JP2004065202A - Transgenic animal expressing androgen receptor complex binding protein - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【関連出願】
この出願は、２００１年２月１２日に出願された米国出願第０９／７８１，６９３号および２００１年１月１７日に出願された米国仮出願第６０／２６２，３１２号の一部継続出願であり、これらに基づく優先権を主張するものである。これら親出願を、本明細書の一部として本願に援用する。
【０００２】
【発明の背景】
健康な細胞に比較して、腫瘍細胞で過剰に発現する種々の遺伝子が同定されている。このような遺伝子の同定は、抗腫瘍薬の開発および癌診断のための薬物ターゲットを提供することが期待される。肝臓腫瘍細胞におけるステロイド受容体（例えばアンドロゲン受容体）の数は、それらに隣接した健康な肝臓細胞に比較して増大するように思える。
【０００３】
ステロイドホルモンは、一般に、それらの特異的核内受容体に結合して複合体を形成し、次いで該複合体が転写因子として作用することによって、その生理学的効果を発揮する。この複合体は、ステロイド応答性遺伝子のプロモータにおける特異的なヌクレオチド配列に結合して、これら遺伝子の転写を促進する。
【０００４】
【発明の概要】
本発明はアンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質（ＡＲＣＡＰ）をコードするマウス遺伝子の発見に基づいており、これはヒトＡＲＣＡＰに対して８５％の同一性を有する。ヒトＡＲＣＡＰは、（隣接する正常細胞に比較して）肝細胞腫細胞で過剰発現され、アンドロゲン受容体に結合し、該受容体がアンドロゲン応答性遺伝子をトランス活性化する能力を増強することが分かっている。ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子の相同体としてのマウスＡＲＣＡＰ遺伝子を使用して、癌（例えば肝臓癌）を治療する薬物を開発するための動物モデルとして役立つトランスジェニックマウスを創製することができる。
【０００５】
全長のマウスＡＲＣＡＰ・ｃＤＮＡ（配列番号１）を、開始コドンおよび停止コドンに下線を付して下記に示す。
【０００６】
マウスＡＲＣＡＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列（即ち、配列番号１のＡＴＧ開始コドンから停止コドンの直前のコドンまで）は、配列番号２で指定される。上記ｃＤＮＡによってコードされるマウスＡＲＣＡＰタンパク質（配列番号３で指定）を下記に示す。
【０００８】
従って、本発明は、配列番号３と少なくとも７０％（例えば少なくとも７５、８０、９０、９５、９８、または１００％）一致するアミノ酸配列を含む、実質上純粋なポリペプチドまたはタンパク質を特徴とする。もし、このポリペプチドが配列番号３と１００％一致する配列を含むならば、該ポリペプチドは、保存的なアミノ酸の置換を３０個まで含むことができる。本発明は、その配列が配列番号２からなるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる純粋なポリペプチドをも含む。このポリペプチドはアンドロゲン受容体と結合し、アンドロゲン受容体がもつアンドロゲン応答遺伝子をトランス活性化する能力を増強する。これらのポリペプチドは、ＡＲＣＡＰ抗体（モノクローナルでもポリクローナルでも）を製造するために使用することができる。これらの抗体は、組織および細胞区画におけるＡＲＣＡＰの存在および分布を検出するために有用である。例えば、このような抗体は、ＡＲＣＡＰ癌タンパク質が組織中で発現または過剰発現されているかどうかを決定することにより、癌性の肝臓組織を診断するために使用することができる。また、以下で述べるように、それらは癌（例えば肝臓癌）を治療するために使用することができる。
【００１０】
本発明は更に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸、本発明の核酸を含むベクター、および本発明の核酸を含む細胞（動物モデル中または培養中の）を特徴とする。本発明の核酸の例には、その配列が配列番号２または配列番号２の相補的配列からなる一本鎖プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする一本鎖をもった、単離された核酸が含まれる。このような核酸は、少なくとも１５（例えば少なくとも３０、５０、１００、２００、５００、または１０００）ヌクレオチドの長さであればよい。これらの核酸、ベクター、及び細胞は、動物モデルを創製するため、癌（例えば肝臓癌）を診断するため、または本発明のポリペプチドを製造するために使用することができる。例えば、本発明の核酸は、ＡＲＣＡＰ・ｍＲＮＡが組織または細部中で発現されるかどうかを決定することによって、肝臓癌を診断するために使用することができる。該核酸は、ＰＣＲに基づく検出法におけるプライマーとして、または核酸ブロット（例えばノーザンブロット）におけるラベルされたプローブとして使用することができる。
【００１１】
更に、本発明は、そのゲノムが本発明の核酸を含む導入遺伝子を含み、野生型の動物に比較して増大したアンドロゲン応答性を示すトランスジェニック動物（例えばマウスのような齧歯類）をも特徴とする。このトランスジェニック動物は、核酸から転写物が産生され且つ該転写物がタンパク質に翻訳されるように、本発明の核酸を細胞に導入することによって創製される。これらのトランスジェニック動物は、癌（例えば肝臓癌）を治療する薬物を開発するためのモデルとして使用することができる。
【００１２】
本発明は更に、上記の細胞を培養し、該細胞内で上記ポリペプチドを発現し、培養物から上記ポリペプチドを単離することによって、本発明のポリペプチドを生産する方法をも特徴とする。
【００１３】
