F1c and F2c sequences and the distance between the R1 and R1c sequences. . Specifically, it is preferable that both sequences are selected so as to exist at a distance of 0 to 500 bases, preferably 0 to 100 bases, and most preferably 10 to 70 bases. Here, the numerical values indicate the number of bases that do not include the F1c and F2c sequences themselves and the R1 and R2 sequences themselves, respectively.
[0037]
When a complementary sequence generated on the same strand of an amplification product by the LAMP method anneals to each other to form a loop, a loop primer has a base sequence complementary to a sequence in the loop at its 3 ′ end. 2 primers (one for each complementary to double strand). The outer primer and the loop primer are not essential primers for the LAMP method, but if they are present, the amplification (extension) reaction proceeds more efficiently.
[0038]
3) Template nucleic acid for amplification
The template nucleic acid for amplification used in the LAMP method may be DNA or RNA, and can be prepared from a biological sample such as a tissue or a cell by a known method or by a chemical synthesis method. In this case, a template polynucleotide is prepared such that a sequence of an appropriate length (both side sequences) exists on both sides of a region to be amplified (called a target region). The two-sided sequence means the sequence of the region from the 5 'end of the target region to the 5' end of the polynucleotide chain, and the sequence of the region from the 3 'end of the target region to the 3' end of the polynucleotide chain. . The length of both side sequences is 10 to 1000 bases, preferably 30 to 500 bases in both the 5 'side and 3' side of the target region.
[0039]
4) Reaction conditions
A series of reactions include a buffer that gives a pH suitable for the enzyme reaction, salts necessary for maintaining and annealing the catalytic activity of the enzyme, a protective agent for the enzyme, and, if necessary, a regulator for the melting temperature (Tm). It is preferably performed in the presence of As the buffering agent, one having a neutral to weakly alkaline buffering action such as Tris-HCl is used. The pH may be adjusted according to the DNA polymerase used. As the salts, for example, KCl, NaCl, or (NH₄)₂SO₄Are added as needed to maintain the activity of the enzyme and to adjust the melting temperature (Tm) of the DNA. Bovine serum albumin and saccharides are used as enzyme protecting agents. As the melting temperature (Tm) regulator, betaine, proline, dimethyl sulfoxide, or formamide can be generally used.
[0040]
5) LAMP reaction
In the reaction in the LAMP method, the following components (i), (ii), and (iii) are added to a template nucleic acid, and the inner primer forms a stable base pair bond to a complementary sequence on the template nucleic acid. It proceeds by incubating at a temperature at which the strand displacement polymerase can maintain the enzyme activity. The incubation temperature is from 50 to 75C, preferably from 55 to 70C, and the incubation time is from 1 minute to 10 hours, preferably from 5 minutes to 4 hours.
(I) 2 inner primers, or 2 outer primers, or 2 loop primers
(Ii) strand displacement polymerase
(Iii) substrate nucleotide
[0041]
2.2 Support
The support used for the nucleic acid detection carrier of the present invention is not particularly limited as long as it is a solid phase on which a nucleic acid probe can be immobilized.For example, a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, a latex, Microbeads, silicon chips, capillaries, and the like can be used.
[0042]
The support is preferably subjected to an appropriate surface treatment in order to immobilize the nucleic acid probe. For example, poly L-lysine coating (Schena M, et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996), silane coating (DeRisi J, et al, Nat. Genet. 14: 457-460). , '1996) are well known in the art. In addition, commercially available surface-treated glass plates (for example, Carbostation^TM(Manufactured by Nisshinbo), aluminum & aminosilane coated glass (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like may be used.
[0043]
3.作製 Preparation of nucleic acid detection carrier
The carrier for nucleic acid detection of the present invention is prepared by immobilizing the nucleic acid probe of the present invention on the above support. As described above, the probe may be synthesized on the support by a photolithography technique or the like. However, a method in which the probe synthesized in advance is fixed on the support, or a method in which the primer immobilized on the support (latex particles, etc.) The method of performing the reaction (Japanese Patent Application No. 2001-161486) is preferable for preparing the carrier for nucleic acid detection of the present invention. Hereinafter, these methods will be described.
[0044]
(1) Silane coating-UV crosslinking
