JP2004067536A

JP2004067536A - New method for producing emulsified preparation

Info

Publication number: JP2004067536A
Application number: JP2002226208A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Nomura; 野村　武彦
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2004-03-04

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a practical production method related to a method for producing an emulsified preparation in a large scale. <P>SOLUTION: This method for producing the emulsified preparation is characterized by (a) stirring and emulsifying a mixture of an oily substance with an aqueous solution containing a nonionic surfactant or a mixture of an oily substance containing a solvent-insoluble solid substance with an aqueous solution containing a nonionic surfactant, and (b) cooling the prepared emulsion at a temperature not higher than a clouding point, adding an aqueous solution containing a substance for lowering the clouding point of the nonionic surfactant and then mixing and stirring the mixture. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、油状物質と非イオン性界面活性剤、および該界面活性剤の曇点を下げる物質を含む安定な乳化製剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳化製剤とは液状の医薬品に乳化剤と適当な水溶液を加え、適当な方法で乳化し、全体を均等にしたものである。
乳化製剤の製造方法については、多くの方法、形態が知られているが（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，　２４，　１２０−１２６（１９２０）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，　３７，　２７９−３０２（１９３３）、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　３３，　５９８−６０４（１９５６））、その中の一形態として水中油型エマルションが挙げられる。
水中油型エマルション製剤としては、多くの製剤が知られているが、特に最近では、ＢＣＧの細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下、ＣＷＳと略す）を用いた免疫賦活剤の乳化製剤が、従来にない優れた効果を示すことから、大いに注目されている。　（Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ．，７０，Ｓｅｒ．Ｂ　２０５−２０９（１９９４）、Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ．，７４，Ｓｅｒ．Ｂ　２０５５０−５５（１９９８））。
【０００３】
しかし、上記乳化製剤は、安定した良好な品質の製剤を大量スケールで提供できる工業的製造方法が充分確立していなかった。その原因の一つとして、乳化のために使用する非イオン性界面活性剤の使用方法が挙げられる。
非イオン性界面活性剤の使用に際しては、非イオン性界面活性剤は曇点付近の温度でもっとも界面活性能力が高くなることが知られている（界面活性剤便覧、西　市郎他、１６７−１７６（産業図書））。
また、乳化時間は乳化時の温度に依存されるので、大量スケールで効率的に安定した乳化製剤を製造するためには、使用する非イオン性界面活性剤の曇点を考慮した上で可能な限り高温で乳化することが望ましいことが知られていた。
一方、乳化製剤の調製時の溶液中に曇点を下げる物質が共存する場合、非イオン性界面活性剤の曇点が低下し、従来の製造工程における乳化時の温度で界面活性剤が析出する等の現象がおこり、良好な品質の乳化製剤を得ることができなかった。また、高濃度の油を含有した濃縮製剤を調製する際、乳化製剤の安定性を保持するために、同時に曇点を下げる物質も高濃度に共存させておく必要があり、大幅な曇点の低下により乳化効率が顕著に低下した。
そこで、従来公知の乳化製剤製造方法を改良し、工業的製造法を確立することが急務とされた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来の乳化製剤の工業的製造方法を改良し、曇点の低下を原因とした製造途中に起こる界面活性剤の析出等による付着物を抑制し、最終的に優れた安定性を有する医薬品として有効な乳化製剤品の実用的かつ恒常的製造法を最適な形で提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討を進めた結果、曇点を下げる物質が含まれる乳化製剤の新規な製造方法、および濃縮製剤の希釈による、同一設備における製造スケールの拡大方法を見いだした。
すなわち本発明の製造方法は、まず曇点を下げる物質を加えることなく乳化効率の良い高温で乳化を行った後に乳化液を曇点以下の温度まで冷却し、非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて希釈する。このことにより界面活性剤の一部が析出することを防ぎ、不溶物として付着し残存することもなくなった。また、界面活性剤の一部が析出した乳化製剤は、凍結乾燥すると凍結乾燥中のケーキが収縮あるいは浮上してしまうが、これを阻止することができた。
従って、本発明により、医薬品として有効な乳化製剤品の実用的な大量製造法が可能となり、特に細菌の菌体成分を使用した癌免疫療法用の乳化製剤を医薬品として使用することが可能となった。
【０００６】
本発明の要旨は次のように示される。
［１］　以下の工程を特徴とする、乳化製剤の製造法。
（ａ）油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液を攪拌し乳化した後、
（ｂ）曇点以下の温度まで冷却し、非イオン界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて混合撹拌する。
［２］　非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である［１］記載の乳化製剤の製造法
［３］　非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）である、［１］記載の乳化製剤の製造法。
［４］　非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質がアミノ酸、もしくは無機塩である、［１］〜［３］のいずれか記載の乳化製剤の製造法。