本発明は更に、動物サンプル（例えば血液サンプル）が癌性細胞を含んでいるかどうかを決定する方法を特徴とする。この方法は、動物（例えばマウスのような齧歯類）からサンプルを準備することと、該サンプル中におけるＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルを決定することとを含む。サンプル中のＡＲＣＡＰ遺伝子の発現レベルが正常サンプルよりも高ければ、それは該動物サンプルが癌性細胞（例えば肝臓腫瘍細胞）を含むことを示す。この方法は、動物モデルにおける癌の診断、または癌治療のモニタリングのために使用することができる。
【００１４】
また、動物（例えばマウスのような齧歯類）における癌（例えば肝臓癌）を治療する方法も、本発明の範囲内である。この方法は、ＡＲＣＡＰ遺伝子を発現する癌細胞を有する動物を同定することと、該動物を、アンドロゲン受容体へのＡＲＣＡＰの結合をブロックしてアンドロゲン受容体がアンドロゲン応答性遺伝子をトランス活性化する能力を低下させる組成物で治療することとを含む。この組成物は、本発明の抗体または本発明のアンチセンス核酸を含むことができる。この方法は、薬物（遺伝子治療のために使用されるものを含む）をスクリーニングするため、および動物モデルにおけるそれらの薬効を試験するために使用することができる。
【００１５】
所定のポリペプチドに関して、ここで使用される「実質的に純粋な」の用語は、当該ポリペプチドが、他の生物学的高分子を実質上含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０、８５、９５、または９９％）の純度である。純度は、適切な標準的方法の何れによって測定してもよく、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定すればよい。
【００１６】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を持つ他の残基と置き換わることである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当該技術において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもったアミノ酸が含まれる。
【００１７】
「ストリンジェントな条件」下のハイブリダイゼーションとは、６５℃、０．５×ＳＳＣでハイブリダイゼーションした後、４５℃、０．１×ＳＳＣで洗浄することを意味する。
【００１８】
二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列の「一致性パーセント」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）において改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０）を使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕら（Ｊ， Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ， ２１５：４０３−４１０，１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムのスコア＝１００、文字数＝１２で行われる。二つの配列の間にギャップが存在する場合には、Ａｌｔｓｃｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されたＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムが利用されるとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターが使用される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【００１９】
「単離された核酸」とは、その構造が天然に存在する如何なる核酸とも一致せず、または天然に存在する三つ以上の分離された遺伝子に亘るゲノム核酸の如何なる断片とも一致しない核酸である。従ってこの用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有してはいるが、該ＤＮＡ分子が天然に存在している生物のゲノム内では当該分子の一部の両端に隣接しているコード配列の何れもが隣接位置に存在しないＤＮＡ。；（ｂ）得られる分子が天然に存在する如何なるベクターもしくはゲノムＤＮＡとも一致しないように、原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ、またはベクターに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡのような独立した分子、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製される断片、または制限断片；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子の一部である組換え核酸配列（即ち、融合タンパク質）をコードする遺伝子をカバーする。この定義から特に除かれるものは、様々な（ｉ）ＤＮＡ分子、（ｉｉ）形質導入細胞、または（ｉｉｉ）クローン細胞の混合物中に存在する核酸、例えばｃＤＮＡのようなＤＮＡライブラリーもしくはゲノムＤＮＡライブラリーＤＮＡの中に存在するものである。
【００２０】
本発明の他の特徴または利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２１】
【詳細な記述】
本発明は、ＡＲＣＡＰ遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物、および肝臓癌を治療または予防する薬物を開発するために該動物を使用する方法に関する。
【００２２】
