JP2004069697A - Reagent kit for detecting lupus anticoagulant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、臨床化学や医薬研究などの分野において抗リン脂質抗体症候群の診断に用いられる血液凝固試薬キットに関し、さらに詳しくはin vitroでの血液検査でループスアンチコアグラント陽性疾患を特異的に検出できる試薬キットに関する。 The present invention relates to a blood coagulation reagent kit used for diagnosing antiphospholipid antibody syndrome in fields such as clinical chemistry and pharmaceutical research, and more specifically, specifically detects lupus anticoagulant-positive disease in a blood test in vitro. It relates to a reagent kit that can be used.
ループスアンチコアグラント（以下、ＬＡと略称する）はＳＬＥ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者について初めて報告された抗凝血素である。ＳＬＥ患者においてＬＡが検出される頻度は５％乃至１０％である一方、他の自己免疫性疾患、腫瘍性疾患においても検出されることがある。ＬＡは血栓症、流早産、血小板減少などの抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＰＳ）において検出される頻度が高く、リン脂質依存性の凝固反応で凝固するまでの時間が延長されることから、リン脂質に対する自己抗体であると考えられている。
また、ＬＡは不均一な抗体であり、陰性荷電リン脂質とβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）またはプロトロンビンとの複合体に対する抗体であることが、近年明らかになった。ＬＡの抗凝固作用は、ＬＡがこの複合体と結合することによりプロトロンビンがトロンビンに変化することを阻害するために起こると考えられる。
Lupus anticoagulant (hereinafter abbreviated as LA) is the first anticoagulant reported for SLE (Systemic Lupus Erythematosus) patients. LA is detected in SLE patients at a frequency of 5% to 10%, but may be detected in other autoimmune diseases and neoplastic diseases. LA is frequently detected in antiphospholipid syndrome (APS) such as thrombosis, abortion, and thrombocytopenia, and the time required for coagulation to be prolonged by a phospholipid-dependent coagulation reaction is prolonged. , Are considered to be autoantibodies to phospholipids.
In addition, it has recently been revealed that LA is a heterogeneous antibody and is an antibody against a complex of a negatively charged phospholipid and β2-glycoprotein I (β2-GPI) or prothrombin. It is believed that the anticoagulant effect of LA occurs because LA inhibits prothrombin from converting to thrombin by binding to this complex.
このような特徴を有するＬＡの検出用試薬としては、従来より一定量のリン脂質を含有する凝固試薬、例えば、ウサギ脳由来セファリン、ウシ脳由来セファリン、大豆レシチン、蛇毒などが用いられている。検体血液中にＬＡが存在すると、ＬＡが試薬中のリン脂質を中和してしまうため、検体を凝固するカスケード反応の開始に必要なリン脂質が不足することになることから、ＬＡにより中和されたリン脂質の量に比例して、各検査の凝固時間が延長し、これをもってＬＡ陽性と診断することができる。
また、凝固試薬中のリン脂質が少ないほど、ＬＡの検出感度が高まるので、試薬を希釈したり、正確性を期するために異なった方法を２法以上組合わせることが行われている。
例えば、リン脂質の濃度が異なる２つの試薬を組合わせた活性化部分トロンボプラスチン時間測定（以下、ＡＰＴＴと略称する）試薬を使用し、各試薬の凝固時間から、ロスナー インデックス（Ｒｏｓｎｅｒ Ｉｎｄｅｘ）やループス比（Ｌｕｐｕｓ Ｒａｔｉｏ）（ＬＲ）を算出し、ＬＡ陽性率を判定する手法が知られている。
As a reagent for detecting LA having such characteristics, a coagulation reagent containing a certain amount of phospholipid, for example, cephalin derived from rabbit brain, cephalin derived from bovine brain, soybean lecithin, snake venom and the like have been used. If LA is present in the sample blood, the LA will neutralize the phospholipids in the reagent, resulting in a shortage of phospholipids necessary for the initiation of the cascade reaction that coagulates the sample. The clotting time of each test is prolonged in proportion to the amount of the phospholipid thus performed, and it can be diagnosed as LA-positive.
In addition, since the detection sensitivity of LA increases as the amount of phospholipid in the coagulation reagent decreases, two or more different methods are combined to dilute the reagent or to improve the accuracy.
For example, an activated partial thromboplastin time measurement (hereinafter abbreviated as APTT) reagent in which two reagents having different phospholipid concentrations are combined is used, and the clotting time of each reagent is used to determine the Rosner Index and the Lupus ratio. There is known a method of calculating (Lupus Ratio) (LR) and determining the LA positive rate.
