JP2004057015A - Inositol biosensor and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞内におけるイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）の挙動を可視化してリアルタイムで計測できる分子センサーに関する。即ち、本発明は、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー、それを用いた細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法、及び被検物質の細胞に対するメッセンジャーとしての機能をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、本発明の前記した分子センサーを構成するペプチドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は増殖因子、ホルモン、神経伝達物質などの外来情報に応じ、細胞内でセカンド（第二）メッセンジャーを生成し、それを介して細胞内情報伝達を行っている。この細胞内情報伝達系において、アゴニスト刺激により、細胞質内のカルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを増加させることが知られている。ある場合において、これらのカルシウム増加は、アゴニストにより活性化されたホスフォリパーゼＣが、細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール４、５二リン酸［ＰＩ（４，５）Ｐ２］を加水分解し、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）が産出され、そのＩＰ３が細胞内カルシウムストアを刺激し、カルシウムを放出することに起因していると考えられている。このＩＰ３を介した内膜小胞体からのカルシウムの流入は、高空間・時間分解能をもつＦｕｒａ−２といったカルシウムセンサーを用いて、単一細胞レベルで定量的によく研究されており、ＩＰ３と連動したカルシウムの重要性が明らかになりつつある。しかしながら細胞内での情報伝達を担う分子の生体内動態を検討するための技術は非常に限られており、近年次々と見いだされるシグナル伝達経路がどのように活性化されているかを細胞内で実証することは困難である。そのためには生体内でセカンドメッセンジャーを可視化できる技術、即ち分子センサーの開発が必須となってきている。
【０００３】
とりわけ、ポストゲノム科学では細胞内での情報伝達を担う分子の生体内動態の解析が重要となってきており、セカンドメッセンジャーの動態を細胞内で観測できるような分子センサーの開発が急務である。これまでに国内外で有機分子を用いてセカンドメッセンジャーを捕捉する人工リセプターを合成しようとする研究が活発に行われているが、選択性・親和性において実用レベルに達しているものはない。
細胞内カルシウム動態は、Ｆｕｒａ−２などのセンサーを用いてよく調べられている。一方、ＩＰ３の量を定量する技術として、トリチウムラベルしたイノシトール（［３Ｈ］−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を細胞内に取り込ませ、アゴニストによる刺激を加えたのち細胞を破砕し、イノシトールポリリン酸の代謝量を陰イオンクロマトグラフィーにより定量する方法が知られている（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ， Ｍ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９８３， ２１２， ４７３−４８２； Ｈａｗａｋｉｎｓ， Ｐ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９８６， ２３８， ５０７−５１６）。この方法を用いて、ホスファチジルイノシトールやイノシトールポリリン酸の代謝経路やイノシトールポリリン酸のカルシウムシグナルに対する役割が解明されている（Ｄｉｊｉｋｅｎ， Ｐ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９９５， ２７０， ２９７２４−２９７３１； Ｈｕｎｙａｄｙ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９４， ２６９， ２４７９８−２４８０４； Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ， Ｓ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００， ２７５， １０８４５−１０８５０）。しかし、この方法は、単一細胞レベルでの空間かつ時間的なＩＰ３の変化量を測定することが不可能であるといった欠点がある。
【０００４】
最近、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を融合したホスホリパーゼ Ｃのプレクストリン ホモロジー ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）を用いて、細胞内のＰＩ（４，５）Ｐ２、ＩＰ３の変化をリアルタイムで可視化する方法が報告されている（Ｓｔａｕｆｆｅｒ， Ｔ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， １９９８， ８， ３４３−３４６； Ｖａｒｎａｉ， Ｐ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９８， １４３， ５０１−５１０； Ｎａｓｈ， Ｍ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２００１， ２７６， １９２８６−１９２９３）。このＰＬＣδＰＨ−ＧＦＰは、非刺激時の細胞においてはＰＩ（４，５）Ｐ２と結合することにより細胞膜に局在化しており、アゴニストによる刺激後、ＰＩ（４，５）Ｐ２が加水分解されることにより細胞質に遊離する。その後のＰＩ（４，５）Ｐ２の再合成が起こりＰＬＣδＰＨ−ＧＦＰはまた細胞膜に移動する。このような一過的な細胞内の蛍光変化が種々の細胞で観測されている。特に、この方法を用いてイヌ腎臓上皮細胞におけるカルシウムオシレーションに同期したＩＰ３オシレーションも観測されている（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９， ２８４， １５２７−１５３０）。さらに最近、ＰＬＣδＰＨ−ＣＦＰとＰＬＣδＰＨ−ＹＦＰを細胞内で発現させ、そのＦＲＥＴにより同様の原理に基づいてＰＩ（４，５）Ｐ２、もしくはＩＰ３の変化を可視化する方法も報告されている（Ｗａｌ， Ｊ． Ｖ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２００１， ２７６， １５３３７−１５３４４）。
しかしながら、これらの方法はＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解に基づくものであり、ＩＰ３動態を直接観測できるものではない。これらの方法は、ＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解に基づく挙動から、ＩＰ３動態を推定するものに過ぎない。また、単一細胞内のＩＰ３の濃度変化を測定することは、これらの方法では不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、セカンド（第二）メッセンジャーＩＰ３の細胞内動態をリアルタイムで可視化し、かつ検出し、定量化できる生体内分子センサー、及びそれを用いた検出・定量方法を提供することを目的としている。また、本発明は、細胞内に導入可能な生体内分子センサーを提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＩＰ３とＰＨドメインの結合を検討し、ＰＨドメインにはＩＰ３と結合するための結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）を形成することを報告してきた（Ｍｏｒｉｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００２， １２４， １１３８−１１３９）。本発明者らは、この結合ポケットを利用した新規な分子センサーとして、ＰＨドメインに蛍光物質のような標識物質を導入し、導入された標識物質が当該結合ポケットに収納され、かつＩＰ３とＰＨドメインの結合を阻害せず、そしてＩＰ３とＰＨドメインの結合により当該標識物質の物性が変化するものをデザインしたところ、蛍光物質による標識化によりＩＰ３とＰＨドメインの結合を選択的に可視化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー、より詳細には、当該標識物質が、蛍光物質であり、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度が変化するものである前記分子センサーに関する。さらに詳細には、本発明の分子センサーとなるペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することを特徴とする、細胞内に導入可能な分子センサーに関する。
【０００８】
また、本発明は、細胞培養系に前記した本発明の分子センサーを添加し、当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の分子センサーを含有する細胞培養系に、被検物質を添加して、被検物質の存在による当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、被検物質の細胞に対するメッセンジャーとしての機能をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、ホスホリパーゼＣδのプレクストリン ホモロジー ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）の５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンの少なくとも１アミノ酸が、システインに置換され、当該システインのチオール基に蛍光物質が結合したペプチドにも関する。
【０００９】
本発明者らは、単一細胞内でのＩＰ３の変化をリアルタイムで可視化することを目的として、ＩＰ３に対して特異的に結合することで知られているＰＬＣδＰＨドメインを蛍光ラベルすることによりＩＰ３蛍光センサーからなる分子センサーを作製した。例えば、ホスホリパーゼＣδ１（ＰＬＣδ１）のＰＨドメインのＩＰ３結合部位周辺の１０６番目のアスパラギン残基をシステインに変異させ（Ｎ１０６Ｃ）、そのシステインに特異的に蛍光試薬６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（６−Ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ（ＤＡＮ））を反応させたセンサー（ＤＡＮ１０６）を作製した。
この分子センサーは、ＩＰ３の結合前は蛍光物質がＰＨドメインの結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）におさまっていると予想され、この状態が準安定状態となるため、ＩＰ３への選択性が向上するものと期待された。
【００１０】
さらに、前記ＤＡＮ１０６のＮ末端又はＣ末端にこれを細胞内に導入可能にするためのシグナルペプチドを結合させた。
図１に、本発明の前記した分子センサーの例を模式的に示す。図１（ａ）は、ＰＬＣδＰＨドメインの１０６番目のアスパラギンをシステインに変異させたＰＬＣδＰＨドメインをに示す。この変異させたシステインに蛍光試薬ＤＡＮを反応させて本発明の分子センサーを得た。この末端にシグナルペプチドＴａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｒ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）、又はＲ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）を融合させた配列を有するペプチドがそれぞれ図１（ｂ）、図１（ｃ）、及び図１（ｄ）に示されている。以下、これらをそれぞれＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６、及びＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６と呼ぶ。
これらのシグナルペプチドは、本体のペプチドを細胞内に導入可能にするものである。このシグナルペプチドを融合させたタンパク質は、種々の細胞において細胞と短時間インキュベートするだけで目的タンパク質を細胞内に導入可能であることが報告されている。これらＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６のセンサーをＨＥＫ２９３細胞やＣＨＯ細胞などに導入し、細胞内カルシウム濃度を上昇させるアゴニストで細胞を刺激したところ、細胞内のセンサーの蛍光変化を観測することができた。
【００１１】
得られたＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を用いてＩＰ３の非存在下、及び存在下での蛍光強度を検討した。インビトロでＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＩＰ３添加（０−５０μＭ）に伴う蛍光変化の結果を図２に示す。図２の横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６では、ＩＰ３結合時、蛍光強度が大きく減少し、蛍光波長が長波長シフトするという特性を持っていることがわかる。シグナルペプチドの融合していないセンサーと同様の結果を示した。ＩＰ３濃度に対して蛍光強度変化率をプロットし、フィッティングすることによりＫｄを算出した結果、複合体の解離定数（Ｋｄ）は１．９７μＭであった。
図２の右上のグラフは、ＩＰ３濃度に対し、５００ｎｍの蛍光強度変化率（ΔＦ）をプロットしたものである。当該グラフの横軸はＩＰ３の濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光強度変化率（ΔＦ）を示す。当該グラフ中のバーの位置は実測点である。バーに付されている幅は標準偏差を示している。蛍光強度変化率ΔＦはΔＦｍａｘを１．０として作製している。そして、次の式、
ΔＦ ＝ ΔＦｍａｘ ｛［ＩＰ３］ ／（Ｋｄ ＋ ［ＩＰ３］）｝
にフィッティングすることによりＫｄ値を算出した。
【００１２】
次に、本発明の分子センサーの細胞内での挙動を観察した。
ＨＥＫ細胞内Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＨＥＫ細胞を１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で室温下１時間処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を図３に図面に変わる写真で示す。図３ａはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図３ｂはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示し、図３ｃは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像、図３ｄは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で１時間処理した細胞においてわずかに蛍光が観測された（図３ｄ）。しかし、蛍光が観測された細胞は死んでいると思われ、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６が細胞毒性を示しているか、もしくは死んだ細胞に特異的にセンサーが取り込まれているのではないかと推定された。コントロールとしてＨＢＳバッファーで室温下１時間処理した細胞では蛍光が全く観測されなかった（図３ｂ）。