A nucleic acid probe is spotted on a silane-coated support, and the probe is irradiated with UV light to covalently bond (crosslink) the silane coating on the support and immobilize the probe. UV crosslinking is performed using a commercially available UV crosslinker (for example, SPECTRO @ LINKER (manufactured by Spectronics @ corporation)) or the like to 50 mJ to 150 mJ / cm.²UV irradiation is performed. The silane coating may be performed according to known techniques (DeRisi J, et al, Nat. Genet. 14: 457-460, 1996), or commercially available silane coated glasses (eg, aluminum & amino silane coated glass (Amersham Pharmacia Biotech). And the like) may be used. Spotting of the nucleic acid probe on the support can be performed using a commercially available spotter (or also called an arrayer). As the commercially available spotter, for example, arbitrary ones such as Microarray system Generation III manufactured by Amersham Pharmacia Biotech, STAMP MAN manufactured by Nippon Laser Electronics, and SPBIO2000 manufactured by Hitachi Software Engineering can be used.
[0045]
(2) Poly L-lysine coating-UV crosslinking
A nucleic acid probe is spotted on a support coated with poly-L-lysine, and the probe is irradiated with UV and covalently bonded (cross-linked) to the poly-L-lysine coating on the support to be immobilized. The UV crosslinking may be carried out in the same manner as in the preceding paragraph, but if the support is heated to 100 to 150 ° C. before crosslinking, the fixing rate of the probe is further improved. The poly-L-lysine coating may be performed according to a known technique (Schena M, et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996), or using commercially available surface-treated glass. You may. The spotting of the nucleic acid probe on the support may be carried out in the same manner as in the preceding section. The support after crosslinking is immersed in a post-treatment solution (such as an accessory of a microarray kit), washed and dried.
[0046]
(3) Biotin-avidin binding
This is a method for immobilizing a nucleic acid probe on a support using a biotin-avidin bond. For example, a method is known in which avidin is immobilized on a support, and a nucleic acid probe having a biotinylated nucleotide introduced into the avidin is bound via a biotin-avidin bond (Carl F. Edman et al. Nucleic Acid Res. . $ 25: 4907-4914 (1997)).
[0047]
(4) Fixation to nylon membrane (dot blot method)
In the dot blot method, a membrane on which a nucleic acid probe is immobilized is used as a carrier for nucleic acid detection. The material and size of the membrane are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. In particular, a nylon membrane is suitably used.
[0048]
The method of attaching the probe to the membrane is not particularly limited, and the probe may be attached one by one, or a commercially available 96-hole dot blot device may be used. It is more efficient to use. However, in order to enhance the detection accuracy, it is necessary to equalize the amount of DNA to be attached, and therefore, it is important to keep the probe concentration and the amount of liquid transferred to the membrane constant.
[0049]
(5) LAMP reaction from a primer fixed on a support
This is a method in which an inner primer or a loop primer in the aforementioned LAMP method is immobilized on a support, and an amplification reaction is carried out therefrom to produce a solid phase carrier on which a probe is immobilized (Japanese Patent Application No. 2001-161486). reference). For example, a LAMP reaction is performed using latex particles having the 5 'end of a loop primer bound thereto. As a result, a LAMP product fixed to the latex particles can be synthesized.
[0050]
4. Detection of nucleic acid by nucleic acid detection carrier
The procedure of nucleic acid detection using the carrier for nucleic acid detection of the present invention is basically the same as the procedure using a conventional carrier for nucleic acid detection. That is, a method in which a labeled target is hybridized to a probe, and the amount of the target is detected based on the signal intensity of the labeling substance can be used.
Hereinafter, the nucleic acid detection method using the nucleic acid detection carrier of the present invention will be specifically described.
[0051]
4.1 Preparation of sample (target)
First, a sample to be detected is prepared. The sample is not particularly limited as long as it contains the target nucleic acid. For example, in the case of detecting a specific gene in a biological sample, total RNA or mRNA is prepared from cells according to a well-known method, and this mRNA can be amplified as cDNA by reverse transcription and used as a target. When the amount of the nucleic acid to be analyzed is small, the cDNA may be further amplified as cRNA using T7 RNA polymerase before use.
[0052]
4.2 Target sign
The prepared target is usually labeled with an appropriate reagent for detection. Examples of the labeling substance include fluorescent dyes (Cy3, Cy5, etc.), enzymes, proteins, radioisotopes, chemiluminescent substances (eg, DNP), biotin, DIG (digoxigenin), and the like.