市販の凝固測定試薬としては、グラディポアＬＡ（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ社；オーストラリア）というラッセル蛇毒法による検査試薬がある。これは、蛇毒含有の第１試薬と蛇毒及び過剰のダイズリン脂質含有の第２試薬を組合わせた試薬キットで、第１試薬を添加したときの凝固時間／第２試薬を添加したときの凝固時間で求められる比が１．３以上の場合に、ＬＡ陽性と判定している。
さらに、既存の研究報告によれば（非特許文献１）、ウサギ脳由来リン脂質などによるリン脂質濃度の差を利用して、算術的にＬＡの検出が行なわれている。
またさらに、正常血漿と患者血漿を１：１の割合で混合した試料を用いて、リン脂質濃度が異なる２種類の試薬を組合わせたＡＰＴＴ試薬または希釈ラッセル蛇毒測定（ｄＲＶＶＴ）試薬を用いたときの凝固時間を測定し、患者血漿の凝固時間が正常血漿により補正される度合いを指標にしてＬＡを検出する方法も利用されている。
As a commercially available coagulation measurement reagent, there is a test reagent by the Russell snake venom method called Gladipore LA (Gradipore; Australia). This is a reagent kit in which the first reagent containing snake venom and the second reagent containing snake venom and excess soybean phospholipid are combined, and the coagulation time when the first reagent is added / the coagulation time when the second reagent is added. If the ratio determined by the above is 1.3 or more, it is determined to be LA positive.
Furthermore, according to existing research reports (Non-Patent Document 1), LA is arithmetically detected by utilizing the difference in phospholipid concentration due to phospholipids derived from rabbit brain and the like.
Furthermore, when using a sample obtained by mixing normal plasma and patient plasma at a ratio of 1: 1 and using an APTT reagent or a diluted Russell snake venom measurement (dRVVT) reagent in which two kinds of reagents having different phospholipid concentrations are combined. A method is also used in which the clotting time of a patient is measured and LA is detected using the degree to which the clotting time of the patient's plasma is corrected by normal plasma as an index.
従来行なわれていたリン脂質依存性凝固測定においては、いずれも天然由来リン脂質が用いられ、且つそのリン脂質組成が無調整であった。このため、天然由来リン脂質の不均一性またはリン脂質抽出時の条件のばらつきが凝固時間に影響を及ぼし、ＬＡの検出感度がかなり異なるという問題があった。また、当該凝固試験は、ＬＡ以外の検体を正常血漿と混和することにより、欠損している凝固因子を補充して、凝固時間を正常化させることは可能であるが、ワーファリンやヘパリンなどの血液凝固阻害剤を含有した検体と、ＬＡ陽性患者血漿とを判別することが困難であり、これら凝固阻害剤を含有した検体についてもＬＡ陽性と判定され得るという問題がある。
従って、ＬＡ疾患を正確に判別するためには、ＬＡ以外の凝固活性阻止因子や凝固因子欠損症による凝固時間の延長と、ＬＡによる凝固時間の延長とを区別する必要がある。
本発明の課題は、ＬＡの検出感度を高め、凝固因子欠損症やヘパリン等の血液凝固阻害剤を含有する検体とを区別して、ＬＡを特異的に高精度で検出できる試薬キットを提供することにある。
In the conventional measurement of phospholipid-dependent coagulation, naturally-occurring phospholipids were used, and the phospholipid composition was not adjusted. For this reason, there was a problem that the heterogeneity of the naturally occurring phospholipid or the variation in the conditions at the time of extracting the phospholipid affected the coagulation time, and the detection sensitivity of LA was considerably different. In the coagulation test, it is possible to normalize coagulation time by replenishing the defective coagulation factor by mixing a sample other than LA with normal plasma, but it is possible to normalize coagulation time by using blood such as warfarin or heparin. It is difficult to distinguish a sample containing a coagulation inhibitor from the plasma of an LA-positive patient, and there is a problem that a sample containing these coagulation inhibitors can also be determined to be LA-positive.
Therefore, in order to accurately determine LA disease, it is necessary to distinguish between prolongation of coagulation time due to coagulation activity inhibitory factors other than LA and coagulation factor deficiency and prolongation of coagulation time due to LA.
An object of the present invention is to provide a reagent kit capable of enhancing the detection sensitivity of LA and specifically detecting LA with high accuracy by distinguishing from a sample containing a blood coagulation inhibitor such as coagulation factor deficiency or heparin. It is in.