【００１３】
さらに、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による処理時間を２〜８時間と変化させたのち測定したが、細胞死の現象は時間が長くなるにつれより顕著になった。処理時間を短くして１５分行った結果を図４に図面に変わる写真で示す。図４ａは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図４ｂは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。この条件でも充分細胞内に分子センサーが取り込まれており、細胞の状態も１時間処理した場合よりも良好であった。
【００１４】
次に、カルバコール刺激による細胞内のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化の測定について検討した。ＨＥＫ細胞には細胞膜上にムスカリン酸受容体を発現しており、カルバコールにより刺激され、ＰＬＣβの活性化によりＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＨＥＫ細胞に対して蛍光測定を行った結果を図５に示す。図５の横軸は時間（秒）を示し、図５ａの縦軸はＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の蛍光強度変化の比を示し、図５ｂの縦軸はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による相対蛍光強度を示す。図５ａはＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化を示し、０−５分（３００秒）まではＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分は３０μＭ カルバコールを添加した場合である。図５ｂはＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光変化を示し、０−５分（３００秒）はＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分（６００秒）は３０μＭ カルバコールを添加した場合であり、１０分−２０分は再びＨＢＳバッファーにした場合の結果である。
この結果、３０μＭのカルバコールにより刺激したところ、持続的に蛍光強度が減少し、約３分でほぼ平衡状態に達した。さらに５分後にＨＢＳ バッファーで洗浄することにより蛍光が緩やかに回復するのが観測された（図５ｂ）。Ｆｕｒａ−２を導入した細胞において同様の操作を行った結果、カルバコール刺激により細胞内カルシウム濃度が一過的に増加しているのが観測された（図５−ａ）。この蛍光の減少はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビトロのＩＰ３濃度増加に伴う減少と一致していることから（図２参照）、カルバコール刺激により細胞内でＩＰ３濃度が増加していることに起因していることが示された。
【００１５】
同様にアゴニスト刺激による細胞内における蛍光変化をＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞を用いて行った。ＣＨＯ細胞は細胞膜上にプリン受容体を発現しており、ＡＴＰ刺激によりＰＬＣβの活性化が起こり、ＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。また、ＤＴ４０細胞の場合は、細胞膜上にＢ細胞抗原（Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）受容体を発現しており、Ｍ４刺激によりＰＬＣγの活性化が起こり、ＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。
ＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞に対しても、ＨＥＫ細胞の場合と同様にＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の導入を行った。結果を図６に図面に変わる写真で示す。図６Ａは１％Ｆ−１２７を含む１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分インキュベートしたＣＨＯ細胞（ａ）、ＤＴ４０細胞（ｂ）の図面に代わる蛍光画像写真である。図６Ｂの横軸は時間（分）を示し、縦軸は相対比をそれぞれ示す。図６Ｂの（ａ）は、ＣＨＯ細胞における１００μＭ ＡＴＰ刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３分は１００μＭ ＡＴＰで、３−１０分はＨＢＳバッファーで、１０−１１．５分は１００μＭ ＡＴＰで、１１．５−１５分はＨＢＳバッファーで、１５−１７分は１００μＭ ＡＴＰで、１７−２０分はＨＢＳバッファーで処理した。図６Ｂの（ｂ）は、ＤＴ４０細胞における１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３．５分は１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４で、３−６分はＨＢＳバッファーで処理した。
この結果、ＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞共に細胞で蛍光が観測され（図６Ａ−ａ、ｂ）、細胞内への取り込み効率はＨＥＫ細胞よりも効率が高かった。Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＣＨＯ細胞に対して１００μＭ ＡＴＰ刺激した結果、各刺激、洗浄に対応した可逆的な蛍光強度の変化が観測された（図６Ｂ−ａ）。しかし、ＤＴ４０細胞においては、１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４による明確な変化は観測されなかった（図６Ｂ−ｂ）。これは細胞毒性のほうが強かったためと思われる。
【００１６】
さらに、阻害剤処理したＣＨＯ細胞におけるＡＴＰ刺激によるＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の蛍光強度の変化について検討した。ＣＨＯ細胞に１μＭ Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分間インキュベートした後、１μＭのＵ７３３４３又は、１μＭのＵ７３１２２に１５分間インキュベートし測定を行った。結果を図７に示す。図７の横軸はインキュベートした時間（分）を示し、縦軸は相対蛍光強度を示す。図７の○印はコントロールを示し、○印は１μＭのＵ７３３４３を添加した場合を示し、○印は１μＭのＵ７３１２２を添加した場合を示す。各細胞培養系に与えた刺激を矢印で示す。
この結果、ＰＬＣの阻害剤であるＵ７３１２２処理したＣＨＯ細胞において、１００μＭ ＡＴＰ刺激により蛍光強度の減少が抑制された。Ｕ７３１２２の類似体で阻害効果のないＵ７３３４３処理したＣＨＯ細胞では、１００μＭ ＡＴＰ刺激により蛍光強度の変化が観測された。これにより、このアゴニスト刺激による蛍光の変化が、ＰＬＣ活性に依存した変化であり、これはＩＰ３の濃度の上昇に対応した変化であることが示された。
【００１７】
以上に具体的な例により説明してきたように、本発明者らは、細胞内ＩＰ３変化を可視化するのを目的として、本発明の分子センサーの例としてＰＬＣδＰＨドメインを基とするＩＰ３センサーを製造し、その機能を解析した。天然のＰＬＣδＰＨドメインはＩＰ３に対してすでに高い親和性（Ｋｄ＝０．２μＭ）をもっており、他のホスファチジルイノシトールポリリン酸やイノシトールポリリン酸に対しての親和性が低く、ＩＰ３に対して高選択性を保有しているドメインであることが知られている。特にＰＩ（４，５）Ｐ２との解離定数が２μＭとＩＰ３と比較して低い値が報告されており、ＰＩ（４，５）Ｐ２とＩＰ３を識別するのにはこのＰＬＣδＰＨドメインをＩＰ３センサーの土台にするのが好ましいが、必ずしもこれに限定される訳ではない。
本発明者らは、ＰＬＣδＰＨドメインのＩＰ３結合領域周辺の残基（Ｎ１０６）をシステインに変異させ、そのシステインに蛍光ラベルしたＰＨドメイン（ＤＡＮ１０６）は、ＩＰ３濃度依存的に蛍光強度が大きく減少し、かつ長波長シフトする性質を持つ事を見出し、報告してきた（Ｍｏｒｉｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２００２， １２４， １１３９−１１４０）。ＰＨドメインを蛍光ラベルした場合、解離定数が僅かに減少する（Ｋｄ＝〜２μＭ）が、細胞内でのＰＩ（４，５）Ｐ２加水分解後のＩＰ３変化を検出するのには適した解離定数になっていると考えられる。また、蛍光ラベルすることにより、他のイノシトールポリリン酸に対する親和性が減少し、よりＩＰ３に対する選択性が増加しているのが観測された。
そして、細胞外から細胞内にセンサーを簡便に導入することを目的としてＤＡＮ１０６の末端に細胞内に導入可能なシグナルペプチド（Ｔａｔ，Ｒ９，Ｒ７ペプチド）を融合させたものを製造した（Ｔａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６）。このシグナルペプチドを融合させたタンパク質は、種々の細胞において細胞と短時間インキュベートするだけで目的タンパク質を細胞内に導入可能であることが報告されている。このＲ９を融合したＤＡＮ１０６（Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６）は、シグナルペプチドＲ９と融合していないセンサーペプチドと同様のＩＰ３に対する蛍光変化を示した。
【００１８】
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６はＨＥＫ細胞で１０分程度インキュベートするのみで細胞内に取り込まれ、さらにインキュベート時間を長くすると細胞が死んでいくのが観測された。細胞を蛍光顕微鏡で観測すると蛍光を強く発していることから、あまり細胞内に取り込ませると、センサーがホスファチジルイノシトールポリリン酸代謝を阻害することにより細胞の寿命に影響が出てくると考えられる。
ＨＥＫ細胞において、カルバコール刺激を加えることにより蛍光が穏やかに減少し、約３分で平衡に達した。これに比べ、Ｆｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化は、刺激後５秒以内に一過的な変化が観測されている。このカルシウム濃度上昇とＩＰ３濃度上昇の速度の違いというのは次の３点が考えられる。
（ｉ）このセンサーのＩＰ３に対する解離定数は約２Ｍであり、ＩＰ３受容体のＩＰ３に対する解離定数が約数１０ｎＭである事から判断すると、カルシウムの一過的な変化を引き起こすのに必要なＩＰ３濃度上昇の段階を検出するのは困難であり、その後に続く持続的なＩＰ３濃度増加を観測している可能性がある。これは以前ラット耳下腺のスライスに［３Ｈ］−イノシトールを取り込ませその代謝生成物を定量する系で報告されているのだが（Ｄｏｗｎｅｓ， Ｃ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９８３， ２１６， ６３３−６４０）、カルバコール刺激後５秒以内に大きくＩＰ３増加が起こり、その後刺激を続けた場合数分の間持続的にＩＰ３が増加していく傾向が観測されていることからも示唆される。
（ｉｉ） 刺激後の細胞膜直下のＩＰ３濃度は急激に増加しているが、種々のＰＨドメインや他のイノシトールポリリン酸をターゲットとするタンパク質に補足され、実際細胞質内の有効濃度上昇が遅く観測されている。
（ｉｉｉ） もしイノシトール１、３、４、５四リン酸、イノシトール１、３、４三リン酸などの代謝物にも結合しているならば、代謝されたイノシトールポリリン酸の総量として検出している分、時間的に遅れがでる可能性がある。しかし、このＩＰ３センサーはイノシトール１、３、４、５四リン酸に対してＩＰ３の約３０倍の大きい解離定数であり（Ｋｄ＝６４μＭ）、実際ＩＰ３が数Ｍに上昇するまでにイノシトール１、３、４、５四リン酸やイノシトール１、３、４三リン酸が数十μＭも上昇していると考えにくい。
【００１９】
刺激後、洗浄を行うことにより約５分後に初期値にまで蛍光が回復していくのが観測された。これは、ＩＰ３が他のイノシトールポリリン酸に代謝され、センサーからＩＰ３が解離したことに起因すると考えられる。これは以前に、ラット耳下腺のスライスをカルバコール刺激した後、アトロピン（ムスカリン受容体のアンタゴニスト）により阻害をかけた場合、数分オーダーでＩＰ３が代謝され減少してくという報告があり（Ｄｏｗｎｅｓ， Ｃ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９８３， ２１６， ６３３−６４０）、今回得られた蛍光の回復していく時間的にも合っている。
【００２０】
本発明は、新規な分子センサーを提供するものである。本発明の分子センサーは、対象となる分子種に標識物質を導入するのではなく、対象となる分子種を結合する分子種に標識物質を導入し、両者の結合に実質的な影響を与えないないようにしながら、両者の結合の有無により標識物質の標識の状態を変化させることにより対象となる分子種の分子センサーとするというコンセプトに基づくものである。即ち、本発明は、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得る第二の蛋白質（対象となる分子種が結合する分子種）であって、当該第二の蛋白質は標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸を少なくとも１個有し、当該結合サイトに標識物質が結合しており、かつ当該第二の蛋白質に第一の蛋白質が結合することにより標識物質の物性が変化し、標識の状態が変化し、当該物性又は標識の状態の変化を検出又は定量化できることを特徴とする分子センサーを提供するものである。また、それを利用した第一の蛋白質の挙動を計測する方法を提供するものである。
【００２１】
より詳細には、本発明は、対象となる分子種としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を選定したものであり、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類、好ましくはＩＰ３の分子センサーを提供するものである。
本発明の第一の蛋白質（対象となる分子種）としては、第一の蛋白質が結合し得る第二の蛋白質が存在するものの中から選定することができるが、標識物質を目的に沿って第二の蛋白質の中に結合できるサイトを有するものでなければならず、好ましい第一の蛋白質としては、袋状になっている、例えばポケットのような結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）を有する第二の蛋白質に結合する蛋白質が挙げられる。本発明の好ましい第一の蛋白質としては、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）が挙げられる。
【００２２】
本発明における第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）としては、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得るものであればよく、当該結合としては、イオン結合や水素結合のような化学結合であってもよいが、物理的な吸着であってもよく、単なる解合のようなものであってもよいが、両者が選択的に結合することが必要である。このような選択的な結合は、競争的なものであってもよいが、結合又は解離定数が一定であるのが好ましい。
