【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セリンプロテアーゼに対して阻害作用を有する新規なピリドン誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼは活性部位にセリン残基を有するペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１群及びＥＣ３．４．１６群）の総称である。セリンプロテアーゼを阻害する物質として、天然物では血漿中に含まれるα１−アンチキモトリプシンや、放線菌の生産するキモスタチンなどが知られており、合成化合物としてはジイソプロピルフルオロホスホリドなどのクロロメチルケトン誘導体や、ジイソプロピルフルオロホスフェートなどが知られているが、医薬品として実用化はされていない。
【０００３】
セリンプロテアーゼは様々な疾患と密接に関係している。
【０００４】
例えば、セリンプロテアーゼの一種であるカテプシンＧは、多形核白血球（ＰＭＮ）の顆粒中に主に発現され、ＰＭＮ脱顆粒の間に放出され、血小板凝集を刺激し、血管壁のプロテオグリカン、糖タンパク質、及びコラーゲンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、その阻害剤は、炎症及び前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）症状の治療及び予防に適すると考えられる。
【０００５】
また例えば好中球エラスターゼは、感染や炎症性疾患時に出現する好中球の顆粒から大量に放出されるセリンプロテアーゼであり、肺、軟骨、血管壁、皮膚などの生体内結合組織の間質を構成する蛋白質エラスチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンなどを分解する作用を有する。炎症部位でのエラスターゼの過剰放出による組織障害が関与する疾患として、例えば、慢性気管支炎、喘息、膵炎、腎炎、慢性関節リウマチなどの炎症疾患が知られている。従って、エラスターゼ阻害剤はこれらの疾患の治療あるいは予防に適すると考えられる。
【０００６】
また例えばキマーゼは、肥満細胞分泌顆粒中に見出されたセリンプロテアーゼであり、心臓、皮膚、肺、肝臓、腎皮質に多く分布している。ヒト心臓におけるアンジオテンシンＩＩの産生の８０％以上に関与している。また、エンドセリン生成過程、サブスタンスＰ、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）、アポ蛋白Ｂ等の多くの生理活性物質を基質とし、コラゲナーゼ等の他の生体内プロテアーゼの活性化にも関与している。更にはＡｐｏＡ−Ｉを基質とすることにより、コレステロールの逆転相系の阻害作用や、タイプＩＶコラーゲンやフィブロネクチンの細胞外基質を切断し、ヒスタミン等とともに血管透過性を亢進し、ヒスタミン作用を増強し、血清アルブミンからヒスタミン遊離ペプチドを生成し、また、ＩｇＧを限定分解し、白血球遊走因子を形成し、炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン−１βの前駆体を活性化する等の生体内作用をも有する。従って、キマーゼに対する阻害剤は、心血管障害治療剤、動脈硬化治療剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等治療及び予防に適すると考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
セリンプロテアーゼ阻害剤が上記のような疾患の治療薬として有効であると考えられるため、より効果の高く副作用の少ない化合物を求めて新規なセリンプロテアーゼ阻害剤の探索が行われている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような背景のもと、セリンプロテアーゼを阻害する低分子化合物を、微生物代謝産物から探索した結果、ペニシリウム属カビの培養液中より、 式（１ａ）
【化２】
および式（１ｂ）
【化３】
で表される新規なピリドン誘導体を見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下のものに関する。
〔１〕 式（１）
【化４】
（式中、Ｒは水素原子またはカルボキシル基を表す。）
で表される化合物またはその塩。
〔２〕 ペニシリウム属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩生産菌を培養して、その培養物から〔１〕記載の化合物またはその塩を採取する、〔１〕記載の化合物またはその塩の製造方法。
〔３〕 ペニシリウム属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩の生産菌がペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ−３２６２９株である、〔２〕記載の製造方法。
〔４〕 ペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ−３２６２９株。
〔５〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔６〕 セリンプロテアーゼが、カテプシンＧ、エラスターゼ、およびキマーゼからなる群から選ばれる酵素である、〔５〕記載のセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔７〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を含有する、前凝固、高血圧症、慢性気管支炎、膵炎、慢性関節リウマチ、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤。
【００１０】
式（１ａ）および式（１ｂ）の化合物は、本発明者らが佐賀県鹿島市の土壌より分離したカビＳＰＦ−３２６２９株を培養することにより、得ることができる。
【００１１】
ＳＰＦ−３２６２９株は次のような菌学的性質を有する。
【００１２】
オートミール寒天培地（日本製薬社製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は早く、２７℃、１４日で直径５．４ｃｍ、ビロード状を呈する。コロニー表面には無色の菌糸と緑色の分生子が認められる。コロニー裏面は白色を呈する。分生子果の形成が豊富に認められ、子嚢果の形成、可溶性色素の産生は認められない。コーンミール寒天培地上では、コロニーの生育は比較的早く、２７℃、１４日で直径５．１ｃｍ、ビロード状を呈する。コロニー表面には無色の菌糸と緑色の分生子が認められる。コロニー裏面は白色を呈する。分生子果の形成が豊富に認められ、子嚢果の形成、可溶性色素の産生は認められない。麦芽エキス寒天培地上では、コロニーの生育はやや遅く、２７℃、１４日で直径３．８ｃｍ、やや盛り上がり、菌糸が豊富でビロード状を呈する。コロニー表面の色は中央が薄い黄色、中央を囲むように白くなり、周縁部は黄色である。コロニー裏面の色は中央がクリーム色で、周縁部が黄色である。分生子果の形成が少し認められるが、可溶性色素の産生および子嚢果の形成は認められない。ポテトデキストロース寒天培地上では、コロニーの生育は遅く、２７℃、１４日で直径３．１ｃｍ、やや盛り上がり、菌糸が豊富でビロード状を呈する。コロニー表面の色は中央が薄い黄色、中央を囲むように白くなり、周縁部は黄色である。コロニー裏面の色は中央が橙色で、周縁部が黄色である。分生子果の形成が少し認められるが、可溶性色素の産生および子嚢果の形成は認められない。
【００１３】
麦芽エキス寒天上で２７℃、２０日間培養した時の形態は次の通りである。分生子柄は長さ１００〜３００μｍで、ペニシリは、３〜４本のメトレの先端に３〜７本のフィアライドが生じる複輪生体対称型である。フィアライドの先端から分生子が５０〜１００個の連鎖を形成する。分生子は楕円形で、短径１．０〜１．５μｍ、長径２．０〜２．５μｍ、表面はしわ状である。コロニー周縁部では単輪生体もわずかに認められる。テレオモルフは認められない。
【００１４】
以上の菌学的性質より、本菌株は不完全菌亜門に分類され、ペニシリウム属に属する菌株であると同定し、ペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ−３２６２９と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０６）。
【００１５】
上記カビの培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養または通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては例えばグルコース、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、アミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。
