JP2004065194A

JP2004065194A - Method for analysis of adipocyte-relating factor

Info

Publication number: JP2004065194A
Application number: JP2002232747A
Authority: JP
Inventors: Masako Nishizawa; 西澤　雅子
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2004-03-04

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an evaluation method useful for searching a substance capable of suppressing the progress of obesity, insulin resistance and diabetes or curing the diseases. <P>SOLUTION: The method analyzing the expression amount of an adipocyte-relating factor comprises (1) the 1st step of contacting the adipocyte with a protein composed of a specific amino acid sequence and a test substance and (2) the 2nd step of determining the amount of the adipocyte-relating factor in the adipocyte or determine an index having a correlation with the amount after the 1st step. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪細胞関連因子の発現量の分析方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１１βＨＳＤ−１は、コルチゾール生成酵素であり、内臓脂肪型肥満やそれに伴うインシュリン抵抗性、糖尿病、高脂血症病態に関わる因子である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｖｏｌ．２９４，　ｐ．２１６６，　２００１）。
ａＰ２は、脂肪酸結合蛋白質であり、インシュリン抵抗性に関わる因子である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，　ｖｏｌ．４８，　ｐ．１９８７，　１９９９）。
ＤＧＡＴ１は、中性脂肪合成系の最終段階を触媒する酵素、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであり、食事性の肥満に関わっている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　ｖｏｌ．２５，　ｐ．８７，２０００）。
ＰＰＡＲγ２は、脂肪細胞の分化、成熟化を促進する転写因子であり、インシュリン感受性に関わっている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．４，　ｐ．５９７，　１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．４，　ｐ．６１１，　１９９９）。
ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎは、インシュリン感受性を促進する脂肪細胞由来の分泌蛋白であり、動脈硬化性疾患を抑制する（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　ｖｏｌ．８，　ｐ．７３１，　２００２）。
Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪細胞の分化、成熟化を促進する転写因子である（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　ｖｏｌ．６４，　ｐ．３４５，　１９９５）。
ＦＡＳは、脂肪酸合成酵素であり、肥満（体重調節）に関わっている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　ｖｏｌ．８，　ｐ．３３５，　２００２）。
ＧＰＡＴ１は、中性脂肪合成系の中間段階を触媒する酵素グリセロリン酸アシルトランスフェラーゼであり、脂肪細胞の分化過程で活性が上昇する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｖｏ．２７５，　ｐ．９４４１，　２０００）。
ＧＬＵＴ４は、脂肪細胞において糖取り込みを担うトランスポーターの１種であり（Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．９２，　ｐ．５９３，　１９９８）、取り込まれた糖は中性脂肪合成の原料となる。
ＡＤＤ１は、脂肪細胞の分化に関わる転写因子で、コレステロール生合成系遺伝子の発現を制御している（Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　ｖｏｌ．１２，　ｐ．３１８２，　１９９８）。
以上の知見に従えば、これらの因子群の遺伝子発現を制御することにより、肥満、インシュリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化性疾患を効果的に抑制することが可能となる。
一方、配列番号１で表される蛋白質は、脂肪細胞に対して脂肪蓄積促進活性を有することが見出されている（国際公開公報：ＷＯ０２／１０７７２）。また、前駆Ｂリンパ球コロニー形成促進活性を有することが知られていた（国際公開公報：ＷＯ９４／１２５３５）。しかしながら、前記本発明の脂肪細胞関連因子群との関係は全く知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、肥満、インシュリン抵抗性、糖尿病の進行を抑制する能力又は治療する能力を有する物質を探索するために有用な、評価方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質を脂肪細胞へ添加することによって、脂肪細胞関連因子であり、脂肪酸もしくは中性脂肪の合成、脂肪細胞分化、肥満、インシュリン感受（抵抗）性、糖尿病、動脈硬化性疾患等に関与する、１１βＨＳＤ−１遺伝子、ａＰ２遺伝子、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＰＰＡＲγ２遺伝子、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＧＰＡＴ１遺伝子、ＧＬＵＴ４、およびＡＤＤ１遺伝子の発現が有意に増大することを見出した。すなわち、本蛋白質は、これらの脂肪細胞関連因子の発現促進剤となり得ることを見出した。従って、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質は、これらの脂肪細胞関連因子の発現を制御する物質を効率的にスクリーニングするために有用であることを見出した。本発明は上記の知見により、完成するに至ったものである。
【０００５】
即ち、本発明は、
［１］　脂肪細胞関連因子の発現量の分析方法であって、
（１）脂肪細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、脂肪細胞における脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程を有することを特徴とする分析方法、
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列
［２］　第一工程が、脂肪細胞に前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質を接触させた後、当該処理済みの脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする［１］記載の分析方法、
［３］　第一工程が、脂肪細胞に前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質を接触させると同時に又は前に、前記脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする［１］記載の分析方法、
［４］　脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値が脂肪細胞関連因子のｍＲＮＡの、前記脂肪細胞内での存在量であることを特徴とする［１］記載の分析方法、
［５］　脂肪細胞関連因子が１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、およびＡＤＤ１からなる群より選択される１又は複数の因子であることを特徴とする［１］記載の分析方法、
［６］　第一工程が、脂肪細胞に前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞に、被験物質を接触させる工程であることを特徴とする［１］記載の分析方法、
［７］　［１］記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞関連因子の発現量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価することを特徴とする、被験物質における脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力の検定方法、
［８］　異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がブランクであることを特徴とする［７］記載の検定方法、
［９］　［８］記載の検定方法により評価された脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力に基づき脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現制御剤の探索方法、
［１０］　［９］記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体に製剤化されてなることを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現制御剤、
［１１］　抗肥満剤、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤であることを特徴とする、［１０］記載の脂肪細胞関連因子の発現制御剤、
［１２］　下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質を有効成分とすることを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現促進剤、
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列
［１３］　脂肪細胞関連因子の発現を促進するための、下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質の使用、
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列
［１４］　被験物質における、下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質の機能を制御する能力の検定方法であって、［１］〜［６］のいずれかに記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞関連因子の発現量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質における、前記蛋白質の機能を制御する能力を評価することを特徴とする検定方法、
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列
［１５］　異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がブランクであることを特徴とする［１４］記載の検定方法、
［１６］　［１４］又は［１５］記載の検定方法により評価された前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質の機能を制御する能力に基づき該機能を制御する能力を有する物質を選抜することを特徴とする前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質の機能制御剤の探索方法、
［１７］　［１６］記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体に製剤化されてなることを特徴とする前記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質の機能制御剤、
［１８］　［１７］記載の制御剤が、抗肥満剤、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤であることを特徴とする治療剤剤、
［１９］　被験物質における、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力の検定方法であって、
（１）脂肪細胞関連因子を発現し得る脂肪細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、該脂肪細胞における脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記（１）及び（２）の工程により測定された、被験物質として１又は複数の物質、および下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質を各々独立して用いた区における、（２）の値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価する第三工程、
を有することを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力の検定方法、＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列
［２０］　脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値が該因子のｍＲＮＡの、前記脂肪細胞内での存在量であることを特徴とする［１９］記載の検定方法、
［２１］　第三工程において、異なる２種以上の物質を被験物質として用いることを特徴とし、かつそのうち、少なくとも一つの物質がブランクであることを特徴とする［１９］又は［２０］記載の検定方法、
［２２］　［２１］記載の検定方法により評価された脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力に基づき、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する物質を選抜することを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現制御剤の探索方法、
［２３］　［２２］記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体に製剤化されてなることを特徴とする脂肪細胞関連因子の発現制御剤、
［２４］　抗肥満剤、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤であることを特徴とする［２３］記載の脂肪細胞関連因子の発現制御剤、
を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１３８：　９　（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体及び誘導体など）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される（本明細書において、これらを総括して上記特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。）。かかる「ホモログ」としては具体的には、後述のストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」とハイブリダイズするものを挙げることができる。
例えば同族体をコードする遺伝子（オルソログ）として、ヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（オルソログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：　５８７３−５８７７，　１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との相関を示したリストから、ヒト遺伝子に該当するマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【０００７】
本明細書における、「脂肪細胞関連因子」とは、脂肪酸もしくは中性脂肪合成酵素、脂肪細胞の分化に関わる転写因子等、脂肪細胞内における脂肪蓄積量の増減に関与する因子、または、脂肪細胞で発現し生体のインシュリン感受性に関与する因子であり、具体的には１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、およびＡＤＤ１等から選択される１又は複数の因子が挙げられる。
【０００８】
本明細書において「１１βＨＳＤ−１遺伝子」または「１１βＨＳＤ−１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒト１１βＨＳＤ−１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来の１１βＨＳＤ−１遺伝子として公知の遺伝子であり（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ、Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　３２９０）、また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウス１１βＨＳＤ−１遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１５４８３）］等が挙げられる。また、「１１βＨＳＤ−１タンパク質」または単に「１１βＨＳＤ−１」といった用語を用いる場合、ヒト１１βＨＳＤ−１やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ａＰ２遺伝子」または「ａＰ２　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトａＰ２遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のａＰ２遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　２１６７）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスａＰ２遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１１７７０）］等が挙げられる。また、「ａＰ２タンパク質」または単に「ａＰ２」といった用語を用いる場合、ヒトａＰ２やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＤＧＡＴ１遺伝子」または「ＤＧＡＴ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＤＧＡＴ１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＤＧＡＴ１遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　８６９４）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＤＧＡＴ１遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１３３５０）］等が挙げられる。また、「ＤＧＡＴ１タンパク質」または単に「ＤＧＡＴ１」といった用語を用いる場合、ヒトＤＧＡＴ１やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＰＰＡＲγ２遺伝子」または「ＰＰＡＲγ２　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＰＰＡＲγ２遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＰＰＡＲγ２遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　５４６８　）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＰＰＡＲγ２遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１９０１６）］等が挙げられる。また、「ＰＰＡＲγ２タンパク質」または単に「ＰＰＡＲγ２」といった用語を用いる場合、ヒトＰＰＡＲγ２やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子」または「ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　９３７０）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１１４５０）］等が挙げられる。また、「ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎタンパク質」または単に「ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ」といった用語を用いる場合、ヒトａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎやそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「Ｃ／ＥＢＰα遺伝子」または「Ｃ／ＥＢＰα　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＣ／ＥＢＰα遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１０５０）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＣ／ＥＢＰα遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１２６０６）］等が挙げられる。また、「Ｃ／ＥＢＰαタンパク質」または単に「Ｃ／ＥＢＰα」といった用語を用いる場合、ヒトＣ／ＥＢＰαやそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＦＡＳ遺伝子」または「ＦＡＳ　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＦＡＳ遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＦＡＳ遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　２１９４）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＦＡＳ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１４１０４）］等が挙げられる。また、「ＦＡＳタンパク質」または単に「ＦＡＳ」といった用語を用いる場合、ヒトＦＡＳやそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＧＰＡＴ１遺伝子」または「ＧＰＡＴ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＧＰＡＴ１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＧＰＡＴ１遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　１６５５４）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＧＰＡＴ１遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　５５９７９）］等が挙げられる。また、「ＧＰＡＴ１タンパク質」または単に「ＧＰＡＴ１」といった用語を用いる場合、ヒトＧＰＡＴ１やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＧＬＵＴ４遺伝子」または「ＧＬＵＴ４　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＧＬＵＴ４遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＧＬＵＴ４遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　６５１７）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＧＬＵＴ４遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　２０５２８）］等が挙げられる。また、「ＧＬＵＴ４タンパク質」または単に「ＧＬＵＴ４」といった用語を用いる場合、ヒトＧＬＵＴ４やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
本明細書において「ＡＤＤ１遺伝子」または「ＡＤＤ１　ＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、ヒトＡＤＤ１遺伝子やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。具体的には、ヒト由来のＡＤＤ１遺伝子として公知の遺伝子である（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　６７２０）。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ［例えば、マウスＡＤＤ１遺伝子（Ｌｏｃｕｓ　ＩＤ　２０７８７）］等が挙げられる。また、「ＡＤＤ１タンパク質」または単に「ＡＤＤ１」といった用語を用いる場合、ヒトＡＤＤ１やそのホモログなどを包含する趣旨で用いられる。また、ホモログとしては、アイソフォームや、オルソログ等が挙げられる。
【０００９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であるか、及び／または免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」（例えば、同族体（オルソログ）、誘導体、および変異体等）が包含される。なお、本明細書において、これらを上記特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」の「ホモログ」ともいう。
該ホモログとしては、例えば同族体（オルソログ）としては、ヒトのタンパク質に該当するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演鐸的に同定することができる。また、変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
なお、ここで同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、又はＡＤＤ１と生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができ、また上記タンパク質と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、又はＡＤＤ１に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００１０】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ　Ｓｔａｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、又はＡＤＤ１の生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
【００１１】
本発明分析方法において用いられる「下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質」（以下本蛋白質と略する）とは、
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ配列からなる蛋白質）、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ配列のアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質）、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列、及び、
（ｈ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸群に含まれるいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質である（以下、本蛋白質と略することもある。）。
【００１２】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、脂肪細胞関連因子発現を促進する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（１）グリシン、アラニン；（２）バリン、イソロイシン、ロイシン；（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、（４）セリン、スレオニン；（５）リジン、アルギニン；（６）フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００１３】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）］を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。又、ＤＮＡの配列同一性には、アミノ酸の変異を伴わない、コドンのゆらぎを含む。
【００１４】
前記（ｈ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５ＭＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１５】
本蛋白質の調製方法について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）、例えば、（Ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ＩＩ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ配列をコードする塩基配列）、（ＩＩＩ）前記（ＩＩ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ＩＶ）配列番号６で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（Ｖ）配列番号６で示される塩基配列、（ＶＩ）配列番号６で示される塩基配列における第９６番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（ＶＩＩ）前記（ＶＩ）の塩基配列において、その５’末端にＡＴＧが付加された塩基配列等の塩基配列、（ＶＩＩＩ）配列番号９で示される塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１６】
例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本蛋白質を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本蛋白質をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本蛋白質をコードする遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ　Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ　２０，　ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ｐ２０２，　講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００１７】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本蛋白質の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができるが、哺乳動物細胞を用いてもよい。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。
【００１８】
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００１９】
本蛋白質の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、もしくは組み合わせることにより精製すればよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本蛋白質を前記と同様にして精製してもよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
【００２０】
本蛋白質は、脂肪細胞関連因子発現促進剤の有効成分として、例えば、下記に説明するような脂肪細胞における脂肪細胞関連因子発現を抑制する能力を有する物質、又は脂肪細胞関連因子発現を促進する能力を有する物質を探索するための、脂肪細胞関連因子の発現量を効果的に分析する方法等に利用できる。
【００２１】
本発明の第１の態様は、脂肪細胞関連因子の発現量の分析方法、及びそれを用いた脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力の検定方法等に関する。
本発明分析方法は、（１）脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、前記脂肪細胞において発現する脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程を有する。
本発明でいう脂肪細胞は、特に限定されないが、１１βＨＳＤ−１遺伝子、ａＰ２遺伝子、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＰＰＡＲγ２遺伝子、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＧＰＡＴ１遺伝子、ＧＬＵＴ４遺伝子、およびＡＤＤ１遺伝子から選択される１又は複数の遺伝子を発現し得る細胞である。該脂肪細胞の由来としては、具体的にはヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。好ましくは、マウス、ラットの脂肪組織から例えば国際公開公報　ＷＯ０２／１０７７２に記載の方法に従って分離した前駆脂肪細胞が挙げられる。また、あらかじめ株化された脂肪細胞を用いることもできる。このような細胞株として、例えば、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞等をあげることができる。当該細胞株は、市販されているか、又は容易にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）等の細胞寄託機関から入手できる。また本発明分析方法において用いられる脂肪細胞は、組織から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞や、哺乳動物の体内にある細胞であってもよい。場合によっては前記細胞の抽出系でもよい。
【００２２】
該脂肪細胞の培養は、通常の方法（例えば、バイオ実験イラストレイテッド（６）すくすく育て細胞培養，１９９６年、秀潤社刊等に記載されている方法）に準じて行うことができ、具体的には、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養する方法を好ましい態様として挙げることができる。
【００２３】
本発明分析方法の第一工程は、脂肪細胞に本蛋白質を接触させた後、当該処理済みの脂肪細胞に被験物質を接触させる方法でもよいし、また脂肪細胞に本蛋白質を接触させると同時に又は前に、前記脂肪細胞に被験物質を接触させる方法でもよい。即ち、脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる順序は、どちらが先であってもよく、また同時であってもよいが、好ましくは、被験物質を本蛋白質存在下に脂肪細胞と接触させることがよい。
脂肪細胞と接触させる本蛋白質の濃度としては、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌであればよく、３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましい。脂肪細胞と本蛋白質とを接触させる時間は、通常１０分程度〜８日程度であり、数時間〜６日程度が好ましい。脂肪細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。脂肪細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常１０分以上８日程度であり、好ましくは数時間〜６日程度である。
脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる環境としては、脂肪細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該脂肪細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげることができる。具体的には、培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。
【００２４】
さらにまた本発明分析方法の第一工程は、例えば、脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞に、被験物質を接触させる方法でもよい。
当該工程において、本発明形質転換脂肪細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。脂肪細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常１０分以上８日程度が好ましく、より好ましくは数時間から６日程度が挙げられる。
【００２５】
前記本発明形質転換脂肪細胞は、以下のようにして調製することができる。
本蛋白質をコードする遺伝子（以下本遺伝子と称することがある。）を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本遺伝子を導入する脂肪細胞において使用可能なベクターに発現可能な形でプロモーターと接続されるように挿入することにより、プラスミドを作製する。ここで用いられるプロモーターは、本遺伝子が導入される脂肪細胞で機能可能なものであればよく、例えば、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｒａｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用してもよい。または、本遺伝子自身のプロモーターを利用しても良い。
次いで、前記プラスミドを脂肪細胞へ導入する。脂肪細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはＧｒｉｍｍ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１０９２３−１０９２７等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはＴｉｎｇ，　Ａ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１５，　６１８９−６１９６等に記載される方法、ミセル形成法としてはＨａｗｋｉｎｓ，　Ｃ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１３７８６−１３７９０等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
前記プラスミドの導入処理を施した脂肪細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選抜マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、本発明形質転換脂肪細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本遺伝子が染色体に導入されてなる安定形質転換体となった本発明形質転換脂肪細胞を取得してもよい。導入された本遺伝子が脂肪細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の本遺伝子の存在を検出・確認すればよい。
また、本蛋白質をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック動物の脂肪組織又は脂肪細胞における脂肪細胞関連因子の量を測定しても良い。該トランスジェニック動物は、マイクロインジェクション法など当業者に公知の方法で作製することができる。
【００２６】
また、本発明における１又は複数の脂肪細胞関連因子を、ｃＤＮＡクローニングし、プラスミドを構築した後、これを脂肪細胞へトランスフェクションさせることもできる。このような形質転換細胞もまた、本発明の脂肪細胞の範疇である。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＣＳＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８３），　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ＤＭ．　Ｇｌｏｖｅｒ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ　（１９８５））などに準じて行うことができる。具体的には、上記の本発明形質転換脂肪細胞の調製方法と同様の方法に準じればよい。
【００２７】
本発明分析方法において脂肪細胞関連因子量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する方法としては、例えば、
（１）脂肪細胞関連因子の量を、脂肪細胞関連因子を特異的に認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素標識抗体測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ；　ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング等で測定する方法、
（２）脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値として、脂肪細胞関連因子のｍＲＮＡの、前記脂肪細胞内での存在量、
（３）脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値として、前記脂肪細胞内、又は該脂肪細胞培養液中での脂肪細胞関連因子の生理活性値、
（４）脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値として、該因子の発現制御領域の下流に連結した検出マーカー遺伝子由来タンパク質の生理活性値、
を測定する方法等をあげることができる。
【００２８】
上記（１）における、脂肪細胞関連因子の量（蛋白質量）の測定には、脂肪細胞関連因子を特異的に認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素標識抗体測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ；　ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング等が用いられる。
例えばウエスタンブロッティング法は、脂肪細胞あるいは脂肪細胞の破砕液あるいは脂肪細胞の培養上清を電気泳動し、泳動後のタンパク質を、ニトロセルロースなどの適当なメンブランに通常の方法を用いてブロッティングする。このメンブランに対して、一次抗体として脂肪細胞関連因子を特異的に認識する抗体を用いた後、二次抗体として^１２５Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、脂肪細胞関連因子を標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社製）で測定することもできる。また、ＥＬＩＳＡ法の原理および方法の詳細は、生化学実験法１１（東京化学同人社刊）やＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．７０（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ刊）などに記載されている。
また、ＲＩＡ法の基本的な原理はＥＬＩＳＡ法と同様であり、例えば、既知量の標識抗原と抗体の反応液中に未知量の抗原蛋白質を含む試料を添加することで競合反応を起こした後、抗原抗体複合体と遊離状態の抗原とを分離して、そのどちらかを測定し、標準曲線と比較することにより試料中の抗原蛋白質量を定量する方法である（新生化学実験講座１２；東京化学同人社刊、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．７０；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ刊）。
【００２９】
上記で用いられる抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明においてもこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．　Ｓｅｃｔｉｏｎ１１．１２〜１１．１３）。具体的には、ポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した脂肪細胞関連因子タンパク質を用いて、あるいは常法に従って脂肪細胞関連因子タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した脂肪細胞関連因子タンパク質、あるいは該因子の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄｉｔ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｐｕｂｌｉｓｈ．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ．　Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．４〜１１．１１）。