好ましい第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）としては、第一の蛋白質が選択的に結合する蛋白質またはその特定の結合ドメインが挙げられる。第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）の長さには特に制限は無いが、第一の蛋白質が結合するに十分なアミノ酸長があればよい。第一の蛋白質としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を想定する場合には、好ましい第二の蛋白質としては、ホスホリパーゼＣ、好ましくはホスホリパーゼＣδのプレクストリン ホモロジー ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）が挙げられる。より好ましい第二の蛋白質としては、ホスホリパーゼＣδ１のプレクストリン ホモロジー ドメイン（ＰＬＣδ１Ｈドメイン）が挙げられる。
【００２３】
本発明における第二の蛋白質に結合させる標識物質としては、第一の蛋白質と第二の蛋白質の結合を阻害しない物質であって、両者の結合の有無により物性又は標識の状態に変化が生じるものであれば特に制限はないが、可視光によりその変化を確認することができるものが好ましい。好ましい標識物質としては蛍光物質が挙げられる。このような蛍光物質は、第一の蛋白質と第二の蛋白質との結合の有無により、当該蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度が変化するものであり、このいずれか一方又は両者の変化により結合の有無を検出し、定量できるものであればよい。
好ましい蛍光物質としては、例えば、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）、５−ヨードアセタミドフルオレセン（５−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（５Ｆ）、６−ヨードアセタミドフルオレセン（６−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（６Ｆ）、２−［４’−（２”−ヨードアセタミド）フェニル］アミノナフタレン−６−スルホン酸（ＡＮＳ）などのチオール基との反応性を揺する物質が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の分子センサーにおける、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸としては、両者の結合に実質的な影響を与えない、即ち、両者の選択的な結合を実質的に阻害しない位置のアミノ酸であって、かつ当該アミノ酸をシステインのような他のアミノ酸に変更することによっても両者の結合に実質的な影響を及ぼさない位置のアミノ酸である。例えば、ＩＰ３が結合するドメインとしてＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いる場合には、ＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン（Ｒ）、５８番目のバリン（Ｖ）、１０６番目のアスパラギン（Ｎ）などが挙げられる。
例示のために、本発明の具体例で使用したＰＬＣδ１ＰＨドメインのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で以下に示しておく。
【００２５】
１１ ＨＧＬＱＤＤＰＤＬＱＡＬＬＫＧＳＱＬＬＫＶＫＳＳＳＷＲＲＥＲ
４１ ＦＹＫＬＱＥＤＳＫＴＩＷＱＥＳＲＫＶＭＲＳＰＥＳＱＬＦＳＩＥ
７１ ＤＩＱＥＶＲＭＧＨＲＴＥＧＬＥＫＦＡＲＤＩＰＥＤＲＳＦＳＩＶ
１０１ ＦＫＤＱＲＮＴＬＤＬＩＡＰＳＰＡＤＡＱＨＷＶＱＧＬＲＫＩＩＨ
１３１ ＨＳＧＳＭＤＱＲＱＫ
【００２６】
このペプチドにおける前記した３箇所のアミノ酸、即ち５６番目のアルギニン（Ｒ）、５８番目のバリン（Ｖ）、１０６番目のアスパラギン（Ｎ）は、ＩＰ３との結合に寄与しておらず、かつこれらのアミノ酸のβ−炭素原子はＩＰ３のＣ２炭素原子から約８〜９．７オングストローム離れている。したがって、これらのアミノ酸は、丁度、結合ポケットに位置していることになる。
このような位置にあるアミノ酸が本発明のＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えないアミノ酸として好ましいものである。
【００２７】
本発明の分子センサーは、前記した位置のアミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸が、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更するものであるが、第二の蛋白質が元も当該位置にそのようなアミノ酸を有している場合には必ずしも変更する必要はない。本発明における標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸としては、ペプチド結合を形成するアミノ基とカルボキシル基以外に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであればよいが、このような官能基としてはチオール基が好ましい。したがって、好ましい標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸、例えばシステインなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の分子センサーの他の特徴は、本発明の分子センサーのペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することである。このようなシグナルペプチドを有することにより、本発明の分子センサーを細胞外から供給することが可能となる。本発明のシグナルペプチドとしては、ペプチドを細胞内に取り込ませる作用を有するものであればよく、例えば、Ｔａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｒ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）などが挙げられる（カッコ内は、当該シグナルペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したものである。）。
【００２９】
本発明は、前記してきた本発明の分子センサーを用いて細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法を提供するものである。本発明の分子センサーは、細胞培養系における細胞内に直接導入してもよいが、本発明の分子センサーが前記したシグナルペプチドを有するものである場合には、細胞外に添加することにより細胞内に取り込まれることから、細胞外の培養液中に添加するだけであってもよい。
本発明のこの方法における標識物質の標識状態としては、可視化の可能なものが好ましい。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、ＩＰ３と当該分子センサーとの結合による当該蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度の変化を測定する方法が好ましい。また、測定方法としては目視でもよいが蛍光強度を測定できる機器による測定が、特に定量化にためには好ましい。
本発明のこの方法により、細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで検出、定量又は同定することが可能となり、細胞内におけるイノシトール−三リン酸の挙動をリアルタイムで可視化でき、かつ必要に応じて検出、定量又は同定することもできる。
【００３０】
また、本発明は、前記した本発明の分子センサーを利用して、ある物質の細胞に対する作用をスクリーニングすることができる。本発明の分子センサーの対象となる分子種として、細胞内のセカンドメッセンジャーとして知られているイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を採用した場合には、細胞膜に存在する受容体の挙動に応じて当該ＩＰ３が特定の挙動を示すのであるから、当該受容体に反応する物質（メッセンジャー）であるか否かを当該ＩＰ３の挙動を本発明の分子センサーにより計測することにより、判定することができる。
例えば、本発明の分子センサーを含有する細胞培養系に、ある物質（被検物質）を添加して、被検物質の存在による当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することにより、被検物質の存在に対応した細胞内におけるＩＰ３の挙動を測定することができ、その結果として、被検物質が当該細胞に対するメッセンジャーであるか否かをスクリーニングすることが可能となる。この方法におけるメッセンジャーとしては、受容体に対するアゴニスト、リガンド、アンタゴニストなどのいずれであってもよい。
また、被検物質としては、生理活性物質、合成化学物質、天然物、蛋白質などのいずれの物質であってもよいが、プロテオーム解析などにこの方法を応用することにより簡便でかつ可視化できることから非常に有用な方法となることから、被検物質として蛋白質を使用する方法が好ましい例として挙げられる。
【００３１】
さらに本発明は、新規かつ有用なペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得る第二の蛋白質（対象となる分子種が結合する分子種）からなるペプチドであって、当該第二の蛋白質は標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸を少なくとも１個有し、当該結合サイトに標識物質が結合しており、かつ当該第二の蛋白質に第一の蛋白質が結合することにより標識物質の物性が変化し、標識の状態が変化し、当該物性又は標識の状態の変化を検出又は定量化できる標識物質が結合していることを特徴とするペプチドを提供するものである。
【００３２】
より詳細には、本発明のペプチドは、対象となる分子種としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を選定したものであり、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化する標識物質が結合していることを特徴とするペプチドを提供するものである。
さらに詳細には、本発明のペプチドは、ホスホリパーゼＣδのプレクストリンホモロジー ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）、好ましくはＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンの少なくとも１アミノ酸が、システインに置換され、当該システインのチオール基に蛍光物質が結合したペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、ＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、又は１０６番目のアスパラギンのいずれか１個又は２個以上がシステインに置換されたものであればよいが、好ましくは１０６番目のアスパラギンがシステインに置換されたものが挙げられる。
【００３３】
本発明のペプチドにおける蛍光物質としては、例えば、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）、５−ヨードアセタミドフルオレセン（５−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（５Ｆ）、６−ヨードアセタミドフルオレセン（６−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（６Ｆ）、２−［４’−（２”−ヨードアセタミド）フェニル］アミノナフタレン−６−スルホン酸（ＡＮＳ）などのチオール基との反応性を揺する物質が挙げられ、より好ましい蛍光物質としてはが、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）が挙げられる。
また、本発明のペプチドは、当該ペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することもできる。好ましいシグナルペプチドとしては、前記してきたＴａｔ、Ｒ９、又はＲ７などが挙げられる。
本発明の好ましいペプチドとしては、次のアミノ酸配列、
【００３４】
１１ ＨＧＬＱＤＤＰＤＬＱＡＬＬＫＧＳＱＬＬＫＶＫＳＳＳＷＲＲＥＲ
４１ ＦＹＫＬＱＥＤＳＫＴＩＷＱＥＳＲＫＶＭＲＳＰＥＳＱＬＦＳＩＥ
７１ ＤＩＱＥＶＲＭＧＨＲＴＥＧＬＥＫＦＡＲＤＩＰＥＤＲＳＦＳＩＶ
１０１ ＦＫＤＱＲＣＴＬＤＬＩＡＰＳＰＡＤＡＱＨＷＶＱＧＬＲＫＩＩＨ
１３１ ＨＳＧＳＭＤＱＲＱＫ
【００３５】
即ち、１０６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列を有し、当該システインのチオール基に６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）が結合したペプチド（ＤＡＮ１０６）、そのＮ末端にシグナルペプチドＴａｔが結合したペプチド（Ｔａｔ−ＤＡＮ１０６）、そのＣ末端にシグナルペプチドＲ９が結合したペプチド（Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６）、そのＣ末端にシグナルペプチドＲ７が結合したペプチド（Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６）などが挙げられる。
【００３６】
本発明のペプチドは、１アミノ酸変異体の製造方法によって製造することができ、このようにして得られたペプチドをコードするＤＮＡをさらに同様な変異法により２個以上のアミノ酸変異体ペプチドを製造することができる。また、シグナルペプチドを結合させる場合は、シグナル配列をコードするＤＮＡを用いて同様に製造することができる。このようにして製造されたペプチドを目的の蛍光物質と反応させることにより、本発明のペプチドを製造することができる。
【００３７】
本発明は、天然に存在するタンパク質モチーフをリセプターの土台として用いているために、設計初期段階においても目的とする分子に対して選択性及び親和性についてかなり高いものである。さらに、ＩＰ３の結合前は蛍光物質がＰＨドメインの結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）におさまっており、この状態が準安定状態となるためＩＰ３への選択性がさらに向上している。このような特徴を有する本発明の分子センサーは、目的とする分子の対して高い選択性を示し、低濃度から高濃度への範囲で感度よく測定できるという特徴を有し、さらに細胞内でのセカンドメッセンジャーを可視化することができるものであり、刺激に応じた細胞内でのシグナル伝達を定量的に解析することができる。このような手法は、ポストゲノム科学でのシグナル伝達研究において必須の手法であり、多様な生体内セカンドメッセンジャーに対する分子センサーのひとつとして本発明の分子センサーは有用かつ重要なものである。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３９】
実施例１ （Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、及びＲ７Ｃ−１０６をコードす
るＤＮＡを含有するプラスミドの構築）
Ｎ１０６Ｃ ＰＨドメインのコンストラクトの製造は、ラットのＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いてＰＣＲ法を用いたサイト特異的変異法により構築した。このＮ１０６Ｃ ＰＨドメインのプラズミドを基にして、Ｔａｔ、Ｒ７及びＲ９のアミノ酸をコードする配列を含むプライマーをおりごエキスプレス（Ｏｌｉｇｏ ｅｘｐｒｅｓｓ）より購入し、ＰＣＲ法によりＴａｔ、Ｒ９、及びＲ７を、それぞれ融合したＰＨドメインのＤＮＡを作製した。Ｎｄｅ Ｉ、及びＢａｍ ＨＩで制限酵素消化後、ｐｅｔ系発現ベクターにライゲーションして目的のプラスミドを構築した。
【００４０】
実施例２ （Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６の大量発現）
