JP2004049079A

JP2004049079A - Ultramicronized chlorella preparation

Info

Publication number: JP2004049079A
Application number: JP2002209482A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Yamaguchi; 山口　宣夫; Hisako Izumi; 泉　久子
Original assignee: CHLORELLAS SUPPLY KK; ISHIKAWA TENNEN YAKKO BUSSHITS; ISHIKAWA TENNEN YAKKO BUSSHITSU KENKYU CENTER
Current assignee: CHLORELLAS SUPPLY KK; ISHIKAWA TENNEN YAKKO BUSSHITS; ISHIKAWA TENNEN YAKKO BUSSHITSU KENKYU CENTER
Priority date: 2002-07-18
Filing date: 2002-07-18
Publication date: 2004-02-19

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a medicine composition having increased function of chlorella by producing ultramicronized chlorella having high digestibility and absorptivity and a functional product. <P>SOLUTION: The method for producing chlorella comprises (a) a process for grinding chlorella cells, (b) a process for stirring the ground chlorella cells with spraying a solvent on the ground chlorella and (c) a process for heating the chlorella. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウルトラミクロ化クロレラ及びその製造方法、並びにウルトラミクロ化クロレラを含む医薬組成物及び機能性製品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クロレラは、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に分類される直径５〜２０μｍの球形又は楕円形の淡水性単細胞緑藻類であり（海水性変異株を含む）、亜熱帯地域から熱帯地域の湖沼に広く分布する。その藻体中には良質のタンパク質や必須アミノ酸、ビタミン類、ミネラル類がバランスよく豊富に含まれており、健康食品、食品素材及び養殖魚等愛玩動物の飼料素材等として用いられている。また、クロレラは細胞分裂時間が短く、それ故増殖速度が速く、生産性が高いという利点があり、短時間で多量の人工的培養を行うことが可能である。従って、第２次大戦後の食料難の時代には食用として供する計画が多く立案された。
しかし、試験的に食料として利用を試みたときに、クロレラ製剤は体内において消化し難いことが判明した。そこで栄養補給要素として最も重要な「消化率」及び「吸収率」とその「生体への影響」の問題を克服する必要が生じた。
【０００３】
従来は、クロレラの消化率を高めるために易消化性のクロレラ変異株が分離されたり、漂白処理や酵素処理によって、細胞膜を変性させ、消化率を高める様、試みられてきた。しかし、これらは全て、細胞質内成分（核酸とタンパク質が主成分）そのものを変性させる帰結を齎し、発想を変えた対応が求められていた。この様な背景の下、近年、微粉砕クロレラがダイノーミル製法を利用した高速回転法により製造されている（特公昭５５−３２３５１号公報及び特公平６−９４９０号公報）。この製造方法は、クロレラを液状のクロレラスラリーとし、ダイノーミル等を用いてクロレラの細胞自体を細胞下物質に破砕することを特徴とするが、クロレラを液状にする手間がかかるという製造過程の困難性や細胞内タンパク質の変性等による機能の低減が課題として残っていた。また、２〜１０ミクロンの微細クロレラ粉末を含むクロレラ飲料用粉末が報告されているが（特開２０００１−２９２７５１号公報）、ミクロン単位のクロレラでは、体内における消化率や生理活性は、例えば免疫担当細胞の一部の変動のみしか観察されず、複雑なネットワークから成る免疫反応全体の機能を高めるためには十分なものではなかった。さらに、クロレラの乾燥原末をボールミルで処理して得られる細胞壁破砕クロレラは、消化率が高まることは示されているものの、易熱性成分の変性（タンパク質変性）という点で、クロレラの機能は低減している可能性が高い（特開２００２−６５２２６号公報）。
従って、クロレラの有する生理活性機能を変性又は低減させることなく生体内吸収率の高いクロレラを製造することが望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、消化率及び吸収率の高いウルトラミクロ化クロレラを製造し、クロレラの機能を高めた医薬組成物及び機能性製品を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、クロレラ細胞を粉砕工程、加湿工程及び加熱工程に付すことにより得られるウルトラミクロ化クロレラが約０．５〜０．７ミクロンのサイズを有し、またこのウルトラミクロ化クロレラが、既存のクロレラ製剤に比べて極めて優れた生理活性機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、ウルトラミクロ化クロレラの製造方法である。
（ａ）クロレラ細胞を粉砕する工程、
（ｂ）上記粉砕したクロレラに溶剤を噴霧しながら撹拌する工程、及び
（ｃ）上記クロレラを加熱する工程
上記ウルトラミクロ化クロレラの製造方法において、工程（ｃ）の加熱は、遠赤外線により行うことが好ましい。
また本発明は、平均サイズ０．１ミクロン以上１．０ミクロン未満のウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物である。
【０００７】
上記医薬組成物において、ウルトラミクロ化クロレラは、上記ウルトラミクロ化クロレラの製造方法により製造されたものが好ましい。
さらに上記医薬組成物は、免疫増強剤、抗体産生増強剤、抗酸化剤、又は免疫担当細胞増加剤として使用することができる。
上記医薬組成物を免疫担当細胞増加剤として使用する場合、免疫担当細胞は、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１９陽性細胞及びＮＫ細胞、インターロイキン−４保持細胞、並びにインターフェロン−γ保持細胞からなる群より選択される１種以上のものである。
【０００８】
本発明はまた、平均サイズ０．１ミクロン以上１．０ミクロン未満のウルトラミクロ化クロレラを含むことを特徴とする機能性製品である。
上記機能性製品において、ウルトラミクロ化クロレラは、上記ウルトラミクロ化クロレラの製造方法により製造されたものが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るウルトラミクロ化クロレラの製造方法（以下、「本製法」という）は、粉砕工程、加湿工程及び加熱工程を含むものであり、クロレラの有する機能を低減させることなく消化率及び吸収率の高いウルトラミクロ化クロレラを製造することができる。従って、本製法により得られるウルトラミクロ化クロレラは、高効率で消化されて体内に吸収されるため、クロレラの有する生理活性機能がより高く発揮される。
【００１０】
１．クロレラ細胞の調製
本発明において使用するクロレラは、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に属する緑藻類であれば任意のものを選択することができ、特定の種に限定されるものではない。本発明においては、入手が容易で安全性に優れている点で、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｕｇａｒｉｓ）、クロレラ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・エリプソリディア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）等を使用することができる。より具体的には、台湾緑藻工業有限公司で培養されたクロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）などが挙げられる。
【００１１】
上記クロレラは、独立的培養法又は従属的培養法等の任意の培養法により培養し、増殖させることができる。独立的培養法とは、無機金属塩及び窒素源を加えた培地にクロレラを接種し、光照射下に炭酸ガスを含む空気を吹き込んで光合成を行わせて培養する方法であり、従属的培養法とは、炭素源としてグルコースや酢酸を含む培地中で培養する方法である。
【００１２】
