【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な糖質化合物修飾方法に関するものである。
より詳細には、糖質化合物修飾剤、及び、その糖質化合物修飾剤と還元末端を持つ糖質化合物を還元アミノ化法によって結合することによって得られる糖質化合物誘導体、及び、その製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖蛋白質等の糖鎖の機能を解析することは、糖鎖を産業的に利用する上で極めて重要である。その為には、糖蛋白質やプロテオグリカンから遊離される、Ｎ−あるいはＯ−結合型の糖鎖と、それを認識する蛋白質との相互作用を、微量で解析する手法が必要である。
例えば、糖鎖生合成の阻害、蛋白質の糖鎖結合部位の点変異、大量の糖質による阻害等の手法も考えられるが、間接的である為、特異性を正確に解析することは出来ない。
また、糖蛋白から遊離される糖質化合物は、しばしばヘテロな混合物であり、精製が難しい上に、遊離の状態では多価効果を失う為に、阻害効果を見るのに大量のサンプルが必要となる。
【０００３】
こうした問題を解決する為に、遊離された糖質化合物を人工脂質で修飾し、ネオ糖脂質に誘導する手法が開発された（Ｔ． Ｆｅｉｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２３０， ４８４−５１９， １９９４）。還元末端を持つ糖質化合物と、アミノ基を持つ人工脂質とが形成するシッフ塩基を、水素化シアノホウ素ナトリウムで還元する修飾法である。
ネオ糖脂質は、糖蛋白質からヒドラジン分解やアルカリ性条件下の水素化ホウ素分解あるいは糖質加水分解酵素等を用いて切り出した糖質化合物ばかりでなく、天然あるいは合成の糖質化合物に対しても適用出来る。
得られたネオ糖脂質は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上にスポットしたり、プラスティックディッシュにコートしたり、リポソームに取り込んだりして、糖鎖の機能を解析する為のプローブとしての有用性が示されている。
しかし、Ｆｅｉｚｉ等により開発されたこの方法には、修飾剤として用いるＬ−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）やＬ−１，２−ジヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）は市販されているものの高価であること、それらの反応性が低い為、糖質化合物に対して大過剰の人工脂質試薬を要すること、さらに、人工脂質及び生成するネオ糖脂質に紫外吸収が無い為、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での取り扱いが困難であること等の問題点が残されており、その解決が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、紫外吸収を持った糖質化合物修飾剤を用いた、新規な糖質化合物修飾方法、及び、それによって得られる、糖鎖の機能解析用プローブとして有用な、新規な糖質化合物誘導体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、市販の化合物から安価に得られ、２４８ｎｍに紫外吸収の極大を持つ、式（１）の化合物を人工脂質として用いれば、Ｆｅｉｚｉ等の方法の問題点が解決出来ると考えて検討を行った。その結果、式（１）の化合物を用いれば、人工脂質を大過剰用いることなく、還元アミノ化法により、還元末端を持つ糖質化合物を結合させたネオ糖脂質が、高収率で得られることを見出した。さらに、得られた化合物はＨＰＬＣの紫外検出器を用いて検出出来ることを確認して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、式（１）
【化２】
（式中、ＲはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３またはＨを表し、ｍは２から６の整数を、ｎは１１から１７の整数を表す。）
で示される化合物からなる糖質化合物修飾剤、及び、式（１）で示される化合物と還元末端を持つ糖質化合物を還元アミノ化法によって結合することによって得られる糖質化合物誘導体、及び、式（１）で示される化合物と還元末端を持つ糖質化合物を還元アミノ化法によって結合することを特徴とする糖質化合物誘導体の製造法、を提供するものである。
【０００７】
式（１）の化合物は、例えば、川上等の方法（Ｈ． Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． ３８１−３８４ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１， Ｈ． Ａｏｙａｇｉ ｅｄ．， Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｏｓａｋａ， ２００２）に従って、３，５−ジヒドロキシ安息香酸あるいは３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸から、安価に合成することが出来る。
糖質化合物としては、還元末端を持つものであれば何でもよいが、例えば、糖蛋白質からヒドラジン分解やアルカリ性条件下の水素化ホウ素分解あるいは糖質加水分解酵素等を用いて切り出した糖質化合物、あるいは、天然に存在するオリゴ糖や多糖、あるいは、有機合成によって得られる糖質化合物等を用いることが出来る。
【０００８】
還元剤としては、シッフ塩基を還元してアミンを与えるものであれば何でもよいが、例えば、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム等を用いることが出来る。