［５］　電解質がアミノ酸、もしくは無機塩である、［４］記載の乳化製剤の製造法。
［６］　電解質がアルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩である、［４］記載の乳化製剤の製造法。
［７］　溶媒不溶の固形物質が、細菌の菌体成分である［１］〜［６］のいずれか記載の乳化製剤の製造法。
［８］　細菌の菌体成分が、ＢＣＧ−ＣＷＳまたはノカルディア・ルブラー−ＣＷＳである［７］記載の乳化製剤の製造法
［９］　以下の工程を特徴とする乳化製剤の製造法
（ａ）油状物質と、低濃度の非イオン性界面活性剤を含む水溶液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と低濃度の非イオン性界面活性剤を含有する水溶液を加えて４０℃以上で撹拌して粗乳化を行い、
（ｂ）更に非イオン性界面活性剤水溶液を添加し撹拌し単一ピークを得られる粒子径を持つ濃縮水中油型エマルションを製造した後、
（ｃ）曇点以下の温度まで冷却した状態で電解質水溶液を加えて攪拌することによって所望の界面活性剤濃度および原薬濃度の水中油型エマルションを製造する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で使用可能な非イオン性界面活性剤としては特に制限されるものはないが、医薬品製剤に使用される非イオン性の界面活性剤であれば好ましい。例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類または、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類としては例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）等が挙げられ、ソルビタン脂肪酸エステル類としてはソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノラウレートモノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、ソルビタンモノラウレートモノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、ソルビタンモノラウレートモノオレート（Ｓｐａｎ８０）等が挙げられる。特に好ましい非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート類を挙げることができる。さらに好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）が最も適している。
【０００８】
本乳化製剤の製造方法に使用される非イオン性界面活性剤含有水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常非イオン性界面活性剤の含有量として約０．０１％〜１０．０％ｗ／ｗの範囲で用いられる。固形物質が細菌の菌体成分である場合、好ましくは、０．０１％〜４％、更に好ましくは０．１％〜１．５％が挙げられる。
乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。その場合の非イオン性界面活性剤濃度は、粗乳化工程においては必要最小限でよく、０．１％ｗ／ｗ以下の少量が好適である。好ましくは０．０１〜０．０５％ｗ／ｗがあげられる。細乳化工程では、非イオン性界面活性剤濃度は好ましくは０．１％〜１０％ｗ／ｗが挙げられ、固形物質が細菌の菌体成分である場合、好ましくは０．１〜１．５％ｗ／ｗが挙げられる。
また、細乳化工程後に、適宜必要に応じて、さらに非イオン性界面活性剤を加えて、より高含量の非イオン性界面活性剤溶液に調製することもでき、その際、さらに乳化機による攪拌を行うこととで粒度分布をシャープなものにすることも可能である。これら水溶液には必要に応じて適宜安定化剤や等張化剤が加えられていてもよい。また、これら非イオン性界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
【０００９】
本発明に使用可能な非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質としては、医薬品製剤に使用される物質であれば、特に制限されるものはないが、電解質が挙げられる。例えば、有機酸、有機塩基、無機酸、無機塩基、または塩等が挙げられる。有機酸としては例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、アミノ酸、ヒドロキサム酸等が挙げられ、好ましくは、アミノ酸が挙げられる。具体的には、α−アミノ酸であるアラニン、グリシン、バリン、プロリン、リシン、ロイシン、チロシン等のアミノ酸が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン等が挙げられる。無機酸としては、硫酸、リン酸、塩酸等が挙げられる。無機塩基としては、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムカリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。塩としては、前記有機酸、有機塩基、無機酸、および無機塩基の各々に対応する塩を用いることができ、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩等が挙げられ、好ましくは、アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩が挙げられる。具体的には、リン酸一または二水素ナトリウム、リン酸水素一または二カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等が挙げられる。
該電解質は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
また、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の糖類、マンニトール、マルトース等のポリアルコール類、またはウレアなどの非電解質を、安定化剤、賦形剤または等張化剤として、曇天を下げる物質とともに用いることができる。
【００１０】
非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質の濃度は、特に限定されないが、水中油型エマルション製剤において０．１〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当である。好ましくは、１〜２０％ｗ／ｗの範囲が適当である。
更に非電解質の水溶液を添加する場合、該水溶液の濃度としては、約１．５〜１５％
ｗ／ｗ（浸透圧比０．３〜３）が望ましい。
【００１１】
本発明において、乳化製剤が溶媒不溶の固形物質を含む場合、使用可能な固形物質とは溶媒不溶であれば特に制限されるものはなく、医薬品製剤に使用される物質例えば、医薬品の原薬等が挙げられる。該原薬としては、具体的には、細菌菌体成分が挙げられ、好ましくは微生物死菌や微生物由来の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ），リポ多糖（ＬＰＳ）、マンナン、グルカンおよびこれらの誘導体等が挙げられる。微生物死菌の例としては、ヒト型結核菌の死菌などが挙げられる。ＣＷＳの由来微生物としては、マイコバクテリア属、ノカルディア属、コリネバクテリア属、プロピオニバクテリウム属などが挙げられる。さらに好ましくは、マイコバクテリア属ウシ型結核菌であるＢＣＧおよびノカルデイア・ルブラーを挙げることができる。これらのＣＷＳは、物理的に細菌を粉砕した後、除核酸、除タンパク、脱脂などの精製工程を経て得られる不溶性残渣として得られ、その製法自体は公知である。