【００１６】
培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、さらに好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度が挙げられる。培養期間としては例えば、５〜１５日間の範囲が挙げられる。培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲が挙げられる。
【００１７】
培養液から式（１ａ）および式（１ｂ）で表される化合物を単離するには、微生物の生産する二次代謝物の培養液から、通常使用される単離手段が使用できる。培養液上清中からの単離法としては、培養濾液からの通常の単離法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法または吸着もしくは分配クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。これらの単離法は単独または組み合わせて行うことができる。また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や薄層クロマトグラフィーなどにより単離精製できる。培養菌体から目的物を単離する場合は、ろ過もしくは遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができる。抽出物は培養上清からの単離精製と同様の方法で、目的物を得ることができる。
【００１８】
前記式（１）で表される化合物またはその塩には水やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００１９】
前記式（１）で表される化合物は、常法に従いその薬学的に許容される塩とすることができる。このような塩としては塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との酸付加塩、ギ酸、酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、炭酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基との塩、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、ピリジン、リジン等の有機塩基との塩を挙げることができる。
【００２０】
また、前記式（１）で表される化合物またはその塩は不斉炭素原子を含み立体異性体が存在するが、それらには各異性体の混合物や単離されたものを含む。
【００２１】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、経口的または非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、その溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。前記の適当な投与剤型は、例えば、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分を配合することにより製造することができる。また、薬学的に許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００２２】
投与量および投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、経口投与の場合は、通常、成人の一日当たり投与量は０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇの範囲で選択すればよい。
【００２３】
【実施例】
実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
式（１ａ）および式（１ｂ）で表される化合物の取得
グルコース２％、ショ糖５％、綿実粉２％、硝酸ナトリウム０．１％、Ｌ−ヒスチジン０．１％、リン酸２カリウム０．０５％、塩化カリウム０．０７％および硫酸マグネシウム７水和物０．００１４％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地８０ｍＬを５００ｍＬ容量の坂口フラスコに分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したペニシリウム・エスピーＳＰＦ−３２６２９株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター；受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０６）を１白金接種し、２７℃、１３０ｒｐｍにて３日間振盪培養し、前培養液とした。上記と同じ組成の培地３００ｍＬを分注し、オートクレーブ滅菌した２Ｌ容量坂口フラスコ１６本のそれぞれに、前培養液を７ｍＬずつ植菌し、２７℃、１１５ｒｐｍで１１日間振とう培養した。
【００２５】
培養終了後、培養液を集め、アセトン５Ｌを加え、２時間攪拌抽出した。８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により得られる上清から、減圧下アセトンを留去して水溶液残渣を得た。この水溶液残渣を、ろ紙を用いたろ過により、ろ上物とろ液に分けた。ろ液をＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製５．０φ×２５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、蒸留水１．５Ｌ、２５％メタノール１．５Ｌ、５０％メタノール１．５Ｌ、７５％メタノール１．５Ｌ、１００％メタノール１．５Ｌ、１００％アセトン１．５Ｌを用いて順次溶出した。
【００２６】
１００％アセトン溶出画分をろ上物と混合して減圧濃縮し、５００ｍｇの黄色粗精製物を得た。これを５０ｍＬのクロロホルムに溶解し、シリカゲル（メルク社製キーゼルゲル６０、７０〜２３０メッシュ、３．５φ×２５ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付した。クロロホルム３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの９７：３混合液３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの９５：５混合液３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの９０：１０混合液３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの８０：２０混合液３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの７０：３０混合液３００ｍＬを用いて順次溶出した。クロロホルムとメタノールの８０：２０混合液と７０：３０混合液を併せ、減圧濃縮し粗精製物１０９ｍｇを得た。これをジメチルスルホキシドとメタノールの等量混合液３ｍＬに溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を３回行った。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（３０φ×５０ｍｍと３０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル、Ｂ液割合５５％一定、流速：１０ｍＬ／分、検出：２５４ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間８１分から８７分の溶出画分を分取した。これを減圧濃縮することによって、ＳＰＦ−３２６２９−１（２１．６ｍｇ）を得た。
【００２７】