独立的培養法において、培地に加える無機塩としてはＫＨ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４などの微量無機成分が挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素等が挙げられる。光源には、太陽光のほか植物栽培用ランプ等の人工光源を用いることができる。独立的培養法の培養条件は、当業者であれば適切なものを選択することが可能である。例えば、培養条件は、約２０〜２５℃において、３６〜９６時間である。
【００１３】
一方、従属的培養法は、培養タンクを用いて無菌的に行うことが望ましい。培地には、炭素源としてグルコースや酢酸を含有させ、また独立的培養法と同様に、微量無機成分及び窒素源を添加したものが用いられる。培養の際には、通気して炭酸ガスの補給と撹拌を行う。これらの培養は、露天培養でもよく、タンク内閉鎖培養でもよい。従属的培養法の培養条件もまた、当業者であれば適切なものを選択することができる。例えば、培養条件は、約２０〜２５℃において、４８〜９６時間である。
上記培養した後のクロレラ細胞を純水にて遠心洗浄し（例えば１０００ｒｐｍ，　１０分）、細胞浮遊液を得る。浮遊液の濃度は、１×１０^８細胞／ｍｌ以下が好ましく、１×１０^６〜１×１０^７細胞／ｍｌがさらに好ましい。
【００１４】
２．ウルトラミクロ化クロレラの製造
本製法においては、上記「１．クロレラ細胞の調製」の項に従って得られたクロレラ細胞を、粉砕工程、加湿工程及び加熱工程に付し、ウルトラミクロ化クロレラを製造する。本発明において「ウルトラミクロ化クロレラ」とは、平均約０．１ミクロン以上約１．０ミクロン未満、好ましくは平均０．５〜０．７ミクロンのサイズのクロレラを含むものである。
【００１５】
（１）クロレラ細胞の粉砕・微粉末化
上記「１．クロレラ細胞の調製」の項に従って得られたクロレラ細胞を、ボールミルにかけて粉砕する。このボールミルは、例えば、モータを駆動源として回転可能に設けられた回転体に、複数の筒体を配設したものであり、それぞれの筒体内部には、セラミックボールが多数収容されている。そして、筒体の内部にクロレラ細胞を入れ、これを回転体内にセットしてモータを作動し、回転する筒体内部のセラミックボールによって、クロレラ細胞を粉砕する。この工程において、クロレラ細胞は、高圧蒸気下又は平圧下にて処理することが好ましい。
粉砕されたクロレラは、その後、フライホイール式のふるい機にかけられ、０．１〜１．０ミクロン、好ましくは０．５〜０．７ミクロン以下のウルトラミクロ化クロレラのみが選別される。
【００１６】
（２）ウルトラミクロ化クロレラの加湿
上記（１）において得られたクロレラの水分は、約５〜１０％である。このクロレラを上部が開口した平型の箱に入れる。そして、箱内のクロレラの上に溶剤を噴霧して攪拌することにより、約１５〜３０％程度の水分を有するように加湿する。加湿工程において用いる溶剤としては、限定されるものではないが、蒸留水、逆浸透水などが挙げられる。
【００１７】
（３）ウルトラミクロ化クロレラの加熱
続いて、（２）で加湿したクロレラを加熱する。加熱は、例えば遠赤外線を用いて行うことができる。加熱は、約４０〜７０℃、好ましくは６０℃において、約１〜２時間、好ましくは１時間行う。
【００１８】
本製法により得られるウルトラミクロ化クロレラは、平均サイズが約０．１〜１．０ミクロン、好ましくは図１に示すように０．５〜０．７ミクロンである。このような１ミクロン未満のサイズのクロレラは、消化率及び吸収率が高いため、クロレラの有する機能が高く発揮されることになる。また本製法は、クロレラの有する機能を損なうことがないため、ウルトラミクロ化クロレラを得るために非常に有用である。
【００１９】
３．ウルトラミクロ化クロレラを含む医薬組成物
１ミクロン未満のサイズのウルトラミクロ化クロレラは、上述したように、消化率及び吸収率が高く、クロレラが有する機能が高く発揮される。従って、ウルトラミクロ化クロレラを含む医薬組成物は、従来のクロレラを含む医薬組成物よりも高い効果を示すことになる。本発明において、医薬組成物に配合するウルトラミクロ化クロレラは、白血球の量的又は質的調節能、免疫担当細胞群の量的又は質的調節能などのクロレラが有する複数の機能を損なわないという点で、上述したウルトラミクロ化クロレラの製造方法により製造されたものが好ましい。
【００２０】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例としては、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、医薬組成物の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００２１】
本発明に係る医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる。
上記組成物を経口的に投与する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等としてウルトラミクロ化クロレラを製剤化すればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位投与剤形としてもよいし、また液体製剤の場合には使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【００２２】
上記剤形のうち経口用固形製剤は、通常それらの組成物中に薬学上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有する。また、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に薬学上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有する。
【００２３】
本発明に係る医薬組成物を非経口的に投与する場合は、注射剤又は坐剤等とすることができる。例えば注射剤は、ウルトラミクロ化クロレラを溶液、懸濁液、乳液などに溶解又は懸濁して調製されるものであり、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の形態で提供される。また注射剤は、使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌水に再溶解させる粉剤であってもよい。注射手法としては、例えば点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射が挙げられる。これらの非経口投与剤形は、通常それらの組成物中に薬学上一般的に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。
上記組成物に配合するウルトラミクロ化クロレラは、その用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えば、総重量を基準として１〜６０重量％、好ましくは３〜１０重量％である。
【００２４】
また、その投与量は、投与対象の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。例えば、ウルトラミクロ化クロレラと適切な希釈剤及び薬学的に使用しうる担体との組み合わせとして投与される有効量は、経口的に投与する場合には、１日につき体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇであり、１時間から２日の間隔で投与される。
【００２５】
本発明に係る医薬組成物を投与する対象としては、限定するものではないが、ヒト、家畜、愛玩動物、実験動物でありうる。
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含有する医薬組成物は、クロレラの機能（例えば限定するものではないが、免疫増強能、抗体産生増強能、抗酸化能、免疫担当細胞増加能など）を高く示すため、免疫増強剤、抗体産生増強剤、抗酸化剤、免疫担当細胞増加剤などとして用いることができる。
【００２６】
本発明において、「免疫増強能」とは、白血球（顆粒球やリンパ球）の量的及び質的増強、並びにＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの量的及び質的増強を意味し、特に過労等に起因する後天的免疫不全状態の宿主に対して白血球を主体とする造血促進活性、抗体産生細胞増加活性、感染防御活性、抗酸化能力に由来する諸種の生理活性等を増強することが含まれる。従って、本発明における免疫増強能としては、赤血球、白血球、例えば顆粒球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、好中球、好塩基球、好酸球等、大食細胞などを量的及び質的に増強すること、並びにマクロファージの遊走活性、各種サイトカイン（例えばインターロイキン（ＩＬ−１，ＩＦＮ−γ等））の産生、細菌の増殖抑制活性、抗体産生前駆細胞（Ｂ細胞等）の増殖、及び抗体の産生活性を増強することなどが挙げられる。