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者は、試薬に含まれるリン脂質に対するホスファチジルセリンの含有率だけが異なる２種類の試薬に対する凝固時間が、ＬＡ含有血液では、顕著に異なることを見出し、本発明を完成した。
つまり本発明は以下からなる。
１．ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１の凝固時間測定試薬とホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２の凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する割合と異なることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
２．検体と前記第１凝固時間測定試薬を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が１０〜３０μｇ／ｍｌであり、検体と前記第２凝固時間測定試薬を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が１〜７μｇ／ｍｌである前項１記載の試薬キット。
３．前記第１凝固時間測定試薬に含有されるホスファチジルセリンの濃度が、前記第２凝固時間測定試薬に含有されるホスファチジルセリンの濃度比の１０〜２０倍である前項１または２に記載の試薬キット。
４．検体と前記第１凝固時間測定試薬を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が１５〜２０μｇ／ｍｌであり、検体と前記第１凝固時間測定試薬を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が２〜４μｇ／ｍｌである前項２記載の試薬キット。
５．ホスファチジルセリンが合成ホスファチジルセリンまたは９９％以上に精製された天然由来のホスファチジルセリンである前項１に記載の試薬キット。
６．前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が活性化剤及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項１に記載の試薬キット。
７．第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬及び第２部分試薬からなり、第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬及び第４部分試薬からなり、第１部分試薬がホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有し、第１部分試薬中のホスファチジルセリン濃度が３〜１０００μｇ／ｍｌ、第３部分試薬がホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有し、第３部分試薬中のホスファチジルセリン濃度が０．２〜２００μｇ／ｍｌでり、第１部分試薬の濃度が第３部分試薬の濃度より高濃度である前項１に記載の検出用試薬キット。
８．前記第１部分試薬のホスファチジルセリンの濃度が３０〜１００μｇ／ｍｌである前項７に記載の試薬キット。
９．前記第３部分試薬のホスファチジルセリンの濃度が２〜２０μｇ／ｍｌである前項７に記載の試薬キット。
１０．前記第１部分試薬及び前記第３部分試薬がホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有する前項７に記載の試薬キット。
１１．前記ホスファチジルエタノールアミンの濃度が０．１〜３００μｇ／ｍｌであり、ホスファチジルコリンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍｌである前項１０記載の試薬キット。
１２．ホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μｇ／ｍｌであり、ホスファチジルコリンの濃度２０〜１００μｇ／ｍｌである前項１０記載の試薬キット。
１３．前記第１部分試薬及び前記第３部分試薬が活性化剤、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含有し、前記第２部分試薬及び第４部分試薬がカルシウムイオンを含有する前項７に記載の試薬キット。
１４．前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びエラジン酸から選択される１以上の活性化剤である前項１３に記載の試薬キット。
１５．前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が蛇毒及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項１に記載の試薬キット。
１６．前記蛇毒がラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒から選択される１以上の蛇毒である前項１５に記載の試薬キット。
１７．前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が組織因子及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項１に記載の試薬キット。
１８．第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンを含有する前項１５または１７に記載の検出用試薬キット。
１９．前項１〜１８のいずれか一に記載の試薬キットを使用するループスアンチコアグラントの検出方法。
As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have found that the coagulation time for two types of reagents differing only in the content of phosphatidylserine with respect to the phospholipids contained in the reagent is significantly different in LA-containing blood. And completed the present invention.
That is, the present invention includes the following.
1. A first clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid, and a second clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid, wherein the total phosphatidylserine contained in the first clotting time measuring reagent is A reagent kit for detecting lupus anticoagulant, wherein a ratio of the phosphatidylserine contained in the second clotting time measuring reagent to a total phospholipid is different from a ratio of the lipid to a lipid.
2. The concentration of phosphatidylserine when the sample is mixed with the first clotting time measurement reagent is 10 to 30 μg / ml, and the concentration of phosphatidylserine when the sample is mixed with the second clotting time measurement reagent is 1 to 7 μg / ml. Item 2. The reagent kit according to the above item 1, wherein
3. 3. The reagent kit according to the above item 1 or 2, wherein the concentration of phosphatidylserine contained in the first clotting time measuring reagent is 10 to 20 times the concentration ratio of phosphatidylserine contained in the second clotting time measuring reagent.
4. The concentration of phosphatidylserine when the sample is mixed with the first clotting time measurement reagent is 15 to 20 μg / ml, and the concentration of phosphatidylserine when the sample is mixed with the first clotting time measurement reagent is 2 to 4 μg / ml. 3. The reagent kit according to the above item 2, wherein the reagent kit is
5. 2. The reagent kit according to the above item 1, wherein the phosphatidylserine is synthetic phosphatidylserine or a naturally occurring phosphatidylserine purified to 99% or more.
6. The reagent kit according to the above item 1, wherein the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent further comprise an activator and calcium ions.
7. The first clotting time measuring reagent comprises a first partial reagent and a second partial reagent, the second clotting time measuring reagent comprises a third partial reagent and a fourth partial reagent, and the first partial reagent comprises a phospholipid containing phosphatidylserine. The first partial reagent has a phosphatidylserine concentration of 3 to 1000 μg / ml, the third partial reagent contains a phosphatidylserine-containing phospholipid, and the third partial reagent has a phosphatidylserine concentration of 0.2 to 200 μg / ml. 2. The detection reagent kit according to the above item 1, wherein the concentration of the first partial reagent is higher than that of the third partial reagent.
8. Item 8. The reagent kit according to Item 7, wherein the concentration of phosphatidylserine in the first partial reagent is 30 to 100 µg / ml.
9. 8. The reagent kit according to the above item 7, wherein the concentration of phosphatidylserine in the third partial reagent is 2 to 20 μg / ml.
10. The reagent kit according to the above item 7, wherein the first partial reagent and the third partial reagent contain phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine.
11. The reagent kit according to the above item 10, wherein the concentration of the phosphatidylethanolamine is 0.1 to 300 µg / ml and the concentration of the phosphatidylcholine is 2 to 1000 µg / ml.
12. 11. The reagent kit according to the above item 10, wherein the concentration of phosphatidylethanolamine is 1 to 30 μg / ml and the concentration of phosphatidylcholine is 20 to 100 μg / ml.
13. The reagent kit according to claim 7, wherein the first partial reagent and the third partial reagent contain an activator, phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine, and the second partial reagent and the fourth partial reagent contain calcium ions.