一方、上記ＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製５．０φ×２５．０ｃｍ）を用いたカラムクロマトグラフィーの１００％メタノール溶出画分１．５Ｌを減圧濃縮し、４ｇの黄色粗精製物を得た。これを５０ｍＬのメタノールに溶解して、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（４．６φ×４８ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した。１フラクションあたり３０ｍＬとなるように分画し、フラクション１１から１５を減圧濃縮し、１．５ｇの黄色粗精製物を得た。これを１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、シリカゲル（メルク社製キーゼルゲル６０、７０〜２３０メッシュ、３．５φ×２２ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付した。クロロホルム１００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの９８：２混合液３００ｍＬ、クロロホルムとメタノールの９５：５混合液３００ｍＬを用いて順次溶出し、１フラクションが２０ｍＬとなるように分取した。クロロホルムとメタノールの９５：５混合液の溶出画分１から溶出画分１５のうち、溶出画分１１から溶出画分１５までを集め、減圧濃縮して薄黄色の粗精製物を１５０ｍｇ得た。これをメタノール２ｍＬに溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を２回行った。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧｐｒｅｐ（３０φ×５０ｍｍと３０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル、Ｂ液割合３７％一定、流速：１０ｍＬ／分、検出：２５４ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間６６分から７３分の溶出画分を分取した。これを減圧濃縮することによって、ＳＰＦ−３２６２９−２（２９．８ｍｇ）を得た。
【００２８】
化合物ＳＰＦ−３２６２９−１の物理化学的性状は以下のようであった。
【表１】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：淡黄色粉末
分子量：３４５
分子式：Ｃ１８Ｈ１９ＮＯ６
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：３４６（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：３４４（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：３４６．１２９１
計算値：３４６．１２９１（Ｃ１８Ｈ２０ＮＯ６）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
２０３（１６５００）、２１５ｓｈ（１３９００）、３０３（６３００）
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２４７、３０９３、２９６４、１７４８、１６４３、１６１７、１４６６
１Ｈ―ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δｐｐｍ：
０．９２（６Ｈ，ｄ，６．５）、２．１５（１Ｈ，ｍ）、２．４１（２Ｈ，ｄ，６．８）、６．３８（１Ｈ，ｓ）、６．７６（１Ｈ，ｓ）、７．４３（３Ｈ，ｄ，６．３）、７．５７（２Ｈ，ｄ，６．３）、１３．５１（１Ｈ，ｂｒｓ）
１３Ｃ―ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δｐｐｍ：
２２．５（２Ｃ）、２６．３、４３．３、７３．４、９６．７、１００．２、１２８．１（２Ｃ）、１２９．５（２Ｃ）、１２９．８、１３６．８、１５３．２、１６６．４、１７１．４、１７２．８、１７５．１
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−３２６２９−１の構造式を：
【化５】
と決定した。
【００２９】
また、化合物ＳＰＦ−３２６２９−２の物理化学的性状は以下のようであった。
【表２】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：淡黄色粉末
分子量：３０１
分子式：Ｃ１７Ｈ１９ＮＯ４
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：３０２（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：３００（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：３０２．１３９２
計算値：３０２．１３９２（Ｃ１７Ｈ２０ＮＯ４）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
２０６（２２２００）、２８６（４３００）
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２４７、３０９９、２９６４、１７４８、１６４３、１６２４、１４５８
１Ｈ―ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：
０．８８（３Ｈ，ｄ，６．７）、０．８９（３Ｈ，ｄ，６．７）、２．０８（１Ｈ，ｍ）、２．３２（２Ｈ，ｄ，７．０）、６．０９（１Ｈ，ｓ）、６．２３（１Ｈ，ｓ）、６．６３（１Ｈ，ｓ）、７．３２（１Ｈ，ｍ）、７．３３（２Ｈ，ｍ）、７．３４（２Ｈ，ｍ）
１３Ｃ―ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：
２２．２、２２．３、２５．６、４３．０、７２．８、９７．７、１０４．１、１２７．２（２Ｃ）、１２９．１（２Ｃ）、１２９．５、１３５．３、１４８．４、１６４．４、１７１．４、１７２．１
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−３２６２９−２の構造式を：
【化６】
と決定した。
【００３０】
実施例２ ヒト好中球由来カテプシンＧ阻害活性の測定
カテプシンＧ阻害活性の測定には、ヒト好中球由来カテプシンＧ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、カタログ番号１９１３４４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（式中、Ｓｕｃはスクシニル基を、ＭＣＡは４−メチルクマリン−７−イルアミノ基を表す。以下同じ。）（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１．６Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１μｇ／ｍＬヒト好中球由来カテプシンＧおよびジメチルスルホキシド１．０μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド１．０μＬを添加した反応系１００μＬで３７℃、１２０分間反応をおこなった。ヒト好中球由来カテプシンＧにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表３】
【００３１】
実施例３ ヒト好中球由来エラスターゼ阻害活性の測定
エラスターゼ阻害活性の測定には、ヒト好中球由来エラスターゼ（Ａｔｈｅｎｓ研究所社製、製品番号１６−１４−０５１２００）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡ（式中、Ｓｕｃ（ＯＭｅ）はメトキシスクシニル基を表す。以下同じ。）（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１５３−ｖ）を用いた。即ち、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ塩化カルシウム、１００μＭＳｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡ、０．３μｇ／ｍＬヒト好中球由来エラスターゼおよびジメチルスルホキシド１．０μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド１．０μＬを添加した反応系１００μＬで３７℃、１２０分間反応をおこなった。ヒト好中球由来エラスターゼにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表４】
【００３２】
実施例４
ヒトキマーゼ阻害活性の測定
ヒトキマーゼ阻害活性の測定には、ヒト皮膚由来キマーゼ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ社製、カタログ番号ＨＳ２１４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１５０ｎｇ／ｍＬ ヒト皮膚由来キマーゼおよびジメチルスルホキシド０．５μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド０．５μＬを添加した反応系５０μＬで室温、５時間反応をおこなった。ヒト皮膚由来キマーゼにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表５】
【００３３】