【００２７】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物を、造血促進を目的とした免疫増強剤として使用する場合は、造血促進の対象は特に限定されるものではない。例えば、赤血球、白血球、白血球の亜群であるリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、大食細胞等の造血細胞などを増殖促進の対象とすることができる。従って、例えば、再生不良性貧血、白血病（例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病等）、骨髄異形成症候群などの少なくとも一種の血液疾患、後天性免疫不全症候群又は慢性疲労症候群などの治療又は予防（血球の量的若しくは質的回復）を目的として、あるいは外科的手術後、化学療法後又は骨髄移植後の白血球減少症又は後天的免疫不全症についての血球回復を目的として、本発明に係る医薬組成物を用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、上記複数の疾患を併発したものであっても、上記以外の他の疾患を併発したものであってもよい。さらに、本発明に係る医薬組成物を造血を目的とした免疫増強剤として使用する場合は、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、血小板増殖因子などの造血因子又はサイトカインと併用することも可能である。
【００２８】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物を、種々の感染症に対する予防又は治療を目的とした免疫増強剤として使用する場合は、例えば、細胞内寄生性微生物感染症、細胞外寄生性微生物感染症、外毒素性感染症などにおける外敵処理と回復を目的として使用される。
【００２９】
本発明において、「抗体産生増強能」とは、体液性免疫の本体である抗体を産生する形質細胞の量的及び質的増強を意味し、特に過労等に起因する後天的免疫不全状態の宿主における抗体産生形質細胞の増強、体液性免疫による感染防御活性の増強、その他、抗体が関係する生理活性の増強等が含まれる。従って、本発明における抗体産生増強能としては、ＣＤ１９陽性の抗体産生前駆細胞（Ｂ細胞等）の増殖、及びＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ等の抗体の産生活性を増強することなどが挙げられる。
【００３０】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物を、抗体産生増強剤として使用する場合は、例えば糖尿病患者に見られる後天的免疫不全状態、赤痢菌、チフス菌、ブドウ球菌や連鎖球菌などの細胞外寄生菌に対する抵抗力が減少した場合に投与される。
【００３１】
本発明において、「抗酸化能」とは、過剰な活性酸素の作用を消去又は低減させる能力を指し、特に感染性病原体の侵入が無い状況において、食細胞を主体とする異物処理細胞内の活性酸素量を調節する活性を意味する。活性酸素は、強い殺菌作用を示すことが知られており、生体防御、特に食細胞が関与する防御に必要なものであるが、それが過剰に産生されると、生体の正常な細胞に対して有害な影響を与えることが示唆されている。そのため、本発明においては、この過剰な活性酸素量を調節することを目的とする。従って、本発明における抗酸化能としては、好中球、大食細胞やその他の食細胞内の活性酸素の量的及び質的調節などが挙げられる。活性酸素量の調節は、白血球、特に食細胞の細胞質内のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を量的及び質的に増強するクロレラの機能により行う。
【００３２】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物を、抗酸化剤として使用する場合は、循環器系機能の改善、動脈硬化の阻止、各種癌の予防、あるいはＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ）の向上、寿命の延長などを目的として投与することが可能である。
【００３３】
本発明において、「免疫担当細胞増強能」とは、リンパ球の亜群であるＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの量的及び質的増強を意味し、特に過労等に起因する後天的免疫不全状態の宿主に対してリンパ球を主体とする免疫反応遂行活性の増強、抗体産生細胞増加活性、感染防御活性の増強、免疫反応が関与する生理活性の増強が含まれる。従って、本発明における免疫担当細胞増強能としては、リンパ球亜群、すなわちＴ細胞のグループ（ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞）、Ｂ細胞のグループ（ＣＤ１９陽性細胞）、ＮＫ細胞のグループ（ＣＤ１６及びＣＤ５６陽性細胞）、大食細胞のグループ（ＣＤ１１陽性細胞）などを量的及び質的に増強すること、並びに、細胞性免疫及び体液性免疫の関わる各種サイトカイン（例えばインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−９等）の産生活性を増強することなどが挙げられる。
【００３４】
ウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物を、免疫担当細胞増強剤として使用する場合は、強度のストレス若しくは過度のダイエット、又は癌化学療法剤の投与による免疫不全状態の改善、それに、末梢血中の顆粒球過多又はリンパ球過多の個体を正常化することを目的として投与することが可能である。
【００３５】
４．機能性製品
またウルトラミクロ化クロレラは、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品、飼料又は化粧品等の機能性製品に配合されてもよい。従って、ウルトラミクロ化クロレラが配合された食品及び飼料は、抗酸化作用の誘導、健常人の疲労回復、顆粒球及びリンパ球の量的、質的調節などのための健康補助用機能性食品として有用である。またウルトラミクロ化クロレラが配合された化粧品は、その抗酸化能のため、色素沈着阻止・軽減剤として有用である。
【００３６】
ウルトラミクロ化クロレラを配合する食品としては、米飯類、菓子類、麺類、カマボコ・チクワ等の水産練り製品、ハム・ソーセージ等の畜肉加工品、清涼飲料・果実飲料等の飲料類、マヨネーズ・ドレッシング・味付け調味液等の調味料等が挙げられるが、これらに限定されない。食品へのウルトラミクロ化クロレラの配合は、例えば混合、浸漬、塗布、噴霧等の方法で行うことができる。これらの食品には、通常の食品に使用される着色料、香料、甘味料、酸味料等を適宜配合してもよい。食品に配合するウルトラミクロ化クロレラの量は、例えば１〜５００ｇ／ｋｇであり、好ましくは５０ｇ／ｋｇである。
【００３７】
ウルトラミクロ化クロレラを配合する飼料としては、家畜・家禽・魚類用の粉状、練り製品状又はペレット状の飼料等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの飼料には、通常の飼料に使用される着色料、香料等を適宜配合してもよい。飼料に配合するウルトラミクロ化クロレラの量は、例えば２０〜１００ｇ／ｋｇであり、好ましくは５０ｇ／ｋｇである。
【００３８】
また、ウルトラミクロ化クロレラを配合する化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション等を挙げることができる。これらの化粧品には、通常の化粧品に使用される界面活性剤、保湿剤、美白剤、紫外線吸収剤、香料、防腐剤等を適宜配合してもよい。化粧品に配合するウルトラミクロ化クロレラの量は、例えば２０〜１００ｇ／ｌであり、好ましくは５０ｇ／ｌである。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕ウルトラミクロ化クロレラの製造
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　Ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）をデトマー培地及びＭｙｅｒｓ−Ｎ培地で選択的に増殖させた後、２５℃で露天培養した。培養後のクロレラ細胞を純水にて遠心洗浄し（１０００ｒｐｍ，　１０分）、細胞浮遊液を得た。浮遊液の濃度は１×１０^８個／ｍｌとした。
平均サイズが１ミクロン未満となるよう細断処理を行い、ウルトラミクロ化クロレラを得た。これを乾燥して粉末化した。
【００４０】
得られたウルトラミクロ化クロレラの走査型顕微鏡写真を図１に示す。図１Ａは、×５００において観察した乾燥正常クロレラを示す。また図１Ｂは、×５００において観察したウルトラミクロ化クロレラを示す。乾燥正常クロレラのサイズはほぼ２０〜１２０ミクロンであるのに対し、本実施例で調製したウルトラミクロ化クロレラのサイズは、ほぼ０．５〜０．７ミクロンサイズであり、それらが集合していることが観察される。
また、得られたウルトラミクロ化クロレラの一部の粉末を打錠化し、経口投与用の製剤とした。
【００４１】
〔参考例〕化学療法剤の用量設定
ウルトラミクロ化クロレラの薬理効果を試験するにあたり、化学療法剤（マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）：協和発酵社製）を用いて試験動物を免疫抑制状態にさせることとした。この場合、ＭＭＣの投与量を決定するため、ＭＭＣの用量設定に関する予備実験を行った。
実験動物として純系の清浄飼育マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系）を使用した。
【００４２】
Ｃ５７ＢＬ／６の雌性マウス、生後８週令を４群設定した。各群は７匹から構成された。群設定は以下の通りである。