ここで使用する「トランスジェニック非ヒト動物」の用語は、創始トランスジェニック非ヒト動物および該創始動物の子孫、並びにこのような動物の細胞および組織を含むものである。トランスジェニック非ヒト動物は、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびウサギのような家畜、ラット、モルモットおよびマウスのような齧歯類、並びにヒヒ、サルおよびチンパンジーのような非ヒト霊長類であることができる。トランスジェニックブタおよびトランスジェニックマウスが特に有用である。
【００２３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、そのゲノム内に組込まれたＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸を含んでいる。ここで使用する「ＡＲＣＡＰタンパク質」の用語は、野生型ＡＲＣＡＰタンパク質またはその機能的に等価な変種、例えば当該全長タンパク質の断片を意味する。
【００２４】
それは、ゲノム中のイントロン配列（もしあれば）を同定し、これを、ＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸の中に含めるために有用であり得ることが想定される。
【００２５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、当該核酸は、例えば肝臓においてＡＲＣＡＰ遺伝子の発現を促進し得る調節要素に動作可能に連結される。ここで、「動作可能に連結される」の用語は、当該核酸が転写されるような、当該調節要素および核酸の配置を意味する。調節要素は、ＰＥＰＣＫおよびアルブミンプロモータのような肝臓特異的なプロモータであることができる。
【００２６】
本発明はまた、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を創製するのに適した発現ベクターをも特徴とする。
【００２７】
この発現ベクターは、上記のＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸に動作可能に連結された、肝臓での発現を媒介できるプロモータを含むことができる。
【００２８】
発現ベクターを非ヒト動物に導入してトランスジェニック非ヒト動物の創始ラインを製造するために、当該技術で知られている種々の技術を使用することができる。このような技術には、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス媒介性の生殖系列への遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：６１４８， １９８５）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５６：３１３， １９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ３：１８０３， １９８３）、インビトロでの体細胞の形質変換およびこれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３８５（６６１９）：８１０−８１３， １９９７； ａｎｄ Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９４：３６９−３７４， １９９８）が含まれるが、これらに限定されない。一例において、発現ベクターは非ヒト動物の卵子または胚の中にマイクロインジェクションされ、または非ヒト動物の胚性幹細胞の中にマイクロインジェクションされる。
【００２９】
トランスジェニック非ヒト動物が作製されたら（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ （Ｗｉｌｅｙ， ＵＳＡ）およびＭａｎｕｐｌａｔｅ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （Ｈｏｇａｎ Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ Ｌａｃｙ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）に従って作製されたトランスジェニックマウス）、標準の技術を使用して、ＡＲＣＡＰ遺伝子の発現を評価することができる。導入遺伝子の組み込みが起きたかどうかを決定するための最初のスクリーニングを、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成することができる。サザン分析の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ； ＮＹ，の９．３７節〜９．５２節を参照されたい。トランスジェニック非ヒト動物の組織におけるＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸の発現は、当該動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（これらに限定されない）を含む技術を使用して評価することができる。
【００３０】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、肝臓癌のためのモデルとして使用することができる。特に、これらの動物は、肝臓癌の治療または予防のために有効な化合物または組成物を同定するために使用することができる。化合物または組成物は、被験化合物または被験組成物を本発明トランスジェニック非ヒト動物に投与することによって、または被験化合物または被験組成物を当該トランスジェニック非人動物から誘導された器官、組織（例えば肝臓）または細胞（例えば肝臓細胞）と接触させることによって同定することができる。これらトランスジェニック非ヒト動物、器官、組織または細胞に対する、被験化合物または被験組成物の効果が評価される。例えば、トランスジェニック非ヒト動物において、臨床病理学的同定による癌の大きさを評価することができる。癌症候群を軽減する被験化合物または組成物は、肝臓癌の治療または予防に有効である可能性がある。
【００３１】
