JP2004077229A

JP2004077229A - Three-dimensional structure coordinate of translin, and use of it

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Publication number: JP2004077229A
Application number: JP2002236139A
Authority: JP
Inventors: Ikuko Miyaguchi; 宮口　郁子; Narutoshi Sugio; 杉尾　成俊; Tadao Matsuzaki; 松崎　尹雄; Masataka Kasai; 葛西　正孝
Original assignee: Molecuence Corp
Current assignee: Molecuence Corp
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2004-03-11

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a three-dimensional structure of translin available for identification, retrieval, evaluation, designing, or the like of compound having a capacity of adjusting a function of translin. <P>SOLUTION: In a measuring method of an X-ray diffraction pattern of the translin crystal, the translin crystal obtained using sodium formate as a precipitant is frozen in crystallizing solution containing polyalcohol, and X-ray diffraction data is collected in a frozen state. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスリンの結晶のＸ線回折像より得られる３次元構造座標、該構造座標を含むデータベース若しくは記録媒体に関する。また、該３次元構造座標を用いたトランスリンを調節する能力を有する化合物を同定する方法、トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群を調製するための方法、トランスリンの変異体の作製方法、及び該方法により作製されたトランスリンの変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスリンはヒト染色体の転座の際に見出される一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質として報告された蛋白質である。この染色体転座は、例えば白血病の発症のきっかけとなるような第１４染色体上のＴＣＲ−δ遺伝子が、第８染色体あるいは第１染色体に相互転座を起こしていたｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ１１）及びｔ（１；１４）（ｐ３２；ｑ１１）型急性リンパ芽性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）症例の染色体切断点５’側の塩基配列に極めて類似性があることがわかっている。また、同様の配列は濾胞性Ｂリンパ腫に多発するｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）や多数のリンパ性白血病・悪性リンパ腫例の転座切断部位にも存在することが明らかになった。トランスリンは切断されたＤＮＡが一時的に一本鎖となるこれらの配列、即ち、例えばＡＴＧＣＡＧ−ＧＣＣＣ［Ａ／Ｔ］［Ｇ／Ｃ］［Ｇ／Ｃ］［Ａ／Ｔ］、又は、ＧＣＣＣ［Ａ／Ｔ］［Ｇ／Ｃ］［Ｇ／Ｃ］［Ａ／Ｔ］の繰り返し配列に特異的に結合する。
【０００３】
また、マイトマイシンＣのような抗生物質を細胞に加えると、トランスリンが細胞質から細胞核へと輸送されることが確認されている（Ｋａｓａｉ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）
ＪＢＣ　２７２，　１１４０２−１１４０７）。
さらに、近年、トランスリンはｍＲＮＡに結合する蛋白質ＴＢ−ＲＢＰと同じ蛋白質であることが判明し、複数の機能を持つ蛋白質としても注目されている（Ｗｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　９４，　５６４０−５６４５　（１９９７））。トランスリンが結合するｍＲＮＡとして、精巣と脳の複数のｍＲＮＡの３’末端側の非翻訳領域に存在するＨエレメントとＹエレメントと呼ばれる部位が報告され、これらの部位にはＵＣＵＧＡＧＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＧＡＧＵ等の共通の配列が認められることから、ＤＮＡと同様にｍＲＮＡに対しても配列特異的に結合し、ｍＲＮＡの翻訳、分解安定性、局在化や輸送等に関わると考えられている。
【０００４】
以上のことから、トランスリンは核酸の損傷修復、発現調節、分解安定性等に関与していると考えられている。
例えば、ＤＮＡの損傷は、修復されない場合には癌の原因になることがある。実際に、トランスリンは血液の癌とも言われる白血病に関連しており、トランスリンのさらに詳細な解析が望まれている。このためには、トランスリンの機能や立体構造を求めることにより、トランスリンの生物学的な活性を人工的に調節することが非常に有用であると考えられるが、トランスリンの３次元構造はこれまで知られておらず、しかも類似の３次元構造を持つ蛋白質も知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トランスリンの機能を調節する能力を有する化合物の同定、検索、評価、又は設計等に利用可能なトランスリンの３次元構造の提供等を目的として成されたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するためにトランスリンの結晶を用いて、トランスリンの３次元構造座標を初めて明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、本発明によれば、
（１）沈殿剤にギ酸ナトリウムを用いて得られたトランスリン結晶を、多価アルコールを含有する結晶化溶液中で凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集することを特徴とするトランスリン結晶のＸ線回折像の測定方法、
（２）多価アルコールが、ショ糖又はグリセロールである上記（１）に記載の測定方法、
（３）上記（１）又は（２）に記載の測定方法により得られるトランスリンの３次元構造座標、
（４）上記（３）に記載の３次元構造座標について、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で数学的な移動操作を行った結果として得られる３次元構造座標、
（５）３次元構造が未知の蛋白質について、上記（３）又は（４）に記載の３次元構造座標を元に、蛋白質の３次元構造構築方法により求められたものである蛋白質の３次元構造座標、
（６）３次元構造構築方法が、分子置換法又はホモロジーモデリングである上記（５）に記載の３次元構造座標、
（７）３次元構造が未知の蛋白質が、ヒト由来トランスリンのアミノ酸配列に対して２０％以上の相同性を持つ配列を有する蛋白質である上記（５）に記載の３次元構造座標、
（８）上記（３）〜（７）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部又は一部を含む座標が記録されたデータベース、
（９）上記（３）〜（７）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部又は一部が記録されたコンピュータ読みとり可能な記録媒体
が提供される。
【０００７】
また、本発明の別の態様によれば、
（１０）トランスリンの機能を調節する能力を有する化合物を同定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）トランスリンと核酸との結合部位の原子座標を第１記憶手段に入力するステップ、
（ｂ）候補化合物の原子座標を第２記憶手段に入力するステップ、
（ｃ）上記ステップ（ａ）及び（ｂ）の原子座標データについて、相互作用の有無又はその程度を解析するステップ
を含む方法で検索された化合物を、２次候補化合物として実際に用意し、
（ｄ）該２次候補化合物、トランスリン、及び核酸を同時もしくは順に接触させ、
（ｅ）該２次候補化合物がトランスリンと核酸との結合に変化を与えるか否かを判定すること
を含む方法、
（１１）トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）トランスリンと核酸との結合部位の原子座標を第１記憶手段に入力するステップ、
（ｂ）候補化合物の原子座標を第２記憶手段に入力するステップ、
（ｃ）上記ステップ（ａ）及び（ｂ）の原子座標データについて、相互作用の有無又はその程度を解析するステップ
を含む方法で検索された化合物を選択し、実際に化合物群として調製することを含む方法、
（１２）トランスリンと核酸との結合部位の特定が、トランスリンと核酸との複合体結晶を調製し、上記（３）〜（７）のいずれかに記載の３次元構造座標を元に蛋白質の３次元構造構築方法により該複合体結晶の３次元構造座標を求めて、得られた３次元構造座標に基づいて行われるものである上記（１０）又は（１１）に記載の方法
が提供される。
【０００８】
さらに、本発明の別の態様によれば、
（１３）上記（３）〜（７）のいずれかに記載の３次元構造座標を用いるトランスリンの変異体の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項３〜７のいずれかに記載の３次元構造座標を記憶手段に入力し、該座標に基づいてコンピュータ画面上にトランスリンの３次元構造を表示させるステップ、
（ｂ）前記３次元構造座標に１個又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は化学的修飾を行うステップ、
（ｃ）コンピュータ画面上に表示されたトランスリンの３次元構造に生じる変化を解析するステップ
を含む方法で選択されたトランスリンの変異体を、実際に用意し、
（ｄ）該変異体と核酸とを接触させて結合活性を解析し、
（ｅ）トランスリンと核酸との結合活性と、上記（ｄ）で解析された結合活性とを比較することにより、該活性に変化があるか否かを判定すること
を含む方法、
（１４）上記（１３）に記載の方法により作製されたトランスリンの変異体
が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
１．トランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶
本発明のトランスリンの３次元構造座標は、トランスリン結晶、及び、セレノメチオニン誘導体等のトランスリンの重原子誘導体結晶を調製し、これらをＸ線結晶構造解析することにより得られる。トランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、それらを用いてＸ線結晶構造解析が可能なものであれば特に限定されず、如何なる結晶学的定数を与えるものでも良く、また如何なるアミノ酸配列を有するトランスリンから調製された結晶であっても良い。結晶学的定数としては、具体的には、それぞれの結晶が斜方晶系の空間群対称Ｃ２２２_１に属するものが好ましく、さらに結晶の単位格子（単位：Å）がａ＝１２９±１０、ｂ＝１３５±１０、ｃ＝１３２±１０の大きさを持つものがより好ましい。また、これらの結晶は、トランスリン分子又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体分子の４分子ずつが結晶学的な非対称単位中に存在しているものが特に好ましい。
【００１０】
ここで、本発明においてトランスリンとは、ヒト染色体の転座の際等に見出される核酸結合蛋白質であり、切断された核酸が一時的に一本鎖となる配列、例えば、ＤＮＡのＡＴＧＣＡＧ−ＧＣＣＣ［Ａ／Ｔ］［Ｇ／Ｃ］［Ｇ／Ｃ］［Ａ／Ｔ］又はＧＣＣＣ［Ａ／Ｔ］［Ｇ／Ｃ］［Ｇ／Ｃ］［Ａ／Ｔ］等の繰り返し配列、ｍＲＮＡのＵＣＵＧＡＧＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＧＡＧＵ等の配列等に特異的に結合する能力を有する蛋白質、及び、これらの蛋白質と配列及び／又は機能が類似する蛋白質を意味する。具体的には、例えば、後記配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１３〜２４０で示すアミノ酸配列（但し、アミノ酸番号１９５のメチオニンはロイシンである）を有するヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）由来のトランスリン、配列番号：２に示す配列を有するチャイニーズハムスター（Ｃｒｅｃｅｔｕｌｕｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）由来の配列を有するトランスリン、配列番号：３に示す配列を有するニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）由来の配列を有するトランスリン、配列番号：４に示す配列を有するマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来の配列を有するトランスリン、配列番号：５に示す配列を有するラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来の配列を有するトランスリン、配列番号：６に示す配列を有するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）由来の配列を有するトランスリン、配列番号：７に示す配列を有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）由来の配列を有するトランスリン様蛋白質、配列番号：８に示す配列を有するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の配列を有するトランスリン様蛋白質、配列番号：９に示す配列を有する酵母（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）由来の配列を有するトランスリン様蛋白質、等が挙げられる。
【００１１】
これらの配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記したようなトランスリンの生物学的機能を有するものも本発明で用いるトランスリンに含まれる。これらの中で、配列番号：１に示すヒト由来の配列を有するトランスリンが特に好ましく用いられる。
上記したトランスリンは、例えば精製等に用いるための適当なタグ（アミノ酸配列）が付加されたものであっても良い。適当なタグとしては、例えばヒスチジン（Ｈｉｓ）が４〜１０残基程度並んでいる配列を有するヒスチジンタグ、具体的にはＭｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒからなる配列を有するものが挙げられる。これらのタグは、通常トランスリンのＮ末端に付加して用いられる。
【００１２】
トランスリン等の蛋白質のＸ線結晶構造解析においては、位相問題を解決することが不可欠である。このために、目的蛋白質結晶と目的蛋白質の中に特異的に結合させた重原子を持つ重原子誘導体結晶、即ちトランスリン結晶及びトランスリンの重原子誘導体結晶が必要である。トランスリンの重原子誘導体としては、例えば、アミノ酸配列中のメチオニンをセレノメチオニンに置き換えた、トランスリンのセレノメチオニン誘導体が好ましい。しかしながら、ヒト由来のトランスリンの場合、配列中のメチオニンは開始コドンに対応するアミノ末端に一ヶ所しか存在しないため、天然のトランスリンを単にセレノメチオニン誘導体にした結晶では、天然のトランスリン結晶との、Ｘ線による強度差を十分に得ることが期待できない。この様な場合、配列中のメチオニンの数を人工的に増やすことで、構造解析に適したセレノメチオニン誘導体結晶を得ることができる。
【００１３】
人工的に増やすメチオニンの数は、通常１〜５個、好ましくは１〜２個が適当である。配列中のメチオニン数の増加は、メチオニンと性質が似通ったアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシンをメチオニンに置換することにより行えば良い。例えばヒト由来トランスリンのアミノ酸番号１８３のロイシンをメチオニンに変異させるのが好ましい。また適当なタグ、例えばヒスチジンタグをＮ末端に付加する場合、タグの開始コドンに対応するメチオニンをセレノメチオニンに置き換えることが特に好ましい。
【００１４】
これらアミノ酸の変異やタグの付加等はそれ自体既知の通常用いられる方法により行うことができる。トランスリンのセレノメチオニン誘導体は、後述する通り、上記配列をコードする目的遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれた形質転体を、セレノメチオニンを含む培地で培養することにより調製できる。
上記の通り、本発明においてトランスリンのセレノメチオニン誘導体とは、上記トランスリンのアミノ酸配列中のメチオニン又は該配列中に人工的に導入されたメチオニンがセレノメチオニンに置き換えられたアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。
【００１５】
本発明のトランスリンの３次元構造座標を得るために用いられるトランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、具体的には、例えば、以下の様に調製することができる。
先ず、目的とするトランスリン及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体を調製し、それを高純度に精製する。具体的には、例えばヒト由来の配列のＮ末端に上記ヒスチジンタグが結合した２４０アミノ酸残基（配列番号：１）からなる融合蛋白質を発現させて、高純度に精製する。目的とする遺伝子の調製、融合蛋白質の発現は、それ自体既知の方法、例えばＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７２，　Ｎｏ．１７，　ｐａｇｅ　１１４０２−１１４０３等に記載されている方法により行うことができる。その概要を次に示す。
【００１６】
先ず、上記融合蛋白質をコードする目的遺伝子を適当な発現ベクター、例えばｐＱＥ９又はｐＱＥ８０（キアゲン社製）に組み込む。目的遺伝子が正確に組み込まれたことを確認するため、ＤＮＡシークエンサーにより配列を調べる。目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、例えば電子穿孔法等で発現用の適当な宿主、例えば大腸菌等に導入し、形質転換する。この形質転換体を少量の培地（５ｍＬ程度）で培養し、該形質転換体中での目的の蛋白質の発現を調べ、所望の発現が確認できたら、大量の培地（通常２Ｌないし２００ｍＬ程度）で大量培養を行い、大量発現させる。