【００３０】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、脂肪細胞関連因子をコードする公知の遺伝子配列情報に基づいて、ｃＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＣＳＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８３），　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ＤＭ．　Ｇｌｏｖｅｒ，　ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ　（１９８５））などに準じて行うことができる。具体的には脂肪細胞関連因子をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これら脂肪細胞関連因子は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００３１】
上記（２）におけるｍＲＮＡの定量には、脂肪細胞関連因子をコードする遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法等の通常の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）を用いればよい。
【００３２】
例えば、ノザンハイブリダイゼーション法を利用する場合は、前記プローブを放射性同位元素（^３２Ｐ、^３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした、脂肪細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成されたプローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖の量、すなわち脂肪細胞関連因子の量を、プローブに由来するシグナルとして放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＰｈａｒａｍｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従ってプローブＤＮＡを標識し、脂肪細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、分析に用いた脂肪細胞からＲＮＡを抽出して、常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の脂肪細胞関連因子をコードする塩基配列領域が特異的に増幅できるように、一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）を設計し、通常の方法で合成する。なお、プライマー設計に当たっては、たとえばＯｌｉｇｏ　ｖｅｒｓｉｏｎ５などのソフトウエアを用いることができる。合成したプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出、定量する方法を例示することができる。なお、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡ量を放射能や蛍光物質の量として、例えばアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などを用いて定量することができる。また、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した脂肪細胞関連因子プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて定量する方法がある。また、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　社製）を用いてプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＭＥ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　社製）で反応させて、該反応物を検出、定量することもできる。
【００３４】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、脂肪細胞関連因子をコードする遺伝子由来の塩基配列をプローブ（１本鎖ＤＮＡ）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに脂肪細胞から抽出したＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡを添加して、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖の量を定量する方法を挙げることができる。例えば、１１βＨＳＤ−１遺伝子、ａＰ２遺伝子、ＤＧＡＴ１遺伝子、ＰＰＡＲγ２遺伝子、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＧＰＡＴ１遺伝子、ＧＬＵＴ４遺伝子、およびＡＤＤ１遺伝子から選択される１又は複数の遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ９５　Ａ，　Ｂ，Ｃ，　Ｄ，　Ｅを挙げることができる。
【００３５】
上記（３）において、脂肪細胞関連因子の生理活性値の測定には、脂肪細胞関連因子が、１１βＨＳＤ−１、ＤＧＡＴ１、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１等の酵素である場合には、その酵素活性を測定する方法を用いることができる。また、脂肪細胞関連因子が、ＰＰＡＲγ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＡＤＤ１等の転写因子である場合には、該転写因子が制御している蛋白質の発現量を測定する方法や、該転写因子の応答領域を用いたレポータージーンアッセイ等を用いることができる。これらの方法については、当業者にとって公知の方法を用いることができる。以下、具体的に説明する。
（３−１）脂肪細胞関連因子が酵素である場合
本発明分析方法の第一工程による処理を行った後の細胞から、脂肪細胞関連因子（酵素）を含有する溶液を調製し、基質と反応させることができる。ここで、該溶液としては、前記細胞における培養上清、前記細胞を破砕した懸濁液、又は該懸濁液を遠心分離によりペレットと上清に分離した上清を用いることができる。
すなわち、基質および脂肪細胞関連因子を含有する溶液を接触させて、一定時間酵素反応を行い、基質の減少量を分析する方法、あるいは該酵素反応における生成物の増加量を分析する方法、あるいは、該酵素活性に起因して生じる生理活性を測定する方法が挙げられる。
具体的には、脂肪細胞関連因子（酵素）を含有する水溶液（通常緩衝液が用いられる。）に、基質を加え、室温で一定時間反応させる。反応の前後で、それぞれ基質の量、もしくは生成物の量を測定する。すなわち、反応開始直前もしくは反応開始直後の、基質または生成物の量、および、反応開始後一定時間後に減少した基質または増加した生成物の量を測定する。また、基質は、第一工程終了後に添加してもよいし、本発明分析方法の第一工程で添加してもよい。すなわち、脂肪細胞に、本蛋白質、被験物質、及び基質を接触させる順序は特に限定されない。また、基質は通常水や緩衝液の溶液として用いられ、溶解度に応じて、適宜ＤＭＳＯやエタノール等の有機溶媒を添加することもできる。
ここで、酵素活性測定時の反応温度は、例えば、２０℃〜７０℃であればよく、好ましくは３０℃〜４０℃である。反応時間は、例えば、１分間以上で、好ましくは１５分間〜１日間である。反応ｐＨは、例えば、６．０〜９．５で、好ましくはｐＨ７．５〜９．０である。
【００３６】
本工程の酵素反応における基質もしくは生成物の検出、又はその量の測定には、反応液を、例えば、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと記す。）、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等で分離した後、当該基質もしくは生成物を、個々の化合物に適した方法で分析すればよい。例えば、紫外線吸収、可視光吸収、蛍光活性、または放射活性等を検出・測定すればよい。尚、上記分析の際に反応液から蛋白質を除去しておく必要がある場合には、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２８０，　２１１−２２１等に記載される方法により反応液から蛋白質を除去すればよい。また、該基質は、検出感度を上げるべく、当業者に公知の方法で、蛍光標識、又は、ラジオアイソトープ標識することもできる。
【００３７】
（３−２）脂肪細胞関連因子が転写因子である場合
該転写因子が制御している蛋白質の発現量を測定する方法や、該転写因子の応答領域を用いたレポータージーンアッセイ等を用いることができる。該転写因子が制御している蛋白質の発現量を測定する方法としては、該蛋白質の量を測定する方法や、該蛋白質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する方法が挙げられ、これらについては、前記の（１）及び（２）に記載された方法に準じて行うことができる。
一方、前記レポータージーンアッセイについては、後述する（４）に記載された方法に準じて行うことができる。
【００３８】
上記（４）における、脂肪細胞関連因子の量と相関関係を有する指標値として、該因子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に連結した検出マーカー遺伝子（レポータージーン）由来タンパク質の生理活性値を測定する方法は、以下に示すとおりである。すなわち、該発現制御領域に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などの検出マーカー遺伝子をつないだ連結遺伝子を導入した細胞株を用いて、検出マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することができる（レポータージーンアッセイ）。
上記検出マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。
ここで脂肪細胞関連因子をコードする遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。なおヒトａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のプロモーター領域については文献（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｏｂｅｓ．，　ｖｏｌ．２４，　ｐ．８６１，　２０００）において決定されているため、これらの文献に開示されたプロモーター領域を使用することができる。
連結遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００３９】
具体的には、例えば、脂肪細胞関連因子の発現調節領域をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ　Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）等の、検出マーカー遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターに組み込んだレポーターベクターを調製する。
例えば３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣから入手可能）等の細胞に、レポーターベクターを導入して形質転換脂肪細胞を作製する。この細胞をプレインキュベーションした後、本蛋白質および被験物質含有溶液を添加し、更に６〜２４時間培養を続ける。培養終了後、ルシフェラーゼの基質（プロメガ社製）を添加し、ルミノメーターＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１０秒間の発光量を測定することでルシフェラーゼ活性を検出することができる。
【００４０】
以下、本発明の脂肪細胞関連因子の生理活性値の測定方法を、具体的に例示する。たとえば、１１βＨＳＤ−１に関しては、脂肪細胞を適当な方法で破砕し、そこに放射標識した基質コルチゾンあるいは１１−デヒドロコルチコステロンを添加して、生成するコルチゾールあるいはコルチコステロン量を測定する方法が挙げられる（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．１４２，　ｐ．１３７１，　２００１）。ＤＧＡＴ１に関しては、標識された脂肪酸誘導体、たとえばオレイン酸−ＣｏＡのトリグリセライドへの取り込み量を測定することで、酵素活性を定量する方法が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　ｖｏｌ．９５，　ｐ．１３０１８，　１９９８）。ＦＡＳについては、Ｊ．　Ｎｕｔｒ．，　ｖｏｌ．１２６，　ｐ．８６５，　１９９６に記載の方法で酵素活性を測定することができる。ＧＰＡＴ１については、標識された基質を用いて酵素活性を測定する方法が挙げられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　ｖｏｌ．２０９，　ｐ．９２．１９９２）。ＰＰＡＲγ２については、ＰＰＡＲγ２が認識し結合する塩基配列、ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）の下流に検出マーカー遺伝子を連結したプラスミドを脂肪細胞に導入し、検出マーカー遺伝子由来タンパク質の生理活性値を前述のように測定する方法が挙げられる（Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．９３，　ｐ．２２９，　１９９８）。また、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎに関しては、脂肪細胞の培養上清を回収し、筋肉細胞に添加して、β酸化活性の促進を定量する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　ｖｏｌ．９８，　ｐ．２００５，　２００１）が挙げられる。Ｃ／ＥＢＰαについては、Ｃ／ＥＢＰαが発現制御している因子、たとえば糖トランスポーターであるＧｌｕｔ４遺伝子の発現量を定量する方法が挙げられる（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｕｔｒ．，　ｖｏｌ．１４，　ｐ．９９，　１９９４）。
【００４１】
上記のようにして本発明分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞関連因子量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力（すなわち、発現を抑制する能力もしくは発現を促進する能力）を評価する。このようにして被験物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明検定方法において、前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質をブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）とすることで、他方の被験物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を基準としながら他方の被験物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価してもよい。
もちろん、脂肪細胞関連因子の発現促進因子（即ち、本蛋白質）と被験物質との両者を接触させた後の脂肪細胞で発現する脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値１と記す。）を、脂肪細胞関連因子の発現促進因子を接触させ、かつ被験物質を接触させなかった後の脂肪細胞で発現する脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、該被験物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価してもよい。この場合、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を、前記測定値を用いて、下記の式に従って脂肪細胞関連因子の発現制御率として求めるとよい。
すなわち、被験物質が、本蛋白質による脂肪細胞関連因子の発現を抑制する能力を有する場合、その発現抑制率は、下式：
脂肪細胞関連因子の発現抑制率（％）＝［（測定値２−測定値１）／測定値２］×１００
で求められる。また、被験物質が本蛋白質による脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有する場合、その発現促進率は、下式：
脂肪細胞関連因子の発現促進率（％）＝［（測定値１−測定値２）／測定値２］×１００
で求められる。
ここで、ブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）を被験物質として用い、本蛋白質の非存在下に脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定して、対照としてもよい。すなわち、対照における測定値（測定値０）を、上記測定値１及び２から指し引いて脂肪細胞関連因子の発現抑制率及び発現促進率を算出することができる。この場合、発現抑制率は、下式：
脂肪細胞関連因子の発現抑制率（％）＝［｛（測定値２−測定値０）−（測定値１−測定値０）｝／（測定値２−測定値０）］×１００
で求められる。また、被験物質が本蛋白質による脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有する場合、その発現促進率は、下式：
脂肪細胞関連因子の発現促進率（％）＝［｛（測定値１−測定値０）−（測定値２−測定値０）｝／（測定値２−測定値０）］×１００
で求められる。
【００４２】
脂肪細胞関連因子の発現制御物質を探索するには、本発明検定方法により評価された脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力に基づき脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、被験物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を表わす脂肪細胞関連因子の発現制御率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する物質として選抜する。尚、当該物質は、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質（抗体を含む）又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
本発明探索方法によって選抜された物質は脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有しており、脂肪細胞関連因子の発現制御剤の有効成分（抗肥満剤、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤等）として使用してもよい。
具体的には、１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、又はＧＬＵＴ４の発現抑制剤は、肥満、インシュリン抵抗性、糖尿病等の疾患の、予防剤、治療剤、又は進行抑制剤として有用である。
また、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、又はＣ／ＥＢＰαの発現促進剤は、インシュリン抵抗性、糖尿病等の疾患治療剤として有用である。
【００４３】本発明の第２の態様は、前記本蛋白質の機能を制御する能力を検定する方法等に関する。
すなわち上記の本発明分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞関連因子量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の本蛋白質の機能を制御する能力（すなわち、機能を抑制する能力もしくは機能を促進する能力）を評価する。このようにして被験物質が有する本蛋白質の機能を制御する能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本蛋白質の機能としては、脂肪細胞関連因子、具体的には１１βＨＳＤ−１、ａＰ２、ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、およびＡＤＤ１の発現を誘導させる機能が挙げられる。
【００４４】
本発明検定方法において、前記の異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）とすることで、他方の被験物質が有する本蛋白質の機能を制御する能力を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が有する本蛋白質の機能を制御する能力を基準としながら他方の被験物質が有する本蛋白質の機能を制御する能力を評価してもよい。
もちろん、本蛋白質と被験物質との両者を接触させた後の脂肪細胞で発現する脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値１と記す。）を、本蛋白質を接触させ、かつ被験物質を接触させなかった後の脂肪細胞から分泌される脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、該被験物質の本蛋白質の機能を制御する能力を評価してもよい。この場合、本蛋白質の機能を制御する能力は、前記測定値を用いて、下記の式に従って本蛋白質の機能制御率として求めるとよい。
すなわち、被験物質が、本蛋白質の機能を抑制する能力を有する場合、その機能抑制率は、下式：
機能抑制率（％）＝［（測定値２−測定値１）／測定値２］×１００
で求められる。また、被験物質が本蛋白質の機能を促進する能力を有する場合、その機能促進率は、下式：
機能促進率（％）＝［（測定値１−測定値２）／測定値２］×１００
で求められる。
ここで、ブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）を被験物質として用い、本蛋白質の非存在下に脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定して、対照としてもよい。すなわち、対照における測定値（測定値０）を、上記測定値１及び２から指し引いて本蛋白質の機能抑制率及び機能促進率を算出することができる。
【００４５】
本蛋白質の機能制御物質を探索するには、本発明検定方法により評価された本蛋白質の機能を制御する能力に基づき本蛋白質の機能を制御する能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、被験物質の本蛋白質の機能を制御する能力を表わす本蛋白質の機能制御率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、本蛋白質の機能を制御する能力を有する物質として選抜する。尚、当該物質は、本蛋白質の機能を制御する能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質（抗体を含む）又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
本発明探索方法によって選抜された物質は本蛋白質の機能を制御する能力を有しており、本蛋白質の機能制御剤の有効成分として使用してもよい。具体的には、本蛋白質の機能抑制剤は、抗肥満剤、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤等として有用である。
【００４６】
本発明の第３の態様は、脂肪細胞関連因子発現を制御する能力の検定方法であって、陽性対照物質が、本蛋白質であることを特徴とする検定方法等に関するものであり、（１）脂肪細胞に、被験物質を接触させる本第一工程、（２）前記第一工程後に、該脂肪細胞における脂肪細胞関連因子量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び（３）前記（１）及び（２）の工程により測定された、被験物質として１又は複数の物質、および本蛋白質を各々独立して用いた区における、（２）の値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の、脂肪細胞関連因子発現を制御する能力を評価する第三工程を有する。前記検定方法の第一工程及び第二工程は、本蛋白質を被験物質の一つとして用いること、及び第一工程において被験物質が本蛋白質でない場合には本蛋白質を接触させないこと以外は、本発明の第１の態様に準じて実施することができる。
【００４７】
前記第三工程において、被験物質として陽性対照物質、及び１又は異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞関連因子量又はその量と相関関係を有する指標値を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力（すなわち、発現を抑制する能力もしくは発現を促進する能力）を評価することができる。
ここで、陽性対照物質は本蛋白質であり、本蛋白質の濃度としては、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌであればよく、３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましい。また、本蛋白質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を基準としながら他の被験物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価することができる。
本蛋白質以外の被験物質については、上記の本発明の第１の態様と同様であり、更に一つの被験物質をブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）とすることで、他の被験物質が有する脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価してもよい。
【００４８】
具体的には、被験物質が本蛋白質（すなわち、陽性対照物質）である場合の脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値３と記す。）を、被験物質の脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値４と記す。）とを比較することによって、該被験物質の脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を評価することができる。この場合、被験物質としてブランク（脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有さない、例えば、溶媒、試験系溶液等のバックグランドとなる物質）を用いた場合の脂肪細胞関連因子の量又はその量と相関関係を有する指標値（以下、測定値５と記す。）をバックグラウンド値とすることもできる。
すなわち、被験物質が脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有する場合、本蛋白質の発現を促進する能力：（測定値３−測定値５）と被験物質の発現を促進する能力：（測定値４−測定値５）を比較して、（測定値４−測定値５）が（測定値３−測定値５）よりも大きい値を示す場合には、被験物質が本蛋白質よりも高い優れた脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有すると評価することができる。
【００４９】
脂肪細胞関連因子の発現制御物質を探索するには、本発明検定方法により評価された脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力に基づき脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。尚、当該物質は、脂肪細胞関連因子の発現を制御する能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質（抗体を含む）又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
本発明探索方法によって選抜された物質は脂肪細胞関連因子の発現を促進する能力を有しており、脂肪細胞関連因子の発現促進剤の有効成分として使用してもよい。具体的には、ＰＰＡＲγ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ／ＥＢＰαの発現促進剤は、抗糖尿病剤、又はインシュリン抵抗性改善剤等として使用することができる。
【００５０】
本発明において、被験物質となりえるものとしては、特に制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。また、被験物質は通常水や緩衝液の溶液として用いられ、溶解度に応じて、適宜ＤＭＳＯやエタノール等の有機溶媒を添加することもできる。
【００５１】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする脂肪細胞関連因子の発現制御剤、および本発明蛋白質の機能制御剤（以下、本発明制御剤と記す。）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明制御剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明制御剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の、液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明制御剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本動脈硬化病態増悪因子分泌制御剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
尚、本発明制御剤の適用可能な疾患としては、肥満、糖尿病、又はインシュリン抵抗性糖尿病等の疾患等をあげることができる。
【００５２】
【実施例】
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　（本遺伝子の単離：配列番号１で示されるアミノ酸配列及びその部分配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の単離）
（１−１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の単離
ヒト腹腔内脂肪組織からグアニジンチオシアネート／セシウムクロライド法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１８，　５２９４，　１９７９）により調製された全ＲＮＡ１．０μｇを鋳型にして、これとｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）に添付のオリゴｄＴプライマーとを混合した後、１ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＭＭＴＶ逆転写酵素（宝酒造製）５０ユニットを添加し、室温で１０分間、ついで４２℃、１５分間、さらに９９℃、５分間保温することによって、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
続いて該１本鎖ｃＤＮＡ２．０μｇを鋳型に用いて、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの各２０ｐｍｏｌをプライマーとして、２００μＭ　ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２存在下でＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）１ユニットを添加し、９４℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを５５サイクル行う条件下でＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し（泳動バッファー；トリス−硼酸緩衝液（ナカライテスク製））、約１．５ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから切り出し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．著：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載されている方法により、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。クローニングされたＤＮＡの塩基配列を、Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔおよびＴａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてアプライドバイオシステムズ製の３７３Ａ型のＤＮＡシークエンサーにより決定した。該ＤＮＡは配列番号６で示される塩基配列からなり、該塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードしていた。
このようにして配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を単離した。
【００５３】
（１−２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の単離
実施例１（１−１）でクローニングされたＤＮＡを鋳型にして、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、９４℃、１分間、ついで６０℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとして、これを３０サイクル行う条件下でＰＣＲを行い、配列番号６で示される塩基配列の９６番目から１４９３番目の塩基配列を含むＤＮＡを増幅した。
このようにして配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を単離した。
【００５４】
実施例２　（配列番号１で示されるアミノ酸配列及びその部分配列からなる蛋白質の発現プラスミドの調製）
実施例１（１−２）において増幅・単離されたＤＮＡをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し、得られた約１．４ｋｂｐのＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ１１ａ（ノバジェン製）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、配列番号１のアミノ酸番号２７番から４９１番で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質を産生させるための発現プラスミドｐＥＴ１１ａ０８５（図１）を得た。
次に、該発現プラスミドｐＥＴ１１ａ０８５で大腸菌ＤＥ３株（ノバジェン製）を形質転換した。
一方、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を産生させるための発現プラスミドは、実施例１（１−１）において増幅・単離されたＤＮＡを、通常の遺伝子工学的方法によって公知のベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｔａｋｅｂｅ，　Ｙ．，　Ｓｅｉｋｉ，　Ｍ．，　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｊ．，　Ｈｏｙ，　Ｐ．，　Ｙｏｋｏｔａ，　Ｋ．，　Ａｒａｉ，　Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ａｒａｉ，　Ｎ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｊａｎ．　１９８８，　ｐ４６６−４７２）に組み込みことにより調製された。このようにして調製された発現プラスミドを用いて、リポフェクトアミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）により、サル由来のＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ製）を形質転換した。
【００５５】
実施例３　（本蛋白質の調製：配列番号１で示されるアミノ酸配列及びその部分配列からなる蛋白質標品の調製）
実施例２で得られた形質転換体を、３７℃でＯ．Ｄ．６００が０．６になるまで培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと記す。）を添加し、さらに一晩培養した。次いで、遠心分離操作により集菌し、菌体を１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ・２Ｎａと記す。）、５ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと記す。）及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（以下、ＰＭＳＦと記す。）を含むバッファー（以下、バッファーＡと記す。）に懸濁して、超音波処理（氷冷下、５分間×３回）により菌体を破砕し、この破砕液を１２，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離し、沈殿（以下、封入体画分と記す。）を回収した。
該封入体画分に、２Ｍ尿素を含むバッファーＡを添加し、懸濁して、超音波処理（氷冷下、５分間×１回）を行った。前記の超音波処理後の溶液を１２，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離し、得られた沈殿に、４Ｍ尿素を含むバッファーＡを添加して懸濁、超音波処理、遠心分離するという操作を前記と同様に行った。さらに、得られた沈殿に、６Ｍ尿素を含むバッファーＡを添加して懸濁、超音波処理、遠心分離するという操作を前記と同様に行った。得られた沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２ｍＭ　ＤＴＴおよび８Ｍ尿素を含むバッファーに懸濁し、該懸濁液を１２，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を分取した。得られた上清を、ＨｉＬｏａｄ　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（ファルマシア製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供した（流速；１．０ｍｌ／分、検出波長；２８０ｎｍ）。４５分から５５分の間に溶出されるピーク画分を集めてセントリコン（グレースジャパン製、分画分子量３０，０００）で濃縮し、次に、モノＱ　ＨＲ１０／１０イオン交換カラム（ファルマシア製）を用いたクロマトグラフィー（流速１．０ｍｌ／分、０〜１Ｍ　ＮａＣｌグラディエント、検出波長；２８０ｎｍ）に供した。約１００〜約２００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出される画分を集めて、セントリコン（グレースジャパン製、分画分子量３０，０００）で１ｍｇ蛋白質／ｍｌになるように濃縮した。
得られた蛋白質画分に、該画分の容量の１／３量の１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）をゆるやかに攪拌しながら添加した。さらに、室温で一晩、緩やかに攪拌を続けた。次いで、１８，０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離して上清を回収し、該上清に、その容量の７倍量の２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、４ｍＭ還元型グルタチオン及び０．４ｍＭ酸化型グルタチオンを含むバッファーを加えて緩やかに攪拌した。得られた溶液を分画分子量が２５，０００の透析チューブに入れ、該溶液量の１０００倍量の２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、４ｍＭ還元型グルタチオン及び０．４ｍＭ酸化型グルタチオンを含むバッファーに対して、４℃で８〜１６時間透析した。次に、透析チューブ内液量の１０００倍量の２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、４ｍＭ還元型グルタチオン及び０．４ｍＭ酸化型グルタチオンを含むバッファーに対して、４℃で８〜１６時間透析した。さらに、透析チューブ内液量の１０００倍量の２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１ｍＭ還元型グルタチオン及び０．１ｍＭ酸化型グルタチオンを含むバッファーに対して、４℃で８〜１６時間透析した。得られた、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列からなる蛋白質を以下、本蛋白質標品と記す。
一方、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、実施例２で形質転換されたサル由来のＣＯＳ１細胞を、通常の細胞培養法に従って培養することにより培地中に当該蛋白質を分泌させ、さらに分泌された蛋白質を通常のカラムクロマトグラフィーによる蛋白質分離法に従って培地中から回収・精製することにより本蛋白質標品として得た。
【００５６】
実施例４　（本蛋白質を用いた脂肪細胞関連因子発現促進試験）
（４−１）脂肪組織の単離
１４週齢の雄性のＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ）１０匹を屠殺・開腹し、皮下脂肪組織を摘出した。摘出した組織を、リン酸緩衝液（０．２０ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２０ｇ／Ｌ　ＫＨ_２ＰＯ_４、８．００ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２．１６ｇ／Ｌ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１００ユニット／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ製）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ製））約３０ｍｌに浸し、室温で洗浄した。
【００５７】
（４−２）脂肪組織からの細胞の調製と培養
洗浄後の皮下脂肪組織について次に示す処理を行った。すなわち、まず、該組識を、コラゲナーゼ（タイプＩＩまたはＶＩＩＩ。シグマ社製）、ペニシリン（ＧＩＢＣＯ製）、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）およびアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１ｍｇ／ｍｌ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）約３０ｍｌ中でハサミを用いて約５ｍｍ角に細断した。次いで、これを３７℃で６０分間振とう（約１７０ｒｐｍ）し、ナイロンメッシュ（８０Ｓ［目の大きさが２５０μｍ］。三紳工業製）で濾過し、濾液を回収した。該濾液を室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を得た。この沈査を、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。）（ＧＩＢＣＯ製）、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）およびアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ社製）をそれぞれ終濃度１０％、２００μＭ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、ＦＢＳ含有培地と記す。）３０ｍｌに懸濁し、懸濁液をナイロンメッシュ（４２０Ｓ［目の大きさが２５μｍ］。三紳工業製）で濾過した。濾液を回収し、室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を再度ＦＢＳ含有培地３０ｍｌに懸濁した。該懸濁液について、遠心分離、液層除去、ＦＢＳ含有培地に懸濁するという操作を更に２回、前記と同様に行い、懸濁液を調製した。該懸濁液を細胞培養用フラスコ（接着細胞用Ｔ１５０。岩城硝子製）に注入し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。培養開始２〜３時間後に培地を除き、フラスコの器壁を１５ｍｌの前記リン酸緩衝液で洗浄した。洗液を除き、該洗浄操作を再度行った後、リン酸緩衝液を除き、３０ｍｌのＦＢＳ含有培地をフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。培養開始１日後に培地を除き、１５ｍｌのリン酸緩衝液でフラスコの器壁を１回洗浄した後、該フラスコにトリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ・４Ｎａと記す。）溶液（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む。ＧＩＢＣＯ製）１〜２ｍｌを細胞が浸るように添加し、３７℃で５分放置した。これに、ＦＢＳ含有培地をトリプシン−ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液の約１０倍量添加し、細胞懸濁液を得た。
【００５８】
（４−３）脂肪細胞関連因子発現促進試験
（ｉ）脂肪細胞からのＲＮＡ調製