【発明の効果】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有し、前凝固、高血圧症、慢性気管支炎、膵炎、慢性関節リウマチ、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤として有用である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel pyridone derivative having an inhibitory effect on serine protease.
[0002]
[Prior art]
Serine protease is a general term for peptidases having a serine residue in the active site (EC 3.4.21 group and EC 3.4.16 group). As a substance that inhibits serine protease, α1-antichymotrypsin contained in plasma as a natural product, chymostatin produced by actinomycetes, and the like are known, and chloromethyl ketone derivatives such as diisopropylfluorophosphoride as synthetic compounds are known. And diisopropylfluorophosphate are known, but have not been put to practical use as pharmaceuticals.
[0003]
Serine proteases are closely related to various diseases.
[0004]
For example, cathepsin G, a type of serine protease, is mainly expressed in granules of polymorphonuclear leukocytes (PMN) and released during PMN degranulation, stimulating platelet aggregation, proteoglycans on vascular walls, glycoproteins , And a serine protease that hydrolyzes collagen, whose inhibitors are thought to be suitable for the treatment and prevention of inflammatory and procoagulant symptoms.
[0005]
In addition, for example, neutrophil elastase is a serine protease that is released in large amounts from neutrophil granules that appear during infection or inflammatory disease, and is responsible for the interstitial tissue of in vivo connective tissues such as lung, cartilage, vascular wall, and skin. It has an action of decomposing the constituent proteins elastin, collagen, proteoglycan, fibronectin and the like. As diseases involving tissue damage due to excessive release of elastase at an inflammatory site, for example, inflammatory diseases such as chronic bronchitis, asthma, pancreatitis, nephritis, and rheumatoid arthritis are known. Therefore, it is considered that elastase inhibitors are suitable for treating or preventing these diseases.
[0006]
Chymase, for example, is a serine protease found in mast cell secretory granules and is widely distributed in heart, skin, lung, liver, and renal cortex. It is responsible for more than 80% of the production of angiotensin II in the human heart. In addition, many physiologically active substances such as endothelin production process, substance P, bathoactive intestinal polypeptide (VIP), and apoprotein B are used as substrates, and also involved in activation of other in vivo proteases such as collagenase. are doing. Furthermore, by using ApoA-I as a substrate, the inhibitory effect of the reverse phase system of cholesterol and the cleavage of the extracellular matrix of type IV collagen and fibronectin, vascular permeability is enhanced together with histamine and the like, and histamine action is enhanced. In vivo actions such as generating histamine-releasing peptide from serum albumin, limiting the degradation of IgG, forming leukocyte chemotactic factor, and activating the precursor of interleukin-1β, one of the inflammatory cytokines It also has Therefore, an inhibitor of chymase is considered to be suitable for treatment and prevention such as a therapeutic agent for cardiovascular disorders, a therapeutic agent for arteriosclerosis, an anti-inflammatory agent and an anti-allergic agent.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Since a serine protease inhibitor is considered to be effective as a therapeutic agent for the above-mentioned diseases, a search for a novel serine protease inhibitor has been conducted in search of a compound that is more effective and has fewer side effects.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Under such a background, the present inventors have searched for a low-molecular-weight compound that inhibits serine protease from microbial metabolites. As a result, the following formula (1a) was obtained from a culture of Penicillium mold.