実施例１で製造したＴａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、及びＲ７Ｃ−１０６の各コンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにトランスフォームし、ＬＢ培地中３７℃で培養した。Ａ６００＝０．６になったところで１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導をかけた。３時間後２５００ｒｐｍで遠心し大腸菌を回収し、１０ｍＭリン酸（ｐＨ ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ グルコースを含むバッファーに懸濁させ、凍結融解後超音波破菌を行った。９０００ｒｐｍで遠心し、上清とペレットを分離しＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ本タンパク質はインクルージョンボディを形成し、全てペレット中回収された。このペレットを−２０℃で保存した。
【００４１】
実施例３ （Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６の精製及び蛍光
試薬ＤＡＮとの反応）
インクルージョンボディとして保存しておいたＴａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６を、それぞれ４Ｍ尿素、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴを含むバッファーに溶かし、１５０００ｒｐｍで遠心し、不純物を除去後、ハイトラップＳＰカラム（Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））による陽イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、モノＳ（Ｍｏｎｏ Ｓ）（４Ｍ尿素、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＡバッファー、及び４Ｍ尿素、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌを含むＢバッファー）により最終精製を行った。精製後脱気し、ＰＨドメインの約１０倍量のＤＡＮをＤＭＦに溶かし、撹拌しながら滴下した。氷冷しながら約３時間反応させ、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）により反応を止めた。精製はリソースＲＰＣ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））により行い（１０％ アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含むＡバッファー、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含むＢバッファー）、生成物の確認は蛍光試薬に由来する吸収（３９０ｎｍ）を追跡することにより行った。生成物を回収後、ＮＡＰ−５ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＨＢＳバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ １０７ｍＭ、６ｍＭ ＫＣｌ、グルコース １１．５ｍＭ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２）に置換した。濃度はＤＡＮ固有の吸収帯である３９０ｎｍ（ε＝２２０００）測定から算出した。
【００４２】
実施例４ （Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビトロでの蛍光測定）
蛍光の測定には、蛍光スペクトロファプテムメーターＦ４５００（ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｐｔｐｍｅｔｅｒ Ｆ４５００ （Ｈｉｔａｃｈｉ））を用いた。測定条件は、１００ｎＭ Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ ツイーン２０（ｔｗｅｅｎ ２０）で行った。励起、蛍光スリット幅は５ｎｍ、ＤＡＮの励起波長は３９０ｎｍで測定を行い、ＩＰ３の濃度を０〜５０μＭに変化させて蛍光挙動を記録した。
結果を図２に示す。図２の上側の太い黒実線が初期値（ＩＰ３の濃度が０μＭ）の場合であり、下側にいくに従ってＩＰ３の濃度が大きい場合を示しており、下側の太い灰色が最終濃度（ＩＰ３の濃度が５０μＭ）の場合を示している。
【００４３】
実施例６ （６Ｆ１０６、ＤＡＮ５６、６Ｆ５８、及びＤＡＮ５８の製造）
実施例１〜３に記載の方法に準じて、蛍光物質として６Ｆを使用したもの、また実施例１に記載の方法に準じてラットのＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いてシステインを置換した部位が５６番目のもの（Ｒ５６Ｃ）及び５８番目のもの（Ｖ５８Ｃ）を製造した。
これらの分子センサー及びＤＡＮ１０６の、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．００５％のツイーン２０を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で２５℃における蛍光変化比及び解離定数Ｋｄ（μＭ）の値を次の表１に示す。なお、Ｋｄ値はいずれも蛍光滴定による。
【００４４】
実施例５ （細胞内のＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６のＣＣＤカメラ測定）
ＨＥＫ細胞に、１ｍＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で時間（１０分〜８時間）を変えてインキュベートした。ＨＢＳバッファーで洗浄後、ＣＣＤカメラ測定を行った。フィルターは、３９０ｎｍ励起、４８０ｎｍ〜５２０ｎｍの蛍光を検出可能なＷＵフィルター（ＢＰ３３０〜３８５、ダイクロイックミラー４００、ＢＡ４２０以上）を使用した。
結果を図３及び図４に示す。
【００４６】
実施例５ （アーガス（Ａｒｇｕｓ）によるＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビボ蛍光測定）
ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＤＴ４０細胞に、各々１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分間インキュベートした後、ＨＢＳバッファーで洗浄した。バッファーはＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ １０７ｍＭ、６ｍＭＫＣｌ、グルコース１１．５ｍＭ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２）バッファーを用い、刺激はＣＨＯ細胞には１００μＭ ＡＴＰ、ＨＥＫ細胞には３０μＭカルバコール、ＤＴ４０細胞には１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４を含むＨＢＳバッファーを流すことにより行った。
結果を図５及び図６に示す。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は、細胞内のセンカンドメッセンジャーに対する新規な分子センサーを提供するものであり、本発明の分子センサーによりこれまで不可能であった細胞内でのイノシトール三リン酸の濃度変化をリアルタイムに計測し、可視化することが出来る。また、本発明の分子センサーを用いることにより、アゴニストやアンタゴニストなどの細胞に対する作用を簡便にかつ可視化して計測することができ、蛋白質の機能解析をはじめ、細胞機能の解析などの広い分野に応用可能な技術を提供するものである。さらに本発明は、ＩＰ３にとどまらず、生体内セカンドメッセンジャーに対するテーラーメイドの人工リセプター及び分子センサー構築への一般的な設計概念を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の分子センサーのペプチドの構造の例を模式的に示したものである。図１の（ａ）はシグナルペプチドなしのＰＬＣδＰＨドメインの配列、図１の（ｂ）はＴａｔペプチドをＮ末端に融合した配列、図１の（ｃ）はＲ７ペプチドをＣ末端に融合した配列、図１の（ｄ）はＲ９ペプチドをＣ末端に融合した配列をそれぞれ示す。図１中の＊印は、１０６番目アスパラギンをシステインに変異したことを示している。
【図２】図２は、インビトロでの本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＩＰ３添加（０−５０μＭ）に伴う蛍光変化の結果を示す。図２の横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。図２の上側の太い黒実線が初期値（ＩＰ３の濃度が０μＭ）の場合であり、下側にいくに従ってＩＰ３の濃度が大きい場合を示しており、下側の太い灰色が最終濃度（ＩＰ３の濃度が５０μＭ）の場合を示している。
図２の右上のグラフは、ＩＰ３濃度に対し、５００ｎｍの蛍光強度変化率（ΔＦ）をプロットしたものである。当該グラフの横軸はＩＰ３の濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光強度変化率（ΔＦ）を示す。
【図３】図３は、ＨＥＫ細胞を１μＭの本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を示す図面に変わる写真である。図３ａはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図３ｂはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示し、図３ｃは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像、図３ｄは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
【図４】図４は、ＨＥＫ細胞を、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で１５分処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を示す図面に変わる写真である。図４ａは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図４ｂは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
【図５】図５は、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＨＥＫ細胞に対してアゴニスト刺激を行ったときの蛍光変化測定の結果を示す。図５の横軸は時間（秒）を示し、図５ａの縦軸はＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の蛍光強度変化の比を示し、図５ｂの縦軸はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による相対蛍光強度を示す。図５ａはＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化を示し、０−５分（３００秒）まではＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分は３０ｍＭ カルバコールを添加した場合である。図５ｂはＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光変化を示し、０−５分（３００秒）はＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分（６００秒）は３０μＭカルバコールを添加した場合であり、１０分−２０分は再びＨＢＳバッファーにした場合の結果である。
【図６】図６は、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＣＨＯ細胞及びＤＴ４０細胞に対してアゴニスト刺激を行ったときの蛍光変化測定の結果を示す図面に代わる写真である。図６Ａは１％Ｆ−１２７を含む１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分インキュベートしたＣＨＯ細胞（ａ）、ＤＴ４０細胞（ｂ）の図面に代わる蛍光画像写真である。図６Ｂの横軸は時間（分）を示し、縦軸は相対比をそれぞれ示す。図６Ｂの（ａ）は、ＣＨＯ細胞における１００μＭ ＡＴＰ刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３分は１００μＭ ＡＴＰで、３−１０分はＨＢＳバッファーで、１０−１１．５分は１００μＭ ＡＴＰで、１１．５−１５分はＨＢＳバッファーで、１５−１７分は１００μＭ ＡＴＰで、１７−２０分はＨＢＳバッファーで処理した。図６Ｂの（ｂ）は、ＤＴ４０細胞における１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３．５分は１ｍｇ／ｍｌ Ｍ４で、３−６分はＨＢＳバッファーで処理した。
【図７】図７は、阻害剤処理したＣＨＯ細胞におけるＡＴＰ刺激による、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の蛍光強度変化の結果を示す。図７の横軸はインキュベートした時間（分）を示し、縦軸は相対蛍光強度を示す。図７のＡはコントロールを示し、Ｃは１μＭのＵ７３３４３を添加した場合を示し、Ｂは１μＭのＵ７３１２２を添加した場合を示す。各細胞培養系に与えた刺激を矢印で示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to intracellular inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 The present invention relates to a molecular sensor capable of real-time measurement by visualizing the behavior of (2). That is, the present invention relates to inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 A) a peptide having a domain capable of binding to 3 And at least one amino acid that does not directly affect the binding to the domain is changed to an amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance, and the amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance is replaced with an amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance. By attaching a labeling substance, IP 3 And a molecular sensor of inositols, wherein the labeling state of the labeling substance is changed by the binding of the domain, a method for measuring in real time a change in the concentration of inositol-triphosphate in cells using the same, and The present invention relates to a method for screening a function of a test substance as a messenger for cells.