14． 14. The reagent kit according to the above item 13, wherein the activator is one or more activators selected from ellagic acid, kaolin, celite and ellagic acid.
15. The reagent kit according to claim 1, wherein the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent further include snake venom and calcium ions.
16. 16. The reagent kit according to the above 15, wherein the snake venom is one or more snake venoms selected from Russell snake venom, textalin snake venom, and ecarin snake venom.
17. 2. The reagent kit according to the above item 1, wherein the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent further include a tissue factor and calcium ions.
18. 18. The detection reagent kit according to the above item 15 or 17, wherein the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent contain phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine.
19. 19. A method for detecting lupus anticoagulant using the reagent kit according to any one of the above items 1 to 18.
本発明の試薬キットでは、ＬＡに対して特異的に凝固時間の差異を認めることができ、またヘパリンなどの抗凝固剤を含有した検体がＬＡ陽性患者血漿と同様に陽性と判定されることがなく、ＬＡ陽性患者だけを高感度に検出することができる。 In the reagent kit of the present invention, a difference in coagulation time can be specifically recognized with respect to LA, and a sample containing an anticoagulant such as heparin is determined to be positive as in the case of LA-positive patient plasma. However, only LA-positive patients can be detected with high sensitivity.
本発明のＬＡ検出用試薬キットは、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１の凝固時間測定試薬と、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２の凝固時間測定試薬とを含み、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が異なっている。
本発明のＬＡ検出用試薬キットは、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１の凝固時間測定試薬と、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２の凝固時間測定試薬とを含み、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が異なっているものである。
The LA detection reagent kit of the present invention comprises: a first clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid; and a second clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid. The content ratio of phosphatidylserine contained in the clotting time measuring reagent to the total phospholipid is different from the content ratio of phosphatidylserine contained in the second clotting time measuring reagent to the total phospholipid.
The LA detection reagent kit of the present invention comprises: a first clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid; and a second clotting time measuring reagent containing a phosphatidylserine-containing phospholipid. The content ratio of phosphatidylserine contained in the clotting time measuring reagent to the total phospholipid is different from the content ratio of phosphatidylserine contained in the second clotting time measuring reagent to the total phospholipid.
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬に含有されるホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略記することがある）は、ホスファチジルセリンであってもよいし、天然由来ホスファチジルセリンであってもよい。ホスファチジルセリンは合成ホスファチジルセリンであることが好ましい。天然由来のホスファチジルセリンを用いる場合には、純度９９％以上に精製されたものを用いることが好ましい。 The phosphatidylserine (hereinafter sometimes abbreviated as PS) contained in the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent may be phosphatidylserine or a naturally occurring phosphatidylserine. Good. Preferably, the phosphatidylserine is a synthetic phosphatidylserine. When using phosphatidylserine derived from nature, it is preferable to use a phosphatidylserine that has been purified to a purity of 99% or more.
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬に含有されるＰＳ以外のリン脂質としては、各凝固時間即手試薬がｉｎ ｖｉｔｒｏで血液凝固を起こすことができるように、血液凝固に必要な他のリン脂質であって、ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略称する）、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略記することがある）などが挙げられる。 The phospholipids other than PS contained in the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent are necessary for blood coagulation so that each of the coagulation time instant reagents can cause blood coagulation in vitro. Other phospholipids include phosphatidylethanolamine (hereinafter abbreviated as PE), phosphatidylcholine (hereinafter sometimes abbreviated as PC), and the like.
第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血液凝固を起こすのに必要な他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、活性化剤、蛇毒、カルシウム、組織因子などが挙げられる。活性化剤としては、エラグ酸、カオリン、セライト及びエラジン酸からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。組織因子としては、ウサギ脳、ヒト胎盤由来のもの、組換え体を用いることが好ましい。
これらの他の成分は、凝固時間測定試薬の種類に応じて適宜選択される。例えば、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び活性化剤を含む場合には活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び蛇毒を含む場合には、ラッセル蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する。また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び組織因子を含む場合には、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。
The first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent may further contain other components necessary for causing blood coagulation in vitro. Other components include, for example, activators, snake venom, calcium, tissue factor, and the like. As the activator, it is preferable to use one or more selected from the group consisting of ellagic acid, kaolin, celite, and ellagic acid. As the snake venom, it is preferable to use one or more selected from the group consisting of Russell snake venom, textalin snake venom, and ecarin snake venom. It is preferable to use a tissue factor derived from rabbit brain or human placenta or a recombinant.
These other components are appropriately selected according to the type of the coagulation time measuring reagent. For example, when the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent include calcium and an activator, the clotting time is measured based on the measurement principle of activated partial thromboplastin time measurement. When the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent include calcium and snake venom, the clotting time is measured based on the principle of Russell snake venom measuring time. When the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent contain calcium and tissue factor, the clotting time is measured based on the principle of prothrombin time measurement.
尚、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに必要に応じて、ＨＥＰＥＳおよびｔｒｉｓ緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。緩衝液の濃度は、一般的に臨床化学の分野で用いられている濃度であればよく、簡単な繰り返し実験により決定することができる。 The first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent may further contain a buffer such as HEPES and a tris buffer, if necessary. The concentration of the buffer may be a concentration generally used in the field of clinical chemistry, and can be determined by a simple repeated experiment.