Embedded image
Embedded image
[0009]
That is, the present invention relates to the following.
[1] Equation (1)
Embedded image
Or a salt thereof.
[2] The compound according to [1] or a salt thereof, wherein the compound according to [1] or a salt-producing bacterium belonging to the genus Penicillium is cultured, and the compound or salt thereof according to [1] is collected from the culture. Manufacturing method.
[3] The method according to [2], wherein the bacterium producing the compound according to [1] or a salt thereof belonging to the genus Penicillium is Penicillium sp. SPF-32629 strain.
[4] Penicillium sp. SPF-32629 strain.
[5] A serine protease inhibitor comprising the compound of [1] or a salt thereof as an active ingredient.
[6] The serine protease inhibitor according to [5], wherein the serine protease is an enzyme selected from the group consisting of cathepsin G, elastase, and chymase.
[7] Precoagulation, hypertension, chronic bronchitis, pancreatitis, rheumatoid arthritis, heart failure, ischemic peripheral circulation disorder, myocardial ischemia, myocardial ischemia, venous dysfunction, myocardial infarction containing the compound or salt thereof according to [1]. Later progression of heart failure, diabetic nephropathy, nephritis, arteriosclerosis, hyperaldosteronism, scleroderma, glomerulosclerosis, renal failure, Alzheimer's disease, memory deficiency, depression, sensory dysfunction, anxiety, tension symptoms, Therapeutic agent for discomfort mental state, glaucoma, ocular hypertension, restenosis after PTCA, asthma, rhinitis, or allergic disease.
[0010]
The compounds of formulas (1a) and (1b) can be obtained by the present inventors by culturing mold SPF-32629 strain isolated from soil in Kashima city, Saga prefecture.
[0011]
The SPF-32629 strain has the following mycological properties.
[0012]
On an oatmeal agar medium (actinomycete medium No. 3 “Digo” manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), the colony grows rapidly and exhibits a 5.4 cm diameter and velvety shape at 27 ° C. for 14 days. Colorless hyphae and green conidia are observed on the colony surface. The back of the colony is white. The formation of conidia is abundant, and the formation of ascocarps and the production of soluble pigment are not observed. On the cornmeal agar medium, the colony grows relatively quickly and shows a velvety diameter of 5.1 cm at 14 days at 27 ° C. Colorless hyphae and green conidia are observed on the colony surface. The back of the colony is white. The formation of conidia is abundant, and the formation of ascocarps and the production of soluble pigment are not observed. On the malt extract agar medium, the growth of the colonies is rather slow, and at 27 ° C. for 14 days, the diameter is 3.8 cm, slightly swelling, rich in hyphae, and presents a velvety shape. The color of the colony surface is light yellow at the center, white around the center, and yellow at the periphery. The color of the back of the colony is cream at the center and yellow at the periphery. The formation of conidia is slightly observed, but the production of soluble pigment and the formation of ascocarp are not observed. On the potato dextrose agar medium, the growth of the colonies is slow, 3.1 cm in diameter and slightly swelled at 27 ° C. and 14 days, rich in hyphae and appearing velvety. The color of the colony surface is light yellow at the center, white around the center, and yellow at the periphery. The color of the back of the colony is orange at the center and yellow at the periphery. The formation of conidia is slightly observed, but the production of soluble pigment and the formation of ascocarp are not observed.
[0013]
The form when cultured on malt extract agar at 27 ° C. for 20 days is as follows. The conidiophores are 100-300 μm in length, and penicillium is a bicyclic biosymmetric type in which 3-7 phialides are formed at the tips of 3-4 metres. Conidia form a chain of 50 to 100 from the tip of the phialide. The conidium is elliptical, having a minor axis of 1.0 to 1.5 μm, a major axis of 2.0 to 2.5 μm, and a wrinkled surface. Slight single-wheeled organisms are also found at the colony periphery. Teleomorphs are not allowed.
[0014]
Based on the above bacteriological properties, this strain is classified as incomplete subphylum, identified as a strain belonging to the genus Penicillium, named Penicillium sp. SPF-32629, and Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary (Accession date: June 25, 2002; Accession number FERM P-18906).
[0015]
The medium used for culturing the mold may be liquid or solid, but usually, shaking culture or aeration and stirring culture using a liquid medium is advantageous. The medium to be used is not particularly limited.Examples of the carbon source include glucose, sucrose, glycerin, starch, dextrin, molasses, and the like.The nitrogen source includes proteins such as peptone and casamino acid. Organic nitrogen sources such as hydrolysates, meat extracts, yeast extracts, soybean flour, cottonseed flour, corn steep liquor, amino acids and the like, and inorganic nitrogen sources such as ammonium salts and nitrates are used. In addition, inorganic salts such as various phosphates, magnesium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, and calcium carbonate can be added for osmotic pressure adjustment, pH adjustment, replenishment of trace components, and the like. Further, various vitamins, nucleic acid-related compounds and the like may be added for the purpose of promoting the growth of bacteria. During the culture period, it is also possible to add an antifoaming agent such as silicone oil, a polypropylene glycol derivative, and soybean oil.