被験化合物は、薬学的に許容可能な無毒の賦形剤もしくはキャリアと混合することによって薬学的組成物に処方し、何れかの経路によって本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与することができる。例えば、皮下、筋肉内、血管内、皮内、鼻腔内もしくは腹腔内投与のような非経腸的経路、並びに舌下、経口もしくは直腸内投与のような経腸的経路を使用することができる。
【００３２】
更なる詳細がなくても、当業者は、ここでの説明に基づいて本発明をその全範囲において利用できるものと思われる。ここで引用した全ての刊行物は、その全体が本明細書の一部をなすものとして本願に援用される。
【００３３】
＜他の実施例＞
この明細書に開示した全ての特徴は、如何なる組み合わせで組み合わせてもよい。この明細書に開示した夫々の特徴は、同一、均等、または類似の目的に資する別の特徴で置き換えてもよい。従って、特に述べない限り、開示された各特徴は均等または類似の特徴の一例に過ぎない。
【００３４】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、またその精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途および条件に適合させるために本発明の種々の変更、改変を行うことができる。従って、他の実施例もまた冒頭の特許請求の範囲内にあるものである。[0001]
[Related application]
This application is a continuation-in-part of US application Ser. No. 09 / 781,693 filed on Feb. 12, 2001 and US Provisional Application No. 60 / 262,312 filed on Jan. 17, 2001. And claims priority based on these. These parent applications are hereby incorporated by reference as part of the present specification.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Various genes have been identified that are overexpressed in tumor cells as compared to healthy cells. Identification of such genes is expected to provide drug targets for the development of antitumor drugs and cancer diagnosis. The number of steroid receptors (eg, androgen receptors) in liver tumor cells seems to be increased compared to healthy liver cells adjacent to them.
[0003]
Steroid hormones generally exert their physiological effects by binding to their specific nuclear receptors to form a complex, which then acts as a transcription factor. This complex binds to specific nucleotide sequences in the promoter of steroid responsive genes and promotes transcription of these genes.
[0004]
Summary of the Invention
The present invention is based on the discovery of a murine gene encoding androgen receptor complex binding protein (ARCAP), which has 85% identity to human ARCAP. Human ARCAP is overexpressed in hepatocellular cells (compared to adjacent normal cells) and is found to bind to androgen receptor and enhance its ability to transactivate androgen responsive genes ing. The mouse ARCAP gene as a homolog of the human ARCAP gene can be used to create transgenic mice that serve as animal models for developing drugs to treat cancer (eg, liver cancer).
[0005]
The full-length mouse ARCAP cDNA (SEQ ID NO: 1) is shown below with the start and stop codons underlined.
[0006]
The nucleotide sequence encoding the mouse ARCAP protein (ie, from the ATG start codon to the codon immediately before the stop codon in SEQ ID NO: 1) is specified in SEQ ID NO: 2. The mouse ARCAP protein (designated by SEQ ID NO: 3) encoded by the above cDNA is shown below.