ＰＳの添加濃度は、第１凝固時間測定試薬のＰＳ濃度が第２凝固時間測定試薬のＰＳ濃度の１０〜２０倍であることが好ましい。具体的には、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬と検体を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が１０〜３０μｇ／ｍｌであり、好ましくは１５〜２０μｇ／ｍｌであるのが好ましい。また、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬と検体を混合したときのホスファチジルセリンの濃度が１〜７μｇ／ｍｌであり、好ましくは２〜４μｇ／ｍｌであるのが好ましい。 It is preferable that the PS concentration of the first coagulation time measurement reagent is 10 to 20 times the PS concentration of the second coagulation time measurement reagent. Specifically, the concentration of the phosphatidylserine when the sample is mixed with the first clotting time measuring reagent containing a phospholipid containing phosphatidylserine is 10 to 30 μg / ml, preferably 15 to 20 μg / ml. Is preferred. The concentration of phosphatidylserine when the second coagulation time measuring reagent containing a phospholipid containing phosphatidylserine and the specimen are mixed is 1 to 7 μg / ml, preferably 2 to 4 μg / ml.
また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬は、それぞれリン脂質及び上記他の成分の混合物であってもよいし、第１凝固時間測定試薬が別々の容器に収容された第１部分試薬と第２部分試薬から構成され、第２凝固時間測定試薬が別々の容器に収容された第３部分試薬と第４部分試薬から構成されたものであってもよい。第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬の組合せ及び第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬と第４部分試薬の組合せでなる場合、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第１部分試薬、第３部分試薬のホスファチジルセリン濃度は、第１部分試薬では３〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは４０〜６０μｇ／ｍｌ、第３部分試薬試薬では０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは６〜１０μｇ／ｍｌとなるような量が含まれていることが好ましい。ただし、第１部分試薬の濃度が第３部分試薬の濃度より高濃度である。 Further, the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent may each be a mixture of a phospholipid and the other component, or the first clotting time measuring reagent may be a first clotting time measuring reagent contained in a separate container. It may be composed of a partial reagent and a second partial reagent, and the second coagulation time measuring reagent may be composed of a third partial reagent and a fourth partial reagent stored in separate containers. When the first clotting time measuring reagent is a combination of the first partial reagent and the second partial reagent and the second clotting time measuring reagent is a combination of the third partial reagent and the fourth partial reagent, the first clotting time measuring reagent contains a phosphatidylserine-containing phospholipid. The phosphatidylserine concentration of the first and third partial reagents is 3 to 1000 μg / ml, preferably 30 to 100 μg / ml, more preferably 40 to 60 μg / ml for the first partial reagent, and 0 for the third partial reagent. It is preferable that the amount is contained so as to be 0.2 to 200 µg / ml, preferably 2 to 20 µg / ml, more preferably 6 to 10 µg / ml. However, the concentration of the first partial reagent is higher than the concentration of the third partial reagent.
また、第１部分試薬または第３部分試薬がホスファチジルエタノールアミンを含有する場合、ホスファチジルエタノールアミンの濃度が０．１〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは３〜１５μｇ／ｍｌである。第１部分試薬または第３部分試薬がホスファチジルコリンを含有する場合、ホスファチジルコリンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは３５〜８５μｇ／ｍｌである。 When the first partial reagent or the third partial reagent contains phosphatidylethanolamine, the concentration of phosphatidylethanolamine is 0.1 to 300 μg / ml, preferably 1 to 30 μg / ml, more preferably 3 to 15 μg / ml. It is. When the first partial reagent or the third partial reagent contains phosphatidylcholine, the concentration of phosphatidylcholine is 2 to 1000 μg / ml, preferably 20 to 100 μg / ml, more preferably 35 to 85 μg / ml.
より具体的には、活性化部分トロンボプラスチン時間測定の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬からなり、第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬と第４部分試薬からなるとともに、第１部分試薬及び第３部分試薬が活性化剤及びリン脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）を含有し、第２部分試薬及び第４部分試薬にカルシウムが含有するものが挙げられる。 More specifically, in the clotting time measuring reagent based on the principle of activated partial thromboplastin time measurement, the first clotting time measuring reagent is composed of the first partial reagent and the second partial reagent, and the second clotting time measuring reagent is the third partial reagent. The first and third partial reagents comprise an activator and a phospholipid (phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine), and the second and fourth partial reagents comprise a partial reagent and a fourth partial reagent. Containing calcium.
ラッセル蛇毒測定時間の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬及び第２時間凝固時間測定試薬にリン脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、蛇毒及びカルシウムを含有するものが挙げられる。 Coagulation time measuring reagents based on the principle of the Russell snake venom measurement time include those containing phospholipids (phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine), snake venom and calcium in the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent. No.
プロトロンビン時間測定の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬及び第２時間凝固時間測定試薬にリン脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、組織因子及びカルシウムを含有するものが挙げられる。 Coagulation time measuring reagents based on the principle of prothrombin time measurement include those containing phospholipids (phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine), tissue factor and calcium in the first and second time clotting time measuring reagents. No.