【００１７】
次に、菌体を遠心により、ペレット状にして回収する。回収した菌体を適当な緩衝液等に懸濁し、菌体を超音波により破砕し、抽出液を遠心分離して上清を集める。得られた抽出液から、適当な蛋白質の精製方法、例えばアフィニティーカラム、陰イオン交換カラム及びゲル濾過カラム等のそれ自体既知の方法を組み合わせて蛋白質の精製を行う。適当なタグ、例えばヒスチジンのタグが付加している融合蛋白質の場合は、先ずヒスチジンタグに選択的に結合するカラム、例えばＴａｌｏｎ（クロンテック社製）、Ｎｉ−ＮＴＡ（キアゲン社製）を用い、その後、陰イオン交換カラム、ゲル濾過の順にカラムを使用して精製する。精製の際に用いるこれらのカラムは、蛋白質の性質によって使い分ければ良い。
【００１８】
トランスリンのセレノメチオニン誘導体は、例えばＡ．　Ｄｕｃｒｕｉｘ，　Ｒ．　Ｇｉｅｇｅ　（１９９２）　Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐａｇｅ　３１１−３１７等に記載されている方法により次の通り調製することができる。即ち、上記目的遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、メチオニン要求株に導入する。この形質転換体を、セレノメチオニンを含む最小培地（この場合、メチオニンが入っていない培地、例えばＬｅＭａｓｔｅｒ培地等）で培養し、発現させる。発現させた蛋白質は上記と同様に精製する。但し、セレノメチオニンは酸化されやすいので、酸化を避けるために、緩衝液は脱気して用いるのが好ましい。
【００１９】
かくして得られる高純度に精製された蛋白質を用いてＸ線結晶構造解析が可能な蛋白質結晶を調製することができる。結晶化は、目的の蛋白質溶液に沈殿剤を添加する、又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作によって、蛋白質が溶液状態から非溶解状態になる場合において、ある特定の条件において、結晶として析出する性質を利用するものである。
【００２０】
トランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体の結晶化は、それ自体既知の方法、例えばバッチ法、透析法、蒸気拡散法などの手法（「蛋白質のＸ線結晶解析法」、Ｊ．　ドレント著、　竹中ら訳　（１９９８）　、　シュプリンガー・フェアラーク東京）を用いて行うことができる。また、結晶化に際しては蛋白質濃度、塩濃度、水素イオン濃度　（ｐＨ）、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子の決定が必要である。例えば、トランスリンの結晶化においては、蒸気拡散法を用い、ｐＨ４．０〜５．５、蛋白質濃度２〜１０ｍｇ／ｍＬ、温度１５〜２０℃の条件下で沈殿剤として１．８〜２．５Ｍ、より好ましくは２．０〜２．２Ｍのギ酸塩、例えばギ酸ナトリウムを用いるのが特に好ましい。
【００２１】
ただし、同一の蛋白質が、異なる条件でも結晶化し得ることは周知の事実であり、本発明のトランスリンの３次元構造座標を得るために用いられるトランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、これらの条件で調製されたものに限定されるものではなく、前記した定義に含まれるもの、また前記した結晶学的定数と実質的に同一の結晶学的定数を与えるものを含む。
かくして得られるトランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、Ｘ線構造解析が可能な高品質の結晶である。
【００２２】
２．トランスリンの３次元構造座標
上記１において調製されたトランスリン結晶とトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶を、Ｘ線回折による結晶構造解析技術を用いて解析することにより、本発明のトランスリンの３次元構造座標が得られる。
【００２３】
まず、上記１において調製された結晶を、多価アルコールを含有する結晶化溶液中で凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得る。ここで多価アルコールとしては、ショ糖（シュークロース）、グリセロール、ソルビトール、キシリトール等が挙げられる。これらの中でショ糖又はグリセロールが好ましく、特にショ糖が好ましい。結晶化溶液中の多価アルコールの濃度の下限は通常２０％、好ましくは２５％であり、上限は通常３５％、好ましくは３０％である。具体的な濃度の範囲は、これらの下限と上限の濃度の組み合わせにより決定される。
【００２４】
この回折像を解析して得られる上記ヒト由来トランスリンの結晶は、斜方晶系の空間群　Ｃ２２２_１に属するもので、単位格子としてａ軸１２９±１０Å、ｂ軸１３５±１０Å、ｃ軸１３２±１０Åの大きさを有する。更にこの結晶のＸ線回折による結晶構造解析を行うことにより、ヒト由来トランスリンの３次元構造座標を得ることができる。
【００２５】
Ｘ線結晶解析は、「蛋白質のＸ線結晶解析法（Ｊ．　ドレント著、　竹中ら訳　（１９９８）　、　シュプリンガー・フェアラーク東京）」等の一般的実験書に記載の方法に従って行うことができる。タンパク質の結晶は、一般的にＸ線を照射されている間にＸ線のエネルギーによって損傷を受けることが知られている。この損傷を防ぐために、前記結晶化溶液中で凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集する。具体的には、例えば、タンパク質結晶を１００Ｋ程度の低温の窒素気流中で凍結させ、この状態で直ちにＸ線回折データを収集することが好ましい。
【００２６】
ここで、蛋白質の３次元構造座標とは、蛋白質を構成する各原子の空間的な位置関係を示す値であって、３次元空間上で立体構造を記述するものである。各原子の座標とは、空間上のある点を原点とする互いに垂直な３方向の相対的な距離であり、蛋白質中に存在する水素原子を除く原子１つあたりに３個の数字からなるベクトル量である。
【００２７】
得られたトランスリンの３次元構造座標を後記表１に示す。表１は、一般的に用いられている蛋白質の３次元構造座標の表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述したものである。表１の１行目以降、最終行を除いて、各原子の３次元座標を記述している。１列目の　ＡＴＯＭ　はこの行が原子座標の行であることを示し、２列目はその原子の順番を、３列目はアミノ酸残基における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基を、５列目は分子の種類を　（同一の種類は一本のポリペプチド鎖であることを示す）、６列目は配列番号１に対応したアミノ酸の番号を、７、８、９列目はその原子の座標　（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）　を示す。１０列目はその原子の占有率　（本発明においてはすべて１．００）　を、１１列目はその原子の温度因子を、１２列目は原子番号を示している。また、最終行は、この表の終わりの行であることを示している。
【００２８】
トランスリン結晶から得られた３次元構造座標を元に、蛋白質の構造を理解するのに一般的に用いられている表記方法であるリボンモデルでトランスリンの主鎖を表記した。その中に結晶学的対称性を持たない最小単位、すなわち非対称単位内にあるトランスリンを図１に、トランスリンの４量体を図２に示す。
これらの図から理解されるように、トランスリンの結晶は、非対称単位中に４分子（分子Ａ、分子Ｂ、分子Ｃ及び分子Ｄ）を含んでいる。これらの４分子の複合体は、巨視的にみて、非結晶学的な疑似４回対称軸によって関係づけられる。
【００２９】
即ち、分子Ａ、分子Ｂ、分子Ｃ及び分子Ｄは、アミノ酸配列が同じであり、化学的・生化学的に全く同等のものである。ところが、トランスリンの結晶中では、分子充填の結果として隣り合う分子との接触様式が異なる２つの部位・状態が生じ、結晶中に存在するトランスリン分子の４分の１が部位・状態Ａに、残りの４分の１ずつが部位・状態Ｂ、Ｃ、Ｄに存在している。これを通常「結晶学的に独立な分子Ａ、分子Ｂ、分子Ｃ及び分子Ｄ」と呼んでいる。両者は結晶中での環境の違いを受け、分子の３次元構造上にも若干の変化がみらる。しかし、この相違はあくまで結晶内での部位・状態を反映したものであり、結晶を溶解して溶液状態にすると両者の区別は全くつかなくなる。こうした現象及び表現方法は、蛋白質結晶のみならず小分子の分子性結晶でも極めて一般的なものである。
【００３０】
また、トランスリンは生物的には８量体で機能することが知られており、結晶中でも、４量体同士が結晶学的な対称で８量体を形成している。この８量体を図３に示す。
なお、上記トランスリンの３次元構造座標において、トランスリンの分子Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにおけるＭｅｔ１よりＮ末側に存在する、人工的に付加したＭｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ配列とＡｓｎ２１８　からＬｙｓ２２８までのアミノ酸残基は、結晶中においてもその位置が一定しておらず、Ｘ線結晶構造解析において考慮から除外している。
【００３１】
上記した本発明のトランスリンの３次元構造座標と実質的に一致するものは本発明の範囲である。ここで、「実質的に一致する」とは、該構造の主要部分、具体的にはαヘリックスといった２次構造を形成している部分や、温度因子が他の部分に比べ低い値となっている部分において、対応する部分の主鎖又はＣα炭素の部分の２乗平均平方根誤差がおよそ２Å以下である構造を指す。また、各配列の開始部位及び終了部位も必ずしも厳密に規定されたものでなく、Ｎ末端及び／又はＣ末端部分に別の蛋白質が結合しているもの、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数個のアミノ酸残基が付加したものなど、トランスリンの構造について実質的な変化をもたらさないものについても本発明に包含される。
【００３２】
なお、後記表１に示した構造座標は、結晶内における単位格子の原点を３次元空間における原点として表記している。本発明の構造座標をコンピュータによる計算に用いる場合などにおいて、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で並進、回転、対称などの数学的な移動操作を施した結果として得られる新たな構造座標も本発明の３次元構造座標の範囲である。
【００３３】
３．分子置換法によりＸ線結晶構造解析を行うための構造座標の使用
本発明のトランスリンの３次元構造座標、例えば後記表１に示す構造座標は、トランスリンと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶などのＸ線結晶構造解析に用いることができる。すなわち、Ｘ線結晶構造解析の手法の一つとして一般的に用いられている分子置換法　（例えば、「蛋白質のＸ線結晶解析法」、Ｊ．　ドレント著、竹中ら訳　（１９９８）、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４）　において、本発明のトランスリンの３次元構造座標の全て又はその一部を使用することで、構造座標が未知の上記蛋白質の結晶においても、その構造座標を決定する際に、重原子同型置換法を用いることなく、はるかに迅速にその結晶のＸ線回折像より得られる構造因子からその３次元構造座標を決定しうる。
【００３４】
分子置換法を行う際には、分子置換法に用いるプログラムが動作するように調整されているコンピュータを用いる。該プログラムは、例えばＸ−ＰＬＯＲ　（モレキュラーシミュレーション社）　や　ＡＭＯＲＥ　（ＣＣＰ４　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，　Ｎｕｍｂｅｒ　４　（１９９４）　Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．　Ｄ５０，　６７０−６７３）　のプログラム群の１つ）　などがあるが、その他のプログラムを用いても良い。ここで、Ｘ−ＰＬＯＲは分子置換法、構造精密化等の計算を行うＸ線及びＮＭＲによる蛋白質３次元構造解析用統合ソフトであり、その詳細はＢｒｕｎｇｅｒ，　Ａ．　Ｔ．　（１９９２）　Ｘ−ＰＬＯＲ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１；　Ａ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｘ−ｒａｙ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ＮＭＲ，　Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，　ＣＴ．に記載されている。また、ＣＣＰ４は、分子置換法、同型置換法、構造精密化等の計算を行う蛋白質Ｘ線結晶構造解析用プログラム群であり、その詳細はＴｈｅ　ＣＣＰ４　Ｓｕｉｔ：　Ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ　（１９９４）　Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．　Ｄ５０，　７６０−７６３．に記載されている。
【００３５】
本発明のトランスリンの３次元構造座標を用いて分子置換法を適用すべき結晶としては、トランスリンと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶や、トランスリンと結合し得る化合物、例えばターゲットとなる核酸とトランスリンとの複合体から得られた結晶等が挙げられる。ターゲットとなる核酸としては、トランスリンと結合する配列を有するものであればいかなるものでもよいが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡが挙げられ、これらの中でもＤＮＡ又はｍＲＮＡが好ましく、特に一本鎖のＤＮＡが好ましい。ここで、有意な相同性とは、一般に、アミノ酸配列において２０％以上、好ましくは３０％以上一致している場合をさす。アミノ酸配列の相同性が２０％未満になると導き出された３次元構造座標の信頼性は低下する。逆にアミノ酸配列の相同性がより高いほど、容易に目的の３次元構造座標を導き出すことができる。ヒトは哺乳類に含まれるために、哺乳類由来のトランスリンのアミノ酸配列は、ヒト由来のものとそれぞれアミノ酸配列の相同性が高いと予想される。従って、哺乳類由来のトランスリンについては、正確なアミノ酸配列が決定されれば、本発明の構造座標を用いて容易に３次元構造座標を導き出すことができる。
【００３６】
分子置換法の適用については、実際に目的の結晶のＸ線回折像から計算された構造因子に分子置換法を適用し、有意な解が得られることにより判断されうる。ここで、構造因子（Ｆ）とは、電子密度（ρ）をフーリエ変換して得られる物理量であり、構造因子をフーリエ変換すれば電子密度が得られる。構造因子は複素数で、Ｆ＝｜Ｆ｜ｅｘｐ（ｉφ）の形で表現される。ここで｜Ｆ｜は振幅、φは位相を示し、｜Ｆ｜は回折Ｘ線の強度の平方根に比例する。φはＸ線回折実験により直接測定できず、「結晶構造解析」とは、このφを決定することと等価である。
【００３７】
４．ホモロジーモデリングによりＸ線結晶構造解析を行うための構造座標の使用
かくして得られる本発明のトランスリンの３次元構造座標、例えばヒト由来トランスリンの３次元構造座標を用いて、異種のトランスリンあるいはアミノ酸配列が有意に相同である他の蛋白質の３次元構造座標をホモロジーモデリング　（中村春木、中井謙太　（１９９５）　バイオテクノロジーのためのコンピュータ入門、コロナ社、１８６−２０４）　により推定することができる。
【００３８】
ホモロジーモデリングによる解析を行う際には、ホモロジーモデリングに用いるプログラムが動作するように調整されているコンピュータを用いる。該プログラムは、例えばＨＯＭＯＬＯＧＹやＭＯＤＥＬＥＲ　（モレキュラーシミュレーション社）　や　ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ　（Ｐｅｉｔｓｃｈ　（１９９６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｔｒａｎｓ．　２４，　２７４−２７９）などがあるが、その他のプログラムを用いても良い。
【００３９】
まず、例えばヒト由来トランスリンの構造座標を用いる場合、この座標において、ヒトと哺乳類のトランスリンでアミノ酸残基で一致していない部分の側鎖部分を、哺乳類の該アミノ酸残基の側鎖に置き換える。この段階で、立体化学的に各原子が重ならず、エネルギーが最小になるような側鎖のコンフォーメーションを選択する。更に、全アミノ酸残基に対して主鎖部分も含めたコンフォーメーションの計算を行い、全体のエネルギーが最小になるようにする。
【００４０】
本発明のトランスリンの３次元構造座標を用いてホモロジーモデリングを適用すべき蛋白質としては、他種のトランスリンや、トランスリンと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質、あるいはトランスリンと結合する化合物、例えばターゲットとなる核酸とトランスリンとの複合体が挙げられる。ターゲットとなる核酸としては、トランスリンと結合する配列を有するものであればいかなるものでもよいが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡが挙げられ、これらの中でもＤＮＡ又はｍＲＮＡが好ましく、特に一本鎖のＤＮＡが好ましい。
【００４１】
ここで、有意な相同性とは、前記の通り、一般にアミノ酸配列において２０％　以上、好ましくは３０％　以上一致している場合をさす。アミノ酸配列の相同性が２０％　未満になると導き出された３次元構造座標の信頼性は低下する。逆にアミノ酸配列の相同性がより高いほど、容易に目的の３次元構造座標を導き出すことができる。ヒトは哺乳類に含まれるために、哺乳類由来のトランスリンのアミノ酸配列は、ヒト由来のものとそれぞれアミノ酸配列の相同性が高いと予想される。従って、哺乳類由来のそれらについては、正確なアミノ酸配列が決定されれば、本発明による構造座標を用いて容易に３次元構造座標を導き出すことができる。
上記方法により得られる相同な蛋白質の推定３次元構造座標も本発明の範囲である。
【００４２】
５．トランスリンの３次元構造座標が記録されたデータベース又は記録媒体
かくして得られたトランスリンの３次元構造座標を、コンピュータが利用可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することによりトランスリンの３次元構造座標データベース又は記録媒体が構築できる。本発明においてデータベースとは、上記構造座標を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピュータシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ等の光ディスク、半導体メモリのような電気的な一時的記録媒体等を挙げることができる。
【００４３】