[0053]
Labeling can be performed simultaneously with the amplification described in the preceding section. For example, if -labeled nucleotides (eg, Cy3 / Cy5-dCTP (manufactured by AmershamｓPharmaciaＴＰBiotech), DNP-dCTP, DIG-dCTP, etc.) are added to amplify mRNA from mRNA, Cy3, Cy5, DNP or DIG-labeled. CDNA target can be obtained.
[0054]
In the case of biotin labeling, a method of incorporating a biotin derivative of a nucleotide into a target chain by an enzyme reaction, a photoactive biotin derivative or a commercially available biotin labeling reagent (carbobiotin^TM(Manufactured by Nisshinbo Co., Ltd.) can be added to the target and reacted to obtain a biotin-labeled target.
[0055]
4.3 Hybridization
Next, the labeled target is hybridized to a nucleic acid detection carrier. Hybridization conditions (temperature, time, etc.) and washing conditions are appropriately determined depending on the type of the nucleic acid detection carrier and the target used. Hybridization may be performed using a commercially available automatic device (for example, ASP (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech)).
[0056]
In the case of a biotin-labeled target, after hybridization, for example, an alkaline phosphatase-labeled streptavidin or an alkaline phosphatase anti-biotin antibody is reacted, and a luminescent substrate is further reacted to cause chemiluminescence. Similarly, in the case of DIG labeling, for example, after binding an alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody, a luminescent substrate is further reacted to cause chemiluminescence.
[0057]
4.4 Detection and analysis
Finally, the fluorescence or chemiluminescence by the labeled target hybridized to the nucleic acid detection carrier is detected as the signal intensity. The signal is read by a scanner (for example, GTMAS {Scan} II (manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.) or the like), converted into an image using analysis software (for example, Array-Pro Analyzer (manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.), and quantified. The signal read by the scanner may be subjected to adjustment of error and normalization of variation for each sample as necessary. The normalization can be performed on the basis of a gene commonly expressed in each sample such as a housekeeping gene. Further, a reliability limit line may be specified to remove data having low correlation.
[0058]
4.5 2 fluorescent labeling method
When it is desired to compare the expression levels of nucleic acids in two samples, a bifluorescent labeling method in which two samples to be compared are labeled with two fluorescent substances having different fluorescence wavelengths is simple and preferable. At this time, it is necessary that the two fluorescent substances have no overlapping of the fluorescent wavelengths. For example, Cy3 and Cy5 can be preferably used. When Cy3 and Cy5 are used, one sample is labeled with Cy3, the other sample is labeled with Cy5, and simultaneously hybridized to a nucleic acid detection carrier, and the fluorescence intensities of Cy3 and Cy5 are read by a scanner. By analyzing the pseudo color tone obtained by superimposing the fluorescence of Cy3 and Cy5, the difference in the expression level of the nucleic acid between the two samples can be easily detected.
[0059]
4.6 Effect of carrier for nucleic acid detection of the present invention
As shown in Examples described later, the carrier for nucleic acid detection of the present invention in which a probe having a tandem structure containing two sequences complementary to each other is immobilized, as compared to a carrier in which a conventional probe is immobilized, A signal intensity that is at least twice as high can be detected.
That is, by using the nucleic acid detection carrier of the present invention, it becomes possible to detect a target nucleic acid with higher sensitivity than the conventional method.
[0060]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[Example 1] Preparation of DNA microarray
DNA microarrays were prepared using LAMP products using the three genes of mouse GAPDH, Haptoglobin and γ-actin as templates, and PCR products as probes.
[0061]
1. Preparation of probe
LAMP primers were designed based on the sequences of mouse GAPDH cDNA (SEQ ID NO: 1), mouse Haptoglobin cDNA (SEQ ID NO: 2), and mouse γ-actin cDNA (SEQ ID NO: 3), and a LAMP reaction was performed. In the LAMP reaction, the reaction was performed at 65 ° C. for 2 hours in the reaction solution composition shown in Table 1 without heat denaturation of the template nucleic acid. The Bst DNA polymerase used was 8 U / μl manufactured by New England Biolabs.
Similarly, PCR primers were designed and a PCR reaction was performed. The PCR reaction was carried out at 95 ° C. for 1 minute, followed by 30 cycles of 94 ° C., 30 seconds, 65 ° C., 30 seconds, 68 ° C., 30 seconds. This operation was repeated three times because the amount of product obtained was small.
[0062]
[Table 1]