上記（４−２）で得られた細胞懸濁液をＦＢＳ含有培地で適宜希釈し、１×１０^５細胞／ｍｌとし、６穴プレート（接着細胞培養用。岩城硝子製）に１ウエルあたり２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ_２存在下、３７℃にて１日間培養した後、プレートの各ウエルから培地を除き、１００ｎｇ／ｍｌの本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地２ｍｌを添加して５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２日間培養した。２日目の細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを取得する場合は、培養上清を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液で細胞を１回洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ製）１ｍｌを添加して細胞を溶解した。４日目あるいは６日目の細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを取得する場合は、培養上清を除去し、１００ｎｇ／ｍｌの本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地２ｍｌを添加し、２日間培養する操作をさらに１回あるいは２回繰り返した。４日目あるいは６日目に培養上清を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液で細胞を１回洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ製）１ｍｌを添加して細胞を溶解した。室温で５分間放置後、各ウエルから液体を回収し、ＴＲＩｚｏｌのプロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。具体的には、得られた細胞溶解液（６穴プレート１枚分）を１５ｍｌ遠心チューブ（ＩＷＡＫＩ社製）に集め、これに０．６ｍｌのクロロホルム（関東化学社製）を添加し、当該混合物を１５秒間上下に激しく攪拌した後、５分間室温で静置した。次いで、当該混合物を遠心分離（４℃、９，０００ｒｐｍ、１０分間）した後、水層を新しい１５ｍｌ遠心チューブに回収した。回収された水層に、３ｍｌの２−プロパノール（関東化学社製）を添加し、これを転倒混和した後、室温で１０分間静置した。当該混合物を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清を除去してペレットを得た。得られたペレットを、０．１ｍｌのＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解した。溶解後、これにＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）添付の３５０ｕｌ　ＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０μｌ　β−メルカプトエタノール／ｍｌ　ＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、当該混合物を混和した。更に、当該混合物に２５０μｌのエタノール（関東化学社製）を添加し、これを混和した。当該混和物をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ添付のＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに供し、これを遠心分離（室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間）した。遠心分離後、得られた溶出液を再度同じＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心分離（室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間）した。遠心分離後、得られた溶出液を捨てた。次いで前記のカラムに、エタノールで４倍希釈されたＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ　Ｋｉｔ添付のＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒ５００μｌを供し、これを遠心分離（室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間）した。遠心分離後、得られた溶出液を捨てた。次いで当該カラムに、エタノールで４倍希釈されたＲＰＥ　ｂｕｆｆｅｒ５００μｌを供し、遠心分離（室温、１４，０００ｒｐｍ、２分間）した。このようにして得られたカラムを新しいエッペンドルフチューブに移してＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ添付の蒸留水５０μｌを添加し、これを１分間室温で静置した。静置後、当該カラムから遠心分離（室温、１０，０００ｒｐｍ、１分間）によりｔｏｔａｌＲＮＡを溶出させ、これを回収することによりｔｏｔａｌＲＮＡを得た。一方、本蛋白質無添加区については、本蛋白質標品を添加しないこと以外は同様の操作を行い、ｔｏｔａｌＲＮＡを得た。ＴｏｔａｌＲＮＡの取得量および純度は、分光光度計を用いて測定した。
【００５９】
（ｉｉ）ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ調製
上記（ｉ）で得られたｔｏｔａｌＲＮＡ５μｇ及びＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ社）付属のｐｄ（Ｔ）１２−１８　０．５μｌを含む１７μｌの水溶液を７０℃、１０分間加熱した後、氷上で５分間冷却した。次いで、これに上記キット付属の５×ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、上記キット付属の０．２５Ｍ　ＤＴＴ溶液　１μｌ、上記キット付属のＲＮａｓｉｎ　１μｌ及び上記キット付属のＡＭＶ−ＲＴ　１μｌを添加した後、得られた混合物を４１℃で４５分間加熱することによりｃＤＮＡ合成を行い、ｃＤＮＡ含有溶液を得た。
【００６０】
（ｉｉｉ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
本蛋白質を添加した脂肪細胞および、本蛋白質無添加区の脂肪細胞中の、ＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡの発現量を以下の方法で定量した。
上記（ｉｉ）で得られた、本蛋白質を添加した脂肪細胞から調製したｃＤＮＡ含有溶液が２００倍希釈された液（ｃＤＮＡ希釈液）　１μｌ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　２５μｌ、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー　２０ｐｍｏｌ及び配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー　２０ｐｍｏｌからなる５０μｌの反応液（反応液Ａ）を調製した。次に、内部標準としてマウス３６Ｂ４遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定するために、上記のｃＤＮＡ希釈液　１μｌ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　２５μｌ、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー　２０ｐｍｏｌ及び配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー　２０ｐｍｏｌからなる５０μｌの反応液（反応液Ｂ）を調製した。
ＰＣＲは、ＡＢＩ７７００（ＰＥ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。まず各反応液を５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間保温した。その後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の保温サイクルを４０回繰り返した。当該ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を定量することにより、ＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡの発現量を測定した。反応液Ａを用いた場合における発現量を測定値Ａ、反応液Ｂを用いた場合における発現量を測定値Ｂとした。マウス３６Ｂ４遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量は各細胞においてほぼ一定であることが知られている。そこで、マウス３６Ｂ４遺伝子の発現量を内部標準として使用するため、測定値Ａを測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出することにより、ＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡの補正発現量（測定値６）を得た。本蛋白質無添加区の脂肪細胞から調製したｃＤＮＡを用いて、前記同様に、測定値Ａを測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出することにより、ＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡの補正発現量（測定値７）を得た。
これらの測定値から、下記の式に従って、本蛋白質標品によるＰＰＡＲγ２発現促進率を算出した。
ＰＰＡＲγ２発現促進率（％）＝（測定値６／測定値７）×１００
本蛋白質標品によるＰＰＡＲγ２発現促進率は９６０％であった。
上記と同様の方法を用いて、本蛋白質標品による各脂肪細胞関連因子の発現促進率を求めた。１１βＨＳＤ−１ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号１１と配列番号１２に記載のプライマーを、ａＰ２ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号１３と配列番号１４に記載のプライマーを、ＤＧＡＴ１ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号１５と配列番号１６に記載のプライマーを、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ　ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号１７と配列番号１８に記載のプライマーを、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号１９と配列番号２０に記載のプライマーを、ＦＡＳｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号２１と配列番号２２に記載のプライマーを、ＧＰＡＴ１ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号２３と配列番号２４に記載のプライマーを、ＡＤＤ１ｍＲＮＡ発現量を測定する際には、配列番号２５と配列番号２６に記載のプライマーを用いた。
【００６１】
２日目における本蛋白質標品による脂肪細胞関連因子の発現促進率を調べたところ、ａＰ２については１５２０％、ＤＧＡＴ１については１０８０％、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎについては２６８％、Ｃ／ＥＢＰαについては３１１％、ＦＡＳについては１７００％、ＧＰＡＴ１については４６６％、ＡＤＤ１については６６０％であった。また、６日目における本蛋白質標品による１１βＨＳＤ−１の発現促進率は、２８０％であった。
【００６２】
実施例５　（脂肪細胞関連因子発現制御剤のスクリーニング）
実施例４の（４−１）及び（４−２）に記載された方法で脂肪細胞懸濁液を調製した。該脂肪細胞懸濁液をＦＢＳ含有培地で適宜希釈し、１×１０^５細胞／ｍｌとし、６穴プレート（接着細胞培養用。岩城硝子製）に１ウエルあたり２ｍｌずつ分注する。５％ＣＯ_２存在下、３７℃にて１日間培養した後、プレートの各ウエルから培地を除き、▲１▼１００ｎｇ／ｍｌの本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地２ｍｌを添加したもの、▲２▼１００ｎｇ／ｍｌの本蛋白質標品及び被験物質を含むＦＢＳ含有培地２ｍｌを添加したもの、▲３▼ＦＢＳ含有培地２ｍｌを、それぞれ５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２日間培養する。これを、実施例４の（４−３）に記載された方法で、前記▲１▼▲２▼及び▲３▼についてそれぞれｔｏｔａｌＲＮＡを抽出する。次いで、実施例（４−３）に記載された方法で、配列番号１５で示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６で示される塩基配列からなるプライマーを用いて、ｃＤＮＡ合成を行い、ＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、ＤＧＡＴ１のｍＲＮＡの発現量を測定することができる。前記▲１▼のサンプルで測定した値を測定値８、▲２▼のサンプルで測定した値を測定値９、及び▲３▼のサンプルで測定した値を測定値１０とすると、被験物質が、本蛋白質のＤＧＡＴ１発現促進活性を抑制もしくは促進するか否かを評価することができる。すなわち、被験物質のＰＰＡＲγ２発現抑制率又は発現促進率は、下式で算出することができる。すなわち、｛（測定値８−測定値１０）−（測定値９−測定値１０）｝が正の値の場合、被験物質はＤＧＡＴ１発現抑制剤であり、発現抑制率は、下式：
｛（測定値８−測定値１０）−（測定値９−測定値１０）｝／（測定値８−測定値１０）Ｘ１００　（％）
で表される。また、｛（測定値８−測定値１０）−（測定値９−測定値１０）｝が負の値の場合、被験物質はＤＧＡＴ１発現促進剤であり、発現促進率は、
｛（測定値９−測定値１０）−（測定値８−測定値１０）｝／（測定値８−測定値１０）Ｘ１００　（％）
で表される。ここで算出される発現抑制率・促進率に基づき、発現制御剤を同定することができる。被験物質がＤＧＡＴ１発現抑制剤である場合、該物質を、抗肥満剤等の候補化合物とする。
上記と同様の方法を用いて、１１βＨＳＤ−１、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、ＰＰＡＲγ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＳ、ＧＰＡＴ１、ＧＬＵＴ４、ＡＤＤ１等の発現制御剤をスクリーニングすることができる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、脂肪細胞関連因子の発現量の効果的な分析方法が提供可能となった。
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミド　ｐＥＴ１１ａ０８５の構造を示す。図中、斜線部分は、挿入された配列番号６で示される塩基配列の９６番目から１４９３番目の塩基配列を含むＤＮＡを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing the expression level of a fat cell-related factor and the like.
[0002]
[Prior art]
11βHSD-1 is a cortisol-forming enzyme and is a factor involved in visceral fat-type obesity and associated insulin resistance, diabetes, and hyperlipidemia (Science, vol. 294, p. 2166, 2001).
aP2 is a fatty acid binding protein and a factor involved in insulin resistance (Diabetes, vol. 48, p. 1987, 1999).
DGAT1 is a diacylglycerol acyltransferase, an enzyme that catalyzes the final step of the neutral fat synthesis system, and is involved in dietary obesity (Nature Genetics, vol. 25, p. 87, 2000).
PPARγ2 is a transcription factor that promotes adipocyte differentiation and maturation and is involved in insulin sensitivity (Molecular Cell, vol. 4, p. 597, 1999, Molecular Cell, vol. 4, p. 611, 1999). ).
adiponectin is a secretory protein derived from adipocytes that promotes insulin sensitivity and suppresses arteriosclerotic diseases (Nature Medicine, vol. 8, p. 731, 2002).
C / EBPα is a transcription factor that promotes adipocyte differentiation and maturation (Annu. Rev. Biochem., Vol. 64, p. 345, 1995).
FAS is a fatty acid synthase and is involved in obesity (weight control) (Nature Medicine, vol. 8, p. 335, 2002).
GPAT1 is an enzyme glycerophosphate acyltransferase that catalyzes an intermediate stage of the neutral fat synthesis system, and its activity increases during the differentiation process of adipocytes (J. Biol. Chem. Vo. 275, p. 9441, 2000).
GLUT4 is one of the transporters responsible for sugar uptake in fat cells (Cell, vol. 92, p. 593, 1998), and the sugar taken up is a raw material for neutral fat synthesis.
ADD1 is a transcription factor involved in adipocyte differentiation and regulates the expression of cholesterol biosynthesis genes (Genes & Development, vol. 12, p. 3182, 1998).
According to the above findings, obesity, insulin resistance, diabetes, and arteriosclerosis can be effectively suppressed by controlling the gene expression of these factors.
On the other hand, the protein represented by SEQ ID NO: 1 has been found to have fat accumulation promoting activity on adipocytes (WO 02/10772). It was also known to have a precursor B lymphocyte colony formation promoting activity (WO 94/12535). However, the relationship with the adipocyte-related factor group of the present invention was not known at all.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an evaluation method useful for searching for a substance having an ability to suppress or treat obesity, insulin resistance, and progression of diabetes.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies and have found that by adding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to adipocytes, it is an adipocyte-related factor, fatty acid or neutral fat synthesis, adipocyte differentiation, 11βHSD-1 gene, aP2 gene, DGAT1 gene, PPARγ2 gene, adiponectin gene, C / EBPα gene, FAS gene, GPAT1 gene, GLUT4, and ADD1 involved in insulin sensitivity (resistance), diabetes, arteriosclerosis, etc. The expression of the gene was found to be significantly increased. That is, the present inventors have found that the present protein can be an expression promoter for these adipocyte-related factors. Therefore, it has been found that a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is useful for efficiently screening substances that regulate the expression of these adipocyte-related factors. The present invention has been completed based on the above findings.
[0005]
That is, the present invention
[1] A method for analyzing the expression level of a fat cell-related factor,
(1) a first step of contacting an adipocyte with a protein having any of the following amino acid sequences and a test substance:
(2) an analysis method comprising, after the first step, a second step of measuring an amount of an adipocyte-related factor in an adipocyte or an index value having a correlation with the amount,
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor
[2] The first step is a step of contacting a protein consisting of any one of the above amino acid sequences with an adipocyte and then contacting the test substance with the treated adipocyte [1]. Analysis method described,
[3] The first step is a step of contacting a test substance with the adipocyte at the same time as or before contacting the adipocyte with a protein comprising any of the above amino acid sequences [1]. Analysis method described,
[4] The analysis method according to [1], wherein the index value having a correlation with the amount of the fat cell-related factor is the amount of mRNA of the fat cell-related factor present in the fat cell.
[5] The adipocyte-related factor is one or more factors selected from the group consisting of 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, and ADD1. Analysis method according to [1],
[6] The first step is a step of bringing a test substance into contact with a transformed adipocyte obtained by introducing a gene encoding a protein comprising any one of the above amino acid sequences into an adipocyte [ 1] The analysis method described above,
[7] Differences obtained by comparing the expression levels of adipocyte-related factors in sections using two or more different substances as test substances independently, as measured by the analysis method according to [1]. Based on evaluating the ability to control the expression of adipocyte-related factor of the substance based on, the test method of the ability to control the expression of adipocyte-related factor in the test substance,
[8] The assay method according to [7], wherein at least one of the two or more different substances is a blank.
[9] An adipocyte-related substance, which is characterized by selecting a substance having an ability to control the expression of an adipocyte-related factor based on the ability to control the expression of an adipocyte-related factor evaluated by the assay method according to [8]. A method for searching for a factor expression controlling agent,
[10] A substance selected by the search method according to [9] or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. Adipocyte-related factor expression regulator,
[11] The adipocyte-related factor expression regulator according to [10], which is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin resistance improving agent,
[12] An agent for promoting expression of an adipocyte-related factor, comprising a protein having any one of the following amino acid sequences as an active ingredient:
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor
[13] Use of a protein having any one of the following amino acid sequences for promoting expression of an adipocyte-related factor:
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor
[14] A test method for the ability of a test substance to control the function of a protein comprising any of the following amino acid sequences, which is measured by the analysis method according to any one of [1] to [6]. Evaluate the ability of the substance to control the function of the protein based on the difference obtained by comparing the expression levels of adipocyte-related factors in the group in which two or more different substances are used independently as test substances. A testing method characterized by:
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor
[15] The assay method according to [14], wherein at least one of the two or more different substances is a blank.
[16] selecting a substance having the ability to control the function of a protein consisting of any one of the amino acid sequences evaluated by the assay method according to [14] or [15], based on the ability to control the function; A method for searching for a protein function controlling agent comprising the amino acid sequence of any of the above,
[17] A substance comprising the substance selected by the search method according to [16] or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. A protein function controlling agent comprising the amino acid sequence of any of the above,
[18] The therapeutic agent according to [17], wherein the control agent is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin sensitizer.
[19] A method for assaying the ability of a test substance to regulate the expression of an adipocyte-related factor,
(1) a first step of bringing a test substance into contact with an adipocyte capable of expressing an adipocyte-related factor,
(2) After the first step, a second step of measuring the amount of an adipocyte-related factor in the adipocyte or an index value having a correlation with the amount, and
(3) (2) in a section in which one or more substances as test substances and a protein having any one of the following amino acid sequences, each of which was measured in the steps (1) and (2), were used independently. A) evaluating the ability of the substance to control the expression of adipocyte-related factors based on the difference obtained by comparing the values of
A method for assaying the ability to control the expression of adipocyte-related factors, characterized by having an amino acid sequence
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor
[20] The test method according to [19], wherein the index value having a correlation with the amount of an adipocyte-related factor is the amount of mRNA of the factor in the adipocyte,
[21] The assay according to [19] or [20], wherein in the third step, two or more different substances are used as test substances, and at least one of them is a blank. Method,
[22] An adipocyte characterized by selecting a substance having an ability to control the expression of an adipocyte-related factor based on the ability to control the expression of an adipocyte-related factor evaluated by the assay method according to [21]. A method for searching for an agent for controlling the expression of a related factor,
[23] A substance comprising the substance selected by the search method according to [22] or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. Adipocyte-related factor expression regulator,
[24] the adipocyte-related factor expression regulator according to [23], which is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin resistance improving agent;
Is provided.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, in the present specification, the abbreviations of amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, and the like are referred to by the IUPAC-IUB regulations [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138: 9 (1984)], "Guidelines for Preparation of Specifications Containing Base Sequences or Amino Acid Sequences" (edited by the Japan Patent Office) and conventional symbols in the art.
As used herein, the term "gene" or "DNA" is used to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand that constitute the double-stranded DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in the present specification, a gene (DNA) means a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA containing cDNA (positive strand) and a sequence having a sequence complementary to the positive strand, unless otherwise specified. It includes a main-stranded DNA (complementary strand), and any of these fragments. In addition, the term “gene” or “DNA” includes not only “gene” or “DNA” represented by a specific nucleotide sequence, but also a protein having a biological function equivalent to a protein encoded by these (for example, a cognate family). “Gene” or “DNA” that encodes the “gene” or “DNA” encoding the “gene” or “DNA” represented by the above specific nucleotide sequence. Homolog "). Specific examples of such “homologs” include those that hybridize with the “gene” or “DNA” represented by the specific base sequence under the following stringent conditions.
For example, as a gene encoding a homolog (ortholog), a gene of another biological species such as a mouse or rat corresponding to a human gene can be exemplified, and these genes (ortholog) can be obtained from HomoloGene (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/Homologene/). Specifically, the specific human nucleotide sequence is matched with BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ( Score is the highest, E-value is 0, and Identity indicates 100%). The accession number is input to Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/), and the UniGene Cluster ID (the number indicated by Hs.) Obtained is input to HomoloGene. From the resulting list showing the correlation between genes of other species and human genes, genes of other species such as mice and rats corresponding to human genes can be selected. The gene or DNA does not matter which functional region is used, and may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
[0007]
As used herein, the term "adipocyte-related factor" refers to a factor involved in increasing or decreasing fat accumulation in adipocytes, such as a fatty acid or a neutral lipase, a transcription factor involved in adipocyte differentiation, or an adipocyte. And one or more selected from 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, ADD1, and the like. Factors.
[0008]
When a term such as “11βHSD-1 gene” or “11βHSD-1 DNA” is used in the present specification, unless otherwise specified, it is used to include the human 11βHSD-1 gene and homologs thereof. Specifically, it is a gene known as the 11βHSD-1 gene derived from human (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink, LocusID 3290). Ortholog [for example, mouse 11βHSD-1 gene (Locus ID 15483)] and the like. When a term such as “11βHSD-1 protein” or simply “11βHSD-1” is used, it is used to include human 11βHSD-1 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
In the present specification, when a term such as “aP2 gene” or “aP2 DNA” is used, it is used to include the human aP2 gene and homologs thereof unless otherwise specified. Specifically, it is a gene known as a human-derived aP2 gene (Locus ID 2167). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse aP2 gene (Locus ID 11770)]. When a term such as “aP2 protein” or simply “aP2” is used, it is used to include human aP2 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
When a term such as "DGAT1 gene" or "DGAT1 DNA" is used herein, unless otherwise specified, it is used to include the human DGAT1 gene and its homologue. Specifically, it is a gene known as a human-derived DGAT1 gene (Locus ID 8694). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse DGAT1 gene (Locus ID 13350)]. When a term such as “DGAT1 protein” or simply “DGAT1” is used, it is used to include human DGAT1 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