溶媒としては、糖質化合物と式（１）の化合物と還元剤を同時に溶解する溶媒系であれば何でもよいが、例えば、メタノールとクロロホルムの混合溶媒、もしくは、それに少量の水を加えた溶媒を用いることができる。
糖質化合物誘導体の合成は、例えば、糖質化合物を少量の水に溶解し、メタノールとクロロホルムの混合溶煤、式（１）の化合物、水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、反応が充分に進行するまで加熱することによって行うことが出来る。
【０００９】
式（１）で示される化合物と還元末端を持つ糖質化合物を還元アミノ化法によって結合することによって得られる糖質化合物誘導体の精製は、ＤＰＰＥやＤＨＰＥ誘導体と同様にシリカゲルの分取用ＴＬＣやカラムクロマトグラフィー等を用いることが出来る。また、分子量が大きくなるので、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０等の有機溶媒を用いるゲルクロマトグラフィーを用いて精製することも出来る。さらに、化合物が紫外吸収を持つ為に、ＨＰＬＣを用いて精製することも出来る。
ＬＨ−２０等を用いるゲルクロマトグラフィーを用いれば、修飾前の糖質化合物が混合物であれば、糖質化合物誘導体も混合物のまま精製することが可能であり、ＨＰＬＣを用いれば、その混合物を分離・精製することが可能になる。
こうして得られた、式（１）で示される化合物と還元末端を持つ糖質化合物を還元アミノ化法によって結合することによって得られる糖質化合物誘導体は、ＤＰＰＥやＤＨＰＥ誘導体と同様に、ＴＬＣ上にスポットしたり、プラスティックディッシュにコートしたり、リポソームに取り込んだり、さらには、表面プラズモン共鳴バイオセンサーの疎水性表面に固定化したりして、糖鎖の機能を解析する為のプローブとして用いることが出来る。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記述に限定されるものではない。
【実施例１】
（Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドによるラクトースの修飾）
ラクトース１水和物（１０．０ ｍｇ， ２７．８μｍｏｌ）を蒸留水（２２５μｌ）に溶解した後、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド溶液（４．２４ ｍｇを４．５６ ｍｌのクロロホルム：メタノール＝１：１溶媒に溶解）と水素化シアノホウ素ナトリウム溶液（５．０ ｍｇを０．５ ｍｌメタノールに溶解）を加え、６０℃で一晩加熱撹拌した。反応終了後、メタノールを加え溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝１３０：５０：９）により精製し、目的の糖質化合物誘導体（１７．６ ｍｇ， ６９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ， ６００ ＭＨｚ） δ６．９３ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ）、６．６１ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ２．１Ｈｚ）、４．４８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）、４．１４ （１Ｈ， ｍ）、３．９９ （４Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）、３．８９ （１Ｈ， ｍ）、３．７３−３．８４ （７Ｈ， ｍ）、３．５７ （１Ｈ， ｂｄｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ８．３ Ｈｚ）、３．５３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ９．６ Ｈｚ）、３．４９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ９．６ Ｈｚ）、３．３７ （２Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）、３．３２ （１Ｈ， ｍ）、２．９９−３．０８ （３Ｈ， ｍ）、１．７６ （４Ｈ， ｍ）、１．４７（８Ｈ， ｍ）、１．３５ （４Ｈ， ｍ）、１．２９ （３２Ｈ， ｍ）、０．８９ （６Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）ｍ／ｚ ９１６（［Ｍ＋Ｈ］＋）。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６Ａ；カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＳＩＬ １００Ａ， ４．６×１５０ ｍｍ；移動相：クロロホルム−メタノール−水 （１３０ ：５０ ： ９）；流速：０．６ ｍｌ ／ 分；検出器：ＵＶ （２４８ ｎｍ））保持時間：４．０分
【００１１】
【発明の効果】
本発明は、還元末端を持つ糖質化合物と還元アミノ化法によりネオ糖脂質を与え、かつ、紫外吸収を持った糖質化合物修飾剤を用いた、新規な糖質化合物修飾方法、及び、それによって得られる、糖鎖の機能解析用プローブとして有用な、新規な糖質化合物誘導体を提供するものである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel carbohydrate compound modification method.