なお、本発明で使用される菌体成分の濃度は、好ましくは乳化製剤において０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
【００１２】
本発明で使用可能な油状物質としては特に制限されるものはなく、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２７巻、第３１１〜３２９項（１９７４年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、流動パラフィン、バイオール（Ｂａｙｏｌ　Ｆ）、ドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ−６ＶＲ）、モレスコバイオレスなどが挙げられる。植物油としては、落花生油、ゴマ油、ＡＤ−６５（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）、オレイン酸エチル、大豆油、ツバキ油等が挙げられる。動物油としては、スクワラン、スクワレンのようなテルペノイド誘導体が挙げられる。好ましい例としては、ドラケオール６ＶＲ、スクワレン、スクワラン、グリセリン、シンセラン４等を挙げることができる。
なお、油状物質の濃度は、水中油型エマルション製剤において０．０１〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当であるが、好ましくは０．０１〜１０％ｗ／ｗが挙げられ、より好ましくは０．０１〜５．０％ｗ／ｗが挙げられる。
【００１３】
また、本発明で使用可能な等張液は、エマルション粒子の分散媒体となるものとして、注射用水（注射用蒸留水）、生理食塩水などが挙げられるが、注射可能な分散溶媒であれば特に限定されない。
その他、医薬品製剤に使用しうる安定化剤、酸化防止剤、防腐剤、緩衝剤等を必要に応じて添加することができる。添加濃度としては水中油型エマルション製剤において１０％ｗ／ｗ以下で十分である。
【００１４】
本発明で使用可能な分散・乳化機器としては、例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザー、ホモミキサー、超音波ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリンホモジナイザー型高圧ホモジナイザー、ＩＫＡウルトラタックスＴ−２５（商品名）等の分散・乳化機により、分散もしくは乳化を行って所望の濃縮された水中油型エマルション溶液を得ることができる。調製後、賦形剤、安定化剤等の添加剤を添加し、適宜所望の製剤製造を行う。
乳化のための攪拌条件は製剤調製時の原料の分量および乳化機器によって異なるため、所望の粒度分布が得られたことを目安に回転数を決めることが好ましい。例えば、本発明の乳化製剤の製造法における工程では、概ね回転数１００００〜２５０００ｒｐｍで乳化することが挙げられる。本発明の工程で製造された乳化製剤の粒度分布は０．１〜１０μｍである。
【００１５】
乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。粗乳化は、細乳化よりも低速で行うことが好ましい。
工程を複数回に分けた場合も撹拌速度は原料の分量、乳化機器によって異なるが、例えば、本発明の乳化製剤の製造法における工程での回転数は、粗乳化で約３０００ｒｐｍ〜１００００ｒｐｍであり、好ましくは６０００ｒｐｍ〜８０００ｒｐｍが挙げられ、より好ましくは約７０００ｒｐｍが挙げられる。
また、細乳化工程での撹拌の回転数は好ましくは約８０００ｒｐｍ以上が挙げられ、より好ましくは１００００ｒｐｍ〜２００００ｒｐｍが挙げられ、より好ましくは１２０００ｒｐｍ〜１６０００ｒｐｍが挙げられる。
【００１６】
本発明乳化製剤の製造法での乳化の温度としては、４０℃〜８５℃であればよいが、約６５℃以上の高温であることが望ましい。
本発明の乳化製剤の製造法の乳化時間は乳化温度に依存するが、５〜６０分が挙げられ、好ましくは５〜３０分が挙げられ、より好ましくは５〜１０分が挙げられる。
また、乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。粗乳化、細乳化で乳化温度を変える必要はない。例えば、粗乳化、細乳化共、６５℃〜７０℃でそれぞれ約１０分で乳化を行うことができる。
【００１７】
本発明の乳化製剤の製造法で非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質を含有する水溶液を添加する際の撹拌は低速で良く、乳化後の濃縮エマルションと上記水溶液がまんべんなく混合される程度でよい。ここで低速とは、１０００〜７０００ｒｏｕｎｄ／ｍｉｎの速度を意味する。
上記水溶液の添加は、乳化工程後であればいつでもよいが、乳化製剤を曇点以下の温度に冷却した後に添加することが好ましい。複数回に分けて乳化した場合は、最終の乳化工程が終了した後に、曇点以下まで冷却し添加する。
曇点は、使用する非イオン性界面活性剤によって異なる（界面活性剤便覧、西市郎他、１６７−１７６（産業図書））。曇点の温度変化は、非イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質との組み合わせ且つ、非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質の含有量に依存されるので、適宜その条件での曇点を求める。曇点の測定方法は「新・界面活性剤入門」藤本　武彦（三洋化成工業）、Ｐ９５記載の方法で容易に求められる。
例えば、本発明の乳化製剤の製造法における曇点以下の温度とは、特に限定されないが、本発明の好ましい態様においては、通常４０℃以下が挙げられ、より好ましくは３０℃以下が挙げられる。
乳化製剤の製法の処方での原料の分量は特に制限されない。本発明の乳化製剤の製造法での乳化機器においても特に制限されない。
【００１８】
本発明に係る乳化製剤は、注射など非経口で投与できる。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。例えば細菌の細胞壁骨格成分を非経口的に投与する場合、通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、例えば細菌の細胞壁骨格成分を非経口投与する場合、特に注射剤として使用する場合には、通常は成人に対して週１回若しくは４週１回の投与で１回当たり有効成分が０．１〜２５０μｇの範囲、好ましくは１０〜２００μｇの範囲を投与することができる。より好ましくは２５〜２５０μｇの範囲を投与することが出きる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例、試験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２０】
試薬
スクワラン　　：スーパースクワランＥｘ．（Ｌｏｔ．ＰＣ９Ｆ５４、スクアテック社）
ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）：ＴＯ−１０Ｍ（Ｌｏｔ．９３１６、日光ケミカル）
グリシン　　　：特級グリシン（ナカライテスク）
乳化機器
乳化機　：ロボミックス、攪拌部：ホモミクサーＭＡＲＫＩＩターヒ゛ン蓋一体型（特殊機化工業）
乳化容器：ジャケット付きセパラブルフラスコ（ロボミックス２Ｌ用、特殊機化工業）
恒温槽　：ＥＹＥＬ　ＤＩＧＩＴＡＬ　ＵＮＩ　ＡＣＥ　ＵＡ−１００
乳化条件
処方：有効成分として、ＢＣＧ−ＣＷＳを用いる場合の、１Ｌあたりの原料の組成としては、例えば以下の表１に例示される。
【００２１】
【表１】