In the present specification, when a term such as “PPARγ2 gene” or “PPARγ2 DNA” is used, unless otherwise specified, it is used to include the human PPARγ2 gene and a homolog thereof. Specifically, it is a gene known as a human-derived PPARγ2 gene (Locus ID 5468). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse PPARγ2 gene (Locus ID 19016)]. When a term such as “PPARγ2 protein” or simply “PPARγ2” is used, it is used to include human PPARγ2 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
In the present specification, when a term such as "adiponectin gene" or "adiponectin DNA" is used, it is used to include the human adiponectin gene and homologs thereof unless otherwise specified. Specifically, it is a gene known as a human-derived adiponectin gene (Locus ID 9370). Further, examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse diponectin gene (Locus ID 11450)]. Further, when a term such as “adiponectin protein” or simply “adiponectin” is used, it is used to include human adiponectin and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
In the present specification, when a term such as “C / EBPα gene” or “C / EBPα DNA” is used, unless otherwise specified, it is used to include the human C / EBPα gene and its homologue. Specifically, it is a gene known as a human-derived C / EBPα gene (Locus ID 1050). Examples of the homolog include an isoform and an ortholog [for example, a mouse C / EBPα gene (Locus ID 12606)]. When a term such as “C / EBPα protein” or simply “C / EBPα” is used, it is used to include human C / EBPα and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
When a term such as "FAS gene" or "FAS DNA" is used herein, unless otherwise specified, it is used to include the human FAS gene and homologs thereof. Specifically, it is a gene known as a human-derived FAS gene (Locus ID 2194). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse FAS gene (Locus ID 14104)]. When a term such as "FAS protein" or simply "FAS" is used, it is used to include human FAS and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
When a term such as "GPAT1 gene" or "GPAT1 DNA" is used in this specification, it is used to include the human GPAT1 gene and homologues thereof, unless otherwise specified. Specifically, it is a gene known as a human-derived GPAT1 gene (Locus ID 16554). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse GPAT1 gene (Locus ID 55979)]. Further, when a term such as “GPAT1 protein” or simply “GPAT1” is used, it is used to include human GPAT1 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
When a term such as “GLUT4 gene” or “GLUT4 DNA” is used in this specification, unless otherwise specified, it is used to include the human GLUT4 gene and homologs thereof. Specifically, it is a gene known as a human-derived GLUT4 gene (Locus ID 6517). Examples of the homolog include an isoform and an ortholog [for example, a mouse GLUT4 gene (Locus ID 20528)]. When a term such as “GLUT4 protein” or simply “GLUT4” is used, it is used to include human GLUT4 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
When a term such as "ADD1 gene" or "ADD1 DNA" is used in this specification, it is used to include the human ADD1 gene and homologs thereof unless otherwise specified. Specifically, it is a gene known as a human-derived ADD1 gene (Locus ID 6720). Examples of the homolog include isoforms and orthologs [for example, mouse ADD1 gene (Locus ID 20787)]. Further, when a term such as “ADD1 protein” or simply “ADD1” is used, it is used to include human ADD1 and homologs thereof. Examples of the homolog include isoforms and orthologs.
[0009]
As used herein, the term "polynucleotide" is used to include both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. In addition, the above-mentioned RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
As used herein, “protein” or “(poly) peptide” includes not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific amino acid sequence but also a biological function equivalent to these, And / or proteins "proteins" or "(poly) peptides" having equivalent activity in immunological activity (eg, homologs (orthologs), derivatives, variants, etc.). In the present specification, these are also referred to as “homologs” of “protein” or “(poly) peptide” represented by the above specific amino acid sequence.
As the homolog, for example, homologues (orthologs) include proteins of other biological species such as mouse and rat corresponding to human proteins. These are homologogene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). / HomoGene /) can be identified from the base sequence of the gene identified in a deductive manner. The variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having an amino acid sequence modified by artificial deletion, substitution, addition and insertion. You.
Here, proteins having an equivalent biological function include 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, or ADD1 in biochemical or pharmacological functions. Proteins having an equivalent function can be mentioned, and examples of proteins having the same immunological activity as the above proteins include 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, Examples include GLUT4 or a protein having the ability to specifically bind to an antibody against ADD1.
[0010]
The number of amino acid mutations and mutation sites in a protein are not limited as long as their biological functions and / or immunological activities are maintained. Indicators for determining how and how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of biological function or immunological activity are computer programs well known to those skilled in the art, For example, it can be found using DNA Star software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted may be such that the protein obtained after the substitution has the biological function and / or immunological activity of 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, or ADD1. As long as it retains, it is not particularly limited, but from the viewpoint of protein structure retention, amino acids having properties similar to the amino acid before substitution, such as polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and amphipathic nature of the residue. It is preferable that For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are non-charged amino acids. Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
In addition, examples of the mutant include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide having no mutation.
[0011]
The “protein consisting of any of the following amino acid sequences” (hereinafter abbreviated as the present protein) used in the analysis method of the present invention includes:
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (that is, a partial amino acid sequence from the 27th position to the 491st position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1); Protein consisting of an amino acid sequence represented by amino acids),
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c) (that is, an amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) Protein consisting of an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote the expression of an adipocyte-related factor, and
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And a protein consisting of any amino acid sequence included in an amino acid group consisting of amino acid sequences capable of promoting the expression of adipocyte-related factors (hereinafter, may be abbreviated as the present protein).
[0012]
Here, “deletion, addition or substitution of amino acid” in the above (b) and “80% or more sequence identity” in the above (e) and (g) include, for example, SEQ ID NO: 1. It includes intracellular processing of a protein having an amino acid sequence, naturally occurring mutations due to species differences, individual differences, differences between tissues, etc., from which the protein is derived, and artificial amino acid mutations.
As a technique for artificially performing the “deletion, addition or substitution of an amino acid” (hereinafter, also referred to as amino acid modification in general) in (b), for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Conventionally, site-directed mutagenesis is performed on the DNA encoding the sequence, and then the DNA is expressed by a conventional method. Examples of the site-directed mutagenesis method include a method using an amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)) and a method using PCR using a primer for mutagenesis. And the like.
The number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically, one or several, or more. The number of such modifications may be within a range in which the ability to promote the expression of an adipocyte-related factor can be found.
In addition, among the above-mentioned deletions, additions or substitutions, modifications relating to amino acid substitutions are particularly preferred. The substitution is more preferably an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric structure. Such substitutions include, for example, (1) glycine, alanine; (2) valine, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, (4) serine, threonine; (5) lysine, arginine (6) Substitution within the group of phenylalanine and tyrosine.
[0013]
In the present invention, “sequence identity” refers to sequence identity and homology between two DNAs or two proteins. Said "sequence identity" is determined by comparing two optimally aligned sequences over the region of the sequence to be compared. Here, the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences. Regarding such sequence identity, for example, using the Vector NTI, the ClustalW algorithm [Nucleic Acid Res. , 22 (22): 4673-4680 (1994)]. The sequence identity is measured by using sequence analysis software, specifically, an analysis tool provided by Vector NTI, GENETYX-MAC, or a public database. The public database is, for example, a homepage address http: // www. ddbj. nig. ac. jp is generally available.
The sequence identity in the present invention may be 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more. In addition, DNA sequence identity includes codon fluctuations without amino acid mutation.
[0014]
Regarding "hybridize under stringent conditions" in (h) above, the hybridization used herein is described in, for example, Sambrook J. et al. Frisch E., et al. F. , Maniatis T .; The method can be carried out according to an ordinary method described in Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, and the like. Further, “under stringent conditions” refers to, for example, 45 ° C. in a solution containing 6 × SSC (a solution containing 1.5 M NaCl and 0.15 M trisodium citrate is referred to as 10 × SSC) and 50% formamide. After forming a hybrid at 50 ° C. with 2 × SSC (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6). ) And the like. The salt concentration in the washing step can be selected, for example, from the condition of 2 × SSC at 50 ° C. (low stringency condition) to the condition of 0.2 × SSC up to 50 ° C. (high stringency condition). The temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). Also, both the salt concentration and the temperature can be varied.
[0015]
The method for preparing the present protein will be described below.
First, a gene encoding the present protein (hereinafter sometimes referred to as the present gene), for example, (I) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (II) an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 In the sequence, a base sequence encoding a partial amino acid sequence in which 26 amino acids have been deleted from the amino terminus (that is, the amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) (III) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the amino acid sequence of (II) above, wherein methionine is added to the amino terminus thereof; (IV) a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6; A base sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide, (V) represented by SEQ ID NO: 6 (VI) a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 96th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, (VII) a 5'-terminal thereof in the nucleotide sequence of the above (VI) And (VIII) a gene having a base sequence such as the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 by a conventional genetic engineering method (for example, Sambrook J., Frisch EF). , Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition, a method described in Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc. (Method described in Cold Spring Harbor Laboratory press). Next, by using the obtained present gene, the present protein is produced and obtained according to a usual genetic engineering method. Thus, the present protein can be prepared.
[0016]
For example, a culture can be obtained by preparing a plasmid capable of expressing the present gene in a host cell, introducing the plasmid into the host cell, transforming the plasmid, and further culturing the transformed host cell (transformant). What is necessary is just to obtain this protein from a thing. Examples of the plasmid include a plasmid that contains genetic information that can be replicated in a host cell, is capable of autonomous propagation, is easily isolated and purified from the host cell, and is a promoter that can function in the host cell. And a gene in which a gene encoding the present protein is introduced into an expression vector having a detectable marker. Various types of expression vectors are commercially available. For example, an expression vector used for expression in Escherichia coli is an expression vector containing a promoter such as lac, trp, or tac, and these are commercially available from Pharmacia, Takara Shuzo, or the like. Restriction enzymes used for introducing a gene encoding the present protein into the expression vector are also commercially available from Takara Shuzo.
If it is necessary to induce further high expression, a ribosome binding region may be linked upstream of the gene encoding the present protein. As the ribosome binding region to be used, Guarante L. et al. (Cell 20, p543) and Taniguchi et al. (Genetics of Industrial Microorganisms, p202, Kodansha).
[0017]
Examples of host cells include prokaryotic or eukaryotic microbial cells, insect cells, mammalian cells, and the like. For example, Escherichia coli and the like can be preferably mentioned from the viewpoint that large-scale preparation of the present protein is facilitated, but mammalian cells may be used.
The plasmid obtained as described above can be introduced into the host cell by a conventional genetic engineering method.
[0018]
The transformant can be cultured by a conventional method used for culturing microorganisms, insect cells or mammalian cells. For example, in the case of Escherichia coli, the cultivation is performed in a medium containing an appropriate carbon source, a nitrogen source, and trace nutrients such as vitamins as appropriate. The culture method may be any of solid culture and liquid culture, and preferably includes liquid culture such as aeration and stirring culture.
[0019]
The present protein may be obtained by combining methods generally used for isolation and purification of general proteins. For example, transformants obtained by the above-mentioned culture are collected by centrifugation or the like, and the transformants are crushed or dissolved, if necessary, proteins are solubilized, and various types such as ion exchange, hydrophobicity, gel filtration, etc. Purification may be performed by a single step or a combination of steps using chromatography. Alternatively, for example, the transformant obtained by the above culture may be removed by centrifugation or the like, and the present protein may be purified from the culture supernatant in the same manner as described above. If necessary, an operation for restoring the higher-order structure of the purified protein may be further performed.
[0020]
The present protein is, as an active ingredient of an adipocyte-related factor expression promoter, for example, a substance capable of suppressing adipocyte-related factor expression in adipocytes as described below, or an ability to promote adipocyte-related factor expression The method can be used for a method of effectively analyzing the expression level of an adipocyte-related factor for searching for a substance having the following.
[0021]
The first aspect of the present invention relates to a method for analyzing the expression level of a fat cell-related factor, a method for assaying the ability to control the expression of a fat cell-related factor using the same, and the like.
The analysis method of the present invention comprises (1) a first step of bringing the present protein and a test substance into contact with adipocytes, and (2) an amount of an adipocyte-related factor expressed in the adipocytes or the amount thereof after the first step. And a second step of measuring an index value having a correlation with.
The adipocyte in the present invention is not particularly limited, but is selected from 11βHSD-1, aP2 gene, DGAT1 gene, PPARγ2 gene, adiponectin gene, C / EBPα gene, FAS gene, GPAT1 gene, GLUT4 gene, and ADD1 gene. Cells capable of expressing one or more genes. Specific examples of the origin of the adipocyte include human, monkey, cow, rabbit, mouse, rat, hamster and the like. Preferably, preadipocytes isolated from mouse or rat adipose tissue, for example, according to the method described in International Publication WO02 / 10772, may be mentioned. In addition, pre-established adipocytes can also be used. Such cell lines include, for example, mouse 3T3-L1 cells and the like. Such cell lines are commercially available or can be easily obtained from a cell depository such as the ATCC (American Type Culture Collection). The fat cells used in the analysis method of the present invention may be cells isolated from a tissue, cells forming a group having the same function and morphology, or cells in the body of a mammal. In some cases, an extraction system for the cells may be used.
[0022]
The cultivation of the fat cells can be performed according to a usual method (for example, a method described in “Bio-Experiment Illustrated (6) Quickly Growing Cell Culture, 1996, published by Shujunsha, etc.). Specifically, for example, at 37 ° C., 5% CO ₂ A preferred embodiment is a method of culturing under the following conditions.
[0023]
The first step of the analysis method of the present invention may be a method of contacting the present adipocyte with the present protein, and then contacting the test substance with the treated adipocyte, or simultaneously contacting the adipocyte with the present protein or Prior to this, a method of bringing a test substance into contact with the fat cells may be used. That is, the order in which the present protein and the test substance are brought into contact with the fat cells may be either first or simultaneously, but preferably the test substance is brought into contact with the fat cells in the presence of the present protein. Good.
The concentration of the present protein to be brought into contact with adipocytes may be generally about 1 ng / ml to about 10 μg / ml, and preferably 3 ng / ml to 100 ng / ml. The time for bringing the adipocyte into contact with the present protein is usually about 10 minutes to about 8 days, preferably about several hours to about 6 days. The concentration of the test substance to be brought into contact with the fat cells may be generally about 0.1 μM to about 100 μM, and preferably 1 μM to 50 μM. The time for bringing the adipocyte into contact with the test substance is usually about 10 minutes to about 8 days, preferably about several hours to about 6 days.
The environment in which the present protein and the test substance are brought into contact with the fat cells is preferably an environment in which the life activity of the fat cells is maintained, and examples thereof include an environment in which the energy source of the fat cells coexists. Specifically, it is advantageous that the first step is performed in a medium.
[0024]
Furthermore, the first step of the analysis method of the present invention may be, for example, a method of contacting a test substance with a transformed adipocyte obtained by introducing a gene encoding the present protein into an adipocyte.
In this step, the concentration of the test substance to be brought into contact with the transformed adipocyte of the present invention may generally be about 0.1 μM to about 100 μM, and preferably 1 μM to 50 μM. The time for bringing the adipocyte into contact with the test substance is usually preferably from 10 minutes to about 8 days, more preferably from several hours to about 6 days.
[0025]
The transformed fat cell of the present invention can be prepared as follows.
A gene encoding the present protein (hereinafter, sometimes referred to as the present gene) is connected to a promoter in a form that can be expressed in a vector that can be used in an adipocyte into which the present gene is to be introduced, using a general genetic engineering technique. A plasmid is prepared by inserting the plasmid as described above. The promoter used here may be a promoter capable of functioning in an adipocyte into which the present gene is introduced. For example, SV40 virus promoter, cytomegalovirus promoter (CMV promoter), Raus Sarcoma Virus promoter (RSV promoter), β Actin gene promoter and the like. A commercially available vector containing such a promoter upstream of the multiple cloning site may be used. Alternatively, the promoter of the present gene itself may be used.