[0016]
The culture temperature is preferably in the range of 20 to 35 ° C, more preferably in the range of 25 to 30 ° C. The culturing period includes, for example, a range of 5 to 15 days. Examples of the pH of the medium include a range around neutrality.
[0017]
In order to isolate the compounds represented by the formulas (1a) and (1b) from the culture solution, a commonly used isolation means can be used from the culture solution of the secondary metabolite produced by the microorganism. The isolation method from the culture supernatant may be a conventional isolation method from a culture filtrate, for example, a solvent extraction method, an ion exchange resin method, or adsorption or partition chromatography and gel filtration chromatography. These isolation methods can be performed alone or in combination. It can be isolated and purified by high performance liquid chromatography (HPLC) or thin layer chromatography. When the target substance is isolated from the cultured cells, the cells collected by means such as filtration or centrifugation can be directly extracted using a water-soluble organic solvent such as acetone. The target product can be obtained from the extract in the same manner as in the isolation and purification from the culture supernatant.
[0018]
The compound represented by the formula (1) or a salt thereof includes a solvate with a pharmaceutically acceptable solvent such as water or ethanol.
[0019]
The compound represented by the formula (1) can be converted to a pharmaceutically acceptable salt thereof according to a conventional method. Such salts include acid addition salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid. Acid addition salts with organic acids such as acids, propionic acid, citric acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, carbonic acid, glutamic acid, and aspartic acid, and sodium salts And salts with inorganic bases such as potassium salt and calcium salt, and salts with organic bases such as triethylamine, piperidine, morpholine, pyridine and lysine.
[0020]
The compound represented by the formula (1) or a salt thereof has an asymmetric carbon atom and has stereoisomers, and these include a mixture of the isomers and an isolated one.
[0021]
The compound represented by the formula (1) or a salt thereof can be administered orally or parenterally. That is, it can be orally administered in a commonly used dosage form such as a powder, granule, capsule, syrup, suspension or the like, or, for example, a solution, emulsion, suspension or the like thereof. The mold can be administered parenterally in the form of injections. It can also be administered intranasally in the form of a spray. The above-mentioned suitable dosage form can be produced, for example, by mixing the active ingredient with an acceptable usual carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent and the like. Also, pharmaceutically acceptable buffers, solubilizing agents, isotonic agents and the like can be added.
[0022]
The dose and the number of times of administration vary depending on the administration method and the age, body weight, medical condition, etc. of the patient. In the case of oral administration, the daily adult dose is usually 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 500 mg. You can select it with.
[0023]
【Example】
The present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
[0024]
Example 1
Acquisition of compounds represented by formulas (1a) and (1b) Glucose 2%, sucrose 5%, cottonseed powder 2%, sodium nitrate 0.1%, L-histidine 0.1%, dipotassium phosphate 80 mL of a medium containing 0.05%, 0.07% of potassium chloride, and 0.0014% of magnesium sulfate heptahydrate and adjusted to pH 7.0 was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask and sterilized in an autoclave. One platinum inoculation of Penicillium sp. SPF-32629 strain (incorporated administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary; accession date: June 25, 2002; accession number FERM P-18906), which was cultured on a slope, Shaking culture was performed at 27 ° C. and 130 rpm for 3 days to obtain a pre-culture solution. 300 mL of a medium having the same composition as above was dispensed, and 7 mL of the pre-cultured solution was inoculated into each of 16 autoclave-sterilized 16-L Sakaguchi flasks and shake-cultured at 27 ° C and 115 rpm for 11 days.
[0025]
After completion of the culture, the culture was collected, 5 L of acetone was added, and the mixture was extracted with stirring for 2 hours. Acetone was distilled off from the supernatant obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes under reduced pressure to obtain an aqueous solution residue. This aqueous solution residue was separated into a filtrate and a filtrate by filtration using filter paper. The filtrate was subjected to column chromatography using DIAION ™ HP-20 (5.0φ × 25.0 cm, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and 1.5 L of distilled water, 1.5 L of 25% methanol, 1.5 L of 50% methanol, Elution was performed sequentially using 1.5 L of 75% methanol, 1.5 L of 100% methanol, and 1.5 L of 100% acetone.