凍結乾燥
凍結乾燥機：フィンテック社製ＧＴ―６
重鎮容器
バイアル　：ＶＳＣ１８―ＣＳ（不二硝子）
ゴム栓　　：Ｖ１０―Ｆ８（大協精工）
物性評価
粒度分布評価：島津静的光散乱粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００
【００２２】
実施例１
菌体成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６００ｍｇを、スクワラン　　１６ｇとトルエン２００ｍｌの混合液に加え、振とうあるいは超音波により１５分間分散した。その後、窒素気流下で６０℃に加熱しトルエンを留去した。次いで、０．０２％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液７８６ｍＬを添加し、ホモミキサー（ロボミックス）を用い、７０００ｒｐｍ１０分間６５℃で粗乳化を行った。その後、１０％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液１５ｍＬを添加し、ホモミキサー（ロボミックス）を用いて１２０００ｒｐｍ５分間６５℃で本乳化した。本乳化後、粒度分布が所望のものであることを確認後、１０％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液１８３ｍＬを添加し、ホモミキサー（Ｔ．Ｋ．ＲＯＢＯ　ＭＩＣＳ）を用いて５０００ｒｐｍ１分間６５℃で混合することにより最終的なポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を２．０％ｗ／ｗに調整した。その後、品温を３０℃以下に冷却した後、２４００ｍＭグリシン水溶液１０００ｍＬを徐々に製剤側に添加し、充分混合することにより、最終的に原薬濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、スクワラン濃度０．８％ｗ／ｗ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度１．０％ｗ／ｗ、グリシン濃度１２００ｍＭの水中油型エマルション製剤を得た。
【００２３】
参考例１　（グリシン共存下でのビークル調製）
乳化中あるいは直後での、不溶性物質の生成製剤の不安定化原因が原薬ではないことを確認するため、以下のようにグリシン共存下ビークルを調製した。さらに、グリシン添加のタイミングの影響についても検討した。
２％ｗ／ｗスクワラン、１％ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のビークル（１Ｌスケール）を下記の３種の製法にて調製。
▲１▼グリシン・前添加　…０．２％　ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）／１２００ｍＭグリシン水溶液にて本乳化を行う
▲２▼グリシン・後添加（スラリー）…グリシン無しで本乳化した後、グリシンをスラリー状態（粉末）で直接製剤に投入（この時の品温は約６５℃）
▲３▼グリシン・後添加（溶液）…油、界面活性剤を各２倍量含有した濃縮製剤を調製後、２４００ｍＭグリシン溶液を等量添加（品温２５℃）
尚、特記しない限り、本乳化での設定温度は６５℃である。（品温：６５〜７０℃）
試験の結果を以下に示す。
▲１▼グリシンを含んだポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液にて本乳化を行った結果、０．２％ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）における従来の乳化では充分シャープな粒度分布は得られず、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を上げて乳化したが改善は見られなかった。さらに、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の最終濃度である１％ｗ／ｗで本乳化を行ったところ、粒度分布が変化し、製剤中に不溶性物質が浮遊しているのが認められた。粒度分布の結果を図１に示す。
▲２▼グリシン非含有ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液にて乳化を行ったところ、１０分間の乳化においては粒度分布が充分にシャープにはならなかった。これはスクワラン４％ｗ／ｗの濃縮製剤での乳化であった為と考えられる。そこで、２０分間の乳化に延長したところ、本来のシャープな粒度分布が得られることが判った。その後、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を１％ｗ／ｗにしても粒度分布は変化しなかった。さらに、グリシン９０ｇ（１２００ｍＭ相当）をスラリーで投入しミキサーにて混合（回転数：３０００ｒｐｍ、乳化ではない）したが、粒度分布には変化は無かった。ところが、その状態からミキサーの回転数を上げ（１２０００ｒｐｍ）、乳化したところ、粒度分布が変化し、▲１▼での結果と同様な不溶性物質が生成し始めた。粒度分布変化の結果を図３に示す。
▲３▼　▲２▼での結果を参考にして、グリシン非存在下での本乳化におけるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を２倍の０．４％ｗ／ｗにしたところ、１０分間の乳化により▲２▼と同様なシャープな粒度分布が得られた。その後、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を最終濃度（１％）に調整し、グリシン２４００ｍＭ溶液を製剤と等量添加し混合したが、粒度分布に変化は無かった。さらに、▲２▼の最終工程での結果を参考に、ここでは品温を１５℃付近まで冷却してから、１０分間の細乳化を行ったところ、粒度分布は全く変化せず、不溶性物質の生成も認められなかった。粒度分布変化の結果を図４に示す。
製法▲１▼と▲３▼により調製された製剤比較すると、明らかに製法▲１▼による製剤の上部には不溶性物質が浮遊しているのが判った。
以上の結果から、グリシン共存下での乳化で認めれる製剤の不安定化は、原薬の影響で起こっているのではなく、おそらくグリシンが高濃度化することにより他の成分（ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）あるいはスクワラン）に何らかの影響を及ぼし製剤を不安定化させたものと考えられた。
また、▲２▼、▲３▼の結果から、「高濃度のグリシン」「高温（６５〜７０度）」「高い回転数での乳化」という３つの条件が揃った時に、製剤が不安定化することが示された。
【００２４】
参考例２　グリシン共存下でのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点測定
ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のような非イオン性界面活性剤は、親水基であるポリオキシエチレン基の親水性により溶解している。これは、基中にあるエーテル結合型の酸素原子に水分子が水素結合することにより生ずるものである。この水素結合は水溶液の温度が上昇して水分子の運動が活発になると切れてしまい、それまでミセル状に溶解していた界面活性剤分子は水和性を失って白濁して析出する。この温度を曇点（ｃｌｏｕｄ　ｐｏｉｎｔ）というが、グリシン濃度がポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点に及ぼす影響について検討した。
「新・界面活性剤入門」（藤本　武彦（三洋化成工業）、Ｐ９５）に記載されている方法に従って、グリシン３００ｍＭ〜１２００ｍＭにおけるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点を測定した。
一般に界面活性剤の曇点は、０．５〜５％　ｗ／ｗ程度の範囲では濃度の影響を受けず一定であることが知られている。ここでの検討では、実際の本乳化での設定濃度である０．２％　ｗ／ｗで測定することにした。
試験結果を以下に示す。
図６に示すように、グリシン濃度と曇点の間には良い相関性が認められ、グリシン濃度の増加に反してポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点が低下することが判明した。このことから、ＢＣＧ−ＣＷＳエマルション調製時の乳化温度である６５〜７０℃の条件下では、グリシン濃度約６００ｍＭ以上でポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）が析出していた可能性が高いことが判った。
以上の結果から、これまでの製剤調製において、グリシン６００ｍＭ以上での細乳化ではポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）が析出し乳化力が顕著に低下していたことが示された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は乳化製剤の安定化大量製造方法である。その特徴は、溶媒不溶の固形物質、油状物質、非イオン性界面活性剤水溶液のみで濃縮エマルション製剤を調製した後で、非イオン性界面活性剤の曇点を低下させる物質含有の水溶液と混合することにより、付着物の生成と凍結乾燥中のケーキの収縮などの製剤の不安定化を解消することができた。
すなわち、本発明により、医薬品として有効な乳化製剤品の実用的な大量製造法が可能となり、特に細菌の菌体成分を使用した癌免疫療法用の乳化製剤を医薬品として提供することが可能となった。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１の▲１▼の、グリシン共存下での乳化による粒度分布変化を表すグラフである。
【図２】参考例１の▲２▼の、グリシン非含有ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液で乳化時間を変えて乳化した場合の粒度分布変化と、グリシンをスラリーで乳化後に添加した場合の粒度分布変化を表すグラフである。
【図３】参考例１の▲２▼の、グリシン溶液を乳化後に添加した場合の粒度分布変化を表すグラフである。
【図４】参考例２の雲点とグリシン濃度のとの相関性を表すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a stable emulsion preparation comprising an oily substance, a nonionic surfactant, and a substance that lowers the cloud point of the surfactant.
[0002]
[Prior art]
An emulsified preparation is obtained by adding an emulsifier and an appropriate aqueous solution to a liquid medicine and emulsifying it by an appropriate method to make the whole uniform.
Many methods and forms are known for producing emulsion formulations (J. Phys. Chem., 24, 120-126 (1920), J. Phys. Chem., 37, 279-302 (1933). ), J. Am. Oil Chem. Soc., 33, 598-604 (1956)), an oil-in-water emulsion is mentioned as one form thereof.
As an oil-in-water emulsion preparation, many preparations are known. Particularly recently, an emulsion preparation of an immunostimulator using a cell wall skeleton component of BCG (Cell Wall Skeleton, hereinafter abbreviated as CWS) has been conventionally used. It has attracted a great deal of attention because of its excellent effects. (Pro. Japan Acad., 70, Ser. B 205-209 (1994), Pro. Japan Acad., 74, Ser. B 20550-55 (1998)).
[0003]
However, an industrial production method capable of providing a stable and good quality preparation on a large scale has not been sufficiently established for the above emulsion preparation. One of the causes is a method of using a nonionic surfactant used for emulsification.
When using nonionic surfactants, it is known that nonionic surfactants have the highest surface active ability at temperatures near the cloud point (Surfactant Handbook, Nishi Ichiro et al., 167-176). (Industrial book)).
In addition, since the emulsification time depends on the temperature at the time of emulsification, it is possible in consideration of the cloud point of the nonionic surfactant to be used in order to produce an emulsion formulation that is stable on a large scale. It has been known that it is desirable to emulsify at as high a temperature as possible.