Next, the plasmid is introduced into adipocytes. Examples of the method of introducing into a fat cell include a calcium phosphate method, an electric transduction method, a DEAE dextran method, and a micelle forming method. Grimm, S.M. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923-10927, and the like, Ting, A.A. T. et al. , EMBO J .; , 15, 6189-6196, and the micelle formation method described in Hawkins, C .; J. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786-13790 and the like. When the micelle formation method is used, a commercially available reagent such as Lipofectamine (manufactured by Gibco) or Fugene (manufactured by Boehringer) may be used.
The transformed adipocytes of the present invention are obtained by culturing the adipocytes subjected to the plasmid introduction treatment, for example, by using a selection marker gene previously contained in the vector and culturing in a medium under selection conditions according to the selection marker gene. Can be selected. Further, the selection may be continued to obtain a transformed adipocyte of the present invention which has become a stable transformant obtained by introducing the present gene into a chromosome. To confirm that the introduced gene has been integrated into the chromosome present in adipocytes, the genomic DNA of the cell is prepared according to ordinary genetic engineering methods, and the partial nucleotide sequence of the gene is determined. The presence of the present gene in the genomic DNA may be detected and confirmed by using a method such as PCR using the DNA contained as a primer or Southern hybridization using a DNA having a partial base sequence of the present gene as a probe.
Alternatively, the amount of an adipocyte-related factor in adipose tissue or adipocytes of a transgenic animal into which a gene encoding the present protein has been introduced may be measured. The transgenic animal can be prepared by a method known to those skilled in the art, such as a microinjection method.
[0026]
In addition, one or more adipocyte-related factors of the present invention can be cDNA-cloned to construct a plasmid, and then transfected into adipocytes. Such transformed cells are also a category of the adipocyte of the present invention. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done. Specifically, a method similar to the above-described method for preparing the transformed adipocyte of the present invention may be used.
[0027]
As a method for measuring an index value having a correlation with the fat cell-related factor amount or the amount in the analysis method of the present invention, for example,
(1) The amount of an adipocyte-related factor is measured by a radioimmunoassay (RIA) method using an antibody that specifically recognizes an adipocyte-related factor, an enzyme-labeled antibody measurement method (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA), Western blotting, or the like. how to,
(2) As an index value having a correlation with the amount of adipocyte-related factor, the amount of mRNA of adipocyte-related factor present in the adipocyte,
(3) As an index value having a correlation with the amount of an adipocyte-related factor, a physiological activity value of an adipocyte-related factor in the adipocyte or in the adipocyte culture solution;
(4) As an index value having a correlation with the amount of an adipocyte-related factor, a physiological activity value of a detection marker gene-derived protein linked downstream of an expression control region of the factor,
And the like.
[0028]
In the measurement of the amount (protein amount) of the adipocyte-related factor in the above (1), a radioimmunoassay (RIA) method using an antibody that specifically recognizes the adipocyte-related factor, an enzyme-labeled antibody measurement method (Enzyme Linked Immunosorbent) Assay; ELISA), Western blotting and the like are used.
For example, in the Western blotting method, an adipocyte, a lysate of an adipocyte or a culture supernatant of an adipocyte is electrophoresed, and the protein after the electrophoresis is blotted on a suitable membrane such as nitrocellulose using a usual method. After using an antibody that specifically recognizes adipocyte-related factors as the primary antibody for this membrane, ¹²⁵ Adipocyte-related factors are labeled using an antibody that binds to a primary antibody labeled with a radioisotope or a fluorescent substance such as I, and a signal derived from the radioisotope or the fluorescent substance is measured using a radiometer (BAS-1800II: Fuji (Made by Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector. In addition, using the ECL Plus Western Blotting Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), detection is performed according to the protocol, and the multi-bio imager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia, Inc., which can also be measured by Amersham Pharmacia). Further, the principle and method of the ELISA method are described in detail in Biochemical Experiment Method 11 (published by Tokyo Chemical Dojinsha), Method in Enzymology, vol. 70 (Academic Press).
The basic principle of the RIA method is the same as that of the ELISA method. For example, a competitive reaction is caused by adding a sample containing an unknown amount of an antigen protein to a reaction solution of a known amount of a labeled antigen and an antibody. Is a method of separating an antigen-antibody complex from a free antigen, measuring either of them, and comparing with a standard curve to determine the amount of antigen protein in the sample (Shinsei Kagaku Kenkyusho 12; Tokyo, Japan). Method in Enzymology, vol. 70, published by Academic Press).
[0029]
The method for producing the antibody used above is already well known, and can be produced according to these conventional methods also in the present invention (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish John Wiley and Sydney). Section 11.12 to 11.13). Specifically, in the case of a polyclonal antibody, an oligopeptide having a partial amino acid sequence of an adipocyte-related factor protein is synthesized using an adipocyte-related factor protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method. Then, a non-human animal such as a rabbit can be immunized and obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, a non-human animal such as a mouse was immunized with a fat cell-related factor protein expressed or purified in E. coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the factor. It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion of spleen cells and myeloma cells (Current Protocols in Molecular Biology Edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wisconsin. 11).
[0030]
In addition, the protein used for producing the antibody is based on known gene sequence information encoding adipocyte-related factors, cDNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culture of a transformant and culture of the transformant. From the protein. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done. Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding an adipocyte-related factor in a desired host cell is prepared, introduced into a host cell, transformed, and the transformant is cultured. Then, the target protein can be recovered from the obtained culture. These adipocyte-related factors can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the information on the amino acid sequence provided by the present invention.
[0031]
In the quantification of mRNA in the above (2), a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in a nucleotide sequence of a gene encoding an adipocyte-related factor and / or a polynucleotide complementary thereto is used as a primer or a probe by RT -Conventional methods such as PCR method, Northern hybridization method, DNA chip analysis method, in situ hybridization analysis method (for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning, 2nd edition (Molecular Cloning) 2nd edition), a method described in Cold Spring Harbor Laboratory press, etc.).
[0032]
For example, when using the Northern hybridization method, the probe may be replaced with a radioisotope ( ³² P, ³³ P or the like: labeled with RI) or a fluorescent substance, and then hybridized with an adipocyte-derived RNA transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and then formed with a probe (DNA or RNA) and RNA. An example of a method for detecting and measuring the amount of the double-stranded DNA, that is, the amount of the adipocyte-related factor, with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film Corporation) or a fluorescence detector as a signal derived from the probe. it can. Further, using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham PharmaciaBiotech), the probe DNA is labeled according to the protocol, and the probe DNA is hybridized with RNA derived from adipocytes. A method of detecting and measuring with STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.
[0033]
When the RT-PCR method is used, RNA is extracted from the adipocytes used for the analysis, cDNA is prepared according to a conventional method, and the nucleotide sequence region encoding the target adipocyte-related factor is used as a template to prepare a cDNA. A pair of primers (a positive strand binding to the above cDNA (-strand) and a reverse strand binding to the + strand) are designed so as to be able to amplify the DNA, and synthesized by an ordinary method. In designing primers, for example, software such as Oligo version 5 can be used. A method for performing PCR using the synthesized primers and detecting and quantifying the resulting amplified double-stranded DNA can be exemplified. The amount of labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using primers that have been labeled with RI or a fluorescent substance in advance is defined as the amount of radioactivity or fluorescent substance, for example, Agilent 2100 Bioanalyzer (Yokogawa (Analytical Systems, Inc.) or the like. In addition, there is a method in which the produced double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled adipocyte-related factor primer is used as a probe, hybridized thereto, and quantified. In addition, an RT-PCR reaction solution was prepared using SYBR Green RT-PCR Reagents (manufactured by Applied Biosystems) according to the protocol, and ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (a reaction of Applied Biosystems using Applied Biosystems). , Can also be quantified.
[0034]
When DNA chip analysis is used, a DNA chip having a nucleotide sequence derived from a gene encoding an adipocyte-related factor attached as a probe (single-stranded DNA) is prepared, and RNA is extracted from adipocytes. A method of adding cRNA prepared by a conventional method and quantifying the amount of double-stranded DNA and cRNA formed can be mentioned. For example, the expression level of one or a plurality of genes selected from the 11βHSD-1 gene, aP2 gene, DGAT1 gene, PPARγ2 gene, adiponectin gene, C / EBPα gene, FAS gene, GPAT1 gene, GLUT4 gene, and ADD1 gene is detected. Examples of DNA chips that can be measured include Gene Chip Human Genome U95A, A, B, C, D, and E manufactured by Affymetrix.
[0035]
In the above (3), when measuring the physiological activity value of the adipocyte-related factor, when the adipocyte-related factor is an enzyme such as 11βHSD-1, DGAT1, FAS, GPAT1, etc., a method of measuring the enzyme activity Can be used. When the adipocyte-related factor is a transcription factor such as PPARγ2, C / EBPα, or ADD1, a method for measuring the expression level of a protein controlled by the transcription factor or a response region of the transcription factor may be used. The used reporter gene assay or the like can be used. For these methods, methods known to those skilled in the art can be used. Hereinafter, a specific description will be given.
(3-1) When the adipocyte-related factor is an enzyme
From the cells that have been subjected to the treatment in the first step of the analysis method of the present invention, a solution containing an adipocyte-related factor (enzyme) can be prepared and reacted with a substrate. Here, as the solution, a culture supernatant of the cells, a suspension obtained by crushing the cells, or a supernatant obtained by separating the suspension into a pellet and a supernatant by centrifugation can be used.
That is, by contacting a solution containing a substrate and an adipocyte-related factor, performing an enzyme reaction for a certain period of time, a method of analyzing the amount of decrease in the substrate, or a method of analyzing the amount of increase in the product in the enzyme reaction, or A method for measuring a physiological activity caused by the enzyme activity is exemplified.
Specifically, a substrate is added to an aqueous solution (usually a buffer is used) containing an adipocyte-related factor (enzyme) and allowed to react at room temperature for a certain period of time. Before and after the reaction, the amount of the substrate or the amount of the product is measured. That is, the amount of the substrate or the product immediately before the start of the reaction or immediately after the start of the reaction, and the amount of the substrate or the product that has decreased after a certain period of time after the start of the reaction are measured. Further, the substrate may be added after the completion of the first step, or may be added in the first step of the analysis method of the present invention. That is, the order in which the present protein, the test substance, and the substrate are brought into contact with adipocytes is not particularly limited. Further, the substrate is usually used as a solution of water or a buffer, and an organic solvent such as DMSO or ethanol can be appropriately added according to the solubility.
Here, the reaction temperature at the time of measuring the enzyme activity may be, for example, 20 ° C to 70 ° C, and preferably 30 ° C to 40 ° C. The reaction time is, for example, 1 minute or more, preferably 15 minutes to 1 day. The reaction pH is, for example, 6.0 to 9.5, and preferably 7.5 to 9.0.
[0036]
For the detection of the substrate or the product in the enzymatic reaction in this step, or the measurement of the amount, the reaction solution is subjected to, for example, high performance liquid chromatography (hereinafter, referred to as HPLC), thin-layer chromatography, paper chromatography, or the like. After separation, the substrate or product may be analyzed by a method appropriate for the individual compound. For example, ultraviolet absorption, visible light absorption, fluorescence activity, or radioactivity may be detected and measured. When it is necessary to remove the protein from the reaction solution during the above analysis, for example, see Methods Enzymol. 280, 211-221, etc., the protein may be removed from the reaction solution. Further, the substrate can be labeled with a fluorescent label or a radioisotope by a method known to those skilled in the art in order to increase the detection sensitivity.
[0037]
(3-2) When the adipocyte-related factor is a transcription factor
A method for measuring the expression level of a protein controlled by the transcription factor, a reporter gene assay using a response region of the transcription factor, and the like can be used. Examples of a method for measuring the expression level of a protein controlled by the transcription factor include a method for measuring the amount of the protein and a method for measuring the amount of mRNA of a gene encoding the protein. It can be carried out according to the method described in the above (1) and (2).
On the other hand, the reporter gene assay can be performed according to the method described in (4) below.
[0038]
In the above (4), as an index value having a correlation with the amount of an adipocyte-related factor, a physiological activity value of a protein derived from a detection marker gene (reporter gene) linked to a gene region controlling expression of the factor (expression control region) Is measured as described below. That is, the activity of a protein derived from a detection marker gene can be measured using a cell line in which a linked gene having a detection marker gene such as a luciferase gene introduced therein is introduced into the expression control region (reporter gene assay).
The detection marker gene is preferably a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction. Specifically, in addition to the luciferase gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene, a β-glucuronidase gene, a β-galactosidase gene And reporter genes such as the aequorin gene can also be used.
Here, as the expression control region of the gene encoding the adipocyte-related factor, for example, about 1 kb, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the gene can be used. Since the promoter region of the human adiponectin gene is determined in the literature (Int. J. Obes., Vol. 24, p. 861, 2000), the promoter region disclosed in these literatures can be used. .
Preparation of the linked gene and measurement of the activity derived from the marker gene can be performed by known methods.
[0039]
Specifically, for example, a reporter vector is prepared in which the expression regulatory region of an adipocyte-related factor is incorporated in a vector such as pGL3-basic Vector (manufactured by Promega) containing a luciferase gene as a detection marker gene.
For example, transformed adipocytes are prepared by introducing a reporter vector into cells such as 3T3-L1 cells (available from the ATCC). After pre-incubating the cells, a solution containing the present protein and the test substance is added, and the culture is continued for another 6 to 24 hours. After completion of the culture, a luciferase substrate (Promega) is added, and the luciferase activity can be detected by measuring the amount of luminescence for 10 seconds with a luminometer ML3000 (Dynatech Laboratories).
[0040]
Hereinafter, the method for measuring the physiological activity value of an adipocyte-related factor of the present invention will be specifically exemplified. For example, as for 11βHSD-1, a method of crushing adipocytes by an appropriate method, adding a radiolabeled substrate cortisone or 11-dehydrocorticosterone thereto, and measuring the amount of cortisol or corticosterone to be produced is known. (Endocrinology, vol. 142, p. 1371, 2001). Regarding DGAT1, there is a method of quantifying the enzymatic activity by measuring the amount of incorporation of a labeled fatty acid derivative, for example, oleic acid-CoA, into triglyceride (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95). , P.13018, 1998). For FAS, see J.M. Nutr. , Vol. 126, p. 865, 1996, the enzyme activity can be measured. As for GPAT1, a method of measuring the enzyme activity using a labeled substrate can be mentioned (Methods Enzymol., Vol. 209, p. 92.1992). As for PPARγ2, a base sequence that PPARγ2 recognizes and binds, a plasmid in which a detection marker gene is linked downstream of PPRE (PPAR responsible element) is introduced into adipocytes, and the physiological activity value of the detection marker gene-derived protein is determined as described above. There is a method of measuring (Cell, vol. 93, p. 229, 1998). As for adiponectin, a method of quantifying the promotion of β-oxidation activity by collecting a culture supernatant of adipocytes and adding the supernatant to muscle cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 98, p. 2005) , 2001). Regarding C / EBPα, a method for quantifying the expression level of a factor that is regulated by C / EBPα expression, for example, the Glut4 gene that is a sugar transporter can be mentioned (Annu. Rev. Nutr., Vol. 14, p. 99). , 1994).
[0041]
Compare the index value of the fat cell-related factor or the index value having a correlation with the amount in the section in which two or more different substances as test substances were independently used, which were measured by the analysis method of the present invention as described above. Based on the difference obtained, the ability of the substance to control the expression of an adipocyte-related factor (ie, the ability to suppress the expression or promote the expression) is evaluated. In this manner, the test substance can be assayed for its ability to control the expression of adipocyte-related factors (the assay method of the present invention).
In the assay method of the present invention, at least one of the two or more different substances is used as a blank (having no ability to control the expression of an adipocyte-related factor, for example, a background such as a solvent or a test solution). The ability of the other test substance to control the expression of adipocyte-related factors may be evaluated, or the fat contained in at least one of the two or more different substances may be evaluated. The ability of the other test substance to control the expression of an adipocyte-related factor may be evaluated based on the ability to control the expression of a cell-related factor.