本発明の試薬キットは、以上のような組成を有する第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬におけるリン脂質総量に対するホスファチジルセリンの含有割合が異なることにより、凝固時間が異なる２種類の試薬の組合わせである。換言すると、ＰＳがＬＡで中和されることにより凝固時間に差異が表れるようにＰＳ含有量に差がある組合わせとすればよい。 The reagent kit of the present invention comprises two reagents having different clotting times due to the difference in the content of phosphatidylserine with respect to the total amount of phospholipids in the first and second clotting time measuring reagents having the above compositions. Is a combination of In other words, a combination having a difference in PS content may be used so that a difference in coagulation time appears when PS is neutralized by LA.
次に、上記構成を有する本発明の試薬キットを用いて、ＬＡを検出する方法について説明する。
まず検体試料を２つに分け、一方には高濃度のＰＳを含む第１凝固時間測定試薬を添加し、もう一方の検体試料には、低濃度のＰＳを含む第２凝固時間測定試薬を添加する。凝固時間測定試薬がそれぞれ第１部分試薬と第２部分試薬とに分かれている場合には、第１部分試薬と第２部分試薬とを混合してから、検体に添加してもよいし、まず第１部分試薬（又は第２部分試薬）を検体に添加した後、第２部分試薬（又は第１部分試薬）を添加してもよい。第１部分試薬又は第２部分試薬を別々に添加する場合、第１部分試薬（又は第２部分試薬）添加後、第２部分試薬（又は第１部分試薬）添加前に、必要に応じて検体と部分試薬の混合物を加熱してもよい。
検体に各試薬を添加した後、試料の凝固時間を測定する。凝固時間の測定は、当業者に公知の方法で行えばよく、公知の自動測定装置を用いて測定してもよい。
Next, a method for detecting LA using the reagent kit of the present invention having the above configuration will be described.
First, a sample sample is divided into two, and one is added with a first coagulation time measurement reagent containing high-concentration PS, and the other is added with a second coagulation time measurement reagent containing low-concentration PS. I do. When the coagulation time measuring reagent is divided into a first partial reagent and a second partial reagent, respectively, the first partial reagent and the second partial reagent may be mixed and then added to the sample. After adding the first partial reagent (or the second partial reagent) to the sample, the second partial reagent (or the first partial reagent) may be added. When the first partial reagent or the second partial reagent is separately added, the sample may be added as needed after the first partial reagent (or the second partial reagent) is added and before the second partial reagent (or the first partial reagent) is added. The mixture of and the partial reagent may be heated.
After adding each reagent to the sample, the coagulation time of the sample is measured. The measurement of the coagulation time may be performed by a method known to those skilled in the art, and may be measured using a known automatic measuring device.
ここで、検体に用いる試料としては、血液をそのまま用いるよりも血漿を用いることが好ましく、より好ましくは血小板除去血漿である。さらに好ましくは、患者の血漿に、正常血漿または血小板除去正常血漿を混合したものを試料とする。正常血漿を混合しておくことにより、凝固因子欠損に基づく凝固時間の延長を防止することができ、リン脂質依存性血液凝固検査の感度が高まるからである。患者血漿と正常血漿の混合比は、一般的に４：１乃至１：４であり、好ましくは１：１である。 Here, as a sample used for the specimen, it is preferable to use plasma rather than directly using blood, and more preferably, platelet-free plasma. More preferably, a mixture of a patient's plasma and normal plasma or platelet-free normal plasma is used as the sample. By mixing normal plasma, it is possible to prevent the coagulation time from being prolonged due to coagulation factor deficiency, thereby increasing the sensitivity of a phospholipid-dependent blood coagulation test. The mixing ratio between patient plasma and normal plasma is generally between 4: 1 and 1: 4, preferably 1: 1.
本発明の試薬キットを用いた凝固検査では、ＬＡ陽性患者、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者などの抗凝血疾患由来の試料の凝固時間は、正常血漿の凝固時間よりも長くなる。さらに、ＬＡ陽性患者検体については、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬による凝固時間の差異も認められる。すなわち、ＬＡ陽性患者由来の試料では、高濃度のＰＳを含む第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間よりも、低濃度のＰＳを含む第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間の方が長くなる。一方、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者由来の試料では、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との間で、凝固時間の顕著な差異は認められなかった。従って、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との凝固時間の差異に基づいて、ＬＡを特異的に検出することができる。 In the coagulation test using the reagent kit of the present invention, the coagulation time of a sample derived from an anticoagulant disease, such as an LA-positive patient, a patient with a blood coagulation factor deficiency, a patient with warfarin, or a patient with heparin, is longer than the coagulation time of normal plasma. become longer. Furthermore, for the LA-positive patient sample, a difference in the clotting time between the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent is also observed. That is, in the sample derived from the LA-positive patient, the clotting time when using the second clotting time measuring reagent containing a low concentration of PS is longer than the clotting time when using the first clotting time measuring reagent containing a high concentration of PS. The time is longer. On the other hand, in samples from blood coagulation factor deficient patients, warfarin-administered patients, and heparin-administered patients, no remarkable difference in the coagulation time was observed between the first and second coagulation time measuring reagents. Therefore, LA can be specifically detected based on the difference in clotting time between the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent.