The present invention also relates to a peptide constituting the above-described molecular sensor of the present invention.
[0002]
[Prior art]
Cells generate second (secondary) messengers in cells in response to foreign information such as growth factors, hormones, and neurotransmitters, and transmit intracellular information through them. In this intracellular signal transduction system, agonist stimulation stimulates cytosolic calcium concentration [Ca 2+ ] I is known to increase. In some cases, these increased calcium levels indicate that phospholipase C activated by the
[0003]
In particular, in post-genomic sciences, it has become important to analyze the in vivo dynamics of molecules responsible for information transmission in cells, and there is an urgent need to develop molecular sensors that can observe the dynamics of second messengers in cells. So far, there have been active studies in Japan and overseas to synthesize artificial receptors that capture second messengers using organic molecules, but none of them has reached a practical level in selectivity and affinity.
Intracellular calcium kinetics have been well studied using sensors such as Fura-2. On the other hand, IP 3 As a technique for quantifying the amount of tritium, tritium-labeled inositol ([ 3 [H] -Inositol) is taken into cells, stimulated by an agonist, crushed, and the metabolic amount of inositol polyphosphate is determined by anion chromatography (Berridge, MJ). , Et al., Biochem. J., 1983, 212, 473-482; Hawakins, PT, et al., Biochem. J., 1986, 238, 507-516). Using this method, the metabolic pathways of phosphatidylinositol and inositol polyphosphate and the role of inositol polyphosphate on calcium signals have been elucidated (Dijiken, PV, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270). Hunyady, L., et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 24798-24804; Matkovich, S.J., et al., J. Biol. Chem., 2000, 275. , 10845-10850). However, this method requires a spatial and temporal IP at the single cell level. 3 There is a disadvantage that it is impossible to measure the amount of change in.
[0004]
Recently, intracellular PI (4,5) P2, IP was expressed using the pleckstrin homology domain (PLCδPH domain) of phospholipase C fused with green fluorescent protein (GFP). 3 A method for visualizing the change of the target in real time has been reported (Stuffer, TP, et al., Curr. Biol., 1998, 8, 343-346; Varnai, P., et al., J. Cell). Biol., 1998, 143, 501-510; Nash, MS, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 19286-19293). In non-stimulated cells, PLCδPH-GFP is localized in the cell membrane by binding to PI (4,5) P2, and after stimulation with an agonist, PI (4,5) P2 is hydrolyzed. Release to the cytoplasm. Subsequent resynthesis of PI (4,5) P2 occurs and PLCδPH-GFP also migrates to the cell membrane. Such transient changes in intracellular fluorescence have been observed in various cells. In particular, IP synchronized with calcium oscillation in canine kidney epithelial cells using this method 3 Oscillation has also been observed (Hirose, K., et al., Science, 1999, 284, 1527-1530). More recently, PLCδPH-CFP and PLCδPH-YFP have been expressed in cells, and PI (4,5) P2 or IP based on the same principle by FRET. 3 A method of visualizing the change of the chromosomal activity has also been reported (Wal, JVD, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 15337-15344).
However, these methods are based on the hydrolysis of PI (4,5) P2, 3 The dynamics cannot be directly observed. These methods are based on the behavior based on the hydrolysis of PI (4,5) P2, 3 It is only an estimation of dynamics. In addition, IP within a single cell 3 It is not possible with these methods to measure the change in the concentration of
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a second (second) messenger IP 3 It is an object of the present invention to provide a biomolecule sensor capable of visualizing, detecting, and quantifying the intracellular dynamics in real time, and a detection / quantification method using the same. Another object of the present invention is to provide a biomolecule sensor that can be introduced into cells.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have proposed IP 3 Consider the binding between the PH domain and the PH domain. 3 (Morii, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 1138-1139). The present inventors have introduced a labeling substance such as a fluorescent substance into the PH domain as a novel molecular sensor using this binding pocket, and the introduced labeling substance is stored in the binding pocket, and IP 3 Does not interfere with the binding of the PH domain with IP 3 Was designed to change the physical properties of the labeling substance by binding to the PH domain. 3 The present inventors have found that the binding between the and the PH domain can be selectively visualized, and completed the present invention.
[0007]
That is, the present invention relates to inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 A) a peptide having a domain capable of binding to 3 And at least one amino acid that does not directly affect the binding to the domain is changed to an amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance, and the amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance is replaced with an amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance. By attaching a labeling substance, IP 3 The labeling state of the labeling substance is changed by binding to the domain and the domain, more specifically, the labeling substance is a fluorescent substance, 3 The present invention relates to the molecular sensor, wherein the fluorescence wavelength and / or the fluorescence intensity of the fluorescent substance is changed by the binding between the fluorescent substance and the domain. More specifically, the present invention relates to a molecular sensor which can be introduced into cells, which further comprises a signal peptide at the N-terminus or C-terminus of the peptide serving as the molecular sensor of the present invention.
[0008]
Further, the present invention provides a method for measuring the change in the concentration of inositol-triphosphate in a cell in real time, which comprises adding the above-described molecular sensor of the present invention to a cell culture system and measuring the labeling state of a labeling substance of the molecular sensor. Related to the method of measuring with.
Further, the present invention comprises adding a test substance to a cell culture system containing the above-described molecular sensor of the present invention, and measuring the labeling state of the label substance of the molecular sensor due to the presence of the test substance. And a method for screening the function of a test substance as a messenger for cells.
Further, the present invention provides a method of the present invention, wherein at least one amino acid of arginine at position 56, valine at position 58, and / or asparagine at position 106 of the pleckstrin homology domain (PLCδPH domain) of phospholipase Cδ is substituted with cysteine, It also relates to a peptide having a fluorescent substance bound to the group.
[0009]
We have identified IP in a single cell. 3 In order to visualize the change of IP in real time, IP 3 By fluorescently labeling the PLCδPH domain known to specifically bind to 3 A molecular sensor consisting of a fluorescent sensor was prepared. For example, phospholipase Cδ 1 (PLCδ 1 ) PH domain IP 3 The asparagine residue at position 106 around the binding site is mutated to cysteine (N106C), and the fluorescent reagent 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (6-Bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (DAN)) is specifically used for the cysteine. A reacted sensor (DAN106) was produced.
This molecular sensor uses IP 3 Is presumed that the fluorescent substance is contained in the binding pocket of the PH domain before binding, and this state becomes a metastable state. 3 It was expected that the selectivity to the product would be improved.
[0010]
Further, a signal peptide for allowing the DNA to be introduced into cells was bound to the N-terminus or C-terminus of the DAN106.
FIG. 1 schematically shows an example of the aforementioned molecular sensor of the present invention. FIG. 1A shows a PLCδPH domain in which asparagine at position 106 of the PLCδPH domain is mutated to cysteine. The mutated cysteine was reacted with the fluorescent reagent DAN to obtain the molecular sensor of the present invention. FIGS. 1 (b), 1 (c), and 1 (d) show a peptide having a sequence obtained by fusing the signal peptide Tat (YGRKKRRQRRR), R7 (RRRRRRRR), or R9 (RRRRRRRRRR) to this end. Have been. Hereinafter, these are referred to as Tat-DAN 106, R7C-DAN 106, and R9C-DAN 106, respectively.
These signal peptides make it possible to introduce the peptide of the body into cells. It has been reported that a protein obtained by fusing this signal peptide can introduce a target protein into cells by simply incubating the protein with cells in various cells for a short time. When these Tat-DAN106, R9C-DAN106, and R7C-DAN106 sensors are introduced into HEK293 cells, CHO cells, and the like, and the cells are stimulated with an agonist that increases intracellular calcium concentration, changes in the fluorescence of the intracellular sensors are observed. I was able to.
[0011]
Using the obtained R9C-DAN106, IP 3 The fluorescence intensity in the absence and presence of was examined. R9C-DAN106 IP in vitro 3 FIG. 2 shows the results of the fluorescence change accompanying the addition (0-50 μM). The horizontal axis in FIG. 2 shows the fluorescence wavelength, and the vertical axis shows the fluorescence intensity. In R9C-DAN106, IP 3 It can be seen that at the time of coupling, the fluorescence intensity is greatly reduced and the fluorescence wavelength is shifted to a longer wavelength. Similar results were obtained with the sensor without signal peptide fusion. IP 3 The Kd was calculated by plotting the fluorescence intensity change rate against the concentration and performing fitting, and as a result, the dissociation constant (Kd) of the complex was 1.97 μM.
The upper right graph in FIG. 3 It is a plot of the change rate of fluorescence intensity (ΔF) at 500 nm against the concentration. The horizontal axis of the graph is IP 3 , And the vertical axis indicates the fluorescence intensity change rate (ΔF). The positions of the bars in the graph are actual measurement points. The width of the bar indicates the standard deviation. The fluorescence intensity change rate ΔF is prepared with ΔFmax set to 1.0. And the following equation:
ΔF = ΔFmax ｛[IP 3 ] / (Kd + [IP 3 ])｝
The Kd value was calculated by fitting.
[0012]
Next, the behavior of the molecular sensor of the present invention in cells was observed.
R9C-DAN106 in HEK Cells HEK cells were treated with 1 μM R9C-DAN106 at room temperature for 1 hour, and the results of measurement with a CCD camera are shown in FIG. Figure 3a shows a transmitted light image of HEK cells incubated for 1 hour in HBS buffer, Figure 3b shows a fluorescent image of HEK cells incubated for 1 hour in HBS buffer, and Figure 3c incubated 1 hour of 1 M R9C-DAN106. FIG. 3d shows a fluorescence image of the HEK cells in which 1 μM R9C-DAN106 was incubated for 1 hour.
Slight fluorescence was observed in cells treated with R9C-DAN106 for 1 hour (FIG. 3d). However, the cells for which fluorescence was observed appeared dead, and it was presumed that R9C-DAN106 was cytotoxic, or that the sensor was specifically incorporated into the dead cells. As a control, no fluorescence was observed in cells treated with HBS buffer at room temperature for 1 hour (FIG. 3b).