（Ａ）　ＭＭＣ無投与正常群
（Ｂ）　ＭＭＣ　０．０８ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与された群
（Ｃ）　ＭＭＣを０．５ｍｇ／ｋｇ投与された群
（Ｄ）　ＭＭＣを３ｍｇ／ｋｇ投与された群
ＭＭＣ投与後３日目に脾臓を摘出し、単核遊離白血球を調製した。脾重量で補正を行った後、生理食塩水に浮遊させ、１ｍｌ当りの白血球数を算出した。
その結果、脾細胞は癌化学療法剤の用量依存的に減少を示した（図２Ｂ）。
【００４３】
また、３ｍｇ／ｋｇのＭＭＣを投与された群では、抗体産生細胞（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ；ＰＦＣ）が正常群の５１％を示し、有意に減少した（図２Ａ）。
以上のことより、薬理効果試験に用いるＭＭＣの投与量は、正常値の３３％を示す３ｍｇ／ｋｇとした。
【００４４】
〔実施例２〕薬理効果試験−１
Ｃ５７ＢＬ／６系雌性マウス（生後８週令）を清浄環境下（ＳＰＦ条件）で飼育した。
マウスは、実施例１で製造したウルトラミクロ化クロレラを投与する前に、癌細胞（赤白血病癌、株名：ＥＬ−４）の移植を行ない（５×１０^４個／ｍｌ）、１４〜２１日飼育して担癌状態とした。
【００４５】
次に、ＭＭＣを注射し、後天的免疫不全モデルを作製した。マウスは１群１０匹とし、以下の７群を設定した。
（Ａ）　ＭＭＣ無投与正常群（癌細胞を投与しない群）
（Ｂ）　ＭＭＣ群：ＭＭＣを３ｍｇ／ｋｇの濃度で皮下注射した群
（Ｃ）　ＭＭＣ注射直後より毎日ウルトラミクロ化クロレラクロレラを２ｇ与えた群
（Ｄ）　ＭＭＣ注射後、細胞膜破砕クロレラＡを毎日２ｇ与えた群
（Ｅ）　ＭＭＣ注射後、細胞膜破砕クロレラＢを毎日２与えた群
（Ｆ）　ＭＭＣ注射後、十全大補湯を５００ｍｇ／ｋｇ与えた群
なお、十全大補湯は造血作用及び疲労回復を示す漢方薬として知られているものである。また、上記（Ｄ）及び（Ｅ）群に使用した細胞膜破砕クロレラＡ及び細胞膜破砕クロレラＢは、それぞれ、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）とクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｌｉｓ）の従来の細胞膜破砕サンプルである。
各試料投与後７日目に脾臓を摘出し、単核白血球を調製し、脾臓重量で補正した後、単位体積当りの白血球数（脾細胞数）を測定した。
【００４６】
その結果を、図３に示す。（Ｂ）のＭＭＣ群では、脾細胞は正常群（１００％）と比較して低下した（６３％）が、ウルトラミクロ化クロレラを併用投与（Ｃ群）すると１３６％に回復した（図３）。ウルトラミクロ化クロレラ（Ｃ群）は、既知の造血作用を示す十全大補湯（Ｆ群；８６％に回復）より優れた作用を示した。細胞膜破砕クロレラ製剤は、Ｄ群で７２％、Ｅ群で７７％であり、いずれもＣ群よりも劣っていた。
【００４７】
〔実施例３〕薬理効果試験−２
実施例２において設定した群と同様の群を設定し、各群のマウスに対し、ＭＭＣ注射の１日後に、抗原として綿羊赤血球２×１０^８個／０．２ｍｌを腹腔より接種した。その５日後に脾臓を摘出し、単一細胞とした。細胞浮遊液を二分し、一方はＪｅｒｎｅ法に準拠して、溶血斑形成細胞を検出して、抗体産生細胞数を評価した。
【００４８】
結果を図４に示す。抗体産生細胞は、癌化学療法剤　ＭＭＣ投与群において抑制的値を示した（正常群（Ａ）１１６３×１０^６個に対し、ＭＭＣ群（Ｂ）４８３×１０^６個）。しかし、ＭＭＣの注射後、ウルトラミクロ化クロレラを抗与された群（Ｃ群；１５６２×１０^６個）は、細胞膜破砕クロレラＡ及びＢ（それぞれＤ群及びＥ群；４６３×１０^６個及び８８３×１０^６個）、並びに十全大補湯（Ｆ群；８９２×１０^６個）より有意な抗体産生細胞数の増加を示した。
【００４９】
〔実施例４〕薬理効果試験−３
実施例２において設定した群と同様の群を設定し、各群のマウスに対し、ＭＭＣ注射の１日後に、抗原として綿羊赤血球２×１０^８個／０．２ｍｌを腹腔より接種した。各グループは試験開始前と安楽死前の時点で体重を測定した。
【００５０】
結果を図５に示す。測定した群の中で、癌化学療法剤ＭＭＣ投与群は体重も減少的な傾向を示した（正常群（Ａ）２３．６ｇに対し、ＭＭＣ群（Ｂ）１９．３ｇ）。しかし、ＭＭＣ注射後ウルトラミクロ化クロレラを与えられた群（Ｃ群；２４．３ｇ）は、細胞膜破砕クロレラＡ及びＢ（それぞれＤ群及びＥ群；１８．０ｇ及び２１．０ｇ）、並びに十全大補湯（Ｆ群；２３．６ｇ）と比較して体重の回復を示した。
【００５１】
〔実施例５〕薬理効果試験−４
実施例２において設定した群と同様の群を設定し、各群のマウスに対し、ＭＭＣ注射の１日後に、抗原として綿羊赤血球２×１０^８個／０．２ｍｌを腹腔より接種した。その５日後に脾臓を摘出し、単一細胞とした。細胞浮遊液を二分し、一方はＪｅｒｎｅ法に準拠して、溶血斑形成細胞を検出して、抗体産生細胞を評価した。他の一群は、各リンパ球亜群を検出するための試薬（各リンパ球亜群に対するモノクローナル抗体と蛍光色素を結合させたもの、べクトン−ディッキンソン社製；ＵＳＡ）を用いて、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ５６陽性細胞、並びにＮＫ細胞、インターフェロンγ保持細胞、及びＩＬ−４保持細胞をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ、べクトレーディッキンソン社製；ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００５２】
結果を図６に示す。図６において棒グラフは、左より順に、正常群（ドット）、ＭＭＣ投与群（斜線）、ウルトラミクロ化クロレラ投与群（白抜）、細胞膜破砕クロレラＡ投与群（横線）、細胞膜破砕クロレラＢ投与群（網掛け）、及び十全大補湯投与群（縦線）を表す。測定したリンパ球亜群の中でＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１及びＣＤ１９陽性のＢ細胞に対して、癌化学療法剤ＭＭＣ投与群は抑制的に作用した。ウルトラミクロ化クロレラを抗与された群は、これらのＢ細胞の回復を顕著に示した。
【００５３】
〔実施例６〕薬理効果試験−５
実施例２において設定した群と同様の群を設定し、各群のマウスに対し、ＭＭＣを注射した。ＭＭＣ投与の２４時間後に、グリコーゲンオイスター水溶液２ｍｌを腹腔内注射した。その３日後に、頚椎脱臼して安楽死させたマウスより腹腔滲出細胞を回収し、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して２回洗浄した。ＨＥＰＥＳバッファー中に１×１０^６細胞／ｍｌとなるように細胞浮遊液を調製した後、ｃｙｔ−Ｃ　１００μｌ及びＰＭＡ　１０μｌを加えて３７℃の恒温槽にて軽く振盪させながら２０分間培養した。培養後直ちに氷中につけて反応を停止させ、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。上清の吸光度を５５０ｎｍ及び５４０ｎｍにて測定し、生体内細胞において生成された活性酸素量を算出した。活性酸素量の測定は、オイスターグリコーゲンによる刺激から３日後に行った。
【００５４】
マウスの腹腔滲出好中球により産出された活性酸素量を表１に示す。その結果、表１に示すように、ウルトラミクロ化クロレラを投与された群は他の群に比べ、活性酸素の発生量が少なく、生体内細胞に対して抗酸化作用を発揮していることがわかる。
【００５５】
【表１】

【００５６】
【発明の効果】
本発明により、平均サイズ０．１ミクロン以上１．０ミクロン未満のウルトラミクロ化クロレラを有効成分として含む医薬組成物、及びウルトラミクロ化クロレラの製造方法が提供される。本発明のウルトラミクロ化クロレラは、従来のクロレラ製剤に比べて極めて優れた効果、例えば免疫増強効果、抗体生産増強効果、抗酸化効果、免疫細胞増加効果などを有するため、医薬組成物及び機能性製品として使用するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】乾燥正常クロレラ（Ａ）とウルトラミクロ化クロレラ（Ｂ）の走査型顕微鏡写真を示す図である。
【図２】化学療法剤（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ）のマウス抗体産生細胞（Ａ）とマウス脾細胞（Ｂ）に対する影響を示す図である。
【図３】化学療法剤注射後のマウス脾細胞数を示す図である。
【図４】化学療法注射後のマウス脾細胞中の抗体産生能力を示す図である。
【図５】化学療法注射後のマウス体重変動を示す図である。
【図６】ＦＡＣＳにより測定したサイトカイン保持細胞の検出結果を示す図である。棒グラフは、左より順に、正常群（ドット）、ＭＭＣ投与群（斜線）、ウルトラミクロ化クロレラ投与群（白抜）、細胞膜破砕クロレラＡ投与群（横線）、細胞膜破砕クロレラＢ投与群（網掛け）、及び十全大補湯投与群（縦線）を表す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an ultramicronized chlorella and a method for producing the same, and a pharmaceutical composition and a functional product containing the ultramicronized chlorella.