ＬＡの検出は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬の差異によって判定することができるが、より高精度に判定するためには、正常血漿の凝固時間に対する患者由来の試料の凝固時間の比、例えばＲｏｓｎｅｒ Ｉｎｄｅｘ（Ｅ．Ｒｏｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍａｓｔ．１９８７，５７：１４４−１４９）またはＬｕｐｕｓ Ｒａｔｉｏ（ＬＲ）（Ｒ．Ｓｃｈｊｅｔｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９３，６９：２３９−２５０）により、判定を行うことが好ましい。
正常血漿の場合、ＰＳ含有率は凝固時間に影響を及ぼさないので、第１凝固時間試薬と第２凝固時間試薬の比に該当するＬＲ値は１程度である。また、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、またはヘパリン投与患者由来の場合であっても、正常血漿と比べて凝固時間は延長されるものの、ＰＳ濃度差による凝固時間の差はほとんど認められないため、ＬＲ値は１程度となる。これに対して、ＬＡ陽性の場合には、第１凝固時間測定試薬、第２凝固時間測定試薬の各濃度、組合わせにもよるが、第２凝固時間測定試薬の方が第１凝固時間測定試薬よりも凝固時間が延びるために、ＬＲ値を比較することによりＬＡ陽性患者由来の検体を自動的に検出することができる。
The detection of LA can be determined by the difference between the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent. However, in order to determine with higher accuracy, the clotting time of a sample derived from a patient relative to the clotting time of normal plasma is determined. Time ratios, for example, Rosner Index (E. Rosner, et al., Thromb. Haemast. 1987, 57: 144-149) or Lupus Ratio (LR) (R. Schjetlein, et al., Thromb. Res. 1993, 69). : 239-250).
In the case of normal plasma, the LR value corresponding to the ratio of the first clotting time reagent to the second clotting time reagent is about 1 because the PS content does not affect the clotting time. In addition, even when derived from blood coagulation factor deficient patients, warfarin-administered patients, or heparin-administered patients, coagulation time is prolonged compared to normal plasma, but there is almost no difference in coagulation time due to PS concentration difference Therefore, the LR value is about 1. On the other hand, in the case of LA positive, the second clotting time measuring reagent is more suitable for the first clotting time measuring reagent depending on the concentration and combination of the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent. Since the coagulation time is longer than that of the reagent, a sample derived from an LA-positive patient can be automatically detected by comparing the LR values.
実施例１
ヘペス、エラグ酸、トリス、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を混合し、第１部分試薬及び第３部分試薬を調製した。第１部分試薬の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＳが５０μｇ／ｍｌ、ＰＥが５０μｇ／ｍｌ、ＰＣが７０μｇ／ｍｌであり、各成分添加後のｐＨは７．３５である。また、第３部分試薬の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＳが１０μｇ／ｍｌ、ＰＥが５０μｇ／ｍｌ、ＰＣが７０μｇ／ｍｌであり、各成分添加後のｐＨは７．３５である。
また、塩化カルシウム濃度が２５ｍＭになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第４部分試薬とした。
正常血漿としてコアグトロールＮを用いた。１種類のヘパリン投与患者血漿、１種類の第ＶＩＩＩ因子欠乏患者血漿、４種類のワーファリン投与患者血漿、５種類のＬＡ陽性患者血漿を入手した。各患者血漿は、正常血漿と１：１で混合したものを測定試料とした。
正常血漿及び上記で調製した測定試料をそれぞれ５０μｌづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬（又は第３部分試薬）５０μｌを添加し、３７℃に３分間加温した後、各試料に第２部分試薬（又は第４部分試薬）を５０μｌづつ添加した。
全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて、凝固時間を測定した。測定は２回行い、平均値を求めた。
Example 1
Hepes, ellagic acid, Tris, phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylcholine (PC) were mixed to prepare a first partial reagent and a third partial reagent. The concentration of each component of the first partial reagent was 50 mM for hepes, 0.1 mM for ellagic acid, 25 mM for Tris, 50 μg / ml for PS, 50 μg / ml for PE, and 70 μg / ml for PC. pH is 7.35. The concentration of each component of the third partial reagent was 50 mM for hepes, 0.1 mM for ellagic acid, 25 mM for Tris, 10 μg / ml for PS, 50 μg / ml for PE, and 70 μg / ml for PC. The latter pH is 7.35.
Further, those prepared with purified water so that the calcium chloride concentration became 25 mM were used as the second partial reagent and the fourth partial reagent.
Coagtrol N was used as normal plasma. One type of heparin-administered patient plasma, one type of factor VIII-deficient patient plasma, four types of warfarin-administered patient plasma, and five types of LA-positive patient plasma were obtained. Each patient's plasma was mixed with normal plasma at a ratio of 1: 1 as a measurement sample.
Two sets of 50 μl each of normal plasma and the measurement sample prepared above were prepared, and 50 μl of the first partial reagent (or the third partial reagent) was added to each sample of one set, and the mixture was heated to 37 ° C. for 3 minutes. Thereafter, 50 μl of the second partial reagent (or the fourth partial reagent) was added to each sample.