[0013]
Furthermore, the measurement was performed after changing the treatment time with R9C-DAN106 to 2 to 8 hours. The cell death phenomenon became more prominent as the time became longer. The result obtained by shortening the processing time for 15 minutes is shown in FIG. FIG. 4a shows a transmitted light image of HEK cells incubated with 1 μM R9C-DAN106 at room temperature for 15 minutes, and FIG. 4b shows a fluorescence image of HEK cells incubated with 1 μM R9C-DAN106 at room temperature for 15 minutes. Under these conditions, the molecular sensor was sufficiently incorporated into the cells, and the state of the cells was better than that of the cells treated for 1 hour.
[0014]
Next, the measurement of the change in fluorescence due to R9C-DAN106 in cells due to carbachol stimulation was examined. HEK cells express the muscarinic acid receptor on the cell membrane, are stimulated by carbachol, and activated by 3 Is known to cause intracellular calcium increase.
FIG. 5 shows the results of fluorescence measurement performed on HEK cells into which R9C-DAN106 was introduced. The horizontal axis in FIG. 5 shows time (seconds), the vertical axis in FIG. 5a shows the ratio of the change in fluorescence intensity of calcium concentration due to Fura-2, and the vertical axis in FIG. 5b shows the relative fluorescence intensity due to R9C-DAN106. FIG. 5a shows the change in calcium concentration due to Fura-2, in the HBS buffer until 0-5 minutes (300 seconds), and 5 minutes-10 minutes when 30 μM carbachol was added. FIG. 5b shows the change in fluorescence due to R9C-DAN106, 0-5 minutes (300 seconds) in HBS buffer, 5-10 minutes (600 seconds) when 30 μM carbachol was added, and 10 minutes-20. The minutes are the results when the HBS buffer was used again.
As a result, when the cells were stimulated with 30 μM carbachol, the fluorescence intensity continuously decreased, and reached an almost equilibrium state in about 3 minutes. After a further 5 minutes, it was observed that the fluorescence was slowly recovered by washing with the HBS buffer (FIG. 5b). As a result of performing the same operation on the cells into which Fura-2 was introduced, it was observed that intracellular calcium concentration was transiently increased by carbachol stimulation (FIG. 5-a). This decrease in fluorescence is due to the in vitro IP of R9C-DAN106. 3 Consistent with the decrease with increasing concentration (see FIG. 2), carbachol stimulation induced intracellular IP 3 This was shown to be due to the increasing concentration.
[0015]
Similarly, intracellular fluorescence change by agonist stimulation was performed using CHO and DT40 cells. CHO cells express purine receptors on the cell membrane, and activation of PLCβ occurs by ATP stimulation. 3 Is known to cause intracellular calcium increase. In the case of DT40 cells, a B cell antigen (B cell antigen) receptor is expressed on the cell membrane, and PLC4 activation is caused by M4 stimulation, and IP4 3 Is known to cause intracellular calcium increase.
R9C-DAN106 was also introduced into CHO and DT40 cells as in the case of HEK cells. The result is shown in FIG. FIG. 6A is a fluorescence image photograph instead of a drawing of CHO cells (a) and DT40 cells (b) in which 1 μM R9C-DAN106 containing 1% F-127 was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The horizontal axis in FIG. 6B indicates time (minutes), and the vertical axis indicates the relative ratio. FIG. 6B (a) shows the change in calcium concentration due to Fura-2 in 100 μM ATP stimulation in CHO cells as a ratio (top), and the change in fluorescence due to R9C-DAN106 as a relative fluorescence intensity (bottom). ). 0-2 min is HBS buffer, 2-3 min is 100 μM ATP, 3-10 min is HBS buffer, 10-11.5 min is 100 μM ATP, 11.5-15 min is HBS buffer, 15 min. Treated with 100 μM ATP for -17 minutes and HBS buffer for 17-20 minutes. FIG. 6B (b) shows the change in the calcium concentration due to Fura-2 by stimulating 1 mg / ml M4 in DT40 cells as a ratio (top), and the change in the fluorescence due to R9C-DAN106 as a relative fluorescence intensity. (Below). 0-2 minutes were treated with HBS buffer, 2-3.5 minutes with 1 mg / ml M4, and 3-6 minutes with HBS buffer.
As a result, fluorescence was observed in the cells for both CHO and DT40 cells (FIGS. 6A-a, b), and the efficiency of incorporation into cells was higher than that of HEK cells. As a result of 100 μM ATP stimulation of CHO cells into which R9C-DAN106 was introduced, reversible changes in fluorescence intensity corresponding to each stimulation and washing were observed (FIG. 6B-a). However, no clear change due to 1 mg / ml M4 was observed in DT40 cells (FIG. 6B-b). This may be due to the higher cytotoxicity.
[0016]
Furthermore, the change in the fluorescence intensity of R9C-DAN106 due to ATP stimulation in CHO cells treated with the inhibitor was examined. CHO cells were incubated with 1 μM R9C-DAN106 at 37 ° C. for 10 minutes, and then incubated with 1 μM U73343 or 1 μM U73122 for 15 minutes to measure. FIG. 7 shows the results. The horizontal axis in FIG. 7 indicates the incubation time (minutes), and the vertical axis indicates the relative fluorescence intensity. In FIG. 7, the mark ○ indicates the control, the mark 場合 indicates the case where 1 μM U73343 was added, and the mark ○ indicates the case where 1 μM U73122 was added. The stimulus applied to each cell culture system is indicated by an arrow.
As a result, in CHO cells treated with U73122, which is a PLC inhibitor, the decrease in fluorescence intensity was suppressed by stimulation with 100 μM ATP. In U73343-treated CHO cells having no inhibitory effect with the analog of U73122, a change in fluorescence intensity was observed upon stimulation with 100 μM ATP. Thus, the change in fluorescence due to this agonist stimulation is a change dependent on the PLC activity, 3 It was shown that the change corresponded to the increase in the concentration of.
[0017]
As described above with reference to specific examples, the present inventors consider that intracellular IP 3 For the purpose of visualizing changes, an IP based on PLCδPH domain is used as an example of the molecular sensor of the present invention. 3 The sensor was manufactured and its function was analyzed. The natural PLCδPH domain is IP 3 Already has a high affinity (Kd = 0.2 μM), low affinity for other phosphatidylinositol polyphosphates and inositol polyphosphates, 3 It is known that the domain possesses high selectivity for. In particular, the dissociation constant with PI (4,5) P2 is 2 μM and IP 3 Reported lower values compared to PI (4,5) P2 and IP 3 This PLCδPH domain can be identified by IP 3 Preferably, but not necessarily, the sensor base.
We have identified the IP of the PLCδPH domain. 3 The residue (N106) around the binding region was mutated to cysteine, and the cysteine-labeled PH domain (DAN106) 3 It has been found and reported that the fluorescence intensity is greatly reduced in a concentration-dependent manner and has a property of long wavelength shift (Morii, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 1139). -1140). When the PH domain is fluorescently labeled, the dissociation constant slightly decreases (Kd = 〜2 μM), but the IP after hydrolysis of PI (4,5) P2 in cells 3 It is considered that the dissociation constant is suitable for detecting the change. In addition, the fluorescent label reduces the affinity for other inositol polyphosphates and increases the IP. 3 An increase in selectivity for was observed.
Then, for the purpose of easily introducing the sensor from outside the cell to the inside of the cell, a product in which a signal peptide (Tat, R9, R7 peptide) capable of being introduced into the cell was fused to the end of DAN106 (Tat-DAN106). , R9C-DAN106, R7C-DAN106). It has been reported that a protein obtained by fusing this signal peptide can introduce a target protein into cells by simply incubating the protein with cells in various cells for a short time. The RAN-fused DAN106 (R9C-DAN106) has the same IP as the sensor peptide not fused to the signal peptide R9. 3 The change in fluorescence was shown.
[0018]
It was observed that R9C-DAN106 was taken up into HEK cells only by incubating it for about 10 minutes, and that the cells died when the incubation time was further increased. Observation of the cells with a fluorescence microscope reveals strong fluorescence. Therefore, if the cells are incorporated too much, it is considered that the sensor inhibits the metabolism of phosphatidylinositol polyphosphate, thereby affecting the life span of the cells.
In HEK cells, fluorescence was moderately reduced by the addition of carbachol stimulation and reached equilibrium in about 3 minutes. In contrast, a transient change in calcium concentration caused by Fura-2 was observed within 5 seconds after stimulation. This increase in calcium concentration and IP 3 The following three points can be considered as differences in the rate of concentration increase.
(I) IP of this sensor 3 Is about 2M, and IP 3 Receptor IP 3 Judging from the fact that the dissociation constant for is about several tens nM, the IP required to cause a transient change in calcium 3 It is difficult to detect the stage of concentration increase, and the subsequent persistent IP 3 An increase in concentration may have been observed. This was previously used for slices of rat parotid glands. 3 H] -inositol has been reported in a system for incorporating and quantifying metabolites thereof (Downes, CP, et al., Biochem. J. 1983, 216, 633-640), but after carbachol stimulation. Big IP within 5 seconds 3 If an increase occurs and then the stimulation is continued, the IP is sustained for several minutes 3 It is suggested from the fact that the tendency of increasing is observed.
(Ii) IP just below the cell membrane after stimulation 3 Although the concentration is rapidly increasing, it is supplemented by various PH domains and other proteins targeting inositol polyphosphate, and in fact, an increase in the effective concentration in the cytoplasm has been observed late.
(Iii) If it also binds to metabolites such as
[0019]
After stimulation, the fluorescence was observed to recover to the initial value after about 5 minutes by washing. This is the IP 3 Is metabolized to other inositol polyphosphates, and IP 3 Is considered to be caused by the dissociation. This was previously due to carbachol stimulation of rat parotid gland slices followed by inhibition with atropine (an antagonist of muscarinic receptor) in the order of minutes. 3 Has been reported to be metabolized and decreased (Downes, CP, et al., Biochem. J. 1983, 216, 633-640), and the time obtained for the recovery of the fluorescence obtained this time is also appropriate. ing.
[0020]
The present invention provides a novel molecular sensor. The molecular sensor of the present invention does not introduce a labeling substance into a target molecular species, but introduces a labeling substance into a molecular species that binds the target molecular species, and does not substantially affect the binding between the two. It is based on the concept of changing the state of labeling of the labeling substance depending on the presence or absence of the binding of the two to make a molecular sensor of the target molecular species. That is, the present invention relates to a second protein (a molecular species to which a target molecular species binds) capable of binding to a first protein (a target molecular species), wherein the second protein comprises a labeling substance. It has at least one amino acid having a binding site capable of binding, the labeling substance is bound to the binding site, and the physical properties of the labeling substance are changed by the binding of the first protein to the second protein. The present invention provides a molecular sensor characterized in that the state of a label changes and the change in the physical property or the state of the label can be detected or quantified. Another object of the present invention is to provide a method for measuring the behavior of the first protein using the same.