[0026]
The fraction eluted with 100% acetone was mixed with the filtrate and concentrated under reduced pressure to obtain 500 mg of a crude yellow crude product. This was dissolved in 50 mL of chloroform, and subjected to column chromatography using silica gel (Kieselgel 60, manufactured by Merck, 70 to 230 mesh, 3.5 φ × 25 cm). 300 mL of chloroform, 300 mL of a 97: 3 mixture of chloroform and methanol, 300 mL of a 95: 5 mixture of chloroform and methanol, 300 mL of a 90:10 mixture of chloroform and methanol, 300 mL of a 80:20 mixture of chloroform and methanol, chloroform and methanol Were sequentially eluted using 300 mL of a 70:30 mixed solution. An 80:20 mixture of chloroform and methanol and a 70:30 mixture were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 109 mg of a crude product. This was dissolved in 3 mL of an equal volume mixture of dimethyl sulfoxide and methanol, and 1 mL was subjected to reverse phase HPLC three times. The conditions for the reverse phase HPLC were as follows: column: Wakopak ™ Wakosil-II 5C18HGprep (connecting 30φ × 50mm and 30φ × 250mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), eluent A: 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution, eluent B: Acetonitrile, solution B ratio was constant at 55%, flow rate: 10 mL / min, detection: absorbance at 254 nm. An eluted fraction with a retention time of 81 to 87 minutes was collected. This was concentrated under reduced pressure to obtain SPF-326629-1 (21.6 mg).
[0027]
On the other hand, 1.5 L of a 100% methanol eluted fraction of column chromatography using the above DIAION ™ HP-20 (5.0φ × 25.0 cm, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) was concentrated under reduced pressure to obtain 4 g of a crude yellow purified product. Was. This was dissolved in 50 mL of methanol, subjected to column chromatography using Sephadex ™ LH-20 (Amersham Pharmacia Biotech) (4.6 φ × 48 cm), and eluted with methanol. Fractionation was performed so as to be 30 mL per fraction, and fractions 11 to 15 were concentrated under reduced pressure to obtain 1.5 g of a crude yellow purified product. This was dissolved in 15 mL of chloroform and subjected to column chromatography using silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh, 3.5φ × 22 cm, manufactured by Merck). Elution was performed sequentially using 100 mL of chloroform, 300 mL of a 98: 2 mixture of chloroform and methanol, and 300 mL of a 95: 5 mixture of chloroform and methanol, and fractionated so that one fraction became 20 mL. From elution fraction 1 to elution fraction 15 of a 95: 5 mixture of chloroform and methanol, elution fractions 11 to 15 were collected and concentrated under reduced pressure to obtain 150 mg of a pale yellow crude product. The operation of dissolving this in 2 mL of methanol and subjecting 1 mL to reverse phase HPLC was performed twice. The conditions for the reverse phase HPLC were as follows: column: Wakopak ™ Wakosil-II 5C18HGprep (connecting 30φ × 50mm and 30φ × 250mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), eluent A: 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution, eluent B: Acetonitrile, the solution B ratio was constant at 37%, the flow rate was 10 mL / min, and the detection was the absorbance at 254 nm. An eluted fraction with a retention time of 66 minutes to 73 minutes was collected. This was concentrated under reduced pressure to obtain SPF-32629-2 (29.8 mg).
[0028]
The physicochemical properties of compound SPF-326629-1 were as follows.
[Table 1]
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Appearance: pale yellow powder molecular weight: 345
Molecular formula: C 18 H 19 NO 6
Fast electron impact mass spectrum (FAB-MS) m / z (positive): 346 (M + H) +
Fast electron impact mass spectrum (FAB-MS) m / z (negative): 344 (M−H) −
High-resolution high-speed electron impact mass spectrum (HRFAB-MS) m / z (M + H) + :
Found: 346.11291
Calculated: 346.1291 (C 18 H 20 NO 6)
UV-visible absorption spectrum λmax (in methanol) nm (ε):
203 (16500), 215sh (13900), 303 (6300)
Infrared absorption spectrum νmax (KBr) cm -1 :
3247, 3093, 2964, 1748, 1643, 1617, 1466
1 H-NMR (acetone-d 6 ) δ ppm:
0.92 (6H, d, 6.5), 2.15 (1H, m), 2.41 (2H, d, 6.8), 6.38 (1H, s), 6.76 (1H, s), 7.43 (3H, d, 6.3), 7.57 (2H, d, 6.3), 13.51 (1H, brs)
13 C-NMR (acetone-d 6 ) δ ppm:
22.5 (2C), 26.3, 43.3, 73.4, 96.7, 100.2, 128.1 (2C), 129.5 (2C), 129.8, 136.8, 153 .2, 166.4, 171.4, 172.8, 175.1
Solubility: insoluble in water, hexane, soluble in methanol and DMSO .――――――――――――――――――――――――――――――――――
From these, the structural formula of compound SPF-32629-1 is:
Embedded image
It was decided.
[0029]
The physicochemical properties of Compound SPF-32629-2 were as follows.