Of course, the amount of the adipocyte-related factor expressed in adipocytes after contacting both the adipocyte-related factor expression promoting factor (that is, the present protein) and the test substance, or an index value having a correlation with the amount thereof ( Hereinafter, the measured value is referred to as 1)) is correlated with the amount of the adipocyte-related factor expressed in adipocytes after contact with the expression promoter of the adipocyte-related factor and without contact with the test substance or the amount thereof. The ability of the test substance to control the expression of an adipocyte-related factor may be evaluated by comparing with an index value having the following (hereinafter, referred to as a measured value 2). In this case, the ability to control the expression of the adipocyte-related factor may be obtained as the expression control rate of the adipocyte-related factor according to the following formula using the measured value.
That is, when the test substance has the ability to suppress the expression of an adipocyte-related factor by the present protein, the expression suppression rate is represented by the following formula:
Adipocyte-related factor expression suppression rate (%) = [(measured value−measured value 1) / measured value 2] × 100
Is required. When the test substance has the ability to promote the expression of an adipocyte-related factor by the present protein, the expression promotion rate is represented by the following formula:
Adipocyte-related factor expression promotion rate (%) = [(measured value-measured value 2) / measured value 2] × 100
Is required.
Here, a blank (a substance which does not have the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, such as a solvent or a background solution such as a test solution) is used as a test substance, and adipocytes are absent in the absence of the present protein. The amount of the relevant factor or an index value having a correlation with the amount may be measured and used as a control. That is, the measured value (measured value 0) in the control can be subtracted from the measured values 1 and 2 to calculate the expression suppression rate and the expression promotion rate of the fat cell-related factor. In this case, the expression suppression rate is calculated by the following formula:
Adipocyte-related factor expression suppression rate (%) = [{(measured value−measured value 0) − (measured value−measured value 0)} / (measured value−measured value 0)] × 100
Is required. When the test substance has the ability to promote the expression of an adipocyte-related factor by the present protein, the expression promotion rate is represented by the following formula:
Adipocyte-related factor expression promotion rate (%) = [{(measured value−measured value 0) − (measured value−measured value 0)} / (measured value−measured value 0)] × 100
Is required.
[0042]
To search for an adipocyte-related factor expression controlling substance, a substance having the ability to control adipocyte-related factor expression based on the ability to control adipocyte-related factor expression evaluated by the assay method of the present invention should be selected. (Search method of the present invention).
For example, a substance showing a statistically significant value in the expression control rate of an adipocyte-related factor, which indicates the ability of a test substance to control the expression of an adipocyte-related factor, is specifically preferably, for example, 30% or more. A substance having the ability to control the expression of an adipocyte-related factor is selected as a substance having the ability to control the expression of an adipocyte-related factor. The substance may be any substance such as a low molecular weight compound, a protein (including an antibody) or a peptide as long as it has an ability to control the expression of an adipocyte-related factor.
The substance selected by the search method of the present invention has an ability to control the expression of an adipocyte-related factor, and the active ingredient of an adipocyte-related factor expression regulator (antiobesity agent, antidiabetic agent, or insulin-resistant agent) And the like.
Specifically, an expression inhibitor of 11βHSD-1, aP2, DGAT1, FAS, GPAT1, or GLUT4 is useful as a preventive agent, a therapeutic agent, or a progress inhibitor for diseases such as obesity, insulin resistance, and diabetes. is there.
In addition, the PPARγ2, adiponectin, or C / EBPα expression promoter is useful as a therapeutic agent for diseases such as insulin resistance and diabetes.
The second aspect of the present invention relates to a method for assaying the ability to control the function of the present protein.
That is, the amount of a fat cell-related factor or an index value having a correlation with the amount in a section in which two or more different substances as test substances are independently used is measured by the above-described analysis method of the present invention. The ability of the substance to control the function of the present protein (that is, the ability to suppress the function or promote the function) is evaluated based on the difference obtained by the above. In this way, the ability of the test substance to control the function of the present protein can be assayed (the assay method of the present invention).
The function of the present protein includes a function of inducing the expression of adipocyte-related factors, specifically 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, and ADD1.
[0044]
In the assay method of the present invention, at least one of the two or more different substances is a blank (having no ability to control the expression of an adipocyte-related factor, for example, a background such as a solvent or a test solution). The ability to control the function of the present protein possessed by the other test substance may be evaluated, or the present protein possessed by at least one of the two or more different substances may be evaluated. The ability of the other test substance to control the function of the protein of the present invention may be evaluated based on the ability to control the function of the protein.
Of course, the amount of an adipocyte-related factor expressed in adipocytes after contacting both the present protein and the test substance, or an index value having a correlation with the amount (hereinafter referred to as a measured value 1), is determined by the present invention. The amount of the adipocyte-related factor secreted from adipocytes after contacting the protein and not the test substance, or an index value having a correlation with the amount (hereinafter referred to as measured value 2) is compared. Thus, the ability of the test substance to control the function of the present protein may be evaluated. In this case, the ability to control the function of the present protein may be obtained as a function control rate of the present protein using the above measured values according to the following formula.
That is, when the test substance has the ability to inhibit the function of the present protein, the function inhibition rate is calculated by the following formula:
Function suppression rate (%) = [(measured value−measured value 1) / measured value 2] × 100
Is required. When the test substance has the ability to promote the function of the present protein, the function promotion rate is represented by the following formula:
Function promotion rate (%) = [(measured value-measured value 2) / measured value 2] × 100
Is required.
Here, a blank (a substance which does not have the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, such as a solvent or a background solution such as a test solution) is used as a test substance, and adipocytes are absent in the absence of the present protein. The amount of the relevant factor or an index value having a correlation with the amount may be measured and used as a control. That is, the measured value (measured value 0) of the control can be subtracted from the measured values 1 and 2 to calculate the function inhibition rate and function promotion rate of the present protein.
[0045]
In order to search for a function controlling substance of the present protein, a substance having the ability to control the function of the present protein may be selected based on the ability to control the function of the present protein evaluated by the assay method of the present invention (see the search for the present invention). Method).
For example, a substance showing a statistically significant value of the function control rate of the present protein, which indicates the ability of the test substance to control the function of the present protein, more preferably, for example, a substance showing 30% or more, Preferably, a substance showing 50% or more is selected as a substance having the ability to control the function of the present protein. The substance may be any substance such as a low molecular weight compound, a protein (including an antibody) or a peptide as long as it has the ability to control the function of the present protein.
The substance selected by the search method of the present invention has an ability to control the function of the present protein, and may be used as an active ingredient of a function controlling agent of the present protein. Specifically, the function inhibitor of the present protein is useful as an antiobesity agent, an antidiabetic agent, an insulin resistance improving agent, and the like.
[0046]
A third aspect of the present invention relates to a method for assaying the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, wherein the positive control substance is the present protein, and the like. A first step of contacting a test substance with an adipocyte, (2) a second step of measuring an adipocyte-related factor amount in the adipocyte or an index value having a correlation with the amount after the first step, and (3) By comparing the value of (2) in one or a plurality of test substances and a section in which the present protein was independently used, which were measured in the steps (1) and (2), respectively. And a third step of evaluating the ability of the substance to regulate the expression of an adipocyte-related factor based on the obtained difference. The first step and the second step of the assay method are the same as those of the present invention except that the present protein is used as one of the test substances, and that if the test substance is not the present protein in the first step, the present protein is not contacted. Can be carried out according to the first embodiment.
[0047]
In the third step, the amount of a fat cell-related factor or an index value having a correlation with the amount is compared in a section in which a positive control substance as a test substance and one or two or more different substances are independently used. Based on the difference thus obtained, the ability of the substance to regulate the expression of an adipocyte-related factor (ie, the ability to suppress the expression or promote the expression) can be evaluated.
Here, the positive control substance is the present protein, and the concentration of the present protein may be generally about 1 ng / ml to about 10 μg / ml, and preferably 3 ng / ml to 100 ng / ml. In addition, based on the ability of the present protein to regulate the expression of adipocyte-related factors, the ability of other test substances to regulate the expression of adipocyte-related factors can be evaluated.
Test substances other than the present protein are the same as in the first embodiment of the present invention described above, and one test substance is further blanked (having no ability to control the expression of an adipocyte-related factor, for example, a solvent, (A substance serving as a background such as a test system solution) may be used to evaluate the ability of another test substance to control the expression of an adipocyte-related factor.
[0048]
Specifically, when the test substance is the present protein (that is, a positive control substance), the amount of an adipocyte-related factor or an index value having a correlation with the amount (hereinafter referred to as measured value 3) is tested. By comparing the amount of the adipocyte-related factor of the substance or an index value having a correlation with the amount (hereinafter referred to as a measured value 4), the ability of the test substance to control the expression of the adipocyte-related factor is determined. Can be evaluated. In this case, the amount of the adipocyte-related factor or the amount of the adipocyte-related factor when a blank (a substance that does not have the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, such as a solvent or a test solution) is used as a test substance is used. An index value having a correlation with the amount (hereinafter, referred to as a measured value 5) may be used as a background value.
That is, when the test substance has the ability to promote the expression of an adipocyte-related factor, the ability to promote the expression of the present protein: (measured value 3 to measured value 5) and the ability to promote the expression of the test substance: (measured value 4-measured value 5) is compared, and when (measured value 4-measured value 5) shows a value larger than (measured value 3-measured value 5), the test substance is superior to the present protein. It can be evaluated that it has the ability to promote the expression of adipocyte-related factors.
[0049]
To search for an adipocyte-related factor expression controlling substance, a substance having the ability to control adipocyte-related factor expression based on the ability to control adipocyte-related factor expression evaluated by the assay method of the present invention should be selected. (Search method of the present invention). The substance may be any substance such as a low molecular weight compound, a protein (including an antibody) or a peptide as long as it has an ability to control the expression of an adipocyte-related factor.
The substance selected by the search method of the present invention has an ability to promote the expression of an adipocyte-related factor, and may be used as an active ingredient of an adipocyte-related factor expression promoter. Specifically, the PPARγ2, adiponectin, C / EBPα expression promoter can be used as an antidiabetic agent, an insulin resistance improving agent, or the like.
[0050]
In the present invention, the test substance may be a nucleic acid (including an antisense nucleic acid of the gene of the present invention), a peptide, a protein (including an antibody against the protein of the present invention), an organic compound, an inorganic compound, and the like. Yes, screening can be specifically performed by bringing a sample (test sample) containing a test substance that can be a candidate substance into contact with the tissue or cell. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like. The test substance is usually used as a solution of water or a buffer, and an organic solvent such as DMSO or ethanol can be appropriately added according to the solubility.
[0051]
An agent for controlling the expression of an adipocyte-related factor comprising a substance selected by the search method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a function controlling agent for the protein of the present invention (hereinafter referred to as the controlling agent of the present invention). ) Can be administered orally or parenterally to mammals such as humans. For example, when administered orally, the control agent of the present invention can be used in usual forms such as tablets, capsules, syrups, suspensions and the like. In the case of parenteral administration, the control agent of the present invention can be used in the form of ordinary liquid preparations such as solutions, emulsions and suspensions. Examples of a method of parenterally administering the control agent of the present invention in the form described above include an injection method, a method of administering rectally in the form of a suppository, and the like.
The above-mentioned appropriate dosage form is prepared by mixing a substance selected by the search method of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof with an acceptable usual carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent and the like. It can be manufactured by the following. When the composition is used in the form of an injection, an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
The dose varies depending on the age, sex, weight, degree of disease, type of the arteriosclerosis exacerbating factor secretion controlling agent, dosage form, etc. of the mammal to be administered. About 1 mg to about 2 g, preferably about 5 mg to about 1 g, of the active ingredient may be administered per day. In the case of injection, about 0.1 mg to about 500 mg of the active ingredient may be administered to an adult. Just fine. In addition, the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
The disease to which the control agent of the present invention can be applied includes diseases such as obesity, diabetes, and insulin-resistant diabetes.
[0052]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 (Isolation of the present gene: Isolation of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and its partial sequence)
(1-1) Isolation of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
Using 1.0 μg of total RNA prepared from human intraperitoneal adipose tissue by the guanidine thiocyanate / cesium chloride method (Chirgwin, JM et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979) as a template, a cDNA synthesis kit ( After mixing the oligo dT primer attached to Takara Shuzo Co., Ltd., and adding 50 units of MMTV reverse transcriptase (Takara Shuzo) in the presence of 1 mM dNTP, 10 minutes at room temperature, then 15 minutes at 42 ° C., and further 99 A single-stranded cDNA was synthesized by incubating at 5 ° C. for 5 minutes.
Then, using 2.0 μg of the single-stranded cDNA as a template, 200 μM dNTPs, each having 20 pmol of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a primer, 1.5 mM MgCl ₂ In the presence, 1 unit of DNA polymerase (manufactured by PerkinElmer) was added, and a PCR reaction was carried out under the condition that the temperature was kept at 94 ° C. for 1 minute, and further kept at 72 ° C. for 2 minutes as one cycle and 55 cycles were performed. The obtained PCR reaction product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis (electrophoresis buffer; Tris-borate buffer (manufactured by Nacalai Tesque)), and a DNA band of about 1.5 kbp was cut out from the gel. Fritsch, E .; F. Maniatis, T .; Author: "Molecular Cloning Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), cloned into the HincII site of plasmid vector pUC118 (Takara Shuzo). The nucleotide sequence of the cloned DNA was determined by Applied Biosystems 373A DNA using a Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit and a Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). The DNA consisted of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence encoded the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Thus, a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was isolated.
[0053]
(1-2) Isolation of a gene encoding a protein consisting of a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
Using the DNA cloned in Example 1 (1-1) as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 as primers at 94 ° C PCR was carried out under the conditions of 1 minute, then 60 ° C., 1 minute, and further 72 ° C., 2 minutes as one cycle, and this cycle was carried out for 30 cycles, and the 96th to 1493rd nucleotides of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 DNA containing the base sequence was amplified.
Thus, a gene encoding a protein consisting of a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was isolated.
[0054]
Example 2 (Preparation of an expression plasmid for a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a partial sequence thereof)
The DNA amplified and isolated in Example 1 (1-2) was digested with NdeI and BamHI, and the obtained DNA of about 1.4 kbp was subcloned into the NdeI and BamHI sites of an expression vector pET11a (Novagen). An expression plasmid pET11a085 (FIG. 1) for producing a protein having an amino acid sequence in which methionine was added to the amino terminus of the amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in SEQ ID NO: 1 was obtained.
Next, Escherichia coli DE3 strain (manufactured by Novagen) was transformed with the expression plasmid pET11a085.
On the other hand, an expression plasmid for producing a protein having an amino acid sequence represented by amino acids 1 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was amplified in Example 1 (1-1). -The isolated DNA is transformed into a known vector pcDL-SRα296 (Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K) by a known genetic engineering method. , Yoshida, M., and Arai, N., Mol. Cell Biol. Jan. 1988, p466-472). Using the expression plasmid thus prepared, monkey-derived COS1 cells (ATCC) were transformed with Lipofectamine (GibcoBRL).
[0055]
Example 3 (Preparation of the present protein: preparation of a protein preparation consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and its partial sequence)