On the other hand, when a substance that lowers the cloud point coexists in the solution at the time of preparation of the emulsion preparation, the cloud point of the nonionic surfactant is lowered, and the surfactant is precipitated at the temperature during emulsification in the conventional production process. As a result, a good quality emulsified preparation could not be obtained. Moreover, when preparing a concentrated preparation containing a high concentration of oil, it is necessary to coexist with a substance that lowers the cloud point at the same time in order to maintain the stability of the emulsion preparation. Due to the decrease, the emulsification efficiency was significantly decreased.
Therefore, it has been urgently required to improve a conventionally known emulsion preparation production method and establish an industrial production method.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The purpose of the present invention is to improve the industrial production method of conventional emulsion preparations, suppress deposits due to precipitation of surfactants occurring during the production due to lowering of the cloud point, and finally excellent stability The object of the present invention is to provide a practical and constant production method of an emulsified preparation effective as a medicinal drug in an optimal form.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent investigation, the present inventor has found a novel production method of an emulsified preparation containing a substance that lowers the cloud point, and a method for expanding the production scale in the same equipment by diluting the concentrated preparation.
That is, in the production method of the present invention, after emulsifying at a high temperature with good emulsification efficiency without first adding a substance that lowers the cloud point, the emulsion is cooled to a temperature below the cloud point, and the cloud point of the nonionic surfactant is reduced. Dilute by adding an aqueous solution containing a substance that lowers the pH. This prevented a part of the surfactant from precipitating, and it did not adhere and remain as an insoluble matter. Moreover, when the emulsion preparation in which a part of the surfactant was deposited was freeze-dried, the cake during freeze-drying contracted or floated, but this could be prevented.
Therefore, according to the present invention, a practical mass production method of an emulsified preparation effective as a pharmaceutical becomes possible, and in particular, an emulsified preparation for cancer immunotherapy using bacterial cell components can be used as a pharmaceutical. It was.
[0006]
The gist of the present invention is as follows.
[1] A method for producing an emulsified preparation characterized by the following steps.
(A) After stirring and emulsifying a mixed solution of an aqueous solution containing an oily substance and a nonionic surfactant, or a mixed solution of an oily substance containing a solvent-insoluble solid substance and an aqueous solution containing a nonionic surfactant,
(B) Cool to a temperature below the cloud point, add an aqueous solution containing a substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant, and mix and stir.
[2] The process for producing an emulsified preparation according to [1], wherein the nonionic surfactant is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester
[3] The method for producing an emulsified preparation according to [1], wherein the nonionic surfactant is polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80).
[4] The method for producing an emulsified preparation according to any one of [1] to [3], wherein the substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant is an amino acid or an inorganic salt.
[5] The method for producing an emulsified preparation according to [4], wherein the electrolyte is an amino acid or an inorganic salt.
[6] The method for producing an emulsified preparation according to [4], wherein the electrolyte is an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt.
[7] The method for producing an emulsified preparation according to any one of [1] to [6], wherein the solvent-insoluble solid substance is a bacterial cell component.
[8] The method for producing an emulsified preparation according to [7], wherein the bacterial cell component is BCG-CWS or Nocardia Rubler-CWS
[9] Manufacturing method of emulsion preparation characterized by the following steps
(A) An aqueous solution containing an oily substance and a low-concentration nonionic surfactant or an oily substance containing a solvent-insoluble solid substance and an aqueous solution containing a low-concentration nonionic surfactant and adding 40 ° C or more Stirring and rough emulsification,
(B) After further producing a concentrated oil-in-water emulsion having a particle size capable of obtaining a single peak by adding and stirring a nonionic surfactant aqueous solution,
(C) An aqueous electrolyte solution is added in a cooled state to a temperature below the cloud point and stirred to produce an oil-in-water emulsion having a desired surfactant concentration and drug substance concentration.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The nonionic surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a nonionic surfactant used in pharmaceutical preparations. Examples thereof include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters or sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers, polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivatives, polyoxyethylene castor oil derivatives, and the like. Examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polysorbate 20), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (polysorbate 40), polyoxyethylene sorbitan monostearate (polysorbate 60), polyoxyethylene Sorbitan monooleate (polysorbate 80) and the like. Examples of sorbitan fatty acid esters include sorbitan monolaurate (Span 20), sorbitan monolaurate monopalinate (Span 40), sorbitan monolaurate monostearate (Span 60), sorbitan mono Examples thereof include laurate monooleate (Span 80). Particularly preferred nonionic surfactants include polysorbates. More preferably, polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80) is most suitable.
[0008]