このようなデータベース又は記録媒体を用いることにより、後述するトランスリンを調節する能力を有する化合物の同定、トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群の調製、及び、トランスリンの変異体の作製等の操作をより簡便かつ効率的に行うことができる。
【００４４】
６．トランスリンの機能を調節する能力を有する化合物の同定方法、及び、トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群の調製方法
本発明のトランスリンの３次元構造座標は、トランスリン又はトランスリンと有意に相同な蛋白質等の生物学的機能を調節する能力を有する化合物の同定に有用な情報を提供する。トランスリンの機能を調節する能力とは、トランスリンの有する生物活性を活性化する能力でもよいし、阻害する能力でもよい。
【００４５】
同定方法としては、具体的には、例えば、以下のステップ：
（ａ）トランスリンと核酸との結合部位の原子座標を第１記憶手段に入力するステップ、
（ｂ）候補化合物の原子座標を第２記憶手段に入力するステップ、
（ｃ）上記ステップ（ａ）及び（ｂ）の原子座標データについて、相互作用の有無又はその程度を解析するステップ
を含む方法で検索された化合物を、２次候補化合物として実際に用意し、
（ｄ）該２次候補化合物、トランスリン、及び核酸を同時もしくは順に接触させ、
（ｅ）該２次候補化合物がトランスリンと核酸との結合に変化を与えるか否かを判定すること
を含む方法が好ましく用いられる。
【００４６】
本発明の方法においては、上記３次元構造座標のうち、少なくともトランスリンと核酸との結合部位の原子座標が用いられる。トランスリンと核酸との結合部位（以下、これを「基質結合部位」と称することがある）を特定する方法としては、例えば、トランスリンと核酸との複合体結晶を用いる方法、公知のコンピュータ・ソフトウエアを用いる方法等が挙げられる。トランスリンと核酸との複合体結晶を用いる方法としては、まず、公知の方法に従ってトランスリンと核酸との複合体結晶を調製し、本発明の３次元構造座標を元にして公知の蛋白質の３次元構造構築方法により該複合体結晶の３次元構造座標を求めることができる。核酸としては、トランスリンと結合できる配列を有する核酸であればいかなるものでもよい。具体的には、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡが挙げられ、これらの中でもＤＮＡ又はｍＲＮＡが好ましく、特に一本鎖のＤＮＡが好ましく用いられる。蛋白質の３次元構造構築方法としては、上記３に詳述した分子置換法等が好ましく用いられる。かくして得られた３次元構造座標に基づいて、核酸がトランスリンのどの部位に結合しているかを同定することができる。
【００４７】
また、公知のコンピュータ・ソフトウエアを用いてトランスリンと核酸との結合部位を決定する場合には、例えば、トライポスのＳｉｔｅＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ／ｓｃｉＴｅｃｈ／ｉｎＳｉｌｉｃｏＤｉｓｃ／ｂｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｓｉｔｅＩＤ．ｈｔｍｌ）等が挙げられる。また、例えば、本発明のトランスリンの３次元構造座標に基づいてコンピュータ画面上にトランスリンの３次元構造を表示させ、該構造上で基質結合部位を推定することもできる。通常、蛋白質には基質結合部位となり得るようなポケット構造（くぼみ構造）が１、２箇所しか存在しない場合が多いことから、該構造上に存在するポケット構造を基質結合部位であると推定することができる。さらに、用いる３次元構造座標中にＲｏｓｓｍａｎｎ　ｆｏｌｄ（「タンパク質の構造入門」Ｂｒａｎｄｅｎ，　Ｃ．　＆　Ｔｏｏｚｅ，　Ｊ．　（１９９２）、教育社、ｐ．１４５）のような既知の核酸結合性を有するモチーフが含まれていた場合や、配列中にロイシンジッパー（「タンパク質の構造入門」Ｂｒａｎｄｅｎ，　Ｃ．　＆　Ｔｏｏｚｅ，　Ｊ．　（１９９２）、教育社、ｐ．１２５）のような核酸結合性を有する配列が含まれていた場合には、それらを総合して推定を行う。また、該結合部位の表面電荷を解析する方法も好ましく用いられる。核酸は陰性に帯電していることから、ポケット構造をしている部位の表面電荷が陽性に帯電していた場合に、基質結合部位であると推定することができる。
【００４８】
このようにして推定を行った結果、基質結合部位であると推定された部位が真の基質結合部位であることを確認する方法としては、例えば、該結合部位において核酸と相互作用していると推定されるアミノ酸残基及びその近傍に存在するアミノ酸残基を選択して、これに置換、欠失、挿入等の変異を生じさせる方法が好ましく用いられる。ここで、「近傍に存在する」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関与する、具体的にはおよそ５Å以内にあることをいう。変異を生じさせて相互作用を消失させたり、抑制させたりした場合に、核酸との結合能力がどのように変化するかを解析し、該結合能力が低下もしくは消失した場合に、前記結合部位が真の基質結合部位であると確認することができる。
【００４９】
かくしてトランスリンと核酸との結合部位を特定した後、少なくとも該結合部位の原子座標を含む本発明のトランスリンの３次元構造座標の一部もしくは全部を第１記憶手段に入力する。入力は、解析の際に都度行ってもよいが、上記５に詳述したようなデータベース又は記録媒体を用いることもできる。本発明において、記憶手段とは、例えば、ある目的に必要なプログラム等が作動するように調整されているコンピュータ又はそのコンピュータの記録媒体等を意味する。ここでは、３次元構造座標から分子の３次元構造を表現するのに適当なプログラム等が作動するように調整されているコンピュータ又はそのコンピュータの記録媒体等が好ましく用いられる。これらの記憶手段に前記座標を入力することにより、トランスリンにおける核酸との結合部位を３次元的に表現させることができる。蛋白質の分子の３次元構造座標を表現するコンピュータ・プログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、３次元構造座標の入力手段、該座標のコンピュータ画面への視覚的表現手段、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを提供するものである。さらに、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いることも可能である。具体的には、例えば、モレキュラーシミュレーション社から市販されているコンピュータ・プログラムであるＩｎｓｉｇｈｔＩＩやＱＵＡＮＴＡ等が挙げられる。例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩについては、そのモジュールであるＬｕｄｉやＤＯＣＫといったプログラムを単独もしくは組み合わせて用いることで、より詳細な検討、評価、又は設計を行うことができるが、本発明はこれらのプログラムに限定されるものではない。
【００５０】
次に、候補化合物の原子座標を第２記憶手段に入力する。第２記憶手段としては、前記第１記憶手段と同様に、例えば、３次元構造座標から分子の３次元構造を表現するのに適当なプログラム等が作動するように調整されているコンピュータ又はそのコンピュータの記録媒体等が挙げられる。これらの記憶手段に前記原子座標を入力することにより、該候補化合物を３次元的に表現させることができる。ここで、候補化合物は、既知のものであっても、新たに合成された新規な化学構造を有する化合物であっても、その三次元構造が得られるものであれば、いずれの化合物も本発明の方法で用いることができる。具体的には、例えば、天然化合物、合成化合物のいずれでもよく、また、高分子化合物、低分子化合物のいずれでもよい。本発明においては、これらの中で核酸誘導体等が好ましく用いられる。これら化合物の３次元構造座標は、Ｘ線結晶解析やモデリング等のいずれの方法で得られたものでもよい。３次元構造座標が決定されているものは、適当なデータベース、例えばＣＣＤＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄａｔａ　Ｃｅｎｔｒｅ：　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）やＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ：　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から収得することができる。
【００５１】
さらに、特開２０００−１７８２０９号公報に記載されている方法等によって、本発明の３次元構造座標を用い、新規な候補化合物を設計すること（以下、これを「分子設計」と称することがある）もできる。分子設計方法とは、蛋白質の３次元構造座標に基づいて該蛋白質の基質結合部位に結合し得るような化合物を設計する方法であって、上記公報に記載の方法を用いるものに限定されず、それ自体公知の通常用いられる方法を用いることができる。候補化合物の分子設計には、通常、概念的に２つの段階がある。最初の段階は、リード化合物を見つけだすものであり、次の段階はリード化合物の最適化の過程である。これらの過程も、それ自体既知の方法により行うことができ、それによりトランスリンの機能を調節する能力を有する化合物の候補をさらに絞り込むことができる。
【００５２】
上記ステップにより入力されたトランスリンと核酸との結合部位の原子座標データ、及び候補化合物の原子座標データに基づいて、それらの相互作用の有無又はその程度を解析する。すなわち、コンピュータ画面上でトランスリンと候補化合物とを３次元的に表示させ、両者を接近させたり接触させたりして、視覚的検討及び／又はエネルギー計算等に基づいた検討を行うことによって、トランスリンの核酸結合部位と該候補化合物との相互作用の有無又はその程度を解析することができる。ここで、解析の結果、例えば、前記した特定の配列を有する核酸とトランスリンとの結合能力に変化を与えると判定された候補化合物等を２次候補化合物として選択する。変化とは、トランスリンと核酸との結合能力が増強されるものでも、減弱されるものでもよい。また、ここで、生物学的及び熱力学的な安定性が高く、物理特性に優れている化合物を選択することが好ましい。
【００５３】
視覚的に行われる検討の方法としては、具体的には、例えば、シリコングラフィクス社から供給されているクリスタル・アイ（Ｃｒｙｓｔａｌ　　Ｅｙｅｓ）眼鏡を用いた３次元の表記を用いたり、当業者において頻繁に用いられる立体視（Ｓｔｅｒｅｏ　　ｖｉｅｗ）と呼ばれる右目と左目の視野に相当する２種の画面を同時に表記する方法を用いることで、３次元空間の理解が得られる易くなるが、必ずしも３次元空間の表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。また、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入などの変異、又は化学的な修飾によって変化する局部的な構造座標は、化学結合の正当性を保つように各原子の空間的な位置を決定することで得られる。この際、コンピュータに適当なコンフォーメーションの候補群を表示させ、これらの中から選択してもよいし、エネルギー状態が低く安定的な構造をコンピュータに計算させてもよい。そして、その中から核酸との間に、より好ましい結合が生じるような変異又は化学修飾を見いだしていけばよい。
【００５４】
エネルギー計算に基づいた検討の方法としては、例えば、トランスリンと前記候補化合物との間に生じた結合を、コンピュータによってエネルギー計算を行うことにより評価する。エネルギー計算は、当業者において一般的に行われる分子力場計算を行うコンピュータ・プログラムを用いることによって行うことができる。該目的に適したプログラムとしては、例えば、蛋白質に最適化されたＩｎｓｉｇｈｔ　　ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにあるＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
これらの検討の方法は、厳密に区別されるものではなく、それぞれの手法を組み合わせて用いてもよい。例えば、視覚的検討により、トランスリンと望ましい相互作用を有する化合物であると予想されたものについて、実際にエネルギーの計算を行い、その妥当性を評価し、それを繰り返し行うことでさらに優れた化合物を絞り込んでいくという方法も好ましく用いられる。
【００５６】
次に、選択された２次候補化合物を実際に用意して、トランスリンと核酸との結合に対して与える影響を解析する。化合物が公知の入手可能な化合物でない場合には、それ自体公知の通常用いられる化合物の合成方法、精製方法、改変方法等を用いて合成、精製、又は公知の化合物の改変等を行って、調製すればよい。かくして用意された２次候補化合物、トランスリン、及び核酸を同時もしくは順に接触させ、該２次候補化合物がトランスリンと核酸との結合に変化を与えるか否かを判定する。その結果、例えば、トランスリンと核酸のみを接触させた場合と比較して、該２次候補化合物が存在することによりトランスリンと核酸との結合が抑制された場合に、該化合物はトランスリンと核酸との結合の阻害活性を有すると判定することができる。逆に、該２次候補化合物が存在することによりトランスリンと核酸との結合が増強された場合に、該化合物はトランスリンと核酸との結合を増強又は活性化する作用を有すると判定することができる。
【００５７】
また、上記ステップ（ｄ）において、生物活性の有無に関わらずトランスリンとの相互作用が有ると判定された化合物は、該化合物を実際に用意し、トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群として調製することができる。化合物群は、例えば、上記したようなそれ自体公知の通常用いられる化合物の合成方法、精製方法、改変方法等を用いて選択された複数の候補化合物を調製すればよい。また、コンビナトリアル・ケミストリー等の手法を用いて、選択された化合物の類似化合物群を調製し、これを用いてもよい。このような類似化合物群は、トランスリンとの相互作用を有する部位は変化させずに調製されることが好ましく、調製方法としては、例えば、「創薬化学（上）（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ編集、長瀬博　監訳、テクノミック社刊）」等の一般的な参考書等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００５８】
かくして作製された化合物群は、トランスリンに潜在的に結合しうる化合物からなる化合物群であるので、この化合物群の各化合物に実際にトランスリンを接触させ、公知の方法に従って化合物群中に含まれる候補化合物とトランスリンとの間の相互作用の有無又はその程度を解析することにより、トランスリンに対して所望の反応性を有する化合物を２次候補化合物として選択することができる。すなわち、多数の候補化合物が含まれる化合物群を用いれば、このような選択を効率的に行うことができる。また、これら化合物群を基板等に固定化させた化合物アレイを調製して用いれば、より簡便に解析を行うことができる。
【００５９】
かくして選択された２次候補化合物は、上記した方法と同様に、実際にトランスリンと核酸との結合に対して与える影響を解析し、トランスリンと核酸との結合の阻害活性を有する化合物、もしくは、トランスリンと核酸との結合を増強する作用を有する化合物をさらに選択することができる。
上記したようないずれかの方法により選択されたトランスリンの機能を調節する能力を有する化合物、すなわち、トランスリンと核酸との結合の阻害活性を有する化合物、又は、トランスリンと核酸との結合を増強もしくは活性化する作用を有する化合物は、試験管内や生体内における薬理学的又は生理学的試験によりその活性を調べ、所望の活性を有する医薬候補分子を選択することにより実際に医薬として応用可能なものを得ることができる。これをさらに、それ自体公知の通常用いられる方法により医薬品組成物として調製し、トランスリンが関与する各種の疾患の予防及び／又は治療薬として用い得る。このような疾患としては、核酸の損傷、発現調節、分解安定性等に関わる疾患等が挙げられ、より具体的には、例えば、染色体の転座により引き起こされる、白血病や悪性リンパ種等の疾患等が挙げられる。
【００６０】
このように、本発明のトランスリンの３次元構造座標を用いることで、トランスリンの機能を調節する能力を有する化合物のコンピュータによる分子設計が可能となり、薬物開発に必要な化合物の設計、合成、評価等のサイクルを従来の生物学的機能に基づく方法に比較して大幅に短縮することができる。
【００６１】
７．トランスリンの変異体の作製方法及び該方法により得られる変異体
本発明のトランスリンの３次元構造座標を用いて、トランスリンの変異体を作製することができる。具体的には、例えば、以下のステップ：
（ａ）トランスリンの３次元構造座標を記憶手段に入力し、該座標に基づいてコンピュータ画面上にトランスリンの３次元構造を表示させるステップ、
（ｂ）前記３次元構造座標に１個又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は化学的修飾を行うステップ、
（ｃ）コンピュータ画面上に表示されたトランスリンの３次元構造に生じる変化を解析するステップ
を含む方法で選択されたトランスリンの変異体を、実際に用意し、
（ｄ）該変異体と核酸とを接触させて結合活性を解析し、
（ｅ）トランスリンと核酸との結合活性と、上記（ｄ）で解析された結合活性とを比較することにより、該活性に変化があるか否かを判定すること
を含む方法が好ましく用いられる。
【００６２】
まず、記憶手段に本発明のトランスリンの３次元構造座標を入力する。ここで、記憶手段としては、入力された３次元構造座標に基づいてコンピュータ画面上に蛋白質の３次元構造を表示させることのできるプログラム等が作動するように調整されたコンピュータ又はその記録媒体等を用いればよい。入力された３次元構造座標に基づいてトランスリンの３次元構造をコンピュータ画面上に表示させた後、１もしくは複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入等の変異、又は化学的修飾を行う。ここで、変異又は修飾されるアミノ酸残基は、上記６において詳述した方法により決定されたトランスリンと核酸との結合部位において、核酸と相互作用しているアミノ酸残基及びその近傍に存在するアミノ酸残基を選択することが好ましい。ここで、「近傍に存在する」とは、該アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関与する、具体的にはおよそ５Å以内にあることをいう。これらを総合的に考慮して最終的な変異体の設計を行うことができる。
【００６３】