The transformant obtained in Example 2 was subjected to O.C. D. The cells were cultured until 600 became 0.6, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (hereinafter, referred to as IPTG) at a final concentration of 1 mM was added, and the cells were further cultured overnight. Then, the cells are collected by centrifugation, and the cells are 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), 5 mM disodium ethylenediaminetetraacetate (hereinafter, referred to as EDTA · 2Na), and 5 mM dithiothreitol (hereinafter, referred to as DTT). ) And 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (hereinafter, referred to as PMSF) in a buffer (hereinafter, referred to as buffer A), and sonicated (under ice-cooling, 5 minutes x 3 times). The body was crushed, and the crushed liquid was centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. to collect a precipitate (hereinafter, referred to as an inclusion body fraction).
Buffer A containing 2 M urea was added to the inclusion body fraction, suspended, and subjected to sonication (5 minutes x 1 time under ice cooling). The solution after the ultrasonic treatment was centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C., and a buffer A containing 4 M urea was added to the obtained precipitate to suspend, ultrasonic, and centrifuge. The same operation was performed as described above. Further, operations of adding a buffer A containing 6 M urea to the obtained precipitate, suspending, sonicating, and centrifuging were performed in the same manner as described above. The obtained precipitate was suspended in a buffer containing 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 2 mM DTT and 8 M urea, and the suspension was centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. Was collected. The obtained supernatant was subjected to gel filtration chromatography using 200 pg of HiLoad Superdex (manufactured by Pharmacia) (flow rate: 1.0 ml / min, detection wavelength: 280 nm). The peak fraction eluted between 45 minutes and 55 minutes was collected, concentrated with Centricon (Grace Japan, fractional molecular weight 30,000), and then used with a Mono Q HR 10/10 ion exchange column (Pharmacia). Chromatography (flow rate 1.0 ml / min, 0-1 M NaCl gradient, detection wavelength; 280 nm). Fractions eluted with about 100 to about 200 mM NaCl were collected and concentrated to 1 mg protein / ml with Centricon (Grace Japan, fractional molecular weight 30,000).
To the obtained protein fraction, 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5) of 1/3 volume of the fraction was added with gentle stirring. In addition, gentle stirring was continued at room temperature overnight. Then, the supernatant was collected by centrifugation at 18,000 × g for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was added to 7 volumes of 2 M urea, 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 4 mM A buffer containing reduced glutathione and 0.4 mM oxidized glutathione was added, followed by gentle stirring. The obtained solution was placed in a dialysis tube having a molecular weight cut off of 25,000, and the volume of the solution was 1000 times 2 M urea, 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 4 mM reduced glutathione and 0.4 mM oxidized glutathione. Was dialyzed at 4 ° C. for 8 to 16 hours. Next, dialysis was performed at 4 ° C. for 8 to 16 hours against a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 4 mM reduced glutathione, and 0.4 mM oxidized glutathione in a volume 1000 times the volume in the dialysis tube. . Furthermore, dialysis was performed at 4 ° C. for 8 to 16 hours against a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1 mM reduced glutathione, and 0.1 mM oxidized glutathione in a volume 1000 times the volume in the dialysis tube. The obtained protein comprising the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is hereinafter referred to as the present protein preparation.
On the other hand, the protein having the amino acid sequence represented by the first to 491th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained by transforming the monkey-derived COS1 cell transformed in Example 2 into a normal COS1 cell. The protein was secreted into the medium by culturing according to the cell culture method, and the secreted protein was recovered and purified from the medium according to a conventional protein separation method by column chromatography to obtain the present protein sample.
[0056]
Example 4 (Adipocyte-related factor expression promotion test using the present protein)
(4-1) Isolation of adipose tissue
Ten 14-week-old male ICR mice (Japan SLC) were sacrificed and laparotomized, and the subcutaneous adipose tissue was extracted. The excised tissue was placed in a phosphate buffer (0.20 g / L KCl, 0.20 g / L KH). ₂ PO ₄ 8.00 g / L NaCl, 2.16 g / L Na ₂ HPO ₄ ・ 7H ₂ O, 100 units / ml penicillin (manufactured by GIBCO), 100 μg / ml streptomycin (manufactured by GIBCO), 250 ng / ml amphotericin (manufactured by GIBCO)) and washed at room temperature.
[0057]
(4-2) Preparation and culture of cells from adipose tissue
The following treatment was performed on the washed subcutaneous adipose tissue. That is, first, the tissue was treated with collagenase (type II or VIII, manufactured by Sigma), penicillin (manufactured by GIBCO), streptomycin (manufactured by GIBCO), and amphotericin (manufactured by GIBCO) at a final concentration of 1 mg / ml and 100 units / ml, respectively. Using a scissors in about 30 ml of Dulbecco's modified Eagle medium (containing 4.5 g / L D-glucose and 584 mg / L L-glutamine; manufactured by GIBCO), which was added so as to be 100 μg / ml and 250 ng / ml. Shredded. Next, this was shaken at 37 ° C. for 60 minutes (about 170 rpm), filtered through a nylon mesh (80S [mesh size 250 μm], manufactured by Sanshin Kogyo), and the filtrate was collected. After the filtrate was centrifuged at 1800 rpm for 5 minutes at room temperature, the liquid layer was gently removed by decantation to obtain a sediment. The sedimentation was terminated with fetal calf serum (hereinafter referred to as FBS) (manufactured by GIBCO), ascorbic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), penicillin, streptomycin (manufactured by GIBCO), and amphotericin (manufactured by GIBCO). Dulbecco's modified Eagle medium (containing 4.5 g / L D-glucose and 584 mg / L L-glutamine, manufactured by GIBCO) added at a concentration of 10%, 200 μM, 100 units / ml, 100 μg / ml, and 250 ng / ml. This was suspended in 30 ml of an FBS-containing medium, and the suspension was filtered with a nylon mesh (420S [mesh size: 25 μm], manufactured by Sanshin Kogyo). The filtrate was collected, centrifuged at 1,800 rpm for 5 minutes at room temperature, the liquid layer was gently removed by decantation, and the precipitate was suspended again in 30 ml of an FBS-containing medium. The operation of centrifuging, removing the liquid layer, and suspending in a FBS-containing medium was further performed twice on the suspension in the same manner as described above to prepare a suspension. The suspension was poured into a flask for cell culture (T150 for adherent cells, manufactured by Iwaki Glass), and the mixture was heated at 37 ° C and 5% ₂ Cultured in the presence. After 2-3 hours from the start of the culture, the medium was removed, and the wall of the flask was washed with 15 ml of the above-mentioned phosphate buffer. After removing the washing solution and performing the washing operation again, the phosphate buffer solution was removed, and 30 ml of an FBS-containing medium was added to the flask. ₂ Cultured in the presence. One day after the start of the culture, the medium was removed, and the vessel wall was washed once with 15 ml of a phosphate buffer. Then, the trypsin-tetrasodium ethylenediaminetetraacetate (hereinafter, referred to as EDTA · 4Na) solution (0 in the flask) was added to the flask. 1 to 2 ml of 0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA / 4Na (manufactured by GIBCO) were added so that the cells were immersed, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes. To this, an FBS-containing medium was added in an amount of about 10 times the amount of the trypsin-EDTA / 4Na solution to obtain a cell suspension.
[0058]
(4-3) Adipocyte-related factor expression promotion test
(I) RNA preparation from fat cells
The cell suspension obtained in the above (4-2) was appropriately diluted with an FBS-containing medium, and 1 × 10 4 ⁵ 2 ml per well was dispensed into a 6-well plate (for culturing adherent cells; manufactured by Iwaki Glass). 5% CO ₂ After culturing at 37 ° C. for 1 day in the presence, the medium was removed from each well of the plate, and 2 ml of an FBS-containing medium containing 100 ng / ml of the present protein preparation was added thereto to give 5% CO 2. ₂ The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days in the presence. When total RNA was obtained from cells on day 2, the culture supernatant was removed, the cells were washed once with 2 ml of a phosphate buffer, and 1 ml of TRIzol reagent (manufactured by GIBCO) was added to lyse the cells. When obtaining total RNA from cells on the fourth or sixth day, the culture supernatant is removed, and 2 ml of an FBS-containing medium containing 100 ng / ml of the present protein preparation is added, followed by culturing for 2 days. Repeated twice or twice. On day 4 or 6, the culture supernatant was removed, and the cells were washed once with 2 ml of a phosphate buffer, and 1 ml of TRIzol reagent (GIBCO) was added to lyse the cells. After standing at room temperature for 5 minutes, the liquid was recovered from each well, and total RNA was extracted according to the TRIzol protocol. Specifically, the obtained cell lysate (for one 6-well plate) was collected in a 15 ml centrifuge tube (manufactured by IWAKI), and 0.6 ml of chloroform (manufactured by Kanto Kagaku) was added thereto. Was vigorously stirred up and down for 15 seconds, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, the mixture was centrifuged (4 ° C., 9,000 rpm, 10 minutes), and the aqueous layer was collected in a new 15 ml centrifuge tube. To the collected aqueous layer, 3 ml of 2-propanol (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) was added. After the mixture was centrifuged (4 ° C., 8,000 rpm, 10 minutes), the supernatant was removed to obtain a pellet. The obtained pellet was dissolved in 0.1 ml of DEPC-treated sterilized distilled water (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After dissolution, 350 ul RLT buffer (10 μl β-mercaptoethanol / ml RLT buffer) attached to RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) was added thereto, and the mixture was mixed. Further, 250 μl of ethanol (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) was added to the mixture and mixed. The mixture was applied to RNeasy Spin Column attached to RNeasy Mini Kit and centrifuged (room temperature, 10,000 rpm, 15 seconds). After centrifugation, the obtained eluate was again subjected to the same RNeasy Spin Column, and centrifuged (room temperature, 10,000 rpm, 15 seconds). After centrifugation, the obtained eluate was discarded. Next, 500 μl of RPE buffer attached to RNeasy Mini Kit diluted 4-fold with ethanol was applied to the column, and this was centrifuged (room temperature, 10,000 rpm, 15 seconds). After centrifugation, the obtained eluate was discarded. Then, 500 μl of RPE buffer diluted 4-fold with ethanol was applied to the column, and centrifuged (room temperature, 14,000 rpm, 2 minutes). The column thus obtained was transferred to a new Eppendorf tube, 50 μl of distilled water attached to RNeasy Mini Kit was added, and this was allowed to stand at room temperature for 1 minute. After standing, total RNA was eluted from the column by centrifugation (room temperature, 10,000 rpm, 1 minute), and the total RNA was obtained by collecting the total RNA. On the other hand, with respect to the section where the present protein was not added, the same operation was performed except that the present sample was not added, and total RNA was obtained. The amount and purity of TotalRNA were measured using a spectrophotometer.
[0059]
(Ii) Preparation of cDNA using RNA as template
17 μl of an aqueous solution containing 0.5 μl of pd (T) 12-18 attached to 5 μg of total RNA obtained in (i) above and AMV Reverse Transcriptase 1st strand cDNA Synthesis Kit (LIFE SCIENCES) was heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then heated. Cooled on ice for 5 minutes. Next, 5 μl reaction buffer included in the kit, 5 μl of the 0.25 M DTT solution included in the kit, 1 μl of RNasin included in the kit, and 1 μl of AMV-RT included in the kit were added thereto, and the resulting mixture was added. The cDNA was synthesized by heating at 41 ° C. for 45 minutes to obtain a cDNA-containing solution.
[0060]
(Iii) Quantitative RT-PCR
The expression levels of PPARγ2 mRNA in adipocytes to which the present protein was added and in adipocytes in the non-protein-added section were quantified by the following method.
1 μl of a 200-fold diluted cDNA-containing solution (diluted cDNA) obtained from the adipocytes to which the present protein was added, obtained in (ii) above, 1 μl of SYBR Green Master Mix, 25 μl, the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 A reaction solution (reaction solution A) consisting of 20 pmol of the primer consisting of and 20 pmol of the primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 was prepared. Next, in order to measure the expression level of the mouse 36B4 gene (mRNA) as an internal standard, 1 μl of the above-mentioned cDNA dilution, 25 μl of SYBR Green Master Mix, 20 pmol of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 A 50 μl reaction solution (reaction solution B) consisting of 20 pmol of a primer consisting of the base sequence represented by was prepared.
PCR was performed using ABI7700 (PE systems). First, each reaction solution was kept at 50 ° C. for 2 minutes and then at 95 ° C. for 10 minutes. Thereafter, a heat retention cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute was repeated 40 times. By quantifying the PCR product amplified by the PCR, the expression level of PPARγ2 mRNA was measured. The expression level when using reaction solution A was measured value A, and the expression level when using reaction solution B was measured value B. It is known that the expression level of the mouse 36B4 gene (mRNA) is almost constant in each cell. Therefore, in order to use the expression level of mouse 36B4 gene as an internal standard, the corrected expression level of PPARγ2 mRNA (measured value 6) was calculated by calculating the value (A / B value) obtained by dividing measured value A by measured value B. Obtained. By using the cDNA prepared from the adipocytes in the non-protein-added section and calculating the value obtained by dividing the measured value A by the measured value B (A / B value) in the same manner as described above, the corrected expression amount of PPARγ2 mRNA (measured value) was determined. Value 7) was obtained.
From these measured values, the PPARγ2 expression promotion rate by the present protein preparation was calculated according to the following formula.
PPARγ2 expression promotion rate (%) = (measured value 6 / measured value 7) × 100
The promotion rate of PPARγ2 expression by this protein preparation was 960%.
Using the same method as above, the expression promotion rate of each adipocyte-related factor by the present protein preparation was determined. When measuring the expression level of 11βHSD-1 mRNA, the primers described in SEQ ID NOs: 11 and 12 were used, and when measuring the expression level of aP2 mRNA, the primers described in SEQ ID NOs. 13 and 14 were expressed using DGAT1 mRNA expression. When measuring the amount, the primers described in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 were used, and when measuring the expression amount of adiponectin mRNA, the primers described in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were used, and the C / EBPα mRNA expression amount was measured. When measuring the expression level of FAT mRNA, when measuring the expression level of FAS mRNA, the primers described in SEQ ID NO: 21 and 22 are used when measuring the expression level of GPAT1 mRNA. The primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used to When the constant used the primers of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 25.
[0061]
When the expression promotion rate of adipocyte-related factor by this protein preparation on day 2 was examined, aP2 was 1520%, DGAT1 was 1080%, adiponectin was 268%, C / EBPα was 311%, and FAS was Was 1700%, GPAT1 was 466%, and ADD1 was 660%. On the 6th day, the expression promotion rate of 11βHSD-1 by the present protein preparation was 280%.
[0062]
Example 5 (Screening of adipocyte-related factor expression regulator)
An adipocyte suspension was prepared by the method described in (4-1) and (4-2) of Example 4. The adipocyte suspension was appropriately diluted with an FBS-containing medium, and 1 × 10 ⁵ Dispense 2 ml per well into a 6-well plate (for culturing adherent cells; manufactured by Iwaki Glass). 5% CO ₂ After culturing at 37 ° C. for one day in the presence, the medium was removed from each well of the plate, and (1) 2 ml of an FBS-containing medium containing 100 ng / ml of the present protein preparation was added; (2) 100 ng / ml (2) FBS-containing medium containing 2 ml of the FBS-containing medium containing the protein preparation of the present invention and a test substance were added. ₂ Culture for 2 days at 37 ° C in the presence. Then, total RNA is extracted for each of (1), (2) and (3) by the method described in (4-3) of Example 4. Then, cDNA was synthesized by the method described in Example (4-3) using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, and RT- By performing PCR, the expression level of DGAT1 mRNA can be measured. Assuming that the value measured with the sample of (1) is a measured value 8, the value measured with the sample of (2) is a measured value 9, and the value measured with the sample of (3) is a measured value 10, the test substance is It can be evaluated whether or not the DGAT1 expression promoting activity of the present protein is suppressed or promoted. That is, the PPARγ2 expression suppression rate or expression promotion rate of the test substance can be calculated by the following formula. That is, when {(measured value 8−measured value 10) − (measured value 9−measured value 10)} is a positive value, the test substance is a DGAT1 expression inhibitor, and the expression suppression rate is expressed by the following formula:
{(Measured value 8-measured value 10)-(measured value 9-measured value 10)} / (measured value 8-measured value 10) X 100 (%)
Is represented by When {(measured value 8 -measured value 10)-(measured value 9 -measured value 10)} is a negative value, the test substance is a DGAT1 expression promoter, and the expression promotion rate is
{(Measured value 9-measured value 10)-(measured value 8-measured value 10)} / (measured value 8-measured value 10) * 100 (%)
Is represented by The expression controlling agent can be identified based on the expression suppression rate / promotion rate calculated here. When the test substance is a DGAT1 expression inhibitor, the substance is used as a candidate compound such as an antiobesity agent.
Using the same method as described above, expression control agents such as 11βHSD-1, adiponectin, PPARγ2, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, and ADD1 can be screened.
[0063]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has become possible to provide an effective method for analyzing the expression level of an adipocyte-related factor.
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 2
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 4
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 5
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 7
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 8
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 9
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 10
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 11
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 12
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 13
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 14
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 15
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 16
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 17
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 18
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 19
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 20
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 21
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 22
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 23
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 24
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 25
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
SEQ ID NO: 26
Oligonucleotide primers designed to amplify genes
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structure of plasmid pET11a085. In the figure, the hatched portion indicates a DNA containing the 96th to 1493rd base sequence of the inserted base sequence represented by SEQ ID NO: 6.