[0002]
[Prior art]
Chlorella is a spherical or elliptical freshwater unicellular green algae (including marine mutants) with a diameter of 5 to 20 μm classified into the genus Chlorella, and is widely distributed in subtropical to tropical lakes. The alga body contains high-quality proteins, essential amino acids, vitamins, and minerals in a well-balanced and abundant manner, and is used as a health food, a food material, and a feed material for pets such as cultured fish. Chlorella also has the advantages of a short cell division time, a high growth rate and a high productivity, and enables a large amount of artificial cultivation in a short time. Therefore, in the food shortage after the Second World War, many plans were made to use it for food.
However, when trially used as food, it was found that chlorella preparations were difficult to digest in the body. Therefore, it has become necessary to overcome the problems of "digestibility" and "absorption rate", which are the most important nutritional factors, and their "effects on living bodies".
[0003]
In the past, attempts have been made to isolate easily digestible chlorella mutants in order to increase the digestibility of chlorella, or to denature the cell membrane by bleaching or enzymatic treatment to increase the digestibility. However, these all have the consequence of denaturing the cytoplasmic components (nucleic acid and protein as main components) themselves, and a response with a different idea has been required. Against this background, recently, finely pulverized chlorella has been manufactured by a high-speed rotation method using a Dynomill manufacturing method (Japanese Patent Publication No. 55-32351 and Japanese Patent Publication No. 6-9490). This production method is characterized in that chlorella is made into a liquid chlorella slurry, and the cells of the chlorella itself are crushed into subcellular substances using a dyno mill or the like. And the reduction of functions due to denaturation of intracellular proteins, etc. remain as an issue. Further, a powder for chlorella beverages containing a fine chlorella powder of 2 to 10 microns has been reported (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-292751). Only a partial variation of the cells was observed, not enough to enhance the function of the overall immune response, consisting of a complex network. Furthermore, although chlorella obtained by treating dried chlorella powder with a ball mill has been shown to increase digestibility, the function of chlorella is reduced in terms of denaturation of heat-labile components (protein denaturation). (See Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-65226).
Therefore, it has been desired to produce chlorella having a high in vivo absorption rate without denaturing or reducing the physiologically active function of chlorella.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to produce an ultramicronized chlorella having a high digestibility and absorption rate, and to provide a pharmaceutical composition and a functional product having enhanced chlorella functions.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor has conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the ultramicronized chlorella obtained by subjecting the chlorella cells to a crushing step, a humidifying step and a heating step is about 0.5 to 0.7 micron. It has been found that this ultramicronized chlorella has an extremely superior bioactive function as compared with existing chlorella preparations, and has completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention is a method for producing ultramicronized chlorella, comprising the following steps.
(A) a step of grinding chlorella cells,
(B) a step of stirring while spraying a solvent on the ground chlorella, and
(C) heating the chlorella
In the method for producing an ultramicronized chlorella, the heating in the step (c) is preferably performed by far infrared rays.
Further, the present invention is a pharmaceutical composition comprising an ultramicronized chlorella having an average size of 0.1 μm or more and less than 1.0 μm as an active ingredient.
[0007]
In the above pharmaceutical composition, the ultramicronized chlorella is preferably produced by the above method for producing an ultramicronized chlorella.
Further, the above pharmaceutical composition can be used as an immunopotentiator, an antibody production enhancer, an antioxidant, or an immunocompetent cell enhancer.
When the above pharmaceutical composition is used as an immunocompetent cell-enhancing agent, the immunocompetent cells include, for example, CD3, CD4, CD8, CD11, CD19-positive cells and NK cells, interleukin-4 retaining cells, and interferon-γ retaining cells. At least one selected from the group consisting of:
[0008]
The present invention is also a functional product comprising ultramicronized chlorella having an average size of 0.1 micron or more and less than 1.0 micron.
In the above-mentioned functional product, the ultramicronized chlorella is preferably produced by the above method for producing an ultramicronized chlorella.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method for producing ultramicronized chlorella according to the present invention (hereinafter, referred to as “the present production method”) includes a pulverizing step, a humidifying step, and a heating step, and the digestion rate and the absorption rate without reducing the functions of the chlorella. Of ultra-micronized chlorella having a high level can be produced. Therefore, the ultramicronized chlorella obtained by the present production method is digested with high efficiency and absorbed into the body, so that the physiologically active function of the chlorella is exhibited more.
[0010]
1. Preparation of Chlorella cells
As the chlorella used in the present invention, any one can be selected as long as it is a green alga belonging to the genus Chlorella, and it is not limited to a specific species. In the present invention, Chlorella vulgaris, Chlorella regularis, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella elios lipoella eliso lipoella lipoella eliso lipoella lipo, and Chlorella pyrenolipo lipoella lipoella lipoella lipo ellipo eliso lipo ellipo eliso lipo ellipso lipo ellipso ) Etc. can be used. More specifically, Chlorella pyrenoidosa cultivated by Taiwan Green Algae Industry Co., Ltd. and the like can be mentioned.
[0011]
Chlorella can be cultured and propagated by any culture method such as an independent culture method or a dependent culture method. The independent culture method is a method in which chlorella is inoculated into a medium containing an inorganic metal salt and a nitrogen source, and photosynthesis is performed by blowing air containing carbon dioxide gas under light irradiation. Is a method of culturing in a medium containing glucose or acetic acid as a carbon source.
[0012]
In the independent culture method, the inorganic salt added to the medium is KH ₂ PO ₄ , MgSO ₄ And a nitrogen source such as ammonium sulfate and urea. As the light source, an artificial light source such as a plant cultivation lamp can be used in addition to sunlight. Those skilled in the art can select appropriate culture conditions for the independent culture method. For example, the culture condition is 36-96 hours at about 20-25 ° C.
[0013]
On the other hand, the dependent culture method is desirably performed aseptically using a culture tank. As the medium, a medium containing glucose or acetic acid as a carbon source and containing trace inorganic components and a nitrogen source as in the independent culture method is used. At the time of culturing, aeration is performed to supply and agitate carbon dioxide gas. These cultures may be open-cell cultures or closed cultures in tanks. Those skilled in the art can also select appropriate culture conditions for the subordinate culture method. For example, the culture condition is 48-96 hours at about 20-25 ° C.
The chlorella cells after the above culture are centrifugally washed with pure water (for example, 1000 rpm, 10 minutes) to obtain a cell suspension. The concentration of the suspension is 1 × 10 ⁸ Cells / ml or less, preferably 1 × 10 ⁶ ~ 1 × 10 ⁷ Cells / ml are more preferred.
[0014]
2. Production of ultra-micro chlorella
In this production method, the chlorella cells obtained in accordance with the above section “1. Preparation of chlorella cells” are subjected to a pulverizing step, a humidifying step and a heating step to produce ultramicronized chlorella. In the present invention, the “ultramicronized chlorella” includes chlorella having a size of about 0.1 micron or more and less than about 1.0 micron on average, preferably 0.5 to 0.7 micron on average.
[0015]
(1) Pulverization and fine powdering of chlorella cells
The chlorella cells obtained according to the above section “1. Preparation of chlorella cells” are ground in a ball mill. In this ball mill, for example, a plurality of cylinders are disposed on a rotating body rotatably provided with a motor as a drive source, and a large number of ceramic balls are accommodated in each of the cylinders. Then, the chlorella cells are put into the inside of the cylinder, set in a rotating body, a motor is operated, and the chlorella cells are crushed by the ceramic balls inside the rotating cylinder. In this step, the chlorella cells are preferably treated under high-pressure steam or normal pressure.