任意のアミノ酸残基に変異又は化学的修飾を行って、その結果生じるトランスリンの３次元構造の変化、特に核酸との結合部位における３次元構造の変化を、コンピュータ画面上に表示された構造の変化により観察する。観察は、視覚的又はエネルギー計算等に基づいて行われ、具体的には、例えば、シリコングラフィクス社から供給されているクリスタル・アイ（Ｃｒｙｓｔａｌ　　Ｅｙｅｓ）眼鏡を用いた３次元の表記を用いたり、当業者において頻繁に用いられる立体視（Ｓｔｅｒｅｏ　　ｖｉｅｗ）と呼ばれる右目と左目の視野に相当する２種の画面を同時に表記する方法を用いることで、３次元空間の理解が得られる易くなるが、必ずしも３次元空間の表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。また、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入などの変異、又は化学的な修飾によって変化する局部的な構造座標は、化学結合の正当性を保つように各原子の空間的な位置を決定することで得られる。この際、コンピュータに適当なコンフォーメーションの候補群を表示させ、これらの中から選択してもよいし、エネルギー状態が低く安定的な構造をコンピュータに計算させてもよい。そして、その中から核酸との結合能力に変化が生じるような変異又は化学修飾を見いだしていけばよい。
【００６４】
また、具体的にどのアミノ酸を何に置換するかということについては、例えば、「タンパク質工学研究法」（井本泰治　学会出版センター　１９９６）に記載の方法等を参照して決定することもできる。この中でも、例えば、タンパク質の活性部位において、そのポケットの大きさを変えるような変異を導入する方法や、電荷を持つアミノ酸を電荷を持たないものに変換する、あるいはその逆を行うことによって、ポケット内部の静電ポテンシャル分布を変えるような変異を導入する方法が好ましく用いられる。
【００６５】
このような検討結果にも基づいて、核酸との結合部位の３次元構造に変化の見られた変異体等を選択して、選択されたトランスリンの変異体を実際に調製する。変異体は、それ自体公知の多くの方法によって調製され得る。例えば、上記の検討の結果、変異させることにより生物学的活性が上昇すると同定された部位において、対応するアミノ酸残基をコードしている該オリゴヌクレオチドの部位を、変異体に相当するオリゴヌクレオチドを化学的に合成して、配列に特異的なオリゴヌクレオチド切断酵素（制限酵素）を用いて天然型のオリゴヌクレオチドの部分と入れ替えることで、本発明を元にして設計された該変異体をコードするＤＮＡを得ることができる。得られた変異体のＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることで前述のような変異体を得ることができる。このような調製方法は、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ（西郷薫、佐野弓子共訳、丸善株式会社：　　原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，　　Ｓｈｏｒｔ　　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　　Ｔｈｉｒｄ　　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　　Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　＆　　Ｓｏｎｓ，　　Ｉｎｃ．，　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）」等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６６】
また、蛋白質のアミノ酸残基を化学的に修飾することも当業者においては一般的に行われている。具体的には、例えば、　「　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（４７巻，第４０７−４９８頁，Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．及びＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ，Ｎ．，ｅｄｓ，（１９７７）．Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ，　　ＮｅｗＹｏｒｋ．）」等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００６７】
次に、作製された該変異体と核酸とを接触させて結合活性を解析する。解析された結合活性が、トランスリンと核酸との結合活性に比較してどのように変化しているかを判定することにより、該変異体が実際に核酸に対してどのような作用を有するかを確認することができる。例えば、核酸に対する結合活性がトランスリンに比較して低いか又は消失している変異体は、これを医薬組成物として用いたときに、体内に存在するトランスリン輸送蛋白質等のトランスリンに結合する能力を有する蛋白質やトランスリンに結合する配列を有する核酸等にとってｄｅｃｏｙ（おとり蛋白質）と成り得ることから、生体内でのトランスリンの正常な生物学的機能を抑制する効果を有する。また、核酸に対する結合活性がトランスリンに比較して高い変異体は、これを医薬組成物として用いたときに、トランスリンの生物学的機能を増強する効果を有する。
【００６８】
このような変異体を有効成分として含む医薬組成物も、上記６に詳述した方法と同様にして調製し、トランスリンが関与する各種の疾患の予防及び／又は治療薬として用いることができる。
【００６９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。
実施例１　トランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶の調製
（１）ヒト由来トランスリン及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体の調製
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．　２７２，　Ｎｏ．１７，　ｐａｇｅ　１１４０２−１１４０３に記載の方法により調製したヒト由来トランスリンのｃＤＮＡを、Ｎ末端にヒスチジンタグ（Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）が結合した融合蛋白質として発現ベクターｐＱＥ９（キアゲン社製）に組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号：１に示す（但し、アミノ酸番号１９５のメチオニンは、ロイシンである）。この発現ベクターを、宿主大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］へ電子穿孔法により導入し、得られた形質転換体を２Ｌの２×ＹＴＡとカナマイシン１００μｇ／ｍｌ及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む培地で、ジャーファーメンターを用いて、２００ｒｐｍで撹拌、５Ｌ／ｍｉｎで通気しつつ３７℃で培養した。その後、終濃度１．０ｍＭとなるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、トランスリンの発現を誘導した。更に、３７℃で、４時間培養を行い、その培養液を遠心沈降して集菌した。
【００７０】
また、トランスリンのセレノメチオニン誘導体は、トランスリンのアミノ酸番号１８３のロイシンをメチオニンに対応する遺伝子に置換した上で、アミノ末端にヒスチジンタグ（Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）が結合した融合蛋白質として発現ベクターｐＱＥ８０（キアゲン社）　に組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号：１に示す。なお、このアミノ酸配列においてロイシンから置換されたメチオニンはアミノ酸番号１９５である。
【００７１】
この発現ベクターを、メチオニン要求株である宿主大腸菌ＤＬ４１へ電子穿孔法により導入し、得られた形質転換体をセレノメチオニン３０μｇ／ｍｌとカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含む２５０ｍＬのＬｅＭａｓｔｅｒ培地で、三角フラスコを用いて、インキュベータで撹拌しつつ、３７℃で培養した。その後、終濃度１．０Ｍとなるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、トランスリンのセレノメチオニン誘導体の発現を誘導した。更に、３７℃で、１５時間培養を行い、その培養液を遠心沈降して集菌した。
【００７２】
トランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体を発現させた菌体をアフィニティーカラム平衡化バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、超音波によって菌体を破砕後、遠心分離によって菌体中に可溶性蛋白質として存在しているトランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体を含有する上清を得た。得られた上清を平衡化バッファーで平衡化されたアフィニティーカラム（Ｔａｌｏｎ　クロンテック社製）に添加し、トランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体をカラムに特異的に吸着させた。カラムを平衡化バッファーによる洗浄を行った後に、２００ｍＭイミダゾールを含む平衡化バッファーのリニアーグラジエントによって、カラムに吸着されているトランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体を溶出させた。
【００７３】
溶出されたトランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体を含む画分を、陰イオン交換カラム平衡化バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、　５％（ｖ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．０）で透析してから、平衡化された陰イオン交換カラム（ＲＥＳＯＵＣＥ　Ｑ、ファルマシア社製）に吸着させた。カラムを、平衡化バッファーによる洗浄を行った後に、１０００ｍＭ　ＮａＣｌを含む平衡化バッファーのリニアーグラジエントによって、カラムに吸着されているトランスリン又はトランンのセレノメチオニン誘導体を溶出させた。トランスリン又はトランスリンのセレノメチオニン誘導体画分を限外濾過膜で濃縮してから、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．０で平衡化されたゲル濾過カラムに添加した。ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｓｅｒｄｅｘ、ファルマシア社製）により精製された画分を、結晶調製用とした。
【００７４】
得られたトランスリン及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体の純度検定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により行った。トランスリン及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体の純度は９５％以上、収量はトランスリンが約５０ｍｇ、トランスリンのセレノメチオニン誘導体は約５ｍｇであった。
【００７５】
（２）トランスリン結晶、及び、トランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶の調製
トランスリン結晶、及び、トランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。上記（１）で高純度に精製されたトランスリン、又は、トランスリンのセレノメチオニン誘導体を、限外濾過膜で蛋白質濃度を約１０ｍｇ／ｍＬに調製した。この蛋白質溶液１．０μＬに、結晶化溶液として２．０〜２．５Ｍのギ酸ナトリウムとｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸緩衝溶液を等量加え混合し、表面を疎水的になるようにシリコン処理剤により処理したカバーガラス板上においた。この試料をおいたガラス板を、０．５ｍＬの結晶化溶液を入れた気密性のある貯蔵容器に入れ、２０℃で静置した。およそ３〜７日間の静置の後に、試料溶液中に、大きさが５００μｍ×２００μｍ×２００μｍ程度の大きさの六角柱状結晶が得られた。
【００７６】
（３）トランスリンとトランスリンのセレノメチオニン誘導体の結晶形の決定
上記（２）で得られた結晶を、３０％のショ糖を不凍剤として加えた結晶化溶液に浸し、続いて１００Ｋの窒素気流下に入れ、急速凍結した。高輝度光科学研究センターＳＰｒｉｎｇ−８の放射光を用いて、１００Ｋ窒素気流中でＸ線回折データを、振動法を用いて収集した。回折強度処理プログラムＭＯＳＦＬＭ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．Ｗ．（１９９２）ＭＯＳＦＬＭ．Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｖｏｌ．２６）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。トランスリン結晶及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体結晶は、いずれも、斜方晶系の空間群対称Ｃ２２２_１に属し、結晶の格子定数はａ＝１２９±１０、ｂ＝１３５±１０、ｃ＝１３２±１０であった。
結晶の格子定数、空間群と、トランスリンの分子量から、結晶の非対称単位にトランスリン及びトランスリンのセレノメチオニン誘導体は４分子存在することが確認された。
【００７７】
実施例２　トランスリンの結晶構造解析
実施例１の（２）で得られたトランスリン結晶　（母結晶）　を、３０％のショ糖を不凍剤として加えた結晶化溶液に浸し、続いて１００Ｋの窒素気流下に入れ、急速凍結した。高輝度光科学研究センターＳＰｒｉｎｇ−８の放射光を用いて、１００Ｋ窒素気流中でＸ線回折強度データを振動法を用いて収集した。
【００７８】
得られた各々の回折像から、回折強度処理プログラムＨＫＬ２０００（ＨＫＬ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は、斜方晶系の空間群対称Ｃ２２２_１　に属し、結晶の格子定数はａ＝１２９±１０Å、ｂ＝１３５±１０Å、ｃ＝１３１±１０Åであった。
さらに、トランスリンの１８３セレノメチオニン誘導体結晶を、上記と同様に、３０％のショ糖を不凍剤として加えた結晶化溶液に浸し、続いて１００Ｋの窒素気流下に入れ、急速凍結した。高輝度光科学研究センターＳＰｒｉｎｇ−８の放射光を用いて、１００Ｋ窒素気気流中でＸ線回折強度データを振動法を用いて収集した。このとき、セレンの異常散乱項を用いて構造解析を行うために、波長はセレンの吸収端である、０．９７９７Å付近の３波長、即ち、吸収端のピーク、エッジ、リモートの３カ所でデータを収集した。
【００７９】
次に、ＳＯＬＶＥというプログラム群（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ，　Ｔ．Ｃ．　＆　Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，　Ｊ．　ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．　Ｄ　５５，　８４９−８６１（１９９９））を用いて、以下の解析を行った。先ず、セレノメチオニン誘導体の回折点の強度差を用いて、フーリエ変換の計算を行い、得られた差パターソン図から、これを満足する実空間のセレン原子の単位格子内での位置を決定した。得られたセレン原子の位置座標から計算されるセレノメチオニン誘導体結晶の結晶構造因子の位相を用いて、実空間における　トランスリンの結晶の電子密度図を得た。更に、溶媒領域の電子密度の平滑化、ならびに、非結晶学的対称性を用いた電子密度の平均化の計算を行い、分子モデルの構築・修正を行う３次元分子グラフィックスプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ，　Ｔ．　Ａ．　ら（１９９１）　Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．　Ａ４７，　１１０−１１９．）を用いて電子密度図上に、トランスリンのアミノ酸残基を同定した。トランスリンは、非対称単位中に４分子の複合体を含むことが示された。
【００８０】
実施例３　トランスリンの３次元構造座標の精密化
次に、トランスリンの母結晶の反射データを使い、ＣＮＸ　（モレキュラーシミュレーション社）で各原子位置の精密化を行い、上記プログラムＯを用いて水分子の同定を行った。
【００８１】
この操作を繰り返し行い、非対称単位内に存在するトランスリンの４分子共に　各トランスリン分子に結合した水分子を同定した。この段階で、構造座標の正確さの指標とされているＲ因子は１５Åから２．２Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、Ｒ＝２２．９％であった。更に精密化の段階で独立に精密化の計算に入れなかった構造因子から計算されるＲ因子（Ｒ−ｆｒｅｅ　因子と呼ばれている因子）はＲ−ｆｒｅｅ＝２６．５％であった。更に各原子間の結合距離及び結合角の理想状態からの２乗平均平方根誤差は、それぞれ０．００７Å及び１．１３度であった。得られた構造座標は一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って表１に示した。
【００８２】
実施例４　トランスリンの他の結晶形における分子置換法による座標
トランスリンは上記に述べた結晶化条件のほかに、１５％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール４０００、０．１Ｍ　ｐＨ６．２　ＭＥＳ緩衝液で、空間群Ｐ４_１２_１２又はＰ４_３２_１２の結晶が得られている（Ｋａｓａｉ，　ｅｔ　ａｌ．　ＪＢＣ（１９９７），２７２，　１１４０２）。この結晶のＸ線回折強度データを測定し、プログラムＥＰＭＲと実施例２で精密化したトランスリンの座標を用いて、分子置換法により結晶構造を解析した。その結果、この結晶の空間群がＰ４_１２_１２であり、結晶中でのトランスリン分子の配向と位置が決定された。さらに、ＣＮＸで各原子座標の精密化を行い、Ｒ因子は１５Åから３．４８５Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、Ｒ＝２５．０％、Ｒ−ｆｒｅｅ＝４５％であった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明によって提供されるトランスリンの３次元構造座標を用いれば、トランスリンの機能を調節する能力を有する化合物の同定、検索、評価、又は設計等を効率的に行うことができる。これにより、従来の生物学的機能等に基づいて行われていた各手法を大幅に短縮し、トランスリンの関与する疾患に関わる薬剤の開発等を効率的に行うことができる。
【００８４】
【表１】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【０１１９】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【０１２８】