[0008]
Accordingly, the invention features a substantially pure polypeptide or protein comprising an amino acid sequence that matches at least 70% (eg, at least 75, 80, 90, 95, 98, or 100%) of SEQ ID NO: 3. If the polypeptide contains a sequence that is 100% identical to SEQ ID NO: 3, the polypeptide can contain up to 30 conservative amino acid substitutions. The invention also includes a pure polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a probe whose sequence consists of SEQ ID NO: 2. This polypeptide binds to the androgen receptor and enhances the ability of the androgen receptor to transactivate androgen responsive genes. These polypeptides can be used to produce ARCAP antibodies (monoclonal or polyclonal). These antibodies are useful for detecting the presence and distribution of ARCAP in tissues and cellular compartments. For example, such antibodies can be used to diagnose cancerous liver tissue by determining whether the ARCAP oncoprotein is expressed or overexpressed in the tissue. Also, as described below, they can be used to treat cancer (eg, liver cancer).
[0010]
The invention further features an isolated nucleic acid encoding a polypeptide of the invention, a vector containing the nucleic acid of the invention, and a cell (in an animal model or in culture) containing the nucleic acid of the invention. An example of a nucleic acid of the invention is an isolated nucleic acid whose sequence hybridizes under stringent conditions to a single-stranded probe consisting of SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence of SEQ ID NO: 2. Nucleic acids. Such a nucleic acid can be at least 15 (eg, at least 30, 50, 100, 200, 500, or 1000) nucleotides in length. These nucleic acids, vectors, and cells can be used to create animal models, diagnose cancer (eg, liver cancer), or produce polypeptides of the invention. For example, the nucleic acids of the invention can be used to diagnose liver cancer by determining whether ARCAP mRNA is expressed in tissue or in details. The nucleic acid can be used as a primer in a PCR-based detection method or as a labeled probe in a nucleic acid blot (eg, Northern blot).
[0011]
In addition, the present invention provides transgenic animals (eg, rodents such as mice) that have a transgene whose genome comprises a transgene comprising a nucleic acid of the present invention and exhibit increased androgen responsiveness as compared to wild-type animals. Features. The transgenic animal is created by introducing a nucleic acid of the invention into a cell such that a transcript is produced from the nucleic acid and the transcript is translated into a protein. These transgenic animals can be used as models for developing drugs to treat cancer (eg, liver cancer).
[0012]
The invention further features a method of producing a polypeptide of the invention by culturing the above cells, expressing the polypeptide in the cells, and isolating the polypeptide from the culture. .
[0013]
The invention further features a method of determining whether an animal sample (eg, a blood sample) contains cancerous cells. The method includes providing a sample from an animal (eg, a rodent such as a mouse) and determining the level of expression of the ARCAP gene in the sample. If the level of expression of the ARCAP gene in the sample is higher than in a normal sample, it indicates that the animal sample contains cancerous cells (eg, liver tumor cells). This method can be used for diagnosing cancer in animal models or monitoring cancer treatment.
[0014]
Also, methods of treating cancer (eg, liver cancer) in an animal (eg, a rodent such as a mouse) are within the scope of the invention. The method includes identifying an animal having a cancer cell that expresses the ARCAP gene, and identifying the animal with the ability of the androgen receptor to transactivate an androgen responsive gene by blocking ARCAP binding to the androgen receptor. Treating with a composition that reduces The composition can include an antibody of the invention or an antisense nucleic acid of the invention. This method can be used to screen drugs, including those used for gene therapy, and to test their efficacy in animal models.
[0015]
The term "substantially pure" as used herein with respect to a given polypeptide means that the polypeptide is substantially free of other biological macromolecules. A substantially pure polypeptide is at least 75% (eg, at least 80, 85, 95, or 99%) pure by dry weight. Purity may be measured by any appropriate standard method, for example by column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis.
[0016]
A “conservative amino acid substitution” is one in which one amino acid residue is replaced by another having a chemically similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, Cysteine), non-polar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), and aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, Tryptophan, histidine).
[0017]
Hybridization under “stringent conditions” means that hybridization is carried out at 65 ° C. and 0.5 × SSC, followed by washing at 45 ° C. and 0.1 × SSC.