More specifically, the present invention relates to a carbohydrate compound modifier, a carbohydrate compound derivative obtained by binding the carbohydrate compound modifier and a carbohydrate compound having a reducing end by a reductive amination method, and a method for producing the same. Things.
[0002]
[Prior art]
Analyzing the functions of sugar chains such as glycoproteins is extremely important for industrial use of sugar chains. For that purpose, a technique for analyzing the interaction between N- or O-linked sugar chains released from glycoproteins and proteoglycans and proteins recognizing them in a very small amount is required.
For example, methods such as inhibition of sugar chain biosynthesis, point mutation of the sugar chain binding site of protein, inhibition by a large amount of sugar, etc. can be considered, but specificity cannot be accurately analyzed because of indirect methods. .
Also, carbohydrate compounds released from glycoproteins are often heterogeneous mixtures, which are difficult to purify and, in the free state, lose polyvalent effects, requiring a large amount of sample to see the inhibitory effect. Become.
[0003]
In order to solve these problems, a method has been developed in which the released saccharide compound is modified with artificial lipids to induce neoglycolipids (T. Feizi et al., Methods Enzymol., 230 , 484-519, 1994). This is a modification method in which a Schiff base formed by a saccharide compound having a reducing end and an artificial lipid having an amino group is reduced by sodium cyanoborohydride.
Neoglycolipids are applicable not only to carbohydrate compounds cut out from glycoproteins using hydrazinolysis, borohydride decomposition under alkaline conditions, or carbohydrate hydrolases, but also to natural or synthetic carbohydrate compounds. I can do it.
The resulting neoglycolipid is useful as a probe for analyzing the functions of sugar chains by spotting it on thin layer chromatography (TLC), coating it on a plastic dish, or incorporating it into liposomes. It is shown.
However, this method developed by Feizi et al. Includes L-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) and L-1,2-dihexadecyl-sn-glycero used as modifiers. -3-Phosphoethanolamine (DHPE) is commercially available but expensive, and because of their low reactivity, requires a large excess of artificial lipid reagents relative to carbohydrate compounds. However, problems such as difficulty in handling by high performance liquid chromatography (HPLC) remain because neoglycolipids do not have ultraviolet absorption, and their solution has been desired.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel method for modifying a carbohydrate compound using a carbohydrate compound modifier having ultraviolet absorption, and a novel carbohydrate obtained thereby, which is useful as a probe for analyzing the function of a sugar chain. It is to provide a compound derivative.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors believe that the use of a compound of formula (1) which is inexpensively obtained from a commercially available compound and has an ultraviolet absorption maximum at 248 nm as an artificial lipid can solve the problems of the method of Feizi and the like. Study was carried out. As a result, when the compound of the formula (1) is used, a neoglycolipid to which a saccharide compound having a reducing end is bound can be obtained in a high yield by a reductive amination method without using a large excess of artificial lipid. I found that. Furthermore, it was confirmed that the obtained compound could be detected using an ultraviolet detector of HPLC, and the present invention was completed.
[0006]
That is, the present invention relates to formula (1)
Embedded image
(In the formula, R represents O (CH 2 ) n CH 3 or H, m represents an integer of 2 to 6, and n represents an integer of 11 to 17.)
A carbohydrate compound modifier comprising a compound represented by the formula: and a carbohydrate compound derivative obtained by binding the compound represented by the formula (1) to a carbohydrate compound having a reducing end by a reductive amination method; It is intended to provide a method for producing a saccharide compound derivative, wherein the compound represented by (1) and a saccharide compound having a reducing end are bound by a reductive amination method.
[0007]
The compound of the formula (1) can be synthesized, for example, according to the method of Kawakami et al. It can be synthesized at low cost from 2,5-dihydroxybenzoic acid or 3,4,5-trihydroxybenzoic acid.
As the saccharide compound, any saccharide compound may be used as long as it has a reducing end.For example, saccharide compounds cut out from glycoproteins using hydrazinolysis, borohydride decomposition under alkaline conditions, or saccharide hydrolases, Alternatively, a naturally occurring oligosaccharide or polysaccharide, a saccharide compound obtained by organic synthesis, or the like can be used.