【０１２９】

【０１３０】

【０１３１】

【０１３２】

【０１３３】

【０１３４】

【０１３５】

【０１３６】

【０１３７】

【０１３８】

【０１３９】

【０１４０】

【０１４１】

【０１４２】

【０１４３】

【０１４４】

【０１４５】

【０１４６】

【０１４７】

【０１４８】

【０１４９】

【０１５０】

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【０１５３】

【０１５４】

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【０１５６】

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【０１５８】

【０１５９】
【配列表】

【０１６０】

【０１６１】

【０１６２】

【０１６３】

【０１６４】

【０１６５】

【０１６６】

【０１６７】

【図面の簡単な説明】
【図１】トランスリンの構造について、主鎖をリボンモデルで示した図である。
【図２】結晶中の非対称単位内にある、トランスリンの構造について、主鎖をリボンモデルで示した図である。
【図３】トランスリンの機能単位である８量体のトランスリンの構造について、主鎖をリボンモデルで示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to three-dimensional structural coordinates obtained from an X-ray diffraction image of translin crystals, and a database or a recording medium containing the structural coordinates. A method for identifying a compound having the ability to regulate transrin using the three-dimensional structural coordinates; a method for preparing a group of compounds consisting of compounds that can potentially bind to transrin; And a mutant of transrin produced by the method.
[0002]
[Prior art]
Transrin is a protein reported as a single-stranded DNA binding protein found during translocation of the human chromosome. This chromosomal translocation occurs when, for example, the TCR-δ gene on chromosome 14, which triggers the onset of leukemia, is reciprocally translocated to chromosome 8 or chromosome 1 at t (8; 14) (q24 Q11) and t (1; 14) (p32; q11) type acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cases have been found to have extremely similar nucleotide sequences at the 5 ′ chromosomal breakpoint. In addition, it was revealed that a similar sequence is present at t (14; 18) (q32; q21) which frequently occurs in follicular B lymphoma and at the translocation cleavage site of many lymphocytic leukemia / malignant lymphoma cases. Translin is a sequence in which the cleaved DNA temporarily becomes single-stranded, that is, for example, ATGCG-GCCC [A / T] [G / C] [G / C] [A / T], or GCCC It specifically binds to the repeating sequence [A / T] [G / C] [G / C] [A / T].
[0003]
In addition, it has been confirmed that when an antibiotic such as mitomycin C is added to cells, translin is transported from the cytoplasm to the cell nucleus (Kasai, et al. (1997)).
JBC $ 272, $ 11402-11407).
Furthermore, in recent years, transrin has been found to be the same protein as the protein TB-RBP that binds to mRNA, and has attracted attention as a protein having multiple functions (Wu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., {94, {5640-5645} (1997)). As the mRNA to which transrin binds, sites called the H element and the Y element which are present in the untranslated regions at the 3 ′ end of a plurality of testis and brain mRNAs have been reported. Is recognized to be sequence-specifically bound to mRNA as well as DNA, and is considered to be involved in translation, degradation stability, localization and transport of mRNA.
[0004]
From the above, translin is considered to be involved in repair of damage of nucleic acids, regulation of expression, stability of degradation, and the like.
For example, DNA damage can cause cancer if not repaired. In fact, translin is associated with leukemia, which is also referred to as blood cancer, and a more detailed analysis of translin is desired. For this purpose, it is thought that it is very useful to artificially regulate the biological activity of translin by determining the function and three-dimensional structure of translin. Up to now, no protein having a similar three-dimensional structure has been known.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a three-dimensional structure of transrin that can be used for identification, search, evaluation, design, and the like of a compound having the ability to regulate the function of transrin.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have clarified, for the first time, the three-dimensional structural coordinates of translin using a crystal of translin to achieve the above object. The present invention has been achieved based on these findings.
That is, according to the present invention,
(1) Translin characterized in that translin crystals obtained by using sodium formate as a precipitant are frozen in a crystallization solution containing a polyhydric alcohol, and X-ray diffraction data is collected in a frozen state. A method for measuring an X-ray diffraction image of the crystal,
(2) The method according to (1), wherein the polyhydric alcohol is sucrose or glycerol,
(3) three-dimensional structural coordinates of translin obtained by the measurement method according to (1) or (2) above,
(4) With respect to the three-dimensional structure coordinates described in (3) above, three-dimensional structure coordinates obtained as a result of performing a mathematical movement operation in a three-dimensional space without changing the relative arrangement of each atom. ,
(5) The three-dimensional structure of a protein whose protein has an unknown three-dimensional structure determined by the method for constructing a three-dimensional structure of the protein based on the three-dimensional structure coordinates described in (3) or (4) above. Coordinate,
(6) The three-dimensional structure coordinates according to (5), wherein the three-dimensional structure construction method is a molecular replacement method or homology modeling.
(7) the three-dimensional structural coordinates according to (5), wherein the protein whose unknown three-dimensional structure is a protein having a sequence having a homology of 20% or more to the amino acid sequence of human-derived translin;
(8) a database in which coordinates including all or a part of the three-dimensional structure coordinates according to any one of (3) to (7) are recorded;
(9) A computer-readable recording medium in which all or a part of the three-dimensional structural coordinates according to any of (3) to (7) is recorded.
Is provided.
[0007]
Also, according to another aspect of the present invention,
(10) A method for identifying a compound capable of modulating the function of transrin, comprising the following steps:
(A) inputting atomic coordinates of a binding site between translin and a nucleic acid into the first storage means;
(B) inputting the atomic coordinates of the candidate compound into the second storage means;
(C) analyzing the presence / absence of the interaction or the degree of the interaction with respect to the atomic coordinate data of steps (a) and (b).
Is actually prepared as a second candidate compound,
(D) contacting the secondary candidate compound, translin, and nucleic acid simultaneously or sequentially;
(E) determining whether the secondary candidate compound alters the binding of translin to the nucleic acid
Including the method,
(11) A method for preparing a group of compounds consisting of compounds that can potentially bind to transrin, comprising the following steps:
(A) inputting atomic coordinates of a binding site between translin and a nucleic acid into the first storage means;
(B) inputting the atomic coordinates of the candidate compound into the second storage means;
(C) analyzing the presence / absence of the interaction or the degree of the interaction with respect to the atomic coordinate data of steps (a) and (b).
Selecting a compound searched by a method including, and actually preparing as a group of compounds,
(12) Specifying the binding site between transrin and nucleic acid, preparing a complex crystal of transrin and nucleic acid, and preparing a protein based on the three-dimensional structural coordinates according to any of (3) to (7) above. The method according to (10) or (11), wherein the three-dimensional structure coordinates of the complex crystal are obtained by the three-dimensional structure construction method described above, and the method is performed based on the obtained three-dimensional structure coordinates.
Is provided.
[0008]
Further, according to another aspect of the present invention,
(13) A method for producing a translin mutant using the three-dimensional structural coordinates according to any one of (3) to (7) above, comprising the following steps:
(A) inputting the three-dimensional structure coordinates according to any one of claims 3 to 7 into storage means, and displaying the three-dimensional structure of translin on a computer screen based on the coordinates;
(B) substituting, deleting, inserting, or chemically modifying one or more amino acid residues in the three-dimensional structural coordinates;
(C) analyzing a change in the three-dimensional structure of translin displayed on the computer screen;
A mutant of translin selected by a method including
(D) contacting the mutant with a nucleic acid to analyze the binding activity,
(E) determining whether there is a change in the activity by comparing the binding activity between translin and the nucleic acid with the binding activity analyzed in (d) above.
Including the method,
(14) Translin mutant produced by the method according to (13) above
Is provided.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
1. Translin crystals and selenomethionine derivative crystals of transrin
The three-dimensional structural coordinates of the translin of the present invention can be obtained by preparing a translin crystal and a crystal of a translin heavy atom derivative such as a selenomethionine derivative, and subjecting them to X-ray crystal structure analysis. The translin crystal and the selenomethionine derivative crystal of transrin are not particularly limited as long as they can be used for X-ray crystal structure analysis, and any crystallographic constant may be given. It may be a crystal prepared from transrin. As the crystallographic constants, specifically, each crystal is an orthorhombic space group symmetric C222.₁It is more preferable that the crystal has a unit cell (unit: Å) of a = 129 ± 10, b = 135 ± 10, and c = 132 ± 10. In addition, it is particularly preferable that these crystals have four molecules each of a transrin molecule or a selenomethionine derivative molecule of transrin present in a crystallographic asymmetric unit.
[0010]
Here, in the present invention, translin is a nucleic acid binding protein found at the time of translocation of a human chromosome or the like, and a sequence in which a cut nucleic acid temporarily becomes single-stranded, for example, ATGCG-GCCC of DNA. [A / T] [G / C] [G / C] [A / T] or GCCC [A / T] [G / C] [G / C] [A / T], etc., mRNA UCUGAGCCCUGAGCUGCCAAGGAGCGACAGAUCUGAGGU And proteins having the ability to specifically bind to such sequences and the like, and proteins similar in sequence and / or function to these proteins. Specifically, for example, a human (Homo sapiens) having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 13 to 240 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (provided that methionine of amino acid number 195 is leucine), for example. A transrin derived from a Chinese hamster having the sequence shown in SEQ ID NO: 2; a transrin having a sequence derived from Chinese hamster having the sequence shown in SEQ ID NO: 2; a transrin having a sequence derived from a chicken having the sequence shown in SEQ ID NO: 3; A transrin having a sequence derived from a mouse (Mus @ musculus) having the sequence shown in SEQ ID NO: 4, a transrin having a sequence derived from a rat (Rattus @ norvegicus) having the sequence shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: A transrin having a sequence derived from Xenopus laevis having a sequence shown in SEQ ID NO: 7, a transrin-like protein having a sequence derived from Arabidopsis thaliana having a sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a sequence shown in SEQ ID NO: 8 A transrin-like protein having a sequence derived from Drosophila (Drosophila melanogaster), a transrin-like protein having a sequence derived from yeast having the sequence shown in SEQ ID NO: 9 (Shizosaccharomyces @ pombe), and the like.
[0011]
Translins used in the present invention include those having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in these sequences and having the above-mentioned biological function of transrin. Among them, translin having the human-derived sequence shown in SEQ ID NO: 1 is particularly preferably used.
The above-mentioned transrin may be one to which an appropriate tag (amino acid sequence) for use in, for example, purification is added. As a suitable tag, for example, a histidine tag having a sequence in which about 4 to 10 residues of histidine (His) are arranged, specifically, a tag having a sequence consisting of Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser No. These tags are usually used by adding to the N-terminal of transrin.
[0012]
In X-ray crystal structure analysis of proteins such as translin, it is essential to solve the phase problem. For this purpose, a target protein crystal and a heavy atom derivative crystal having a heavy atom specifically bound to the target protein, that is, a translin crystal and a translin heavy atom derivative crystal are required. As a heavy atom derivative of transrin, for example, a selenomethionine derivative of translin in which methionine in the amino acid sequence is replaced with selenomethionine is preferable. However, in the case of human-derived transrin, the methionine in the sequence is present at only one position at the amino terminus corresponding to the initiation codon. However, a sufficient difference in intensity due to X-rays cannot be expected. In such a case, by artificially increasing the number of methionine in the sequence, a selenomethionine derivative crystal suitable for structural analysis can be obtained.
[0013]
The number of methionine artificially increased is usually 1 to 5, preferably 1 to 2. The number of methionine in the sequence can be increased by substituting methionine for an amino acid having similar properties to methionine, for example, leucine or isoleucine. For example, it is preferable to mutate the leucine at amino acid number 183 of human-derived translin to methionine. When a suitable tag, for example, a histidine tag is added to the N-terminus, it is particularly preferable to replace methionine corresponding to the start codon of the tag with selenomethionine.
[0014]
The mutation of these amino acids, the addition of a tag, and the like can be performed by a commonly used method known per se. As described later, a selenomethionine derivative of transrin can be prepared by culturing a transformant into which an expression vector containing the target gene encoding the above sequence has been incorporated in a medium containing selenomethionine.
As described above, the selenomethionine derivative of transrin in the present invention refers to a protein having an amino acid sequence in which methionine in the amino acid sequence of translin or methionine artificially introduced in the sequence is replaced with selenomethionine. means.
[0015]
The translin crystal and the selenomethionine derivative crystal of transrin used for obtaining the three-dimensional structural coordinates of translin of the present invention can be specifically prepared, for example, as follows.
First, translin and a selenomethionine derivative of translin are prepared and purified to high purity. Specifically, for example, a fusion protein consisting of 240 amino acid residues (SEQ ID NO: 1) in which the histidine tag is bound to the N-terminus of a human-derived sequence is expressed and purified to high purity. The preparation of the gene of interest and the expression of the fusion protein can be carried out by methods known per se, for example, in The Journal of Biological Chemistry Vol. 272, {No. 17, \ page \ 11402-11403 and the like. The outline is shown below.
[0016]
First, the gene of interest encoding the fusion protein is inserted into an appropriate expression vector, for example, pQE9 or pQE80 (Qiagen). To confirm that the target gene has been correctly integrated, the sequence is examined using a DNA sequencer. The expression vector into which the target gene has been incorporated is introduced into an appropriate host for expression, for example, Escherichia coli or the like by, for example, an electroporation method, and is transformed. This transformant is cultured in a small amount of medium (about 5 mL), and the expression of the target protein in the transformant is examined. When the desired expression is confirmed, the transformant is added to a large amount of medium (usually about 2 L to 200 mL). Perform large-scale culturing and express in large quantities.
[0017]
Next, the cells are collected by pelleting by centrifugation. The collected cells are suspended in an appropriate buffer or the like, the cells are disrupted by ultrasonic waves, and the extract is centrifuged to collect the supernatant. From the obtained extract, the protein is purified by a suitable protein purification method, for example, a method known per se such as an affinity column, an anion exchange column and a gel filtration column. In the case of a fusion protein to which an appropriate tag, for example, a histidine tag is added, first, a column that selectively binds to the histidine tag, for example, Talon (manufactured by Clontech) or Ni-NTA (manufactured by Qiagen) is used. , An anion exchange column and gel filtration in this order. These columns used for purification may be properly used depending on the properties of the protein.
[0018]
Selenomethionine derivatives of transrin are described, for example, in A. Ducruix, R. Giage (1992) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins page 311-317 can be prepared as follows. That is, the expression vector incorporating the target gene is introduced into a methionine-requiring strain. The transformant is cultured and expressed in a minimal medium containing selenomethionine (in this case, a medium not containing methionine, such as a LeMaster medium). The expressed protein is purified in the same manner as described above. However, since selenomethionine is easily oxidized, it is preferable to use the buffer after degassing in order to avoid oxidation.
[0019]
Using the protein thus purified to a high degree of purity, protein crystals capable of X-ray crystal structure analysis can be prepared. Crystallization is performed by adding a precipitant to the target protein solution, or reducing the amount of solvent by evaporation, etc., when the protein changes from a solution state to a non-dissolved state. This utilizes the property of precipitation.
[0020]
Crystallization of transrin or a selenomethionine derivative of transrin can be performed by a method known per se, for example, a method such as a batch method, a dialysis method, or a vapor diffusion method (“X-ray crystallographic analysis of protein”, J. Drent, written by Takenaka, Ltd.). Translation (1998), Springer Verlag Tokyo). In crystallization, it is necessary to determine physical and chemical factors such as protein concentration, salt concentration, hydrogen ion concentration (pH), type of precipitant to be added, and temperature. For example, in the crystallization of translin, the vapor diffusion method is used, and the pH is 4.0 to 5.5, the protein concentration is 2 to 10 mg / mL, and the temperature is 15 to 20 ° C. It is particularly preferred to use a 5M, more preferably 2.0-2.2M formate, for example sodium formate.
[0021]
However, it is a well-known fact that the same protein can be crystallized under different conditions, and the translin crystals and translin selenomethionine derivative crystals used to obtain the three-dimensional structural coordinates of translin of the present invention are: It is not limited to those prepared under these conditions, but includes those included in the above definition and those that give substantially the same crystallographic constants as the above crystallographic constants.
Translin crystals and selenomethionine derivative crystals of transrin thus obtained are high-quality crystals capable of X-ray structural analysis.
[0022]
2. Translin 3D structural coordinates
The translin crystal and the selenomethionine derivative crystal of transrin prepared in the above 1 are analyzed using a crystal structure analysis technique by X-ray diffraction, whereby the three-dimensional structural coordinates of the transrin of the present invention can be obtained.
[0023]
First, the crystal prepared in 1 above is frozen in a crystallization solution containing a polyhydric alcohol, and X-ray diffraction data is collected in a frozen state to obtain an X-ray diffraction image. Here, polyhydric alcohols include sucrose (sucrose), glycerol, sorbitol, xylitol and the like. Of these, sucrose or glycerol is preferred, and sucrose is particularly preferred. The lower limit of the concentration of the polyhydric alcohol in the crystallization solution is usually 20%, preferably 25%, and the upper limit is usually 35%, preferably 30%. The specific concentration range is determined by a combination of these lower and upper concentration limits.
[0024]
The crystal of human-derived transrin obtained by analyzing this diffraction image has an orthorhombic space group ΔC222.₁And has a unit lattice of 129 ± 10 ° on the a-axis, 135 ± 10 ° on the b-axis, and 132 ± 10 ° on the c-axis. Further, by performing a crystal structure analysis of this crystal by X-ray diffraction, three-dimensional structural coordinates of human-derived translin can be obtained.
[0025]
The X-ray crystallography can be performed according to a method described in a general experimental book such as "X-ray crystallography of protein (J. Drent, Translated by Takenaka et al. (1998)", Springer Verlag Tokyo). It is known that protein crystals are generally damaged by X-ray energy during X-ray irradiation. To prevent this damage, freeze in the crystallization solution and collect X-ray diffraction data in the frozen state. Specifically, for example, it is preferable to freeze the protein crystals in a nitrogen stream at a low temperature of about 100 K and immediately collect X-ray diffraction data in this state.
[0026]
Here, the three-dimensional structural coordinates of a protein are values indicating a spatial positional relationship between atoms constituting the protein, and describe a three-dimensional structure in a three-dimensional space. The coordinates of each atom are the relative distances in three directions perpendicular to each other with a certain point in space as the origin, and a vector consisting of three numbers per atom excluding hydrogen atoms present in proteins. Quantity.
[0027]
The three-dimensional structural coordinates of the obtained translin are shown in Table 1 below. Table 1 is described in accordance with the format of Protein Data Bank, which is a commonly used notation for three-dimensional structural coordinates of proteins. The three-dimensional coordinates of each atom are described from the first line onward in Table 1 except for the last line. {ATOM} in the first column indicates that this row is a row of atomic coordinates, the second column indicates the order of the atoms, the third column indicates the distinction between atoms in amino acid residues, and the fourth column indicates the amino acid residues. The fifth column indicates the type of molecule (the same type indicates a single polypeptide chain), the sixth column indicates the amino acid number corresponding to SEQ ID NO: 1, and the seventh, eighth, and ninth columns indicate The coordinates {(unit in the order of the a-axis, b-axis, and c-axis directions)} of the atom are shown. The tenth column shows the occupancy of the atom (all in the present invention is 1.00), the eleventh column shows the temperature factor of the atom, and the twelfth column shows the atomic number. The last row indicates the last row of the table.
[0028]
Based on the three-dimensional structural coordinates obtained from the transrin crystal, the main chain of translin was represented by a ribbon model, which is a notation method generally used to understand the structure of a protein. FIG. 1 shows translin in the minimum unit having no crystallographic symmetry, ie, an asymmetric unit, and FIG. 2 shows a tetramer of translin.
As can be seen from these figures, the crystal of transrin contains four molecules (molecule A, molecule B, molecule C and molecule D) in the asymmetric unit. These four-molecule complexes are macroscopically related by a non-crystallographic pseudo-quaternary axis of symmetry.