[Table 2]
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
Appearance: pale yellow powder molecular weight: 301
Molecular formula: C 17 H 19 NO 4
Fast electron impact mass spectrum (FAB-MS) m / z (positive): 302 (M + H) +
Fast electron impact mass spectrum (FAB-MS) m / z (negative): 300 (M−H) −
High-resolution high-speed electron impact mass spectrum (HRFAB-MS) m / z (M + H) + :
Obtained value: 302.1392
Calculated: 302.1392 (C 17 H 20 NO 4)
UV-visible absorption spectrum λmax (in methanol) nm (ε):
206 (22200), 286 (4300)
Infrared absorption spectrum νmax (KBr) cm -1 :
3247, 3099, 2964, 1748, 1643, 1624, 1458
1 H-NMR (CDCl 3 ) δ ppm:
0.88 (3H, d, 6.7), 0.89 (3H, d, 6.7), 2.08 (1H, m), 2.32 (2H, d, 7.0), 6. 09 (1H, s), 6.23 (1H, s), 6.63 (1H, s), 7.32 (1H, m), 7.33 (2H, m), 7.34 (2H, m) )
13 C-NMR (CDCl 3 ) δ ppm:
22.2, 22.3, 25.6, 43.0, 72.8, 97.7, 104.1, 127.2 (2C), 129.1 (2C), 129.5, 135.3, 148.4, 164.4, 171.4, 172.1
Solubility: insoluble in water, hexane, soluble in methanol and DMSO .――――――――――――――――――――――――――――――――――
From these, the structural formula of compound SPF-32629-2 is
Embedded image
It was decided.
[0030]
Example 2 Measurement of human neutrophil-derived cathepsin G inhibitory activity For measurement of cathepsin G inhibitory activity, human neutrophil-derived cathepsin G (manufactured by ICN Biomedicals, catalog number 191344) was used. As a substrate, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (where Suc represents a succinyl group and MCA represents a 4-methylcoumarin-7-ylamino group. The same applies hereinafter) (manufactured by Peptide Research Institute, Inc.) Catalog number 3114-v) was used. That is, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 1.6 M sodium chloride, 100 μM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA, 1 μg / mL human neutrophil-derived cathepsin G and dimethyl sulfoxide 1.0 μL or The reaction was performed at 37 ° C. for 120 minutes in 100 μL of the reaction system to which 1.0 μL of dimethyl sulfoxide containing the test inhibitor was added. The amount of 7-amino-4-methylcoumarin released from the substrate after being cleaved by human neutrophil-derived cathepsin G, the inhibitory activity is measured by measuring the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm, The concentration of inhibitor required to inhibit the enzyme activity by 50% (IC 50 ) was determined. The results were as follows.
[Table 3]
[0031]
Example 3 Measurement of Human Neutrophil-Derived Elastase Inhibitory Activity For the measurement of elastase inhibitory activity, human neutrophil-derived elastase (manufactured by Athens Laboratories, product number 16-14-051200) was used. As a substrate, Suc (OMe) -Ala-Ala-Pro-Val-MCA (where Suc (OMe) represents a methoxysuccinyl group; the same applies hereinafter) (Cat. No. 3153-v, manufactured by Peptide Research Institute) Was used. That is, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 2 mM calcium chloride, 100 μM Suc (OMe) -Ala-Ala-Pro-Val-MCA, 0.3 μg / mL human neutrophil-derived elastase and 1.0 μL of dimethyl sulfoxide Alternatively, the reaction was performed at 37 ° C. for 120 minutes in 100 μL of a reaction system to which 1.0 μL of dimethyl sulfoxide containing the test inhibitor was added. The amount of 7-amino-4-methylcoumarin released from the substrate after being cleaved by human neutrophil-derived elastase was measured, and the inhibitory activity was measured by measuring the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm. The concentration of the inhibitor required to inhibit the activity by 50% (IC 50 ) was determined. The results were as follows.
[Table 4]
[0032]
Example 4
Measurement of Human Chymase Inhibitory Activity For the measurement of human chymase inhibitory activity, human skin-derived chymase (Elastin Product, catalog number HS214) was used. Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (Cat. No. 3114-v, manufactured by Peptide Research Laboratories) was used as a substrate. That is, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 3 M sodium chloride, 100 μM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA, 150 ng / mL chymase derived from human skin and 0.5 μL of dimethyl sulfoxide or a test inhibitor are contained. The reaction was carried out at room temperature for 5 hours in 50 μL of the reaction system to which 0.5 μL of dimethyl sulfoxide was added. The amount of 7-amino-4-methylcoumarin released from the substrate after being cleaved by human skin-derived chymase was measured for its inhibitory activity by measuring the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm, and the enzyme activity was measured. The concentration of the inhibitor required for 50% inhibition (IC 50 ) was determined. The results were as follows.
[Table 5]
[0033]
【The invention's effect】
The compound represented by the formula (1) or a salt thereof has a serine protease inhibitory activity, and has precoagulation, hypertension, chronic bronchitis, pancreatitis, rheumatoid arthritis, heart failure, ischemic peripheral circulation disorder, myocardial ischemia. , Venous dysfunction, progression of heart failure after myocardial infarction, diabetic nephropathy, nephritis, arteriosclerosis, hyperaldosteronism, scleroderma, glomerulosclerosis, renal failure, Alzheimer's disease, memory deficiency, depression, sensory function It is useful as a therapeutic agent for disorders, anxiety, tension symptoms, discomfort, glaucoma, ocular hypertension, restenosis after PTCA, asthma, rhinitis, or allergic diseases.