[0063]
[Table 2]

[0064]
GAPDH @ LAMP Primers:
Inner @ primer (F): TGCATTGCTGACAATCTTGAGTGATGCCCCCATGTTTGTGAT (SEQ ID NO: 4)
Inner @ primer (R): CTGCACCACCAACTGCTTTAGCCCTTCCACAATGCCAAAGT (SEQ ID NO: 5)
Outer @ primer (F): AAACGGGTCCATCATCTCCG (SEQ ID NO: 6)
Outer @ primer (R): AGTGATGGCATGGACTGTG (SEQ ID NO: 7)
Loop @ primer (F): GTTTGTCATATTTCTCGTGGGTTC (SEQ ID NO: 8)
Loop @ primer (R): CTGGCCAAGGTCCATCCAT (SEQ ID NO: 9)
GAPDH PCR primers:
Primer (F): GATGCCCCCATGTTTGTTGAT (SEQ ID NO: 10)
Primer (R): CCCTTCCACAATGCCAAAGT (SEQ ID NO: 11)
Primers for Haptobin LAMP:
Inner @ primer (F): TTGCCAATGGTGATCACCTGTGCTGCCATCATCTTCCTCCTT (SEQ ID NO: 12)
Inner @ primer (R): GCACTCTTCCCAGCCTTCCTTGGAGGTTGAAAGTGGTCTCATGG (SEQ ID NO: 13)
Outer @ primer (F): AGTTTGCCCTGGGATTTTGAG (SEQ ID NO: 14)
Outer @ primer (R): GCGGATATCCACATCACCACT (SEQ ID NO: 15)
Loop @ primer (F): TCGGGCAGCTCGTAACTCT (SEQ ID NO: 16)
Loop @ primer (R): TGGGCATGGAGGTCCTGTG (SEQ ID NO: 17)
Haptobin® PCR primers:
Primer (F): TGCTGCATCATCTTCCTCCTT (SEQ ID NO: 18)
Primer (R): GGAGTTGAAAGTGGTCTCCATGG (SEQ ID NO: 19)
Primer for γ-actin LAMP
Inner @ primer (F): TTCCTGGTACTTGGTGAGGCGGGGTCCAGCCTATCTTGAA (SEQ ID NO: 20)
Inner @ primer (R): GCAGTGCCTTTGCCATTTCATGTCAAAGCTCAGGATCCCA (SEQ ID NO: 21)
Outer @ primer (F): TGCCCGAGAAGAAAAACTTG (SEQ ID NO: 22)
Outer @ primer (R): CACCATCATCAGCGACAG (SEQ ID NO: 23)
Loop @ primer (F): GCCAGCACAGAAGGTTGTG (SEQ ID NO: 24)
Loop @ primer (R): GAGGAGGACACCTGGGTACGC (SEQ ID NO: 25)
Primer for γ-actin LAMP
Primer (F): GGGGTCCAGCCTATCTTGAA (SEQ ID NO: 26)
Primer (R): TGTCAAAGCTCAGGATCCCCA (SEQ ID NO: 27)
After completion of the reaction, the resultant was dissolved in the A1 solution by alcohol precipitation.
[0065]
2. Immobilization of probe
The probe was commissioned to Nippon Laser Electronics Co., Ltd., and the prepared probe was fixed on a glass plate to prepare a DNA microarray.
(1) Equipment and reagents
DNA stamping device: STAMP MAN (manufactured by Nippon Laser Electronics), centrifuge for microplate (manufactured by Kubota Seisakusho), hot plate (manufactured by Iuchi Seieido), UV crosslinker (manufactured by Cosmo Bio), incubator: Hybri Canmber (manufactured by Nippon Laser) Electronic)
DNA Microarray Kit: slide glass for DNA Microarray, DNA Printing Buffer, Blocking Solution, Hybridization Buffer, Post Hybridization, Wash, Solution, cover glass, etc. , Purified water: Milli @ Q
[0066]
(2) Manufacturing method (all processes are performed in a clean room)
First, DNA was stamped under the following conditions.
Pattern: 1 block
Spot size: 200 μm
Spot area: about $ 0.5cm²
Dot: 48 tons / Slight glass
[0067]
Next, the stamped slide glass was held over warm water of about 60 ° C. with the spot side down, exposed to steam for about 3 to 5 seconds, and then placed on a hot plate of 80 ° C. and incubated for about 1 hour. . Thereafter, the slide glass was irradiated with 60 mJ of UV and the DNA was cross-linked with UV.
[0068]
Finally, blocking was performed as follows. First, a blocking solution was prepared according to the composition shown in Table 3, and the slide glass was moved up and down four to five times in the blocking solution, followed by incubation for about 15 minutes. Next, the plate was washed with distilled water at 95 ° C., washed with the A5 solution attached to the kit, and centrifuged at 500 rpm for 1 minute for drying.
[0069]
[Table 3]