[0029]
That is, the molecules A, B, C, and D have the same amino acid sequence and are chemically and biochemically equivalent. However, in the transrin crystal, as a result of the molecular packing, two sites / states having different contact modes with adjacent molecules occur, and one quarter of the translin molecules present in the crystal become the site / state A. , And the remaining quarters are present in the parts / states B, C, and D. This is usually called “crystallographically independent molecule A, molecule B, molecule C and molecule D”. Both are affected by differences in the environment in the crystal, and there are slight changes in the three-dimensional structure of the molecule. However, this difference only reflects the site and state in the crystal, and if the crystal is dissolved to form a solution, the two cannot be distinguished at all. Such phenomena and expression methods are extremely common not only in protein crystals but also in small molecule molecular crystals.
[0030]
Translin is known to function as an octamer biologically, and among crystals, tetramers form octamers with crystallographic symmetry. This octamer is shown in FIG.
In the three-dimensional structural coordinates of translin, the artificially added Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser, which is located on the N-terminal side of Met1 in translin molecules A, B, C and D. The position of the sequence and the amino acid residues from Asn218ｓ to Lys228 are not constant even in the crystal, and are excluded from consideration in X-ray crystal structure analysis.
[0031]
What substantially matches the three-dimensional structural coordinates of the translin of the present invention described above is within the scope of the present invention. Here, “substantially coincide with” means that the main part of the structure, specifically a part forming a secondary structure such as α-helix, or a temperature factor is lower than other parts. In the corresponding portion, the root-mean-square error of the main chain or Cα carbon portion of the corresponding portion is about 2 ° or less. In addition, the start site and end site of each sequence are not always strictly defined, and those in which another protein is bound to the N-terminal and / or C-terminal part, and one at the N-terminal and / or C-terminal Alternatively, those that do not substantially change the structure of translin, such as those in which a plurality of amino acid residues are added, are also included in the present invention.
[0032]
In the structural coordinates shown in Table 1 below, the origin of the unit cell in the crystal is expressed as the origin in a three-dimensional space. In the case where the structural coordinates of the present invention are used for calculation by a computer, etc., as a result of performing mathematical movement operations such as translation, rotation, and symmetry in a three-dimensional space without changing the relative arrangement of each atom. The obtained new structure coordinates are also within the range of the three-dimensional structure coordinates of the present invention.
[0033]
3. Use of structural coordinates to perform X-ray crystal structure analysis by molecular replacement method
The three-dimensional structural coordinates of the transrin of the present invention, for example, the structural coordinates shown in Table 1 below, can be used for X-ray crystal structure analysis of crystals obtained from other proteins having an amino acid sequence having significant homology to transrin. Can be used. That is, a molecular replacement method generally used as one of the methods of X-ray crystal structure analysis (for example, “X-ray crystal analysis method of protein”, J. Drent, Translated by Takenaka et al. (1998), Springer In Fairvalk Tokyo, 204-224), by using all or a part of the three-dimensional structure coordinates of the translin of the present invention, the structure coordinates are determined even in a crystal of the protein whose structure coordinates are unknown. In this case, the three-dimensional structural coordinates can be determined much more quickly from the structural factors obtained from the X-ray diffraction image of the crystal without using the heavy atom isomorphous substitution method.
[0034]
When performing the molecular replacement method, a computer adjusted to operate a program used for the molecular replacement method is used. The program may be, for example, X-PLOR {(Molecular Simulation Co.)} or {AMORE} (CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4 (1994) Acta Cryst. D50, 670-673), and other programs). A program may be used. Here, X-PLOR is integrated software for three-dimensional structure analysis of proteins by X-ray and NMR for performing calculations such as molecular replacement method and structure refinement. T. (1992) X-PLOR Version 3.1; A System for X-ray Crystallography and NMR, Yale University Press, New Haven, CT. It is described in. CCP4 is a group of programs for protein X-ray crystal structure analysis for performing calculations such as molecular replacement, isomorphous replacement, and structural refinement. The details thereof are described in The @ CCP4 \ Suit: \ Programs \ Protein \ Crystalography \ (1994) \ Acta \ Cryst. D50, 760-763. It is described in.
[0035]
The crystals to be subjected to the molecular replacement method using the three-dimensional structural coordinates of the translin of the present invention include crystals obtained from other proteins having an amino acid sequence having significant homology to translin, and crystals obtained from translin. Compounds that can bind, such as crystals obtained from a complex of a target nucleic acid and transrin, and the like can be mentioned. As the target nucleic acid, any nucleic acid having a sequence that binds to transrin may be used, and examples thereof include DNA, mRNA, tRNA, and rRNA. Among them, DNA or mRNA is preferable, and single-stranded nucleic acid is particularly preferable. DNA is preferred. Here, the significant homology generally refers to a case where the amino acid sequences are 20% or more, preferably 30% or more identical. If the homology of the amino acid sequence is less than 20%, the reliability of the derived three-dimensional structural coordinates decreases. Conversely, the higher the amino acid sequence homology, the easier it is to derive the desired three-dimensional structural coordinates. Since humans are included in mammals, the amino acid sequence of translin derived from mammals is expected to be highly homologous to the amino acid sequence of human-derived translin. Therefore, for translin derived from mammals, if the correct amino acid sequence is determined, three-dimensional structural coordinates can be easily derived using the structural coordinates of the present invention.
[0036]
The application of the molecular replacement method can be determined by applying the molecular replacement method to the structure factor actually calculated from the X-ray diffraction image of the target crystal and obtaining a significant solution. Here, the structure factor (F) is a physical quantity obtained by Fourier-transforming the electron density (ρ), and the electron density can be obtained by Fourier-transforming the structure factor. The structure factor is a complex number and is expressed in the form of F = | F | exp (iφ). Here, | F | indicates amplitude, φ indicates phase, and | F | is proportional to the square root of the intensity of the diffracted X-ray. φ cannot be directly measured by an X-ray diffraction experiment, and “crystal structure analysis” is equivalent to determining this φ.
[0037]
4. Use of structural coordinates to perform X-ray crystal structure analysis by homology modeling
Using the three-dimensional structural coordinates of the translin of the present invention thus obtained, for example, the three-dimensional structural coordinates of human-derived translin, the three-dimensional structural coordinates of a heterologous transrin or another protein whose amino acid sequence is significantly homologous are calculated. Homology modeling {Haruki Nakamura, Kenta Nakai} (1995) {Introduction to Computers for Biotechnology, Corona, 186-204}.
[0038]
When performing analysis by homology modeling, a computer adjusted to operate a program used for homology modeling is used. The programs include, for example, HOMOLOGY and MODELER (Molecular Simulation) or SWISS-MODEL (Peitsch (1996) Biochem. Soc. Trans. 24, 274-279), but other programs may be used.
[0039]
First, for example, when the structural coordinates of human-derived transrin are used, in these coordinates, the side chain portion of the amino acid residue that does not match in human and mammalian translin is replaced with the side chain of the amino acid residue in mammal. replace. At this stage, the conformation of the side chain is selected so that each atom does not overlap stereochemically and the energy is minimized. Further, a conformation calculation including a main chain portion is performed for all amino acid residues so that the entire energy is minimized.
[0040]
Examples of proteins to which homology modeling is applied using the three-dimensional structural coordinates of translin of the present invention include translin of other species, other proteins having an amino acid sequence having significant homology to translin, or translin. And a complex of translin and a target nucleic acid. As the target nucleic acid, any nucleic acid having a sequence that binds to transrin may be used, and examples thereof include DNA, mRNA, tRNA, and rRNA. Among them, DNA or mRNA is preferable, and single-stranded nucleic acid is particularly preferable. DNA is preferred.
[0041]
As used herein, significant homology refers to a case where the amino acid sequences are generally 20% or more, preferably 30% or more, as described above. When the homology of the amino acid sequence is less than 20%, the reliability of the derived three-dimensional structural coordinates decreases. Conversely, the higher the amino acid sequence homology, the easier it is to derive the desired three-dimensional structural coordinates. Since humans are included in mammals, the amino acid sequence of translin derived from mammals is expected to be highly homologous to the amino acid sequence of human-derived translin. Therefore, for those derived from mammals, if the correct amino acid sequence is determined, three-dimensional structural coordinates can be easily derived using the structural coordinates according to the present invention.
The estimated three-dimensional structural coordinates of homologous proteins obtained by the above method are also within the scope of the present invention.
[0042]
5. Database or recording medium in which three-dimensional structural coordinates of Translin are recorded
By storing the thus obtained translin three-dimensional structure coordinates in an appropriate recording medium in a predetermined format usable by a computer, a translin three-dimensional structure coordinate database or recording medium can be constructed. In the present invention, the database also means a computer system that writes the above-mentioned structural coordinates on an appropriate recording medium and performs a search according to a predetermined program. Suitable recording media include, for example, magnetic media such as flexible disks, hard disks, and magnetic tapes; optical media such as CD-ROMs, MOs, CD-Rs, and CD-RWs; Recording media and the like can be mentioned.
[0043]
By using such a database or a recording medium, identification of a compound having the ability to regulate transrin described below, preparation of a group of compounds consisting of compounds capable of potentially binding to transrin, and variants of transrin The operations such as the production of the lipstick can be performed more easily and efficiently.
[0044]
6. Methods for identifying compounds having the ability to modulate the function of transrin, and methods for preparing compounds comprising compounds capable of potentially binding to transrin
The three-dimensional structural coordinates of the transrins of the invention provide useful information for identifying compounds that have the ability to modulate biological functions, such as transrin or proteins that are significantly homologous to transrin. The ability to regulate the function of transrin may be the ability to activate or inhibit the biological activity of transrin.
[0045]
Specific examples of the identification method include the following steps:
(A) inputting atomic coordinates of a binding site between translin and a nucleic acid into the first storage means;
(B) inputting the atomic coordinates of the candidate compound into the second storage means;
(C) analyzing the presence / absence of the interaction or the degree of the interaction with respect to the atomic coordinate data of steps (a) and (b).
Is actually prepared as a second candidate compound,
(D) contacting the secondary candidate compound, translin, and nucleic acid simultaneously or sequentially;
(E) determining whether the secondary candidate compound alters the binding of translin to the nucleic acid
Is preferably used.
[0046]
In the method of the present invention, among the three-dimensional structural coordinates, at least the atomic coordinates of a binding site between transrin and a nucleic acid are used. Examples of a method for specifying a binding site between transrin and a nucleic acid (hereinafter, this may be referred to as a “substrate binding site”) include, for example, a method using a complex crystal of transrin and a nucleic acid, a known computer, Examples include a method using software. As a method of using a complex crystal of transrin and nucleic acid, first, a complex crystal of transrin and nucleic acid is prepared according to a known method, and a complex protein of known protein is prepared based on the three-dimensional structural coordinates of the present invention. The three-dimensional structure coordinates of the composite crystal can be obtained by the three-dimensional structure construction method. The nucleic acid may be any nucleic acid having a sequence capable of binding to transrin. Specific examples include DNA, mRNA, tRNA, and rRNA. Among them, DNA or mRNA is preferable, and single-stranded DNA is particularly preferably used. As a method for constructing a three-dimensional structure of a protein, the molecular replacement method or the like described in detail 3 above is preferably used. Based on the three-dimensional structural coordinates thus obtained, it is possible to identify to which site of translin the nucleic acid is bound.
[0047]
When the binding site between transrin and nucleic acid is determined using known computer software, for example, the site ID of Tripos (http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/bioInformatics/siteID. html) and the like. Further, for example, the three-dimensional structure of translin can be displayed on a computer screen based on the three-dimensional structure coordinates of translin of the present invention, and the substrate binding site can be estimated on the structure. In general, a protein often has only one or two pocket structures (dent structures) that can serve as a substrate binding site. Therefore, it is assumed that the pocket structure existing on the structure is a substrate binding site. Can be. Further, a motif having a known nucleic acid binding property such as Rossmann fold (“Introduction to Protein Structure”, Branden, C. If it is contained, or a sequence having a nucleic acid binding property such as leucine zipper ("Introduction to Protein Structures" Branden, C. & Tooze, J. J. (1992), Kyoikusha, p. 125) is included in the sequence. If so, the estimation is performed by integrating them. A method of analyzing the surface charge of the binding site is also preferably used. Since the nucleic acid is negatively charged, it can be assumed that the nucleic acid is a substrate binding site when the surface charge of the site having the pocket structure is positively charged.
[0048]
As a method of confirming that the site presumed to be a substrate binding site as a result of the estimation performed in this way is a true substrate binding site, for example, it is considered that the site interacts with a nucleic acid at the binding site. A method is preferably used in which a putative amino acid residue and an amino acid residue present in the vicinity thereof are selected, and a mutation such as substitution, deletion, insertion or the like is generated in this. Here, “present in the vicinity” means that the amino acid residue is involved in an electrostatic interaction, a hydrophobic interaction, a Van der Waals interaction, a hydrogen bond, or the like, specifically, within about 5 °. Means that Analyzing how the binding ability to nucleic acid changes when a mutation is caused to eliminate or suppress the interaction, the binding site is reduced when the binding ability is reduced or eliminated. It can be confirmed that this is a true substrate binding site.
[0049]
After specifying the binding site between transrin and the nucleic acid in this way, a part or all of the three-dimensional structural coordinates of translin of the present invention including at least the atomic coordinates of the binding site is input to the first storage means. The input may be performed each time the analysis is performed, but a database or a recording medium as described in detail in the above 5 can also be used. In the present invention, the storage means means, for example, a computer or a recording medium of the computer which is adjusted so that a program or the like necessary for a certain purpose is operated. Here, a computer or a recording medium of the computer which is adjusted so that a program or the like suitable for expressing the three-dimensional structure of the molecule from the three-dimensional structure coordinates is operated is preferably used. By inputting the coordinates into these storage means, the binding site of translin to the nucleic acid can be expressed three-dimensionally. Many computer programs for expressing the three-dimensional structural coordinates of protein molecules are commercially available. These programs generally include means for inputting three-dimensional structural coordinates, means for visually expressing the coordinates on a computer screen, and methods for expressing. And a means for measuring the distance and bond angle between atoms in a molecule, and a means for additionally correcting the coordinates. Furthermore, it is also possible to use a program created to provide a means for calculating the structural energy of a molecule based on the coordinates of the molecule, and a means for calculating the free energy in consideration of a solvent molecule such as a water molecule. It is. Specifically, for example, a computer program commercially available from Molecular Simulation Company, such as InsightII or QUANTA, may be mentioned. For example, with respect to InsightII, more detailed examination, evaluation, or design can be performed by using a program such as a module such as Ludi or DOCK alone or in combination, but the present invention is limited to these programs. is not.
[0050]
Next, the atomic coordinates of the candidate compound are input to the second storage means. As the second storage means, similarly to the first storage means, for example, a computer adjusted to operate a program or the like suitable for expressing a three-dimensional structure of a molecule from three-dimensional structure coordinates or a computer thereof. And the like. By inputting the atomic coordinates into these storage means, the candidate compound can be expressed three-dimensionally. Here, the candidate compound may be a known compound or a newly synthesized compound having a new chemical structure, provided that the three-dimensional structure can be obtained. Can be used. Specifically, for example, any of a natural compound and a synthetic compound may be used, and any of a high molecular compound and a low molecular compound may be used. In the present invention, among these, nucleic acid derivatives and the like are preferably used. The three-dimensional structural coordinates of these compounds may be obtained by any method such as X-ray crystallography and modeling. The ones for which the three-dimensional structural coordinates have been determined are stored in an appropriate database, for example, CCDC (Cambridge \ Crystalographic \ Data \ Centre: \ http: //www.ccdc.cam.ac.uk/) or PDB (Protein \ Data \ Bank: \ http: // www.rcsb.org/pdb/).
[0051]
Furthermore, designing a new candidate compound using the three-dimensional structural coordinates of the present invention by the method described in JP-A-2000-178209 or the like (hereinafter, this may be referred to as “molecular design”) ) Can also be. The molecular design method is a method of designing a compound capable of binding to a substrate binding site of a protein based on the three-dimensional structural coordinates of the protein, and is not limited to the method using the method described in the above publication, A commonly used method known per se can be used. There are typically two conceptual stages in the molecular design of candidate compounds. The first step is to find the lead compound, and the second step is the process of lead compound optimization. These steps can also be performed by a method known per se, whereby the candidate compounds having the ability to regulate the function of transrin can be further narrowed down.
[0052]
Based on the atomic coordinate data of the binding site between the transrin and the nucleic acid and the atomic coordinate data of the candidate compound input in the above step, the presence or absence or the degree of the interaction is analyzed. That is, translin and a candidate compound are displayed three-dimensionally on a computer screen, and the two are brought close to or brought into contact with each other to perform a visual examination and / or an examination based on energy calculation or the like, whereby the translin is displayed. The presence or absence or the extent of the interaction between the nucleic acid binding site of phosphorus and the candidate compound can be analyzed. Here, as a result of the analysis, for example, a candidate compound or the like that is determined to give a change in the binding ability between the nucleic acid having the specific sequence and translin described above is selected as a secondary candidate compound. The change may be that the binding ability of translin to the nucleic acid is enhanced or attenuated. Here, it is preferable to select a compound having high biological and thermodynamic stability and excellent physical properties.
[0053]
As a method of the visual examination, specifically, for example, three-dimensional notation using Crystal Eyes glasses supplied by Silicon Graphics Co., Ltd., or a method frequently used by those skilled in the art. By using a method of simultaneously displaying two types of screens corresponding to the fields of view of the right eye and the left eye called stereoscopic view (Stereo view), understanding of a three-dimensional space can be easily obtained. Visual examination is possible without using. In addition, local structural coordinates that change due to mutations such as amino acid residue substitutions, deletions, insertions, or chemical modifications determine the spatial position of each atom so as to maintain the validity of chemical bonds. It can be obtained by: At this time, a suitable group of conformation candidates may be displayed on the computer and selected from them, or the computer may calculate a stable structure having a low energy state. Then, a mutation or a chemical modification that causes more preferable binding between the nucleic acid and the nucleic acid may be found.
[0054]
As a method of study based on energy calculation, for example, a bond generated between transrin and the candidate compound is evaluated by performing energy calculation by a computer. The energy calculation can be performed by using a computer program for performing a molecular force field calculation generally performed by those skilled in the art. Examples of programs suitable for the purpose include, but are not limited to, the force field of AMBER in the DISCOVER module of Insight II, which is optimized for proteins, CVFF, and the like.