The ground chlorella is then passed through a flywheel sieving machine to sort out only ultramicronized chlorella of 0.1-1.0 micron, preferably 0.5-0.7 micron or less.
[0016]
(2) Humidification of ultramicro chlorella
The water content of the chlorella obtained in the above (1) is about 5 to 10%. Put this chlorella in a flat box with an open top. Then, the solvent is sprayed on the chlorella in the box and stirred to humidify the water so as to have a water content of about 15 to 30%. Examples of the solvent used in the humidification step include, but are not limited to, distilled water and reverse osmosis water.
[0017]
(3) Heating of ultra-micro chlorella
Subsequently, the chlorella moistened in (2) is heated. The heating can be performed using, for example, far infrared rays. Heating is performed at about 40 to 70 ° C, preferably 60 ° C, for about 1 to 2 hours, preferably 1 hour.
[0018]
The ultramicronized chlorella obtained by the present process has an average size of about 0.1 to 1.0 micron, preferably 0.5 to 0.7 micron as shown in FIG. Such a chlorella having a size of less than 1 micron has a high digestibility and an absorptivity, so that the function of the chlorella is exerted at a high level. Further, the present production method is very useful for obtaining ultramicronized chlorella, since the function of chlorella is not impaired.
[0019]
3. Pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella
Ultramicronized chlorella having a size of less than 1 micron has a high digestibility and absorption rate, and exhibits high functions of chlorella, as described above. Therefore, a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella will show higher effects than a pharmaceutical composition containing conventional chlorella. In the present invention, the ultramicronized chlorella to be added to the pharmaceutical composition does not impair the multiple functions of chlorella, such as the ability to regulate leukocytes quantitatively or qualitatively, and the ability to regulate quantitatively or qualitatively the immunocompetent cell group. In this respect, those manufactured by the method for manufacturing ultramicronized chlorella described above are preferable.
[0020]
The pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive. Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum Gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, etc. Other examples include artificial cell structures such as liposomes. The additives to be used are appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form of the pharmaceutical composition.
[0021]
The pharmaceutical composition according to the present invention can be administered orally or parenterally.
When the above composition is to be orally administered, tablets, granules, powders, solid preparations such as pills, or liquid preparations, suspensions, and liquid preparations such as syrups can be formulated as ultramicronized chlorella. Good. In particular, granules and powders may be in unit dosage form as capsules or, in the case of liquid preparations, as dry products to be re-dissolved when used.
[0022]
Of the above dosage forms, oral solid preparations generally contain additives such as binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents, and the like, which are generally used pharmaceutically in their compositions. Oral liquid preparations generally contain additives such as stabilizers, buffers, flavoring agents, preservatives, fragrances, coloring agents and the like generally used in pharmaceutical compositions.
[0023]
When the pharmaceutical composition of the present invention is administered parenterally, it can be prepared as an injection or suppository. For example, an injection is prepared by dissolving or suspending ultramicronized chlorella in a solution, suspension, emulsion, or the like, and is usually provided in the form of a unit-dose ampoule or a multi-dose container. Injectables may also be powders that are redissolved in a suitable carrier, for example, sterile pyrogen-free water when used. Injection techniques include, for example, intravenous infusion, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and intradermal injection. These parenteral dosage forms usually contain additives, such as emulsifiers, suspending agents and the like, which are commonly used in pharmaceutical compositions.
The ultramicronized chlorella to be added to the above composition varies depending on its use, dosage form, administration route and the like, but is, for example, 1 to 60% by weight, preferably 3 to 10% by weight based on the total weight.
[0024]
The dose varies depending on the age and weight of the subject, the route of administration, and the number of administrations, and can be widely changed. For example, an effective amount to be administered as a combination of ultramicronized chlorella with a suitable diluent and a pharmaceutically acceptable carrier is 1 to 100 mg / kg body weight per day when administered orally. It is administered at intervals of 1 hour to 2 days.
[0025]
Subjects to which the pharmaceutical composition according to the present invention is administered include, but are not limited to, humans, domestic animals, pet animals, and experimental animals.
Pharmaceutical compositions containing ultramicronized chlorella as an active ingredient exhibit high chlorella functions (eg, but not limited to, immunopotentiating ability, antibody production enhancing ability, antioxidant ability, immunocompetent cell increasing ability, etc.) Therefore, it can be used as an immune enhancer, an antibody production enhancer, an antioxidant, an immunocompetent cell enhancer and the like.
[0026]
In the present invention, “immune enhancing ability” means quantitative and qualitative enhancement of leukocytes (granulocytes and lymphocytes) and quantitative and qualitative enhancement of T cells, B cells and macrophages, particularly Increasing hematopoietic promoting activity mainly of leukocytes, activity of increasing antibody-producing cells, protective activity against infection, various physiological activities derived from antioxidant ability, etc. against acquired immunodeficient host due to . Therefore, the immunity-enhancing ability in the present invention includes erythrocytes, leukocytes such as granulocytes, lymphocytes (T cells, B cells, NK cells), neutrophils, basophils, eosinophils, and other macrophages. Quantitative and qualitative enhancement, macrophage migration activity, production of various cytokines (eg, interleukins (IL-1, IFN-γ, etc.)), bacterial growth inhibitory activity, antibody-producing precursor cells (B cells, etc.) ) And enhancing antibody production activity.
[0027]
When a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient is used as an immunopotentiator for promoting hematopoiesis, the target for promoting hematopoiesis is not particularly limited. For example, red blood cells, white blood cells, lymphocytes (T cells, B cells, NK cells), which are a subgroup of white blood cells, and hematopoietic cells such as macrophages can be targets for promoting proliferation. Thus, for example, at least one blood disease such as aplastic anemia, leukemia (eg, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, etc.), myelodysplastic syndrome, etc., acquired immunodeficiency Blood cells for the treatment or prevention (quantitative or qualitative recovery of blood cells) for the syndrome or chronic fatigue syndrome, or for leukopenia or acquired immunodeficiency after surgery, chemotherapy or bone marrow transplantation For the purpose of recovery, the pharmaceutical composition according to the present invention can be used. These diseases may be used alone, in combination with a plurality of the above diseases, or in combination with other diseases other than the above. Furthermore, when the pharmaceutical composition according to the present invention is used as an immunopotentiator for hematopoiesis, macrophage colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, granulocyte colony stimulating factor, erythropoietin, platelet growth factor, etc. It can be used in combination with hematopoietic factors or cytokines.
[0028]
When a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient is used as an immunopotentiator for the prevention or treatment of various infectious diseases, for example, intracellular parasitic microorganism infection, extracellular parasitic microorganism It is used for the treatment and recovery of enemies in infectious diseases and exotoxin infections.
[0029]
In the present invention, the term "antibody production enhancing ability" refers to the quantitative and qualitative enhancement of plasma cells that produce antibodies that are the main body of humoral immunity, and particularly to a host in an acquired immunodeficiency state caused by overwork and the like. And enhancement of infection-protecting activity by humoral immunity, as well as enhancement of antibody-related physiological activities. Therefore, the ability to enhance antibody production in the present invention includes, for example, proliferation of CD19-positive antibody-producing precursor cells (B cells and the like) and enhancement of the activity of producing antibodies such as IgM, IgG, and IgA.
[0030]
When a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient is used as an antibody production enhancer, acquired immunodeficiency states found in, for example, diabetic patients, Shigella, Typhus, Staphylococcus and streptococci, etc. Administered when resistance to ectoparasites decreases.