[0070]
Example 2 Hybridization assay
The DNA microarray for detecting three types of genes (GAPDH, Haptoglobin, and γ-actin) prepared in Example 1 was provided with the sequences of GAPDH (SEQ ID NO: 1), Haptoglobin (SEQ ID NO: 2), and γ-actin (SEQ ID NO: 3). The originally prepared sample (target) was hybridized and the fluorescence intensity was measured. This detection and analysis was entrusted to Nippon Laser Electronics Co., Ltd.
[0071]
1. Hybridization
As a hybridization sample (target), a PCR primer (Primer (F)) designed in Example 2: GAPDH has a base sequence of SEQ ID NO: 10, Haptoglobin has a base sequence of SEQ ID NO: 18, and γ-actin has a base sequence of SEQ ID NO: 26. ) Was prepared by labeling the 5 ′ end with Cy5. As in Example 1, a PCR-amplified sample using this primer was used as a hybridization sample. Each target nucleic acid was dissolved in Hybridization @ Buffer to 50 ng / μl.
[0072]
The prepared hybridization solution {10 μl} was dropped onto a spot on a slide glass (DNA microarray), and a cover glass was placed on the spot to prevent air from entering. Next, the edge of the cover glass was sealed with rubber glue, and the slide glass was placed in a Hybri Chamber set at a temperature of 65 ° C. and a humidity of 80%, and incubated for 16 hours.
[0073]
Next, post-hybridization was performed. After removing the sealing rubber paste, the slide glass was immersed in a B4 solution warmed to 42 ° C. to remove the cover glass. Then, the plate was moved up and down several times in a B5 ° solution (42 ° C.), and then incubated for 1 minute, washed. After raising and lowering twice, it was incubated for 1 minute and washed. Finally, centrifugation was performed at 500 rpm for 1 minute for drying.
[0074]
2. Scanning and analysis
Scanner: The fluorescence intensity on the slide glass was scanned using GTMAS {Scan II} (manufactured by Nippon Laser Electronics), and the amount of Cy5 color development was analyzed using Analysis-Pro Analyzer (manufactured by Nippon Laser Electronics). The measurement was performed on each of two samples, and the results are shown in FIGS.
[0075]
3. result
In each sample, the DNA microarray immobilized with the LAMP product as a probe showed about 2-3 times higher fluorescence intensity than the DNA microarray immobilized with the PCR product as a probe.
[0076]
Example 3 Examination of detection sensitivity by dot blot method
1. Dot blot
100 ng each of a mouse GAPDH cDNA cDNA product and a LAMP product prepared in the same manner as in Example 1 was spotted on a nylon membrane. As a sample (target), a solution prepared by adding 1 μl of a 10-fold dilution of a DIG-labeled GAPDH cDNA fragment (SEQ ID NO: 10) and a 100-fold diluted solution to 1 ml of a hybridization solution was prepared (10 pl pl target / 1 ml, 1 ml each). pl / target / 1 ml) and hybridized on the nylon membrane. Hybridization was performed at 60 ° C. and over night, and after the reaction, the plate was washed with a 0.1 × x SSC, 0.5% SDS solution at 60 ° C. for 45 minutes. The detection was carried out using DIG {label detection kit (Roche)}. FIG. 4 shows the results.
[0077]
2. result
As is clear from FIG. 4, the carrier on which the LAMP product was immobilized was able to detect both the 10-fold diluted sample (10 pltarget / 1 ml) and the 100-fold diluted sample {(1 pl target / 1 ml)}. However, the carrier on which the PCR product was immobilized could not detect a 100-fold diluted sample.
[0078]
From the above results, it was confirmed that the carrier on which the LAMP product was spotted can detect a small amount of the sample with higher sensitivity than the single carrier on which the conventional PCR product was spotted. That is, it was confirmed that the carrier for nucleic acid detection of the present invention was extremely effective for detecting a gene with a low expression level.
[0079]
【The invention's effect】
According to the present invention, a small amount of nucleic acid can be detected with high sensitivity. Moreover, the carrier for nucleic acid detection of the present invention can be easily and inexpensively produced by utilizing the LAMP method.
[0080]
[Sequence list]