[0018]
The "percent identity" of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences is determined by the algorithm of Karlin and Altschl (Proc, modified in Karlin and Altschl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993)). Natl.Acad.Sci.USA 87: 2264-2268, 1990). Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs of Altschu et al. (J, Mol, Biol, 215: 403-410, 1990). BLAST nucleotide searches are performed with the NBLAST program score = 100, number of characters = 12. If there is a gap between the two sequences, Gapped BLAST described in Altschu et al. (Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402, 1997) is used. When BLAST and Gapped BLAST programs are utilized, the default parameters of the respective programs (eg, XBLAST and NBLAST) are used. http: // www. ncbi. nlm. nih. gov. Please refer to.
[0019]
An "isolated nucleic acid" is a nucleic acid whose structure does not match any naturally occurring nucleic acid or does not match any fragment of a genomic nucleic acid spanning three or more isolated genes that occur naturally. . Thus, the term may include, for example, (a) a sequence that is part of a naturally occurring genomic DNA molecule, but is part of the molecule in the genome of an organism in which the DNA molecule naturally occurs. DNA in which none of the coding sequences adjacent to both ends of the DNA are present at adjacent positions. (B) prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, or a nucleic acid integrated into the vector, such that the resulting molecule does not match any naturally occurring vector or genomic DNA; Molecules, genomic fragments, fragments produced by the polymerase chain reaction (PCR), or restriction fragments; and (d) genes encoding recombinant nucleic acid sequences (ie, fusion proteins) that are part of a hybrid gene. Particularly excluded from this definition are DNA libraries or genomic DNA libraries, such as nucleic acids, eg, cDNA, present in a mixture of various (i) DNA molecules, (ii) transduced cells, or (iii) cloned cells. Rally DNA.
[0020]
Other features or advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims.
[0021]
[Detailed description]
The present invention relates to transgenic non-human animals that express the ARCAP gene and methods of using the animals to develop drugs to treat or prevent liver cancer.
[0022]
The term "transgenic non-human animal" as used herein is intended to include the founder transgenic non-human animal and progeny of the founder, as well as the cells and tissues of such animals. Transgenic non-human animals are domestic animals such as pigs, goats, sheep, cows, horses and rabbits, rodents such as rats, guinea pigs and mice, and non-human primates such as baboons, monkeys and chimpanzees. be able to. Transgenic pigs and mice are particularly useful.
[0023]
The transgenic non-human animal of the invention comprises a nucleic acid encoding an ARCAP protein integrated into its genome. As used herein, the term “ARCAP protein” refers to a wild-type ARCAP protein or a functionally equivalent variant thereof, eg, a fragment of the full-length protein.
[0024]
It is envisioned that it may be useful to identify intron sequences (if any) in the genome and include this in the nucleic acid encoding the ARCAP protein.
[0025]
In the transgenic non-human animals of the invention, the nucleic acid is operably linked to a regulatory element capable of promoting ARCAP gene expression, for example, in the liver. Here, the term "operably linked" means the arrangement of the regulatory element and the nucleic acid such that the nucleic acid is transcribed. The regulatory element can be a liver-specific promoter, such as the PEPCK and albumin promoters.
[0026]
The invention also features an expression vector suitable for creating a transgenic non-human animal of the invention.
[0027]
The expression vector can include a promoter capable of mediating hepatic expression, operably linked to the nucleic acid encoding the ARCAP protein described above.
[0028]
Various techniques known in the art can be used to introduce the expression vector into the non-human animal to produce a founding line of the transgenic non-human animal. Such techniques include pronuclear microinjection (US Pat. No. 4,873,191), retrovirus-mediated gene transfer into the germline (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 82: 6148, 1985), gene targeting to embryonic stem cells (Thompson et al., Cell, 56: 313, 1989), electroporation of embryos (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803, 1983). ), In vitro transformation of somatic cells followed by nuclear transfer (Wilmut et al., Nature, 385 (6619): 810-813, 1997; and Wakayama et al., Nature, 394: 369-374, 1). 98) include, but are not limited to. In one example, the expression vector is microinjected into an egg or embryo of a non-human animal or microinjected into embryonic stem cells of a non-human animal.