[0031]
In the present invention, "antioxidant ability" refers to the ability to eliminate or reduce the action of excess reactive oxygen, and particularly in situations where there is no invasion of infectious pathogens, the activity within foreign cells treated mainly by phagocytes. It means the activity of regulating the amount of oxygen. Active oxygen is known to have a strong bactericidal action and is necessary for biological defense, especially for defenses involving phagocytes, but when it is produced in excess, it can damage normal cells in the body. Have been suggested to have harmful effects. Therefore, an object of the present invention is to adjust the excess amount of active oxygen. Therefore, the antioxidant ability in the present invention includes quantitative and qualitative regulation of active oxygen in neutrophils, macrophages and other phagocytes. The regulation of the amount of active oxygen is carried out by the function of chlorella which quantitatively and qualitatively enhances the activity of superoxide dismutase (SOD) in the cytoplasm of leukocytes, especially phagocytes.
[0032]
When a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient is used as an antioxidant, improvement of circulatory system function, prevention of arteriosclerosis, prevention of various cancers, or improvement of QOL (quality of life), It can be administered for the purpose of extending the life.
[0033]
In the present invention, the term “immunocompetent cell-enhancing ability” means the quantitative and qualitative enhancement of T cells, B cells and macrophages, which are a subgroup of lymphocytes, and in particular, acquired immunodeficiency states caused by overwork and the like. The activity of performing lymphocyte-based immune reactions, increasing the number of antibody-producing cells, increasing the protective activity against infection, and enhancing the physiological activities involved in the immune response. Therefore, the immunocompetent cell enhancing ability in the present invention includes lymphocyte subgroups, that is, T cell group (CD3, CD4 and CD8 positive cells), B cell group (CD19 positive cell), and NK cell group (CD16 and CD16). CD56-positive cells), a group of macrophages (CD11-positive cells), etc., in a quantitative and qualitative manner, and various cytokines involved in cellular immunity and humoral immunity (eg, interleukin (IL-1, IFN -Γ, IL-4, IL-9, etc.).
[0034]
When a pharmaceutical composition containing ultramicronized chlorella as an active ingredient is used as an immunocompetent cell potentiator, an intense stress or excessive diet, or improvement of an immunodeficiency state by administration of a cancer chemotherapeutic agent, and peripheral The administration can be performed for the purpose of normalizing an individual having an excess of granulocytes or lymphocytes in the blood.
[0035]
4. Functional products
Further, the ultramicronized chlorella is not limited to use as a pharmaceutical composition, and may be blended in a functional product such as food, feed, or cosmetics. Accordingly, foods and feeds containing ultramicronized chlorella are functional foods for health supplements for inducing antioxidant effects, recovering from fatigue of healthy individuals, and quantitatively and qualitatively regulating granulocytes and lymphocytes. Useful. In addition, cosmetics containing ultramicronized chlorella are useful as pigmentation inhibiting / reducing agents because of their antioxidant ability.
[0036]
Foods containing ultra-micronized chlorella include cooked rice products, confectionery, noodles, fish paste products such as kamaboko and chikuwa, processed meat products such as ham and sausage, beverages such as soft drinks and fruit drinks, mayonnaise dressing, Examples include seasonings such as a seasoning seasoning liquid, but are not limited thereto. The blending of ultramicronized chlorella into food can be carried out, for example, by a method such as mixing, dipping, coating, spraying and the like. These foods may be appropriately blended with coloring agents, flavors, sweeteners, sour agents and the like used in ordinary foods. The amount of the ultramicronized chlorella to be added to the food is, for example, 1 to 500 g / kg, and preferably 50 g / kg.
[0037]
Examples of feed containing the ultramicronized chlorella include, but are not limited to, powdered, pasted, and pelletized feeds for livestock, poultry, and fish. These feeds may be appropriately blended with coloring agents, flavors and the like used in ordinary feeds. The amount of the ultramicronized chlorella to be added to the feed is, for example, 20 to 100 g / kg, and preferably 50 g / kg.
[0038]
Examples of cosmetics containing ultramicronized chlorella include, for example, lotions, emulsions, creams, and foundations. In these cosmetics, a surfactant, a humectant, a whitening agent, an ultraviolet absorber, a fragrance, a preservative, and the like used in ordinary cosmetics may be appropriately compounded. The amount of the ultramicronized chlorella to be incorporated into cosmetics is, for example, 20 to 100 g / l, and preferably 50 g / l.
[0039]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Production of ultramicronized chlorella
Chlorella Pyrenoidosa was selectively grown in a detomer medium and a Myers-N medium, and then cultured at 25 ° C in the open. The chlorella cells after the culture were washed with pure water by centrifugation (1000 rpm, 10 minutes) to obtain a cell suspension. The concentration of the suspension is 1 × 10 ⁸ Pieces / ml.
Shredding was performed so that the average size was less than 1 micron, and an ultramicronized chlorella was obtained. This was dried and powdered.
[0040]
FIG. 1 shows a scanning micrograph of the obtained ultramicronized chlorella. FIG. 1A shows the dried normal chlorella observed at × 500. FIG. 1B shows the ultramicronized chlorella observed at × 500. The size of the dried normal chlorella is approximately 20 to 120 microns, whereas the size of the ultramicronized chlorella prepared in this example is approximately 0.5 to 0.7 microns, and they are aggregated. It is observed that
A part of the obtained powder of ultramicronized chlorella was tableted to prepare a preparation for oral administration.
[0041]
Reference Example: Dose setting of chemotherapeutic agent
In testing the pharmacological effect of the ultramicronized chlorella, test animals were brought into an immunosuppressed state using a chemotherapeutic agent (mitomycin C (MMC): manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd.). In this case, in order to determine the dose of MMC, a preliminary experiment on setting the dose of MMC was performed.
Purely bred mice (C57BL / 6) were used as experimental animals.
[0042]
Four groups of C57BL / 6 female mice, 8 weeks old, were set. Each group consisted of 7 animals. The group settings are as follows.
(A) MMC-free normal group
(B) Group administered with MMC 0.08 mg / kg intraperitoneally
(C) Group administered with MMC at 0.5 mg / kg
(D) Group administered with 3 mg / kg of MMC
On the third day after MMC administration, the spleen was excised and mononuclear free leukocytes were prepared. After correction by spleen weight, the cells were suspended in physiological saline and the number of leukocytes per 1 ml was calculated.
As a result, spleen cells showed a dose-dependent decrease in the cancer chemotherapeutic agent (FIG. 2B).
[0043]
In the group to which 3 mg / kg of MMC was administered, the number of antibody-producing cells (plaque forming cells; PFC) was 51% of that in the normal group, and significantly decreased (FIG. 2A).
From the above, the dose of MMC used for the pharmacological effect test was 3 mg / kg, which represents 33% of the normal value.
[0044]
[Example 2] Pharmacological effect test-1
C57BL / 6 female mice (8 weeks old) were bred in a clean environment (SPF conditions).
The mice were transplanted with cancer cells (erythroleukemia cancer, strain name: EL-4) before administration of the ultramicronized chlorella produced in Example 1 (5 × 10 5). ⁴ Individual / ml) for 14 to 21 days to obtain a cancer-bearing state.
[0045]
Next, MMC was injected to create an acquired immunodeficiency model. Each group consisted of 10 mice, and the following 7 groups were set.
(A) Normal group without MMC administration (group without cancer cell administration)
(B) MMC group: a group in which MMC was subcutaneously injected at a concentration of 3 mg / kg.
(C) A group that received 2 g of ultramicronized chlorella chlorella every day immediately after MMC injection
(D) A group to which 2 g of Chlorella A disrupted cell membrane was given daily after MMC injection
(E) A group receiving 2 daily injections of Chlorella B with disrupted cell membranes after MMC injection
(F) Group given 500 mg / kg of Juzentaihoto after MMC injection
It should be noted that Juzen Taiho-to is known as a Chinese medicine showing hematopoietic action and recovery from fatigue. In addition, the cell membrane-crushed chlorella A and the cell membrane-crushed chlorella B used in the above groups (D) and (E) are conventional cell membrane-crushed samples of Chlorella pyrenoidosa and Chlorella vulgaris, respectively. is there.