The concentration of the nonionic surfactant-containing aqueous solution used in the method for producing the emulsified preparation is not particularly limited, but is usually about 0.01% to 10.0% w /% as the content of the nonionic surfactant. Used in the range of w. When the solid substance is a bacterial cell component, it is preferably 0.01% to 4%, more preferably 0.1% to 1.5%.
The emulsification step can be divided into a plurality of times. For example, the first step is divided into two steps in which rough emulsification is performed and fine emulsification is performed in the second step. In this case, the nonionic surfactant concentration may be the minimum necessary in the rough emulsification step, and a small amount of 0.1% w / w or less is suitable. Preferably 0.01-0.05% w / w is mention | raise | lifted. In the fine emulsification step, the nonionic surfactant concentration is preferably 0.1% to 10% w / w. When the solid substance is a bacterial cell component, preferably 0.1 to 1.5%. % W / w.
Further, after the fine emulsification step, if necessary, a nonionic surfactant can be further added to prepare a higher-content nonionic surfactant solution. It is also possible to sharpen the particle size distribution by performing the above. In these aqueous solutions, stabilizers and isotonic agents may be added as necessary. Moreover, these nonionic surfactants are not limited to one type, and can be used in combination of several types as appropriate.
[0009]
The substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can be used in pharmaceutical preparations, but includes an electrolyte. For example, an organic acid, an organic base, an inorganic acid, an inorganic base, or a salt can be used. Examples of the organic acid include acetic acid, citric acid, lactic acid, amino acid, hydroxamic acid and the like, and preferably an amino acid. Specific examples include α-amino acids such as alanine, glycine, valine, proline, lysine, leucine, and tyrosine. Examples of the organic base include triethylamine. Examples of inorganic acids include sulfuric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, and the like. Examples of the inorganic base include potassium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, sodium potassium carbonate, sodium carbonate and the like. As the salt, salts corresponding to each of the organic acid, organic base, inorganic acid, and inorganic base can be used. For example, alkali metal salt, alkaline earth metal salt, ammonium salt, hydrochloride salt, acetate salt, Examples thereof include sulfates, and alkali metal salts or alkaline earth metal salts are preferable. Specific examples include mono- or di-hydrogen phosphate, mono- or dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, sodium acetate, and the like.
The electrolyte is not limited to one type and can be used in combination of several types as appropriate.
Substances that lower cloudiness by using sugars such as glucose, fructose, lactose, sucrose and trehalose, polyalcohols such as mannitol and maltose, or non-electrolytes such as urea as stabilizers, excipients or isotonic agents Can be used together.
[0010]
The concentration of the substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant is not particularly limited, but in the oil-in-water emulsion formulation, a range of 0.1 to 30% w / w is appropriate. Preferably, a range of 1 to 20% w / w is appropriate.
Further, when a non-electrolyte aqueous solution is added, the concentration of the aqueous solution is about 1.5 to 15%.
w / w (osmotic pressure ratio of 0.3 to 3) is desirable.
[0011]
In the present invention, when the emulsified preparation contains a solvent-insoluble solid substance, the usable solid substance is not particularly limited as long as it is solvent-insoluble. Is mentioned. Specific examples of the drug substance include bacterial cell components. Preferably, microbial killed bacteria and microorganism-derived cell wall skeleton components (CWS), muramyl dipeptide (MDP), lipopolysaccharide (LPS), mannan, Examples include glucan and derivatives thereof. Examples of killed microorganisms include killed bacteria of Mycobacterium tuberculosis. Examples of CWS-derived microorganisms include Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium, and Propionibacterium. More preferred examples include BCG and Nocardia rubler which are Mycobacterium bovine tuberculosis. These CWS are obtained as an insoluble residue obtained by physically pulverizing bacteria and then undergoing purification steps such as denucleic acid removal, protein removal, and degreasing, and the production method itself is known.
In addition, as for the density | concentration of the microbial cell component used by this invention, Preferably 0.01-10 mg / ml is mentioned in an emulsion formulation.
[0012]
The oily substance that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include mineral oils and animal and vegetable oils as described in Immunology Vol. 27, 311 to 329 (1974). Examples of the mineral oil include liquid paraffin, viol (Fayol F), drakeol (Drakeol-6VR), moresco violes and the like. Examples of vegetable oils include peanut oil, sesame oil, AD-65 (a mixture of peanut oil, alacel and aluminum monostearate), ethyl oleate, soybean oil, camellia oil, and the like. Animal oils include terpenoid derivatives such as squalane and squalene. Preferred examples include Drakeol 6VR, squalene, squalane, glycerin, synthelan 4 and the like.
The oily substance concentration in the oil-in-water emulsion preparation is suitably in the range of 0.01 to 30% w / w, preferably 0.01 to 10% w / w, more preferably 0. 0.01 to 5.0% w / w.
[0013]
Examples of isotonic solutions that can be used in the present invention include water for injection (distilled water for injection), physiological saline, and the like as a dispersion medium for emulsion particles. It is not limited.
In addition, stabilizers, antioxidants, preservatives, buffering agents and the like that can be used in pharmaceutical preparations can be added as necessary. As the addition concentration, 10% w / w or less is sufficient in the oil-in-water emulsion preparation.
[0014]
Examples of the dispersion / emulsification apparatus that can be used in the present invention include a Potter-Elvehjem type homogenizer, a homomixer, an ultrasonic homogenizer, a microfluidizer (trade name), a nanomizer (trade name), an optimizer (trade name), and Menton- A desired concentrated oil-in-water emulsion solution can be obtained by dispersing or emulsifying with a dispersing / emulsifying machine such as a Gaurin homogenizer type high-pressure homogenizer or IKA Ultratax T-25 (trade name). After preparation, additives such as excipients and stabilizers are added, and a desired preparation is appropriately produced.