[0029]
Once transgenic non-human animals have been produced (eg, Transgenic mice produced using Current Protocol (Wiley, USA) and Manufacture the Mouse Embryo (using a standard technique produced using Hogan Bedington and Costantini Lacy, CSHL Press)). , ARCAP gene expression can be evaluated. Initial screening to determine whether transgene integration has occurred can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques. For a description of Southern analysis, see, for example, Sambrook et al. 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview; NY, pp. 9.37-9.52. Expression of the nucleic acid encoding the ARCAP protein in tissues of the transgenic non-human animal can be determined by Northern blot analysis, in situ hybridization analysis, and reverse transcriptase PCR (RT-PCR) of tissue samples obtained from the animal. ) Can be evaluated using techniques including:
[0030]
The transgenic non-human animal of the present invention can be used as a model for liver cancer. In particular, these animals can be used to identify compounds or compositions that are effective for treating or preventing liver cancer. The compound or composition can be obtained by administering the test compound or test composition to a transgenic non-human animal of the present invention, or by administering the test compound or test composition to an organ, tissue (eg, liver) derived from the transgenic non-human animal. ) Or cells (eg, liver cells). The effect of the test compound or test composition on these transgenic non-human animals, organs, tissues or cells is evaluated. For example, in a transgenic non-human animal, the size of the cancer can be evaluated by clinicopathological identification. A test compound or composition that reduces a cancer syndrome may be effective in treating or preventing liver cancer.
[0031]
A test compound can be formulated into a pharmaceutical composition by mixing with a non-toxic pharmaceutically acceptable excipient or carrier, and administered to the transgenic non-human animal of the present invention by any route. For example, parenteral routes such as subcutaneous, intramuscular, intravascular, intradermal, intranasal or intraperitoneal administration, and enteral routes such as sublingual, oral or rectal administration may be used. .
[0032]
Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the description herein, utilize the present invention to its fullest extent. All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0033]
<Other embodiments>
All features disclosed in this specification may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by another feature serving the same, equivalent, or similar purpose. Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is one example only of equivalent or similar features.
[0034]
From the above description, those skilled in the art can easily ascertain the essential features of the present invention and, without departing from the spirit and scope thereof, adapt the various features of this invention to its various uses and conditions. Can be changed or modified. Accordingly, other embodiments are also within the scope of the following claims.
Claims (50)
動物からのサンプルを準備することと、
前記サンプル中におけるアンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質遺伝子の発現レベルを決定することとを含み、
前記サンプル中における前記アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質遺伝子の発現レベルは、それが正常サンプルにおけるよりも高ければ、前記動物サンプルが癌性細胞を含むことを示す方法。A method for determining whether an animal sample contains cancerous cells, comprising:
Preparing a sample from the animal;
Determining the expression level of an androgen receptor complex binding protein gene in the sample,
A method wherein the level of expression of said androgen receptor complex binding protein gene in said sample is higher than in a normal sample, indicating that said animal sample contains cancerous cells.
アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質遺伝子を発現する癌細胞を有する動物を同定することと、
前記動物を、前記アンドロゲン受容体複合体結合性タンパク質のアンドロゲン受容体への結合を阻止し、またはアンドロゲン応答性遺伝子をトランス活性化するアンドロゲン受容体の能力を低下させる組成物で治療することとを含む方法。A method of treating cancer in an animal, comprising:
Identifying an animal having a cancer cell that expresses an androgen receptor complex binding protein gene;
Treating the animal with a composition that blocks binding of the androgen receptor complex binding protein to the androgen receptor or reduces the ability of the androgen receptor to transactivate androgen responsive genes. Including methods.
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| JP2002233039A JP2004065202A (en) | 2002-08-09 | 2002-08-09 | Transgenic animal expressing androgen receptor complex binding protein |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019017385A (en) * | 2017-07-14 | 2019-02-07 | 張泰階Ｔａｉ−Ｊａｙ Ｃｈａｎｇ | Human ARCAP transgenic mouse |
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2002
- 2002-08-09 JP JP2002233039A patent/JP2004065202A/en active Pending
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