[0021]
More specifically, the present invention relates to inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 ) Was selected, and inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 A) a peptide having a domain capable of binding to 3 And at least one amino acid that does not directly affect the binding to the domain is changed to an amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance, and the amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance is replaced with an amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance. By attaching a labeling substance, IP 3 Characterized in that the labeling state of the labeling substance is changed by the binding of 3 The present invention provides a molecular sensor.
The first protein (the target molecular species) of the present invention can be selected from those in which a second protein to which the first protein can bind is present. It must have a binding site in the two proteins, and a preferred first protein is a second protein having a bag-like binding pocket such as a pocket. And proteins that bind to. Preferred first proteins of the present invention include inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 ).
[0022]
The second protein (molecular species that binds to the target molecular species) in the present invention may be any protein that can bind to the first protein (target molecular species). Or a chemical bond such as a hydrogen bond, but it may be a physical adsorption or a simple dissociation, but it is necessary that both are selectively bonded. is there. Such selective binding may be competitive, but preferably the binding or dissociation constant is constant.
Preferred second proteins (molecular species that bind to the target molecular species) include proteins to which the first protein selectively binds or specific binding domains thereof. The length of the second protein (the molecular species that binds to the target molecular species) is not particularly limited, but may be any amino acid length that is sufficient for the first protein to bind. Inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 ), Preferred second proteins include the pleckstrin homology domain of phospholipase C, preferably phospholipase Cδ (PLCδPH domain). More preferred second proteins include phospholipase Cδ 1 Pleckstrin homology domain (PLCδ 1 H domain).
[0023]
The labeling substance to be bound to the second protein in the present invention is a substance which does not inhibit the binding between the first protein and the second protein, and whose physical property or labeling state changes depending on the presence or absence of the binding of both. There is no particular limitation as long as the change can be confirmed by visible light. Preferred labeling substances include fluorescent substances. Such a fluorescent substance changes the fluorescence wavelength and / or the fluorescence intensity of the fluorescent substance depending on the presence or absence of the binding between the first protein and the second protein. Any substance can be used as long as it can detect and quantify the presence or absence of binding.
Preferred fluorescent substances include, for example, 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (DAN), 5-iodoacetamidofluorescein (5F), and 6-iodoacetamidofluorescein (5F). Examples thereof include, but are not limited to, substances that fluctuate the reactivity with thiol groups, such as 6-iodoacetamidofluorescein (6F) and 2- [4 ′-(2 ″ -iodoacetamido) phenyl] aminonaphthalene-6-sulfonic acid (ANS). It is not done.
[0024]
IP in the molecular sensor of the present invention 3 The at least one amino acid that does not directly affect the binding to the domain and does not substantially affect the binding between the two, ie, an amino acid at a position that does not substantially inhibit the selective binding between the two. It is an amino acid at a position that does not substantially affect the bond between the two even when the amino acid is changed to another amino acid such as cysteine. For example, IP 3 PLCδ as the domain to which 1 When using a PH domain, PLCδ 1 Arginine (R) at position 56, valine (V) at position 58, and asparagine (N) at position 106 in the PH domain.
For illustrative purposes, the PLCδ used in embodiments of the present invention 1 The amino acid sequence of the PH domain is shown below in one-letter amino acid notation.
[0025]
11 HGLQDDPDLQALLKGGSQLLKVKSSSWRRR
41 FYKLQEDSKTIWQESRKVMRSPESQLFSIE
71 DIQEVRMGHRTEGLEK FARDIPEDRSFSIV
101 FKDQRNTLDLIAPSPADAQHWVQGLRKIIH
131 HSGSMDQRQK
[0026]
The above-mentioned three amino acids in this peptide, namely, arginine (R) at position 56, valine (V) at position 58, and asparagine (N) at position 106 are expressed by IP 3 And the β-carbon atom of these amino acids is IP 3 From about 8 to 9.7 angstroms of the C2 carbon atom. Thus, these amino acids are just located in the binding pocket.
The amino acid at such a position is the IP of the present invention. 3 It is preferable as an amino acid that does not directly affect the binding between and the domain.
[0027]
In the molecular sensor of the present invention, at least one of the amino acids at the positions described above is changed to an amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance. When having such an amino acid, it is not always necessary to change it. As the amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance in the present invention, in addition to an amino group and a carboxyl group forming a peptide bond, those having a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, and a thiol group Although good, such a functional group is preferably a thiol group. Therefore, examples of the amino acid having a binding site capable of binding a preferable labeling substance include an amino acid having a thiol group, such as cysteine.
[0028]
Another feature of the molecular sensor of the present invention is that the peptide of the molecular sensor of the present invention further has a signal peptide at the N-terminal or C-terminal. By having such a signal peptide, the molecular sensor of the present invention can be supplied from outside the cell. The signal peptide of the present invention may be any as long as it has an action of incorporating the peptide into cells, and examples thereof include Tat (YGRKKRRQRRR), R7 (RRRRRRRR), and R9 (RRRRRRRRRR). The amino acid sequence of the signal peptide is indicated by the one-letter code of amino acids.)
[0029]
The present invention provides a method for measuring a change in the concentration of inositol-triphosphate in a cell in real time using the above-described molecular sensor of the present invention. The molecular sensor of the present invention may be directly introduced into a cell in a cell culture system. However, when the molecular sensor of the present invention has the above-mentioned signal peptide, it can be intracellularly added by adding it extracellularly. May be simply added to the extracellular culture solution.
The labeling state of the labeling substance in this method of the present invention is preferably one that can be visualized. For example, when a fluorescent substance is used as a labeling substance, IP 3 It is preferable to measure a change in the fluorescence wavelength and / or the fluorescence intensity of the fluorescent substance due to the binding between the fluorescent substance and the molecular sensor. In addition, as a measurement method, visual measurement may be used, but measurement using an instrument capable of measuring fluorescence intensity is particularly preferable for quantification.
According to this method of the present invention, a change in the concentration of inositol-triphosphate in a cell can be detected, quantified or identified in real time, and the behavior of inositol-triphosphate in a cell can be visualized in real time, and Can be detected, quantified, or identified according to
[0030]
In the present invention, the action of a certain substance on cells can be screened using the above-described molecular sensor of the present invention. As a molecular species targeted by the molecular sensor of the present invention, inositol-1,4,5-triphosphate (IP) known as an intracellular second messenger is used. 3 ) Is adopted, depending on the behavior of the receptor present on the cell membrane, 3 Shows a specific behavior, it is determined whether or not the substance (messenger) reacts with the receptor by the IP 3 Can be determined by measuring the behavior of the present invention using the molecular sensor of the present invention.
For example, by adding a certain substance (test substance) to a cell culture system containing the molecular sensor of the present invention and measuring the labeling state of the labeled substance of the molecular sensor due to the presence of the test substance, the test substance can be detected. IP in cells corresponding to the presence of a substance 3 Can be measured, and as a result, it is possible to screen whether or not the test substance is a messenger for the cell. The messenger in this method may be any of a receptor agonist, ligand, antagonist and the like.
The test substance may be any substance such as a physiologically active substance, a synthetic chemical substance, a natural product, or a protein, but is very simple because it can be easily visualized by applying this method to proteome analysis. A method using a protein as a test substance is a preferred example because it is a useful method.
[0031]
Further, the present invention provides a novel and useful peptide. The peptide of the present invention is a peptide comprising a second protein (a molecular species to which a target molecular species binds) capable of binding to a first protein (a molecular species of interest), wherein the second protein is It has at least one amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance, and the labeling substance is bound to the binding site, and the physical properties of the labeling substance are caused by the binding of the first protein to the second protein. The present invention provides a peptide characterized in that a change in the state of a label changes, and that a labeling substance capable of detecting or quantifying the change in the property or the state of the label is bound.
[0032]
More specifically, the peptide of the present invention has inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 ) Was selected, and inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 A) a peptide having a domain capable of binding to 3 And at least one amino acid that does not directly affect the binding to the domain is changed to an amino acid having a binding site capable of binding a labeling substance, and the amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance is replaced with an amino acid having a binding site capable of binding the labeling substance. By attaching a labeling substance, IP 3 And a labeling substance that changes the labeling state of the labeling substance by binding to the domain.
More specifically, the peptide of the present invention comprises a pleckstrin homology domain (PLCδPH domain) of phospholipase Cδ, preferably PLCδ. 1 At least one amino acid of arginine at position 56, valine at position 58, and / or asparagine at position 106 of the PH domain is substituted with cysteine to provide a peptide having a fluorescent substance bound to the thiol group of the cysteine. The peptide of the present invention has a PLCδ 1 Any one or more of arginine at position 56, valine at position 58, or asparagine at position 106 of the PH domain may be substituted with cysteine, but preferably asparagine at position 106 is substituted with cysteine. Examples include:
[0033]
Examples of the fluorescent substance in the peptide of the present invention include 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (DAN), 5-iodoacetamidofluorescein (5F), and 6-iodoacetamide. Substances that fluctuate the reactivity with a thiol group, such as fluorescein (6-iodoacetamidofluorescein) (6F) and 2- [4 ′-(2 ″ -iodoacetamido) phenyl] aminonaphthalene-6-sulfonic acid (ANS). A more preferable fluorescent substance is 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (DAN).
Further, the peptide of the present invention may further have a signal peptide at the N-terminal or C-terminal of the peptide. Preferred signal peptides include Tat, R9, and R7 described above.
Preferred peptides of the present invention include the following amino acid sequence:
[0034]
11 HGLQDDPDLQALLKGGSQLLKVKSSSWRRR
41 FYKLQEDSKTIWQESRKVMRSPESQLFSIE
71 DIQEVRMGHRTEGLEK FARDIPEDRSFSIV
101 FKDQRCCTLLIAPSPADAQHWVQGLRKIIH
131 HSGSMDQRQK
[0035]
That is, a peptide (DAN106) having an amino acid sequence in which the 106th amino acid is substituted with cysteine and 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (DAN) bonded to the thiol group of the cysteine, and a signal at the N-terminus Peptide to which peptide Tat is bound (Tat-DAN106); peptide to which signal peptide R9 is bound to its C-terminal (R9C-DAN106); and peptide to which signal peptide R7 is bound to its C-terminal (R7C-DAN106).
[0036]
The peptide of the present invention can be produced by a method for producing a single amino acid variant, and a DNA encoding the peptide thus obtained is further produced by a similar mutation method to produce two or more amino acid variant peptides. be able to. When a signal peptide is bound, it can be produced in the same manner using DNA encoding a signal sequence. The peptide of the present invention can be produced by reacting the peptide thus produced with a target fluorescent substance.