Since the stirring conditions for emulsification vary depending on the amount of raw materials and the emulsifying equipment at the time of preparation of the preparation, it is preferable to determine the rotation speed based on the fact that the desired particle size distribution has been obtained. For example, in the process of the method for producing an emulsified preparation of the present invention, emulsification is generally performed at a rotational speed of 10,000 to 25000 rpm. The particle size distribution of the emulsion preparation produced in the process of the present invention is 0.1 to 10 μm.
[0015]
The emulsification step can be divided into a plurality of times. For example, the first step is divided into two steps in which rough emulsification is performed and fine emulsification is performed in the second step. Rough emulsification is preferably performed at a lower speed than fine emulsification.
Even when the process is divided into a plurality of times, the stirring speed varies depending on the amount of the raw material and the emulsifying equipment, but for example, the number of rotations in the process in the method for producing an emulsified preparation of the present invention is about 3000 rpm to 10000 rpm in rough emulsification Preferably 6000 rpm-8000 rpm is mentioned, More preferably, about 7000 rpm is mentioned.
Further, the rotation speed of stirring in the fine emulsification step is preferably about 8000 rpm or more, more preferably 10000 rpm to 20000 rpm, and more preferably 12000 rpm to 16000 rpm.
[0016]
The temperature of emulsification in the method for producing an emulsified preparation of the present invention may be 40 ° C. to 85 ° C., but a high temperature of about 65 ° C. or higher is desirable.
Although the emulsification time of the production method of the emulsion preparation of the present invention depends on the emulsification temperature, 5 to 60 minutes can be mentioned, preferably 5 to 30 minutes can be mentioned, and more preferably 5 to 10 minutes can be mentioned.
Moreover, an emulsification process can also be divided into multiple times. For example, the first step is divided into two steps in which rough emulsification is performed and fine emulsification is performed in the second step. There is no need to change the emulsification temperature for coarse or fine emulsification. For example, both rough emulsification and fine emulsification can be carried out at 65 ° C. to 70 ° C. for about 10 minutes.
[0017]
Stirring when adding an aqueous solution containing a substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant in the method for producing an emulsified preparation of the present invention may be slow, and the concentrated emulsion after emulsification and the above aqueous solution are mixed evenly. It's okay. Here, the low speed means a speed of 1000 to 7000 round / min.
The aqueous solution may be added at any time after the emulsification step, but is preferably added after the emulsion preparation has been cooled to a temperature below the cloud point. When emulsifying in a plurality of times, after the final emulsification step is completed, the solution is cooled to the cloud point or lower and added.
The cloud point varies depending on the nonionic surfactant used (Surfactant Handbook, Ichirou Nishi et al., 167-176 (Industry Books)). The temperature change of the cloud point depends on the combination of the nonionic surfactant and the substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant and the content of the substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant. Therefore, the cloud point under that condition is obtained as appropriate. The method for measuring the cloud point can be easily determined by the method described in “Introduction to New Surfactant” Takehiko Fujimoto (Sanyo Chemical Industries), P95.
For example, although it does not specifically limit with the temperature below the cloud point in the manufacturing method of the emulsion formulation of this invention, In the preferable aspect of this invention, 40 degrees C or less is mentioned normally, More preferably, 30 degrees C or less is mentioned.
The amount of the raw material in the prescription for the production method of the emulsion preparation is not particularly limited. Also in the emulsification apparatus in the manufacturing method of the emulsion formulation of this invention, it does not restrict | limit.
[0018]
The emulsified preparation according to the present invention can be administered parenterally such as injection. The dosage form varies depending on the purpose of treatment and is not particularly limited. For example, when a bacterial cell wall skeleton component is administered parenterally, a commonly used dosage form can be administered from the skin as an injection, for example.
The dose and frequency of administration vary depending on the target disease, patient symptoms, age, weight, sex, etc., but for example, when administering bacterial cell wall skeleton components parenterally, especially when used as an injection, it is usually The active ingredient can be administered to an adult in the range of 0.1 to 250 μg, preferably in the range of 10 to 200 μg, once a week or once every 4 weeks. More preferably, a range of 25 to 250 μg can be administered.
[0019]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a test example are given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited at all by these.
[0020]
reagent
Squalane: Super Squalane Ex. (Lot. PC9F54, SQUATECH)
Polysorbate 80 (Tween 80): TO-10M (Lot. 9316, Nikko Chemical)
Glycine: Special grade glycine (Nacalai Tesque)
Emulsification equipment
Emulsifier: Robotics, Stirrer: Homomixer MARKII Turbine lid integrated type (Special Machine Industries)
Emulsification container: separable flask with jacket (for ROBOMIX 2L, special machinery industry)
Thermostatic bath: EYEL DIGITAL UNI ACE UA-100
Emulsification conditions
Formulation: Examples of the composition of the raw material per liter when BCG-CWS is used as an active ingredient are exemplified in Table 1 below.
[0021]
[Table 1]