[0055]
These examination methods are not strictly distinguished, and the respective methods may be used in combination. For example, a compound that is expected to have a desirable interaction with translin by visual examination is actually calculated for energy, evaluated for its validity, and further improved by repeating the process. Is also preferably used.
[0056]
Next, the selected secondary candidate compound is actually prepared, and the effect on the binding between translin and the nucleic acid is analyzed. When the compound is not a known available compound, it is prepared by performing synthesis, purification, modification of a known compound, or the like using a method for synthesizing, purifying, or modifying a commonly used compound known per se. do it. The thus prepared secondary candidate compound, transrin, and the nucleic acid are simultaneously or sequentially contacted, and it is determined whether the secondary candidate compound changes the binding between transrin and the nucleic acid. As a result, for example, when the binding between translin and nucleic acid is suppressed by the presence of the secondary candidate compound, as compared to the case where It can be determined that the compound has an activity of inhibiting binding to a nucleic acid. Conversely, when the binding between transrin and the nucleic acid is enhanced by the presence of the secondary candidate compound, it is determined that the compound has an action of enhancing or activating the binding between transrin and the nucleic acid. Can be.
[0057]
Further, in the above step (d), a compound determined to have an interaction with transrin irrespective of the presence or absence of biological activity is prepared from the compound which is actually prepared and which is capable of potentially binding to transrin. Can be prepared as a group of compounds. The compound group may be prepared, for example, by preparing a plurality of selected candidate compounds using a method for synthesizing, purifying, modifying, etc., a commonly used compound known per se as described above. Alternatively, a group of similar compounds of the selected compound may be prepared using a technique such as combinatorial chemistry and used. Such a group of similar compounds is preferably prepared without changing the site having an interaction with transrin. Examples of the preparation method include “Drug Chemistry (above)” (edited by CG Wermuth). , Edited by Hirose Nagase, published by Technomic Co., Ltd.).
[0058]
Since the compound group thus prepared is a compound group consisting of compounds that can potentially bind to transrin, each compound in this compound group is actually brought into contact with transrin and included in the compound group according to a known method. By analyzing the presence or absence or the extent of the interaction between the candidate compound and transrin, a compound having the desired reactivity with transrin can be selected as a secondary candidate compound. That is, if a compound group containing a large number of candidate compounds is used, such selection can be performed efficiently. Further, by preparing and using a compound array in which these compound groups are immobilized on a substrate or the like, analysis can be performed more easily.
[0059]
The secondary candidate compound thus selected is analyzed for its effect on the binding between transrin and nucleic acid in the same manner as described above, and a compound having an activity of inhibiting the binding between transrin and nucleic acid, or Further, a compound having an action of enhancing the binding between translin and a nucleic acid can be further selected.
A compound having the ability to regulate the function of transrin selected by any of the methods described above, that is, a compound having an activity of inhibiting the binding of transrin to a nucleic acid, or a compound having an activity of inhibiting the binding of transrin to a nucleic acid. Compounds having an enhancing or activating effect can be actually applied as pharmaceuticals by examining their activity by pharmacological or physiological tests in vitro or in vivo and selecting drug candidate molecules having the desired activity You can get things. This can be further prepared as a pharmaceutical composition by a commonly used method known per se, and used as a preventive and / or therapeutic agent for various diseases involving transrin. Such diseases include diseases related to nucleic acid damage, regulation of expression, stability of degradation, and the like, and more specifically, for example, diseases such as leukemia and malignant lymphoma caused by chromosomal translocation. And the like.
[0060]
As described above, by using the three-dimensional structural coordinates of translin of the present invention, it is possible to molecularly design a compound having the ability to regulate the function of translin by computer, and to design, synthesize, The cycle of evaluation and the like can be greatly shortened as compared with the conventional method based on biological functions.
[0061]
7. Method for producing translin mutant and mutant obtained by the method
Using the three-dimensional structural coordinates of the transrin of the present invention, a mutant of transrin can be produced. Specifically, for example, the following steps:
(A) inputting the three-dimensional structure of translin into storage means and displaying the three-dimensional structure of translin on a computer screen based on the coordinates;
(B) substituting, deleting, inserting, or chemically modifying one or more amino acid residues in the three-dimensional structural coordinates;
(C) analyzing a change in the three-dimensional structure of translin displayed on the computer screen;
A mutant of translin selected by a method including
(D) contacting the mutant with a nucleic acid to analyze the binding activity,
(E) determining whether there is a change in the activity by comparing the binding activity between translin and the nucleic acid with the binding activity analyzed in (d) above.
Is preferably used.
[0062]
First, the three-dimensional structural coordinates of the translin of the present invention are input to the storage means. Here, as the storage means, a computer or its recording medium or the like adjusted so that a program or the like capable of displaying a three-dimensional structure of a protein on a computer screen based on the input three-dimensional structure coordinates is operated. It may be used. After displaying the three-dimensional structure of translin on a computer screen based on the input three-dimensional structure coordinates, mutation or chemical modification such as substitution, deletion, insertion or the like of one or more amino acid residues is performed. Do. Here, the amino acid residue to be mutated or modified is present at the amino acid residue interacting with the nucleic acid and its vicinity at the binding site between translin and the nucleic acid determined by the method described in detail in 6 above. It is preferred to select amino acid residues. Here, “present in the vicinity” means that the amino acid residue is involved in an electrostatic interaction, a hydrophobic interaction, a Van der Waals interaction, a hydrogen bond, or the like, specifically, within about 5 °. Means that The final mutant can be designed in consideration of these factors comprehensively.
[0063]
By performing mutation or chemical modification on any amino acid residue, the resulting change in the three-dimensional structure of translin, in particular, the change in the three-dimensional structure at the binding site with the nucleic acid, can be displayed on the computer screen. Observe by change. The observation is performed visually or based on an energy calculation. Specifically, for example, a three-dimensional notation using Crystal Eyes glasses supplied from Silicon Graphics Co., Ltd. is used. By using a method of simultaneously displaying two types of screens corresponding to the visual field of the right eye and the left eye called stereoscopic view (Stereo @ view), which is frequently used by a trader, it becomes easy to understand the three-dimensional space. Visual examination is possible without using the notation of the dimensional space. In addition, local structural coordinates that change due to mutations such as amino acid residue substitutions, deletions, insertions, or chemical modifications determine the spatial position of each atom so as to maintain the validity of chemical bonds. It can be obtained by: At this time, a suitable group of conformation candidates may be displayed on the computer and selected from them, or the computer may calculate a stable structure having a low energy state. Then, a mutation or a chemical modification that causes a change in the binding ability to the nucleic acid may be found from among them.
[0064]
Further, which amino acid is to be specifically substituted with which can be determined, for example, by referring to the method described in "Research Methods for Protein Engineering" (Yasuharu Imoto @ Society Press Center 1996). Among them, for example, by introducing a mutation in the active site of a protein to change the size of the pocket, or by converting a charged amino acid to a non-charged one or vice versa, A method for introducing a mutation that changes the internal electrostatic potential distribution is preferably used.
[0065]
Based on the results of such studies, a mutant or the like having a change in the three-dimensional structure of the nucleic acid binding site is selected, and a mutant of the selected transrin is actually prepared. Mutants can be prepared by a number of methods known per se. For example, as a result of the above examination, at the site identified as increasing the biological activity by mutation, the site of the oligonucleotide encoding the corresponding amino acid residue, the oligonucleotide corresponding to the mutant By chemically synthesizing and replacing the natural-type oligonucleotide portion with a sequence-specific oligonucleotide cleaving enzyme (restriction enzyme), the variant designed based on the present invention is encoded. DNA can be obtained. The above-mentioned mutant can be obtained by incorporating the DNA of the obtained mutant into an appropriate expression vector, introducing the DNA into an appropriate host, and producing it as a recombinant protein. Such a preparation method is described in, for example, “CURRENT PROTOCOLS Compact Edition, Molecular Biology Experiment Protocol, I, II, III (translated by Kaoru Saigo and Yumiko Sano, Maruzen Co., Ltd .: Original Works, Ausubel, FM, etc., Short Protocol, etc.) Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York) and the like.
[0066]
In addition, those skilled in the art generally chemically modify amino acid residues of proteins. Specifically, for example, {"Methods in Enzymology (Vol. 47, pp. 407-498, Hirs, CHW and Timasheff, S, N., eds, (1977). Academic Press, New York.") And the like.
[0067]
Next, the prepared mutant is brought into contact with a nucleic acid to analyze the binding activity. By determining how the analyzed binding activity has changed as compared to the binding activity between transrin and the nucleic acid, it is possible to determine what action the mutant actually has on the nucleic acid. You can check. For example, a mutant whose binding activity to a nucleic acid is low or absent compared to translin, when used as a pharmaceutical composition, binds to translin such as a transrin transport protein present in the body. Since it can serve as a decoy (decoy protein) for a protein having an ability or a nucleic acid having a sequence that binds to translin, it has an effect of suppressing the normal biological function of transrin in a living body. In addition, a mutant having a higher binding activity to nucleic acid than translin has an effect of enhancing the biological function of transrin when used as a pharmaceutical composition.
[0068]
A pharmaceutical composition containing such a mutant as an active ingredient can also be prepared in the same manner as in the above-mentioned method 6, and used as a preventive and / or therapeutic agent for various diseases involving transrin.
[0069]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Preparation of Translin Crystal and Crystalline Transelenomethionine Derivative
(1) Preparation of human-derived transrin and selenomethionine derivative of transrin
The Journal of Biological Chemistry Vol. No. 272, No. 17, {page} 11402-11403, as a fusion protein in which a histidine tag (Met \ Arg \ Gly \ Ser \ His \ His \ His \ His \ His \ His \ Gly \ Ser) is bound to the N-terminus of the cDNA derived from human translin prepared by the method described in p. Qiagen). The amino acid sequence encoded by the integrated cDNA is shown in SEQ ID NO: 1 (however, methionine at amino acid number 195 is leucine). This expression vector was introduced into host Escherichia coli M15 [pREP4] by electroporation, and the resulting transformant was transformed into a jar fermenter with a medium containing 2 L of 2 × YTA, kanamycin 100 μg / ml and ampicillin 100 μg / ml. The cells were cultured at 37 ° C. with stirring at 200 rpm and aeration at 5 L / min. Thereafter, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1.0 mM to induce transrin expression. Further, the cells were cultured at 37 ° C. for 4 hours, and the culture was centrifuged to collect the bacteria.
[0070]
Further, the selenomethionine derivative of transrin replaces leucine at amino acid number 183 of transrin with a gene corresponding to methionine, and adds a histidine tag (Met \ Arg \ Gly \ Ser \ His \ His \ His \ His \ His \ His \ Gly \ Ser) at the amino terminus. It was incorporated into the expression vector pQE80 (Qiagen) as a bound fusion protein. The amino acid sequence encoded by the integrated cDNA is shown in SEQ ID NO: 1. The methionine substituted for leucine in this amino acid sequence is amino acid number 195.
[0071]
This expression vector was introduced into host Escherichia coli DL41, which is a methionine-requiring strain, by electroporation, and the resulting transformant was placed in a 250 mL LeMaster medium containing 30 μg / ml selenomethionine and 100 μg / ml kanamycin using an Erlenmeyer flask. Then, the cells were cultured at 37 ° C. while stirring in an incubator. Thereafter, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1.0 M to induce the expression of a translin selenomethionine derivative. Furthermore, the cells were cultured at 37 ° C. for 15 hours, and the culture was centrifuged to collect the cells.
[0072]
The cells expressing transrin or a selenomethionine derivative of transrin are suspended in an affinity column equilibration buffer (50 mM @ Tris-HCl, 300 mM @ NaCl, 5% (v / v) glycerol, pH 7.0), and suspended by ultrasonication. After crushing the cells, a supernatant containing transrin or a selenomethionine derivative of transrin present as a soluble protein in the cells was obtained by centrifugation. The obtained supernatant was added to an affinity column (manufactured by Talon @ Clontech) equilibrated with an equilibration buffer, and translin or a selenomethionine derivative of transrin was specifically adsorbed to the column. After the column was washed with the equilibration buffer, translin or the selenomethionine derivative of transrin adsorbed on the column was eluted by a linear gradient of the equilibration buffer containing 200 mM imidazole.
[0073]
The eluted fraction containing transrin or the selenomethionine derivative of transrin was dialyzed against an anion exchange column equilibration buffer (20 mM @ Tris-HCl, 100 mM @ NaCl, @ 5% (v / v) glycerol, pH 7.0). After that, the mixture was adsorbed to an equilibrated anion exchange column (RESOURCE @ Q, manufactured by Pharmacia). After washing the column with the equilibration buffer, the selenomethionine derivative of transrin or tranne adsorbed on the column was eluted by a linear gradient of the equilibration buffer containing 1000 mM NaCl. A gel filtration column equilibrated with 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 5% (v / v) glycerol, pH 7.0 after concentrating a transrin or a selenomethionine derivative fraction of transrin with an ultrafiltration membrane. Was added. The fraction purified by gel filtration chromatography (Susdex, manufactured by Pharmacia) was used for preparing crystals.
[0074]
The purity of the obtained translin and the selenomethionine derivative of translin was determined by SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). The purity of translin and the selenomethionine derivative of translin was 95% or more, and the yield was about 50 mg for translin and about 5 mg for selenomethionine derivative of transrin.
[0075]
(2) Preparation of translin crystals and selenomethionine derivative crystals of transrin
Translin crystals and selenomethionine derivative crystals of transrin were obtained by a hanging drop vapor diffusion method. Translin or a selenomethionine derivative of transrin purified to high purity in (1) above was adjusted to a protein concentration of about 10 mg / mL using an ultrafiltration membrane. To 1.0 μL of this protein solution, 2.0 to 2.5 M sodium formate as a crystallization solution and an equal amount of 0.1 M acetate buffer solution at pH 4.5 are added and mixed, and siliconized so that the surface becomes hydrophobic. Placed on a cover glass plate treated with the agent. The glass plate on which the sample was placed was placed in an airtight storage container containing 0.5 mL of the crystallization solution, and allowed to stand at 20 ° C. After standing for about 3 to 7 days, hexagonal columnar crystals having a size of about 500 μm × 200 μm × 200 μm were obtained in the sample solution.
[0076]
(3) Determination of crystal forms of translin and selenomethionine derivatives of transrin
The crystals obtained in the above (2) were immersed in a crystallization solution to which 30% sucrose was added as an antifreeze, and then placed under a 100 K nitrogen stream and rapidly frozen. X-ray diffraction data was collected by using the vibration method in a 100 K nitrogen stream using the synchrotron radiation of the Japan Synchrotron Radiation Research Institute SPring-8. The diffraction intensity was quantified using a diffraction intensity processing program MOSFLM (Leslie, AGW (1992) MOSFLM. Daresbury Laboratory, Warrington, Vol. 26) to determine the crystal structure factor. Translin crystals and selenomethionine derivative crystals of translin both have orthorhombic space group symmetry C222.₁And the lattice constants of the crystals were a = 129 ± 10, b = 135 ± 10, and c = 132 ± 10.
From the lattice constant of the crystal, the space group, and the molecular weight of transrin, it was confirmed that translin and four selenomethionine derivatives of transrin exist in the asymmetric unit of the crystal.
[0077]
Example 2 Crystal structure analysis of transrin
The translin crystal {(parent crystal)} obtained in (2) of Example 1 is immersed in a crystallization solution containing 30% sucrose as an antifreeze, and then put under a nitrogen stream of 100K and rapidly frozen. did. X-ray diffraction intensity data was collected using a vibration method using a synchrotron radiation from the Japan Synchrotron Radiation Research Institute SPring-8 in a 100 K nitrogen stream.
[0078]
From each of the obtained diffraction images, the diffraction intensity was quantified using a diffraction intensity processing program HKL2000 (HKL Research) to determine the crystal structure factor. The crystals are orthorhombic space group symmetric C222₁And the lattice constants of the crystals were a = 129 ± 10 °, b = 135 ± 10 °, and c = 131 ± 10 °.
Further, 183 selenomethionine derivative crystals of transrin were immersed in a crystallization solution containing 30% sucrose as an antifreeze in the same manner as described above, and then placed under a 100 K nitrogen stream and rapidly frozen. The X-ray diffraction intensity data was collected by using a vibration method in a 100 K nitrogen gas flow using the synchrotron radiation of the Japan Synchrotron Radiation Research Institute SPring-8. At this time, in order to perform a structural analysis using the selenium extraordinary scattering term, the wavelengths are three wavelengths around 0.9797 °, which is the absorption edge of selenium, that is, the data is obtained at three locations of the absorption edge peak, edge, and remote. Was collected.
[0079]
Next, the following analysis was carried out using a program group called SOLVE (Terwillinger, TC & Berendzen, J Acta Crystallogr. D 55, 849-861 (1999)). First, the Fourier transform was calculated using the intensity difference between the diffraction points of the selenomethionine derivative, and the position of the selenium atom in the real space that satisfies this was determined from the obtained difference Patterson diagram. Using the phase of the crystal structure factor of the selenomethionine derivative crystal calculated from the obtained position coordinates of the selenium atom, the electron density diagram of the crystal of translan in real space was obtained. Further, a three-dimensional molecular graphics program O (Jones, J., et al.) That performs smoothing of electron density in the solvent region and calculation of averaging of electron density using non-crystallographic symmetry, and constructs and corrects a molecular model. (1991) Acta Cryst. A47, 110-119.), The amino acid residues of transrin were identified on the electron density diagram. Translin has been shown to contain a complex of four molecules in the asymmetric unit.
[0080]
Example 3 Refinement of three-dimensional structural coordinates of translin
Next, using the reflection data of the mother crystal of translin, the position of each atom was refined by CNX (Molecular Simulation), and water molecules were identified using the above program O.
[0081]
This operation was repeated to identify the water molecules bonded to each of the four translin molecules present in the asymmetric unit. At this stage, the R factor used as an index of the accuracy of the structural coordinates was R = 22.9% when a structural factor obtained from a diffraction image having a Bragg reflection angle of 15 ° to 2.2 ° was used. . Further, at the refinement stage, the R factor (a factor called R-free 構造 factor) calculated from the structural factors that were not independently included in the refinement calculation was R-free = 26.5%. Further, root-mean-square errors of the bond distance and bond angle between the respective atoms from the ideal state were 0.007 ° and 1.13 degrees, respectively. The obtained structural coordinates are shown in Table 1 according to the format of a protein data bank, which is a commonly used notation.
[0082]
Example 4 Coordinates of Translin in Other Crystal Forms by Molecular Replacement Method
Translin was prepared by adding the above-mentioned crystallization conditions to a 15% (w / w) polyethylene glycol 4000, 0.1 M {pH 6.2} MES buffer solution in the space group P4.₁2₁2 or P4₃2₁2 are obtained (Kasai, @ et @ al. @ JBC (1997), 272, @ 11402). The X-ray diffraction intensity data of this crystal was measured, and the crystal structure was analyzed by a molecular replacement method using the program EPMR and the coordinates of translin refined in Example 2. As a result, the space group of this crystal is P4₁2₁2. The orientation and position of the transphosphorus molecule in the crystal were determined. Further, each atomic coordinate is refined by CNX, and when the R factor is a structure factor obtained from a diffraction image having a Bragg reflection angle of 15 ° to 3.485 °, R = 25.0% and R-free = 45%.
[0083]
【The invention's effect】
By using the three-dimensional structural coordinates of transrin provided by the present invention, it is possible to efficiently identify, search, evaluate, or design a compound having the ability to regulate the function of transrin. As a result, each method conventionally performed based on biological functions and the like can be greatly reduced, and a drug related to a disease involving translin can be efficiently developed.
[0084]
[Table 1]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092]