Claims

A method for analyzing the expression level of a fat cell-related factor,
(1) a first step of bringing a protein having any of the following amino acid sequences and a test substance into contact with an adipocyte, and (2) after the first step, the amount of the adipocyte-related factor in the adipocyte or the amount thereof An analysis method comprising a second step of measuring an index value having a correlation.
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor

The analysis according to claim 1, wherein the first step is a step of contacting a protein consisting of any one of the amino acid sequences with an adipocyte and then contacting the test substance with the treated adipocyte. Method.

The analysis according to claim 1, wherein the first step is a step of bringing a test substance into contact with the adipocyte at the same time as or before contacting the adipocyte with a protein comprising any of the amino acid sequences. Method.

The analysis method according to claim 1, wherein the index value having a correlation with the amount of the adipocyte-related factor is the amount of mRNA of the adipocyte-related factor in the adipocyte.

The adipocyte-related factor is one or more factors selected from the group consisting of 11βHSD-1, aP2, DGAT1, PPARγ2, adiponectin, C / EBPα, FAS, GPAT1, GLUT4, and ADD1. 2. The analysis method according to 1.

2. The method according to claim 1, wherein the first step is a step of bringing a test substance into contact with a transformed adipocyte obtained by introducing a gene encoding a protein comprising any one of the amino acid sequences into an adipocyte. Analysis method.

A substance determined based on a difference obtained by comparing the expression levels of adipocyte-related factors in a section in which two or more different substances as test substances are independently used, which are measured by the analysis method according to claim 1. A method for testing the ability of a test substance to regulate the expression of an adipocyte-related factor, comprising evaluating the ability of the test substance to regulate the expression of an adipocyte-related factor.

The assay method according to claim 7, wherein at least one of the two or more different substances is a blank.

An expression of an adipocyte-related factor, wherein a substance having an ability to control the expression of an adipocyte-related factor is selected based on the ability to control the expression of an adipocyte-related factor evaluated by the assay method according to claim 8. How to search for control agents.

A fat comprising a substance selected by the search method according to claim 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. An agent for controlling the expression of cell-related factors.

The agent for controlling the expression of a fat cell-related factor according to claim 10, which is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin resistance improving agent.

An agent for promoting expression of an adipocyte-related factor, comprising a protein having any one of the following amino acid sequences as an active ingredient:
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor

Use of a protein having any one of the following amino acid sequences for promoting expression of an adipocyte-related factor:
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor

A test method for the ability of a test substance to control the function of a protein comprising any one of the following amino acid sequences, wherein the test substance has a different 2 In a section in which at least one kind of substance is used independently, in the substance based on a difference obtained by comparing the expression levels of adipocyte-related factors, the ability to control the function of the protein is evaluated. Test method.
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor

The assay method according to claim 14, wherein at least one of the two or more different substances is a blank.

16. The method according to claim 14, wherein a substance having the ability to control the function of a protein consisting of any one of the amino acid sequences evaluated by the assay method according to claim 14 or 15 is selected. A method for searching for a protein function regulator comprising any one of the amino acid sequences.

17. The method according to claim 16, comprising a substance selected by the search method according to claim 16 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. A protein function regulator comprising the amino acid sequence of any one of the above.

18. The therapeutic agent according to claim 17, wherein the control agent is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin sensitizer.

A test method for testing an ability to control the expression of an adipocyte-related factor,
(1) a first step of bringing a test substance into contact with an adipocyte capable of expressing an adipocyte-related factor,
(2) After the first step, a second step of measuring the amount of an adipocyte-related factor in the adipocyte or an index value having a correlation with the amount, and (3) the steps of (1) and (2) Based on the difference obtained by comparing the value of (2) in a section in which one or more substances as test substances and a protein consisting of any one of the following amino acid sequences were used independently, as determined by Third step of evaluating the ability to control the expression of fat cell-related factors having the substance,
A method for assaying the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, which comprises: <Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to promote expression of an adipocyte-related factor;
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 18 to 1493 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having the ability to promote expression of an adipocyte-related factor,
(H) an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the 18th nucleotide to the 1493rd nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 And an amino acid sequence capable of promoting the expression of an adipocyte-related factor

20. The test method according to claim 19, wherein the index value having a correlation with the amount of the adipocyte-related factor is the amount of mRNA of the factor in the adipocyte.

21. The assay method according to claim 19, wherein in the third step, two or more different substances are used as test substances, and at least one of them is a blank.

22. A method for selecting a substance having the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, based on the ability to control the expression of an adipocyte-related factor, which is evaluated by the assay method according to claim 21. A method for searching for an expression controlling agent.

A fat comprising a substance selected by the search method according to claim 22 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. An agent for controlling the expression of cell-related factors.

24. The adipocyte-related factor expression regulator according to claim 23, which is an antiobesity agent, an antidiabetic agent, or an insulin sensitizer.