freeze drying
Freeze dryer: GT-6 manufactured by Fintech
Heavyweight container
Vials: VSC18-CS (Fuji Glass)
Rubber stopper: V10-F8 (Daikyo Seiko)
Evaluation of the physical properties
Particle size distribution evaluation: Shimadzu static light scattering particle size distribution analyzer SALD-3000
[0022]
Example 1
BCG-CWS (600 mg) was added as a bacterial cell component to a mixed solution of squalane (16 g) and toluene (200 ml) and dispersed by shaking or ultrasonic waves for 15 minutes. Then, it heated to 60 degreeC under nitrogen stream, and toluene was distilled off. Subsequently, 786 mL of 0.02% w / w polysorbate 80 (Tween 80) aqueous solution was added, and rough emulsification was performed at 7000 rpm for 10 minutes at 65 ° C. using a homomixer (Robomix). Then, 15 mL of 10% w / w polysorbate 80 (Tween 80) aqueous solution was added, and this emulsification was performed at 65 ° C. for 5 minutes at 12000 rpm using a homomixer (Robomix). After this emulsification, after confirming that the particle size distribution is desired, 183 mL of 10% w / w polysorbate 80 (Tween 80) aqueous solution was added, and the mixture was homogenized at 5000 rpm for 1 minute at 65 ° C. using a homomixer (TK ROBO MICS). The final polysorbate 80 (Tween 80) concentration was adjusted to 2.0% w / w. Thereafter, after cooling the product temperature to 30 ° C. or lower, 1000 mL of 2400 mM glycine aqueous solution is gradually added to the preparation side and mixed thoroughly, so that the drug substance concentration is finally 0.3 mg / mL, and the squalane concentration is 0.8%. An oil-in-water emulsion formulation having w / w, polysorbate 80 (Tween 80) concentration of 1.0% w / w, and glycine concentration of 1200 mM was obtained.
[0023]
Reference Example 1 (Vehicle preparation in the presence of glycine)
In order to confirm that the cause of destabilization of the preparation of insoluble substances during or immediately after emulsification was not due to the drug substance, a vehicle was prepared in the presence of glycine as follows. Furthermore, the influence of the timing of glycine addition was also examined.
A 2% w / w squalane, 1% w / w polysorbate 80 (Tween 80) vehicle (1 L scale) was prepared by the following three methods.
(1) Glycine pre-addition: 0.2% w / w Polysorbate 80 (Tween 80) / 1200 mM glycine aqueous solution is used for this emulsification
(2) Glycine and post-addition (slurry) ... After emulsification without glycine, glycine is directly added to the formulation in a slurry state (powder) (the product temperature at this time is about 65 ° C)
(3) Glycine and post-addition (solution): After preparing a concentrated preparation containing twice the amount of oil and surfactant, add an equal amount of 2400 mM glycine solution (product temperature 25 ° C.)
Unless otherwise specified, the set temperature in this emulsification is 65 ° C. (Product temperature: 65-70 ° C)
The results of the test are shown below.
(1) As a result of the main emulsification with a polysorbate 80 (Tween 80) solution containing glycine, the conventional emulsification with 0.2% w / w polysorbate 80 (Tween 80) does not provide a sufficiently sharp particle size distribution, and polysorbate Although emulsification was carried out by increasing the concentration of 80 (Tween 80), no improvement was observed. Furthermore, when this emulsification was carried out at 1% w / w, which is the final concentration of polysorbate 80 (Tween 80), the particle size distribution changed, and it was observed that insoluble substances were floating in the preparation. The result of the particle size distribution is shown in FIG.
(2) When emulsification was performed using a glycine-free polysorbate 80 (Tween 80) solution, the particle size distribution was not sufficiently sharpened after 10 minutes of emulsification. This is thought to be due to emulsification with a concentrated formulation of squalane 4% w / w. Therefore, when the emulsification was extended for 20 minutes, it was found that the original sharp particle size distribution was obtained. Thereafter, the particle size distribution did not change even when the concentration of polysorbate 80 (Tween 80) was 1% w / w. Furthermore, 90 g of glycine (equivalent to 1200 mM) was added as a slurry and mixed with a mixer (rotation speed: 3000 rpm, not emulsification), but there was no change in the particle size distribution. However, when the number of revolutions of the mixer was increased (12000 rpm) from this state and emulsified, the particle size distribution changed and insoluble substances similar to the results in (1) began to be produced. The result of the particle size distribution change is shown in FIG.
(3) With reference to the result in (2), the polysorbate 80 (Tween 80) concentration in the main emulsification in the absence of glycine was doubled to 0.4% w / w. A sharp particle size distribution similar to 2 ▼ was obtained. Thereafter, the polysorbate 80 (Tween 80) concentration was adjusted to the final concentration (1%), and an equal amount of glycine 2400 mM solution was added to the preparation and mixed, but there was no change in the particle size distribution. Furthermore, referring to the result of the final step (2), the product temperature was cooled to around 15 ° C. and then fine emulsification was performed for 10 minutes. Neither production was observed. The result of the particle size distribution change is shown in FIG.
When the preparations prepared by the production methods (1) and (3) were compared, it was clearly found that insoluble substances were floating above the preparations produced by the production method (1).
From the above results, the instability of the preparation observed in the emulsification in the presence of glycine did not occur due to the influence of the drug substance, but possibly other components (polysorbate 80 (Tween 80) due to the high concentration of glycine. ) Or squalene), and it was thought that the preparation was destabilized.
In addition, from the results of (2) and (3), when the three conditions of “high concentration glycine”, “high temperature (65 to 70 ° C.)” and “emulsification at high rotational speed” are met, the formulation becomes unstable. Was shown to do.
[0024]
Reference Example 2 Cloud point measurement of polysorbate 80 (Tween 80) in the presence of glycine
Nonionic surfactants such as polysorbate 80 (Tween 80) are dissolved due to the hydrophilicity of the polyoxyethylene group, which is a hydrophilic group. This occurs when a water molecule is hydrogen-bonded to an ether-bonded oxygen atom in the group. This hydrogen bond breaks when the temperature of the aqueous solution rises and the movement of water molecules becomes active, and the surfactant molecules that have been dissolved in micelles until then lose hydration and become cloudy and precipitate. This temperature is referred to as cloud point, but the effect of the glycine concentration on the cloud point of polysorbate 80 (Tween 80) was examined.
The cloud point of polysorbate 80 (Tween 80) at 300 mM to 1200 mM glycine was measured according to the method described in “Introduction to New Surfactant” (Takehiko Fujimoto (Sanyo Chemical Industries), P95).
It is generally known that the cloud point of a surfactant is constant without being affected by the concentration in the range of about 0.5 to 5% w / w. In the examination here, it was decided to measure at 0.2% w / w which is the set concentration in the actual main emulsification.
The test results are shown below.
As shown in FIG. 6, a good correlation was observed between the glycine concentration and the cloud point, and it was found that the cloud point of polysorbate 80 (Tween 80) was lowered against the increase in the glycine concentration. From this, it was found that there was a high possibility that polysorbate 80 (Tween 80) was precipitated at a glycine concentration of about 600 mM or more under the conditions of 65 to 70 ° C., which is the emulsification temperature at the time of preparing the BCG-CWS emulsion.
From the above results, it was shown that in the preparation preparation so far, polysorbate 80 (Tween 80) was precipitated and the emulsifying power was remarkably reduced in the fine emulsification at 600 mM or more of glycine.
[0025]
【The invention's effect】
The present invention is a stabilized mass production method of an emulsified preparation. Its feature is that after preparing a concentrated emulsion formulation only with a solvent-insoluble solid substance, oily substance, and non-ionic surfactant aqueous solution, it is mixed with an aqueous solution containing a substance that lowers the cloud point of the non-ionic surfactant. As a result, it was possible to eliminate the instability of the formulation such as the formation of deposits and shrinkage of the cake during freeze-drying.
That is, according to the present invention, a practical mass production method of an emulsified preparation effective as a pharmaceutical becomes possible, and in particular, an emulsified preparation for cancer immunotherapy using bacterial cell components can be provided as a pharmaceutical. It was.
[0026]
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the change in particle size distribution due to emulsification in the presence of glycine in (1) of Reference Example 1. FIG.
FIG. 2 shows changes in particle size distribution when emulsified with a glycine-free polysorbate 80 (Tween 80) solution in Reference Example (2), and changes in particle size distribution when glycine is added after slurry emulsification. It is a graph showing.
FIG. 3 is a graph showing the change in particle size distribution in the case of (2) in Reference Example 1 when a glycine solution is added after emulsification.
4 is a graph showing the correlation between the cloud point and the glycine concentration in Reference Example 2. FIG.

Claims

A method for producing an emulsified preparation, characterized by the following steps.
(A) After stirring and emulsifying a mixture of an aqueous solution containing an oily substance and a nonionic surfactant, or a mixture of an oily substance containing a solvent-insoluble solid substance and an aqueous solution containing a nonionic surfactant,
(B) Cool to a temperature below the cloud point, add an aqueous solution containing a substance that lowers the cloud point of the nonionic surfactant, and mix and stir.

The method for producing an emulsified preparation according to claim 1, wherein the nonionic surfactant is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester.

The method for producing an emulsified preparation according to claim 1, wherein the nonionic surfactant is polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80).

The manufacturing method of the emulsion formulation in any one of Claims 1-3 whose substance which lowers the cloud point of a nonionic surfactant is electrolyte.

The method for producing an emulsified preparation according to claim 4, wherein the electrolyte is an amino acid or an inorganic salt.

The method for producing an emulsified preparation according to claim 4, wherein the electrolyte is an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt.

The method for producing an emulsified preparation according to any one of claims 1 to 6, wherein the solvent-insoluble solid substance is a bacterial cell component.

The method for producing an emulsified preparation according to claim 7, wherein the bacterial cell component is BCG-CWS or Nocardia Rubler-CWS.