[0093]

[0094]

[0095]

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133]

[0134]

[0135]

[0136]

[0137]

[0138]

[0139]

[0140]

[0141]

[0142]

[0143]

[0144]

[0145]

[0146]

[0147]

[0148]

[0149]

[0150]

[0151]

[0152]

[0153]

[0154]

[0155]

[0156]

[0157]

[0158]

[0159]
[Sequence list]

[0160]

[0161]

[0162]

[0163]

[0164]

[0165]

[0166]

[0167]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the main chain of a translin structure in a ribbon model.
FIG. 2 is a diagram showing a main chain of a structure of translin in an asymmetric unit in a crystal by a ribbon model.
FIG. 3 is a diagram showing the structure of the main chain of a octamer translin, which is a functional unit of translin, in a ribbon model.

Claims

Translin crystals obtained by using sodium formate as a precipitant are frozen in a crystallization solution containing a polyhydric alcohol, and X-ray diffraction data is collected in a frozen state. A method for measuring a line diffraction image.

The method according to claim 1, wherein the polyhydric alcohol is sucrose or glycerol.

A three-dimensional structure coordinate of translin obtained by the measurement method according to claim 1.

4. The three-dimensional structure coordinates obtained as a result of performing a mathematical movement operation in a three-dimensional space without changing the relative arrangement of each atom with respect to the three-dimensional structure coordinates according to claim 3.

A three-dimensional structure coordinate of a protein whose three-dimensional structure is unknown, obtained by a method for constructing a three-dimensional structure of the protein based on the three-dimensional structure coordinates according to claim 3 or 4.

The three-dimensional structure coordinates according to claim 5, wherein the three-dimensional structure construction method is a molecular replacement method or homology modeling.

The three-dimensional structure coordinates according to claim 5, wherein the protein whose three-dimensional structure is unknown is a protein having a sequence having a homology of 20% or more with the amino acid sequence of human-derived transrin.

A database in which coordinates including all or a part of the three-dimensional structure coordinates according to claim 3 are recorded.

A computer-readable recording medium in which all or a part of the three-dimensional structural coordinates according to claim 3 is recorded.

A method for identifying a compound capable of modulating the function of transrin, comprising the following steps:
(A) inputting atomic coordinates of a binding site between translin and a nucleic acid into the first storage means;
(B) inputting the atomic coordinates of the candidate compound into the second storage means;
(C) for the atomic coordinate data of the above steps (a) and (b), a compound searched by a method including a step of analyzing the presence or absence of an interaction or the degree thereof is actually prepared as a secondary candidate compound;
(D) contacting the secondary candidate compound, translin, and nucleic acid simultaneously or sequentially;
(E) a method comprising determining whether the secondary candidate compound alters the binding between transrin and a nucleic acid.

A method for preparing a group of compounds consisting of compounds that can potentially bind to transrin, comprising the following steps:
(A) inputting atomic coordinates of a binding site between translin and a nucleic acid into the first storage means;
(B) inputting the atomic coordinates of the candidate compound into the second storage means;
(C) For the atomic coordinate data of the above steps (a) and (b), select a compound retrieved by a method including a step of analyzing the presence or absence of the interaction or the degree of the interaction, and actually prepare a compound group. Including methods.

The method for constructing a three-dimensional structure of a protein based on the three-dimensional structure coordinates according to any one of claims 3 to 7, wherein the binding site between the transrin and the nucleic acid is specified by preparing a complex crystal of the transrin and the nucleic acid. The method according to claim 10, wherein the method is performed based on the obtained three-dimensional structure coordinates by obtaining the three-dimensional structure coordinates of the composite crystal.

A method for producing a translin mutant using the three-dimensional structural coordinates according to any one of claims 3 to 7, comprising the following steps:
(A) inputting the three-dimensional structure coordinates according to any one of claims 3 to 7 into storage means, and displaying the three-dimensional structure of translin on a computer screen based on the coordinates;
(B) substituting, deleting, inserting, or chemically modifying one or more amino acid residues in the three-dimensional structural coordinates;
(C) actually preparing a mutant of translin selected by a method including a step of analyzing a change occurring in a three-dimensional structure of translin displayed on a computer screen;
(D) contacting the mutant with a nucleic acid to analyze the binding activity,
(E) a method comprising comparing the binding activity between translin and a nucleic acid with the binding activity analyzed in (d) to determine whether there is a change in the activity.

A mutant of transrin produced by the method of claim 13.