[0008]
Any reducing agent may be used as long as it reduces the Schiff base to give an amine, and examples thereof include sodium cyanoborohydride and sodium borohydride.
As the solvent, any solvent may be used as long as it can simultaneously dissolve the saccharide compound, the compound of the formula (1) and the reducing agent. For example, a mixed solvent of methanol and chloroform or a solvent obtained by adding a small amount of water thereto is used. Can be used.
In the synthesis of a saccharide compound derivative, for example, a saccharide compound is dissolved in a small amount of water, a mixed soot of methanol and chloroform, a compound of the formula (1), and sodium cyanoborohydride are added, and the reaction proceeds sufficiently. Can be carried out by heating to
[0009]
Purification of a saccharide compound derivative obtained by combining a compound represented by the formula (1) and a saccharide compound having a reducing end by a reductive amination method can be performed by using a TLC for silica gel preparative separation, like DPPE or DHPE derivative. Column chromatography and the like can be used. In addition, since the molecular weight increases, purification can also be performed using gel chromatography using an organic solvent such as Sephadex LH-20. Further, since the compound has ultraviolet absorption, it can be purified using HPLC.
If gel chromatography using LH-20 or the like is used, if the saccharide compound before modification is a mixture, it is possible to purify the saccharide compound derivative as a mixture, and if using HPLC, the mixture is separated.・ Purification becomes possible.
The thus obtained saccharide compound derivative obtained by bonding the compound represented by the formula (1) and the saccharide compound having a reducing end by a reductive amination method, as well as the DPPE or DHPE derivative, is shown on TLC. It can be spotted, coated on a plastic dish, incorporated into liposomes, or immobilized on the hydrophobic surface of a surface plasmon resonance biosensor, and used as a probe to analyze the function of sugar chains. .
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail, but the present invention is not limited to the following description.
Embodiment 1
(Modification of lactose with N- (6-aminohexyl) -3,5-bis (dodecyloxy) benzamide)
Lactose monohydrate (10.0 mg, 27.8 μmol) was dissolved in distilled water (225 μl), and then N- (6-aminohexyl) -3,5-bis (dodecyloxy) benzamide solution (4.24 mg). Was added to 4.56 ml of chloroform: methanol = 1: 1 solvent) and sodium cyanoborohydride solution (5.0 mg was dissolved in 0.5 ml of methanol), and the mixture was heated and stirred at 60 ° C. overnight. After completion of the reaction, methanol was added and the solvent was distilled off. The residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol: water = 130: 50: 9) to obtain the desired saccharide compound derivative (17.6 mg, 69%).
1 H-NMR (CD 3 OD, 600 MHz) δ 6.93 (2H, d, J = 2.1 Hz), 6.61 (1H, t, J = 2.1 Hz), 4.48 (1H, d) , J = 7.6 Hz), 4.14 (1H, m), 3.99 (4H, t, J = 6.5 Hz), 3.89 (1H, m), 3.73-3.84 (7H, m), 3.57 (1H, bdd, J = 4.8 Hz, 8.3 Hz), 3.53 (1H, dd, J = 7.6 Hz, 9.6 Hz), 49 (1H, dd, J = 3.4 Hz, 9.6 Hz), 3.37 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.32 (1H, m), 2.99-3. 08 (3H, m), 1.76 (4H, m), 1.47 (8H, m), 1.35 (4H, m), 1.29 (32H, m), 0.8 9 (6H, t, J = 7.2 Hz). MALDI-TOFMS (dithranol) m / z 916 ([M + H] < +>). HPLC (Shimadzu LC-6A; column: Inertsil SIL 100A, 4.6 × 150 mm; mobile phase: chloroform-methanol-water (130: 50: 9); flow rate: 0.6 ml / min; detector: UV ( 248 nm)) Retention time: 4.0 minutes
【The invention's effect】
The present invention provides a carbohydrate compound having a reducing end and a neoglycolipid by a reductive amination method, and a novel carbohydrate compound modification method using a carbohydrate compound modifier having ultraviolet absorption, and The present invention provides a novel saccharide compound derivative useful as a probe for analyzing the function of a sugar chain obtained by the above method.