The coagulation time was measured using a fully automatic blood coagulation analyzer Coagrex 800 (Shimadzu Corporation). The measurement was performed twice, and the average value was obtained.
各試料について測定した凝固時間から、下式１で示すＬｕｐｕｓ Ｒａｔｉｏ（ＬＲ）を算出した。ＬＲの計算は、文献（Ｒ．Ｓｃｈｊｅｔｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９３，６９：２３９−２５０）に基づく。
〔式１〕
Ｌｕｐｕｓ Ｒａｔｉｏ（ＬＲ）＝（ｂ／ａ）／（ｄ／ｃ）＝ｂｃ／ａｄ
ここで、式１中のａ、ｂ、ｃ、およびｄは、表１に示す組み合わせで得られた測定値を表す。
[Equation 1]
Lupus Ratio (LR) = (b / a) / (d / c) = bc / ad
Here, “a”, “b”, “c”, and “d” in Expression 1 represent measured values obtained by the combinations shown in Table 1.
各試料について測定した凝固時間及びＬＲ値を表２に示す。表２から、ＰＳ濃度が低い第２凝固時間測定試薬（Ｌ−ＡＰＴＴ試薬）を用いたときに得られたＬＡ陽性患者由来の試料の凝固時間は、ＰＳ濃度が高い第１凝固測定時間試薬（Ｈ−ＡＰＴＴ試薬）を用いたときと比較して、延長度合いが増加した。一方、ヘパリン投与患者、ワーファリン投与患者の試料の凝固時間は、Ｌ−ＡＰＴＴ試薬およびＨ−ＡＰＴＴ試薬のいずれを用いたときも同程度の延長度合いを示した。
また、表２から分かるように、ＬＲのカットオフ値を１．１としたとき、５例のＬＡ陽性患者検体は全て陽性と判定され、ヘパリン投与患者、ワーファリン投与患者、および第ＶＩＩＩ因子欠損患者は全て陰性と判定された。このように、低濃度のＰＳを含む凝固測定試薬と高濃度のＰＳを含むものとの２種類の試薬を用いることにより、簡便かつ精度高く、特異的にＬＡを検出することが可能になった。 As can be seen from Table 2, when the cut-off value of LR was 1.1, all five LA-positive patient samples were determined to be positive, and heparin-administered patients, warfarin-administered patients, and factor VIII-deficient patients. Were all judged negative. Thus, by using two types of reagents, a coagulation measurement reagent containing low-concentration PS and a reagent containing high-concentration PS, LA can be detected simply, accurately, and specifically. .
比較例１：
ＬＡテスト「グラデイポア」（医学生物研究所）を用法用量に従い、各検体試料について凝固時間を測定し、ＬＲ値を同様にして算出した。結果を表３に示す。
The coagulation time was measured for each sample according to the LA test "Gradeipore" (Medical Biological Laboratory) according to the usage, and the LR value was calculated in the same manner. Table 3 shows the results.
表３から、ＰＳ濃度が低い第１凝固時間測定試薬を用いたときに得られたＬＡ陽性患者由来の試料、ヘパリン投与患者、ワーファリン投与患者いずれの試料も凝固時間は、ＰＳ濃度が高い第２凝固測定時間試薬を用いたときと比較して、延長度合いが増加し、ＬＡ陽性患者特異的な凝固時間延長は認められなかった。
従って、実施例のＰＳの濃度のみを変えた第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬を組合わせた試薬キットによれば、ＬＡ陽性患者を、他の抗リン脂質依存性疾患から高感度で、容易に判別することができる。
From Table 3, it is found that the samples derived from the LA-positive patients, the heparin-administered patients, and the warfarin-administered patients obtained by using the first clotting time measuring reagent having a low PS concentration had the second clotting time having the high PS concentration. The degree of elongation was increased as compared with the case where the coagulation measurement time reagent was used, and no elongation of the coagulation time specific to LA-positive patients was observed.
Therefore, according to the reagent kit in which the first clotting time measuring reagent and the second clotting time measuring reagent in which only the concentration of PS is changed in the example, LA-positive patients can be highly induced from other antiphospholipid dependent diseases. The sensitivity can be easily determined.
Claims (19)
第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬及び第４部分試薬からなり、
第１部分試薬がホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有し、第１部分試薬中のホスファチジルセリン濃度が３〜１０００μｇ／ｍｌ、第３部分試薬がホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有し、第３部分試薬中のホスファチジルセリン濃度が０．２〜２００μｇ／ｍｌでり、第１部分試薬の濃度が第３部分試薬の濃度より高濃度である請求項１に記載の検出用試薬キット。 The first clotting time measuring reagent comprises a first partial reagent and a second partial reagent,
The second clotting time measuring reagent comprises a third partial reagent and a fourth partial reagent,
A first partial reagent containing a phospholipid containing phosphatidylserine, a phosphatidylserine concentration in the first partial reagent of 3 to 1000 μg / ml, a third partial reagent containing a phospholipid containing phosphatidylserine, The reagent kit for detection according to claim 1, wherein the concentration of phosphatidylserine in the solution is 0.2 to 200 µg / ml, and the concentration of the first partial reagent is higher than the concentration of the third partial reagent.
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