[0037]
Since the present invention uses a naturally occurring protein motif as a basis for a receptor, the selectivity and affinity for a target molecule are considerably high even in an early stage of design. In addition, IP 3 Before binding, the fluorescent substance is contained in the binding pocket of the PH domain, and this state becomes a metastable state. 3 The selectivity to is further improved. The molecular sensor of the present invention having such characteristics has a feature that it exhibits high selectivity for a target molecule, and can be measured with high sensitivity in a range from a low concentration to a high concentration. It can visualize the second messenger, and can quantitatively analyze signal transduction in cells in response to stimulation. Such a technique is an essential technique in signal transduction research in post-genome science, and the molecular sensor of the present invention is useful and important as one of molecular sensors for various in vivo second messengers.
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0039]
Example 1 (coding Tat-106, R9C-106, and R7C-106
Construction of a plasmid containing DNA
The production of the N106C PH domain construct is based on rat PLCδ. 1 It was constructed by a site-specific mutation method using a PCR method using a PH domain. Based on the N106C PH domain plasmid, primers containing sequences encoding the amino acids of Tat, R7 and R9 were purchased from Oligo express, and Tat, R9 and R7 were respectively fused by PCR. The DNA of the PH domain was prepared. After digestion with Nde I and Bam HI, the target plasmid was constructed by ligation with a pet expression vector.
[0040]
Example 2 (Large expression of Tat-106, R9C-106, R7C-106)
Each construct of Tat-106, R9C-106, and R7C-106 produced in Example 1 was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS and cultured in LB medium at 37 ° C. A 600 = 0.6, induction was performed with 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). After 3 hours, E. coli was recovered by centrifugation at 2500 rpm, suspended in a buffer containing 10 mM phosphoric acid (pH 7.0), 50 mM NaCl, 5 mM DTT, and 50 mM glucose. After centrifugation at 9000 rpm, the supernatant and the pellet were separated and confirmed by SDS-PAGE. This protein formed an inclusion body, and was all recovered in the pellet. The pellet was stored at -20C.
[0041]
Example 3 (Pat and Purification and Fluorescence of R9C-106, R7C-106)
Reaction with reagent Dan)
Tat-106, R9C-106, and R7C-106 stored as inclusion bodies were dissolved in a buffer containing 4 M urea, 10 mM phosphoric acid (pH 7.0), 50 mM NaCl, and 5 mM DTT, respectively, and centrifuged at 15,000 rpm. After removing impurities, the crude product was roughly purified by cation exchange chromatography using a HiTrap SP column (Hitrap SP column (Pharmacia Biotech)), and then mono S (Mono S) (4 M urea, 10 mM phosphoric acid (pH 7.0), 50 mM NaCl) The final purification was carried out using an A buffer containing, and a B buffer containing 4 M urea, 10 mM phosphoric acid (pH 7.0), and 1.5 M NaCl. After purification, the solution was degassed, and about 10 times the amount of DAN of the PH domain was dissolved in DMF and added dropwise with stirring. The reaction was carried out for about 3 hours while cooling on ice, and the reaction was stopped with 5 mM dithiothreitol (DTT). Purification was performed by Resource RPC (Resource RPC (Pharmacia Biotech)) (A buffer containing 10% acetonitrile, 0.1% TFA, B buffer containing 80% acetonitrile, 0.1% TFA), and confirmation of the product was fluorescence. It was performed by following the absorption (390 nm) derived from the reagent. After recovering the product, using an NAP-5 gel filtration column (Pharmacia Biotech), HBS buffer (20 mM HEPES, NaCl 107 mM, 6 mM KCl, glucose 11.5 mM, 1.2 mM MgSO 4) was used. 4 , 2 mM CaCl 2 ). The concentration was calculated from 390 nm (ε = 22000) measurement, which is an absorption band unique to DAN.
[0042]
Example 4 (In vitro fluorescence measurement of R9C-DAN106)
Fluorescence was measured using a fluorescence spectropeptometer F4500 (Hitachi). The measurement conditions were 100 nM R9C-DAN106, 10 mM phosphoric acid (pH 7.0), 50 mM NaCl, and 0.005
FIG. 2 shows the results. The thick solid black line at the top of FIG. 3 Is 0 μM), and the IP becomes lower toward the bottom. 3 Indicates the case where the density of the final density (IP) is large. 3 Is 50 μM).
[0043]
Example 6 (Production of 6F106, DAN56, 6F58, and DAN58)
A method using 6F as a fluorescent substance according to the method described in Examples 1 to 3, and a rat PLCδ according to the method described in Example 1. 1 Cysteine-substituted sites having the 56th position (R56C) and 58th position (V58C) were produced using the PH domain.
The values of the fluorescence change ratio and the dissociation constant Kd (μM) of these molecular sensors and DAN106 at 25 ° C. in a phosphate buffer (pH 7.0) containing 50 mM NaCl and 0.005
[0044]
Example 5 (Intracellular Tat-DAN106, R9C-DAN106, CCD camera measurement of R7C-DAN106)
HEK cells were incubated with 1 mM R9C-DAN106 at 37 ° C. for varying times (10 minutes to 8 hours). After washing with HBS buffer, CCD camera measurement was performed. As the filter, a WU filter (BP330 to 385,
The results are shown in FIGS.
[0046]
Example 5 (In vivo fluorescence measurement of R9C-DAN106 by Argus)
Each of HEK cells, CHO cells, and DT40 cells was incubated with 1 μM of R9C-DAN106 at 37 ° C. for 10 minutes, and then washed with HBS buffer. The buffer was HBS (20 mM HEPES, NaCl 107 mM, 6 mM KCl, glucose 11.5 mM, 1.2 mM MgSO 4). 4 , 2 mM CaCl 2 ) Using a buffer, stimulation was performed by flowing HBS buffer containing 100 μM ATP for CHO cells, 30 μM carbachol for HEK cells, and 1 mg / ml M4 for DT40 cells.
The results are shown in FIGS.
[0047]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel molecular sensor for the second messenger in a cell, and measures the change in the concentration of inositol triphosphate in a cell in real time, which was previously impossible with the molecular sensor of the present invention. And can be visualized. In addition, by using the molecular sensor of the present invention, the effects of agonists and antagonists on cells can be easily and visualized and measured. It provides possible technologies. Furthermore, the present invention 3 In addition, it provides a general design concept for the construction of tailor-made artificial receptors and molecular sensors for in vivo second messengers.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 schematically shows an example of the structure of a peptide of a molecular sensor of the present invention. 1 (a) is a sequence of a PLCδPH domain without a signal peptide, FIG. 1 (b) is a sequence in which a Tat peptide is fused to the N-terminus, FIG. 1 (c) is a sequence in which an R7 peptide is fused to the C-terminus, FIG. 1 (d) shows a sequence obtained by fusing the R9 peptide to the C-terminus. The asterisk in FIG. 1 indicates that the 106th asparagine was mutated to cysteine.
FIG. 2 shows the in vitro IP of R9C-DAN106 of the present invention. 3 The result of the fluorescence change accompanying addition (0-50 μM) is shown. The horizontal axis in FIG. 2 shows the fluorescence wavelength, and the vertical axis shows the fluorescence intensity. The thick solid black line at the top of FIG. 3 Is 0 μM), and the IP becomes lower toward the bottom. 3 Indicates the case where the density of the final density (IP) is large. 3 Is 50 μM).
The upper right graph in FIG. 3 It is a plot of the change rate of fluorescence intensity (ΔF) at 500 nm against the concentration. The horizontal axis of the graph is IP 3 , And the vertical axis indicates the fluorescence intensity change rate (ΔF).
FIG. 3 is a photograph instead of a drawing, showing the results of treating HEK cells with 1 μM R9C-DAN106 of the present invention and measuring with a CCD camera. Figure 3a shows a transmitted light image of HEK cells incubated for 1 hour in HBS buffer, Figure 3b shows a fluorescent image of HEK cells incubated for 1 hour in HBS buffer, and Figure 3c incubated 1 hour of 1 M R9C-DAN106. FIG. 3d shows a fluorescence image of the HEK cells in which 1 μM R9C-DAN106 was incubated for 1 hour.
FIG. 4 is a photograph instead of a drawing, showing the result of treating HEK cells with R9C-DAN106 of the present invention for 15 minutes and measuring with a CCD camera. FIG. 4a shows a transmitted light image of HEK cells incubated with 1 μM R9C-DAN106 at room temperature for 15 minutes, and FIG. 4b shows a fluorescence image of HEK cells incubated with 1 μM R9C-DAN106 at room temperature for 15 minutes.
FIG. 5 shows the results of fluorescence change measurement when agonist stimulation was performed on HEK cells into which R9C-DAN106 of the present invention had been introduced. The horizontal axis in FIG. 5 shows time (seconds), the vertical axis in FIG. 5a shows the ratio of the change in fluorescence intensity of calcium concentration due to Fura-2, and the vertical axis in FIG. 5b shows the relative fluorescence intensity due to R9C-DAN106. FIG. 5a shows the change in calcium concentration due to Fura-2, in HBS buffer until 0-5 minutes (300 seconds), and 5 minutes-10 minutes when 30 mM carbachol was added. FIG. 5b shows the change in fluorescence due to R9C-DAN106, 0-5 minutes (300 seconds) in HBS buffer, 5 minutes-10 minutes (600 seconds) when 30 μM carbachol was added, and 10 minutes-20 minutes. The minutes are the results when the HBS buffer was used again.
FIG. 6 is a photograph instead of a drawing, showing the results of fluorescence change measurement when agonist stimulation was performed on CHO cells and DT40 cells into which R9C-DAN106 of the present invention had been introduced. FIG. 6A is a fluorescence image photograph instead of a drawing of CHO cells (a) and DT40 cells (b) in which 1 μM R9C-DAN106 containing 1% F-127 was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The horizontal axis in FIG. 6B indicates time (minutes), and the vertical axis indicates the relative ratio. FIG. 6B (a) shows the change in calcium concentration due to Fura-2 in 100 μM ATP stimulation in CHO cells as a ratio (top), and the change in fluorescence due to R9C-DAN106 as a relative fluorescence intensity (bottom). ). 0-2 min is HBS buffer, 2-3 min is 100 μM ATP, 3-10 min is HBS buffer, 10-11.5 min is 100 μM ATP, 11.5-15 min is HBS buffer, 15 min. Treated with 100 μM ATP for -17 minutes and HBS buffer for 17-20 minutes. FIG. 6B (b) shows the change in the calcium concentration due to Fura-2 by stimulating 1 mg / ml M4 in DT40 cells as a ratio (top), and the change in the fluorescence due to R9C-DAN106 as a relative fluorescence intensity. (Below). 0-2 minutes were treated with HBS buffer, 2-3.5 minutes with 1 mg / ml M4, and 3-6 minutes with HBS buffer.
FIG. 7 shows the results of changes in the fluorescence intensity of R9C-DAN106 of the present invention caused by ATP stimulation in CHO cells treated with an inhibitor. The horizontal axis in FIG. 7 indicates the incubation time (minutes), and the vertical axis indicates the relative fluorescence intensity. 7A shows the control, C shows the case where 1 μM U73343 was added, and B shows the case where 1 μM U73122 was added. The stimulus applied to each cell culture system is indicated by an arrow.
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