[0081]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 4—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 5—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 6—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 7—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 8-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 9-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 10—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 11—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 12—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 13-Description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 14-Description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 15—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 16—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 17—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 18—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 19-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 20—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 21-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 22—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 23—Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 24-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 25-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 26-Description of Artificial Sequence: Primer
SEQ ID NO: 27-Description of artificial sequence: primer
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the results of detecting a GAPDH cDNA fragment using a DNA microarray on which a LAMP product is immobilized and a DNA microarray on which a PCR product is immobilized.
FIG. 2 is a graph showing the results of detection of a Haptoglobin cDNA fragment by a DNA microarray on which a LAMP product is immobilized and a DNA microarray on which a PCR product is immobilized.
FIG. 3 is a graph showing the results of detection of γ-actin fragments by using a DNA microarray on which a LAMP product is immobilized and a DNA microarray on which a PCR product is immobilized.
FIG. 4 shows the results of a dot blot of a DIG-labeled GAPDHΔ cDNA fragment using a LAMP product and a PCR product.

Claims

Nucleic acid detection in which a nucleic acid probe having a tandem structure comprising a sequence complementary to a part or all of a target nucleic acid and two sequences complementary to each other is repeated once or twice or more on a support. Carrier.

2. The carrier according to claim 1, wherein the nucleic acid probe forms a loop by annealing at least a part between two mutually complementary sequences on the same strand.

The carrier according to claim 1 or 2, wherein a sequence complementary to a part or all of the target nucleic acid and two sequences complementary to each other at least partially overlap.

3. The carrier according to claim 1, wherein a sequence complementary to a part or all of the target nucleic acid and two sequences complementary to each other do not overlap.

The carrier according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleic acid probe is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b).
(A) When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are sequentially selected from the 3 ′ side of the sequence to be amplified on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the F1c (B) a primer comprising the same sequence as above and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order (b) 5 ′ to 5 ′ on the template nucleic acid When the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are sequentially selected in the terminal direction, a sequence R1c complementary to the R1 and a sequence R2 identical to the R2 are added from the 5 ′ side to the 3 ′ side. Primer to include in order

The carrier according to claim 5, wherein the amplification method is a LAMP method.

The support according to any one of claims 1 to 6, wherein the support is any one selected from a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, a latex, a microbead, a silicon chip, and a capillary. A carrier according to item 1.

The carrier according to any one of claims 1 to 7, wherein the nucleic acid probe contains a tandem structure repeated 1 to 20 times.

The carrier according to any one of claims 1 to 8, wherein the nucleic acid probe has a length of 100 to 10,000 bases.

A method for detecting a nucleic acid using the carrier according to any one of claims 1 to 9.

A method for detecting a nucleic acid, comprising the following steps.
1) labeling a nucleic acid in a sample with a labeling substance;
2) a step of hybridizing the labeled nucleic acid to the carrier according to any one of claims 1 to 9;
3) Step of detecting the amount of hybridized labeled nucleic acid by the signal intensity of the labeling substance: