【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビンを認識し、ハプトグロビン様作用を持つペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハプトグロビンはヘモグロビンを認識し強固な結合をすることで知られるタンパク質である。その生理的意義の全容はいまだ不明であるが、複合体を作ることにより、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強することが知られている。また、最近、複合体を形成することにより構造の変化が起こり、マラリア等の感染症や遺伝病（鎌状赤血球症）で上昇する溶血ヘモグロビンの処理にも役立っていることが解ってきた（Ｎａｔｕｒｅ，４０９， １９８−２０１ （２００１））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
低分子の化合物でハプトグロビンと同様の作用を持つ化合物があれば、ハプトグロビンの生体内での機能を調べるのに有用である。本発明の目的は、そのようなハプトグロビン様化合物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ヘモグロビンに対し親和力を持ち、かつハプトグロビン様作用を持つペプチドを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチド
また、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明のペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。
（ａ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチド
（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【０００８】
本発明のペプチドは、ヘモグロビンと特異的に結合することから、ヘモグロビンの検出に利用することができる。また、ハプトグロビンと同様の作用を持つことから、ハプトグロビンの異常等によって生じる疾患などの治療薬として利用できる可能性もある。
【０００９】
【実施例】
〔実施例１〕 ヘモグロビンの精製
ヒト脱繊維血液２０ｍｌを遠沈管に取り、バランスをとった後、遠心機で３０００回転／分で５分間遠心した。遠心機から静かに遠沈管を取り出し、駒込ピペットを使い血清を除去した。遠沈管に残った血球の約３倍容の０．９％ＮａＣｌ水溶液（氷冷）を加え、駒込ピペットで空気を送り込みながら攪拌した。バランスをとった後、３０００回転／分で５分間遠心した。遠心機から遠沈管を静かに取り出し、駒込ピペットで上澄みを取り除いた。上述した０．９％ＮａＣｌ水溶液の添加から遠心までの操作を２回繰り返し、赤血球を洗浄した。
【００１０】
遠心して集めた赤血球に等容の冷蒸留水を加え、駒込ピペットで攪拌して溶血させた。これに赤血球の約半量のエーテル（氷冷）を加えて、駒込ピペットを使い約５分間攪拌した。攪拌は遠沈管を氷冷しながら行った。攪拌後、バランスをとり、３０００回転／分で５分間遠心した。遠心の結果、液は上からエーテル層、赤血球膜層、ヘモグロビン層の３層に分離したので、駒込ピペットを使いヘモグロビン層だけを取り出し、ＰＢＳに対し、透析し、精製ヘモグロビンを得た。
【００１１】
〔実施例２〕 ヘモグロビン認識ペプチドを含むクローンの選択
実施例１で精製したヘモグロビンをポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりヘモグロビンの付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の♯Ｅ８１１０Ｓ Ｐｈ Ｄ．−１２ＴＭｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、１２アミノ酸残基からなる約１０１０種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。
【００１２】
反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、「Ｔｗｅｅｎ ２０」という）含有ＰＢＳで１０〜数十回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄したのち、ハプトグロビン（２−２型）溶液（１００μｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。室温で１時間静置した後、ピペッティングし、取り出した画分を溶出画分とした。
【００１３】
溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ （ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ Ｇａｌ プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、ウレアーゼを固相化したプレートを用いてＥＬＩＳＡ行った。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製ヘモグロビン（１０μｇ／ｍｌ， １００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。ＥＬＩＳＡの結果、ヘモグロビンと強く反応するクローンが幾つかみつかった（クローンＮｏ．１〜４）。これらのクローンを含む溶液の吸光度、及びバックグラウンド（ヘモグロビンをプレートに固定せず、他は同様の操作を行った。）の吸光度を図１に示す。
【００１４】
〔実施例３〕 ハプトグロビン様活性の検出
実施例２でヘモグロビンに対する反応性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜４）を培養後、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより濃縮した。
【００１５】
精製へモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ， ２０μｌ）をＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。このＰＶＤＦ膜を以下の（ａ）〜（ｆ）の試験液に浸漬した後、パーオキシダーゼの発色基質溶液に浸漬した。
（ａ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．１のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は１０１２ｔ．ｕ．／ｍｌである。ファージ１粒子あたり５個のペプチドが提示されている。）
（ｂ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．２のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）
（ｃ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．３のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）
（ｄ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．４のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）
（ｅ）ＰＢＳ及びハプトグロビンを含む試験液（ハプトグロビン濃度は１０μｇ／ｍｌ）
（ｆ）ＰＢＳのみを含む試験液。
【００１６】
発色基質溶液は、ジアミノベンジジン１０ｍｇを１０ｍｌの精製水に溶解し、これに１ｍｌの酢酸バッファー（ｐＨ ４．５）を加えた後、過酸化水素水を１２．５μｌ加えて調製した。
【００１７】
各ＰＶＤＦ膜上のヘモグロビンの発色状態を調べた結果、クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．３のファージ溶液及びハプトグロビンを含む試験液に浸漬した場合に強い発色がみられた。クローンＮｏ．４のファージ溶液を含む試験液に浸漬した場合は、ＰＢＳのみを含む試験液に浸漬した場合と同程度の発色しかみられなかった。以上のことから、クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．３のファージが提示するペプチドは、ハプトグロビンと同様にヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用があると考えられる。なお、図２に、（ｆ）の試験液に浸漬したＰＶＤＦ膜（図中のＡ）及び（ａ）の試験液に浸漬したＰＶＤＦ膜（図中のＢ）を示す。
【００１８】
〔実施例４〕 ペプチドのアミノ酸配列の解析
実施例３でハプトグロビン様活性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜３）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、前記クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。クローンＮｏ．１、２、３が提示していたペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、２、３に示す。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、ヘモグロビンと特異的に結合するので、ヘモグロビンの検出に有用である。また、本発明のペプチドは、生体物質であるハプトグロビンと同様の活性を持つことからペプチド医薬としても有用である。
【００２０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチドとヘモグロビンとの反応性を示す図である。
【図２】ハプトグロビン様活性の検出試験の結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide that recognizes hemoglobin and has a haptoglobin-like action, and a polynucleotide encoding the same.
[0002]
[Prior art]
Haptoglobin is a protein that is known to recognize hemoglobin and make tight binding. The full nature of its physiological significance is still unknown, but it is known that the formation of a complex enhances the peroxidase activity of hemoglobin. In addition, it has recently been found that the formation of a complex causes a structural change, which is also useful for the treatment of hemolytic hemoglobin which is increased in infectious diseases such as malaria and genetic diseases (sickle cell disease) (Nature). , 409, 198-201 (2001)).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
If there is a low-molecular compound having the same action as haptoglobin, it is useful to examine the function of haptoglobin in a living body. It is an object of the present invention to provide such a haptoglobin-like compound.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have succeeded in obtaining a peptide having an affinity for hemoglobin and having a haptoglobin-like action, and have completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention is a peptide shown in the following (a) or (b).
(A) a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 (b) one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 Peptides represented by amino acid sequences in which amino acids have been deleted, substituted or added and which recognizes hemoglobin and has the effect of enhancing the peroxidase activity of hemoglobin. The present invention also relates to polynucleotides encoding the above peptides.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0007]
The peptide of the present invention is as shown in the following (a) or (b).
(A) a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 (b) one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 The number of deleted amino acids in the peptide of the peptide (b), which is represented by an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted or added, recognizes hemoglobin, and has the effect of enhancing the peroxidase activity of hemoglobin, Although not limited, it is usually 7 or less, preferably 5 or less, and more preferably 2 or less.
[0008]
Since the peptide of the present invention specifically binds to hemoglobin, it can be used for detection of hemoglobin. Further, since it has the same action as haptoglobin, it may be used as a therapeutic drug for diseases caused by abnormal haptoglobin and the like.
[0009]
【Example】
[Example 1] 20 ml of purified human defibrillated blood of hemoglobin was placed in a centrifuge tube, balanced, and then centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes with a centrifuge. The centrifuge tube was gently removed from the centrifuge, and the serum was removed using a Komagome pipette. A 0.9% NaCl aqueous solution (ice-cooled) having a volume about 3 times that of the blood cells remaining in the centrifuge tube was added thereto, and the mixture was stirred while sending air with a Komagome pipette. After balancing, centrifugation was performed at 3000 rpm for 5 minutes. The centrifuge tube was gently removed from the centrifuge, and the supernatant was removed with a Komagome pipette. The operation from the addition of the 0.9% NaCl aqueous solution to the centrifugation was repeated twice to wash the red blood cells.
[0010]
An equal volume of cold distilled water was added to the red blood cells collected by centrifugation, and the mixture was stirred with a Komagome pipette to cause hemolysis. About half the amount of red blood cells (ice cooled) was added thereto, and the mixture was stirred for about 5 minutes using a Komagome pipette. The stirring was performed while cooling the centrifuge tube with ice. After stirring, the mixture was balanced and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. As a result of centrifugation, the liquid was separated from the top into an ether layer, an erythrocyte membrane layer, and a hemoglobin layer. Therefore, only the hemoglobin layer was taken out using a Komagome pipette, and dialyzed against PBS to obtain purified hemoglobin.
[0011]
Example 2 Selection of Clones Containing Hemoglobin Recognition Peptide The hemoglobin purified in Example 1 was immobilized on a polystyrene column, and then a portion to which hemoglobin was not adhered was blocked with a 2% casein solution. A random peptide library was added and reacted for one to several hours. The random peptide library was obtained from NEB's E8110S PhD. A -12 TM kit was used. In this library, about 10 10 kinds of peptides consisting of 12 amino acid residues are displayed in a state fused with the phage coat protein PIII.
[0012]
After the completion of the reaction, the plate was washed with PBS containing 0.05 to 0.5% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (hereinafter referred to as “Tween 20”) for 10 to several tens of times, and then a 5% casein solution was added. It was left for one to several hours. After washing with PBS containing Tween 20 again, 100 μl of a haptoglobin (type 2-2) solution (100 μg / ml) was added. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, pipetting was performed, and the extracted fraction was used as an elution fraction.
[0013]
The eluted fraction was used as E. coli. E. coli (ER2537) and grown on IPTG-X Gal plates. After 100 clones were picked and cultured, ELISA was performed using a plate on which urease was immobilized. The ELISA was performed as follows. First, a purified hemoglobin (10 μg / ml, 100 μl) was immobilized on a plate, a peptide-displayed phage solution (100 μl) was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Next, the plate was washed to remove unbound phage, and then 100 μl of a peroxidase-labeled secondary antibody (Pharmacia anti-M13 phage antibody, diluted 2000-fold) was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing the plate, an ABTS substrate solution (Funakoshi) was added to develop the color. As a result of ELISA, several clones that strongly reacted with hemoglobin were found (clone Nos. 1 to 4). FIG. 1 shows the absorbance of the solution containing these clones and the absorbance of the background (the same operation was performed except that hemoglobin was not immobilized on the plate, but otherwise).
[0014]
[Example 3] Detection of haptoglobin-like activity Clones (clone Nos. 1 to 4) confirmed to have reactivity to hemoglobin in Example 2 were cultured and then concentrated with PEG / NaCl.
[0015]
Purified hemoglobin (1 mg / ml, 20 μl) was subjected to NATIVE-PAGE electrophoresis and then transferred to a PVDF membrane. This PVDF membrane was immersed in the following test liquids (a) to (f), and then immersed in a peroxidase coloring substrate solution.
(A) PBS and clone no. Test solution containing 1 phage solution (phage concentration is 10 12 tu / ml; 5 peptides are displayed per phage particle)
(B) PBS and clone no. Test solution containing phage solution (2) (phage concentration is the same as above)
(C) PBS and clone no. Test solution containing phage solution (3) (phage concentration is the same as above)
(D) PBS and clone no. Test solution containing phage solution of No. 4 (phage concentration is the same as above)
(E) Test solution containing PBS and haptoglobin (haptoglobin concentration is 10 μg / ml)
(F) Test solution containing only PBS.
[0016]
The chromogenic substrate solution was prepared by dissolving 10 mg of diaminobenzidine in 10 ml of purified water, adding 1 ml of acetic acid buffer (pH 4.5), and then adding 12.5 μl of aqueous hydrogen peroxide.
[0017]
The color development of hemoglobin on each PVDF membrane was examined. 1 to No. When immersed in a test solution containing the phage solution of No. 3 and haptoglobin, strong color development was observed. Clone No. When immersed in the test solution containing the phage solution of No. 4, only the same level of color development was observed as when immersed in the test solution containing only PBS. From the above, clone No. 1 to No. It is considered that the peptide displayed by the phage No. 3 has the effect of enhancing the peroxidase activity of hemoglobin in the same manner as haptoglobin. FIG. 2 shows a PVDF film (A in the figure) immersed in the test liquid (f) and a PVDF film (B in the figure) immersed in the test liquid (a).
[0018]
Example 4 Analysis of Amino Acid Sequence of Peptide DNA contained in the culture supernatant of the clone (clone Nos. 1 to 3) in which haptoglobin-like activity was confirmed in Example 3 was purified by QIAprep Q13prep M13 system. did. The obtained DNA was precipitated with ethanol and used as a template for sequence analysis. The sequence was analyzed using an ABI 3700 sequencer, and the amino acid sequence of the peptide presented by the clone was determined. Clone No. The amino acid sequences of the peptides presented by 1, 2, and 3 are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.
[0019]
【The invention's effect】
Since the peptide of the present invention specifically binds to hemoglobin, it is useful for detecting hemoglobin. Further, the peptide of the present invention is useful as a peptide drug because it has the same activity as haptoglobin as a biological substance.
[0020]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the reactivity of the peptide of the present invention with hemoglobin.
FIG. 2 shows the results of a test for detecting haptoglobin-like activity.