Seven days after the administration of each sample, the spleen was excised, mononuclear leukocytes were prepared, corrected for spleen weight, and then the number of leukocytes per unit volume (number of spleen cells) was measured.
[0046]
The result is shown in FIG. In the MMC group of (B), splenocytes decreased (63%) as compared to the normal group (100%), but recovered to 136% when ultramicronized chlorella was administered in combination (Group C) (FIG. 3). . Ultramicronized chlorella (Group C) showed an effect superior to Juzentaihoto (Group F; recovered to 86%), which has a known hematopoietic effect. The cell membrane-crushed chlorella preparation was 72% in Group D and 77% in Group E, all of which were inferior to Group C.
[0047]
[Example 3] Pharmacological effect test-2
A group similar to the group set in Example 2 was set, and 1 day after MMC injection, 2 × 10 5 sheep red blood cells were used as an antigen for each group of mice. ⁸ Individuals / 0.2 ml were inoculated from the peritoneal cavity. Five days later, the spleen was removed to obtain single cells. The cell suspension was bisected, and one was detected for hemolytic plaque forming cells according to the Jerne method, and the number of antibody-producing cells was evaluated.
[0048]
FIG. 4 shows the results. The antibody-producing cells showed inhibitory values in the group administered with the cancer chemotherapeutic agent MMC (normal group (A) 1163 × 10 ⁶ MMC group (B) 483 × 10 ⁶ Pieces). However, after injection of MMC, the group receiving ultramicronized chlorella (Group C; 1562 × 10 ⁶ Chlorella A and B (groups D and E, respectively; 463 × 10 ⁶ Individual and 883 × 10 ⁶ ), And Juzen Taiho-to (Group F; 892 × 10 ⁶ ) Showed a more significant increase in the number of antibody-producing cells.
[0049]
[Example 4] Pharmacological effect test-3
A group similar to the group set in Example 2 was set, and 1 day after MMC injection, 2 × 10 5 sheep red blood cells were used as an antigen for each group of mice. ⁸ Individuals / 0.2 ml were inoculated from the peritoneal cavity. Each group was weighed before the start of the study and before euthanasia.
[0050]
FIG. 5 shows the results. Among the groups measured, the group administered with the cancer chemotherapeutic agent MMC also showed a tendency to decrease in body weight (normal group (A) 23.6 g, whereas MMC group (B) 19.3 g). However, the groups receiving ultramicronized chlorella after MMC injection (Group C; 24.3 g) included cell membrane disrupted chlorella A and B (Groups D and E; 18.0 g and 21.0 g, respectively), and The body weight was recovered as compared with Daihoto (Group F; 23.6 g).
[0051]
[Example 5] Pharmacological effect test-4
A group similar to the group set in Example 2 was set, and 1 day after MMC injection, 2 × 10 5 sheep red blood cells were used as an antigen for each group of mice. ⁸ Individuals / 0.2 ml were inoculated from the peritoneal cavity. Five days later, the spleen was removed to obtain single cells. The cell suspension was bisected, and one was detected for hemolytic plaque forming cells and evaluated for antibody-producing cells according to the Jerne method. The other group uses a reagent for detecting each lymphocyte subgroup (a monoclonal antibody for each lymphocyte subgroup combined with a fluorescent dye, manufactured by Becton-Dickinson; USA) to produce anti-CD3, Anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11, anti-CD19, and anti-CD56 positive cells, and NK cells, interferon γ-retaining cells, and IL-4 retaining cells were subjected to FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter, manufactured by Vectreickinson; USA). Was measured using
[0052]
FIG. 6 shows the results. In FIG. 6, the bar graphs are, from the left, a normal group (dots), an MMC administration group (shaded line), an ultramicronized chlorella administration group (open white), a cell membrane disruption chlorella A administration group (horizontal line), and a cell membrane disruption chlorella B administration group (Shaded) and Juzentaihoto administration group (vertical line). Among the lymphocyte subgroups measured, the group administered with the cancer chemotherapeutic agent MMC inhibited CD3, CD4, CD11 and CD19-positive B cells. The group receiving ultramicronized chlorella showed marked recovery of these B cells.
[0053]
[Example 6] Pharmacological effect test-5
The same group as the group set in Example 2 was set, and MMC was injected into each group of mice. Twenty-four hours after MMC administration, 2 ml of an aqueous glycogen oyster solution was injected intraperitoneally. Three days later, peritoneal exudate cells were collected from the mice euthanized by cervical dislocation and centrifuged at 1500 rpm at 4 ° C. for 5 minutes and washed twice. 1 × 10 in HEPES buffer ⁶ After preparing a cell suspension to give cells / ml, 100 μl of cyt-C and 10 μl of PMA were added, and cultured for 20 minutes while shaking lightly in a 37 ° C. incubator. Immediately after the culture, the reaction was stopped by placing on ice and centrifuged at 1500 rpm at 4 ° C. for 10 minutes. The absorbance of the supernatant was measured at 550 nm and 540 nm, and the amount of active oxygen generated in the cells in the living body was calculated. The measurement of the amount of active oxygen was performed three days after the stimulation with oyster glycogen.
[0054]
Table 1 shows the amount of active oxygen produced by peritoneal exudate neutrophils of mice. As a result, as shown in Table 1, the group to which ultramicronized chlorella was administered had a smaller amount of active oxygen generated than the other groups, and exhibited an antioxidant effect on cells in the living body. Understand.
[0055]
[Table 1]

[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition containing an ultramicronized chlorella having an average size of 0.1 μm or more and less than 1.0 μm as an active ingredient, and a method for producing the ultramicronized chlorella. The ultramicronized chlorella of the present invention has extremely excellent effects as compared with conventional chlorella preparations, such as an immunopotentiating effect, an antibody production enhancing effect, an antioxidant effect, an immune cell increasing effect, etc. Useful as a product.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing scanning micrographs of dried normal chlorella (A) and ultramicronized chlorella (B).
FIG. 2 shows the effect of a chemotherapeutic agent (Mitomycin-C) on mouse antibody-producing cells (A) and mouse splenocytes (B).
FIG. 3 shows the number of mouse spleen cells after injection of a chemotherapeutic agent.
FIG. 4 is a graph showing the ability to produce antibodies in mouse splenocytes after injection of chemotherapy.
FIG. 5 is a graph showing changes in body weight of mice after injection of chemotherapy.
FIG. 6 is a diagram showing the results of detection of cytokine-bearing cells measured by FACS. The bar graph shows, from left to right, a normal group (dot), an MMC administration group (shaded line), an ultramicronized chlorella administration group (open white), a cell membrane disruption chlorella A administration group (horizontal line), and a cell membrane disruption chlorella B administration group (shaded). ) And Juzentaihoto administration group (vertical line).

Claims

The following steps:
(A) a step of grinding chlorella cells,
(B) a step of stirring while spraying a solvent on the pulverized chlorella, and (c) a step of heating the chlorella,
A method for producing ultramicronized chlorella, comprising:

The method according to claim 1, wherein in the step (c), heating is performed by far infrared rays.

A pharmaceutical composition comprising an ultramicronized chlorella having an average size of 0.1 micron or more and less than 1.0 micron as an active ingredient.

The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the ultramicronized chlorella is produced by the method according to claim 1 or 2.

The pharmaceutical composition according to claim 3 or 4, which is used as an immunopotentiator, an antibody production enhancer, an antioxidant, or an immunocompetent cell enhancer.

When used as an immunocompetent cell increasing agent, the immunocompetent cells are selected from the group consisting of CD3, CD4, CD8, CD11, CD19 positive cells and NK cells, interleukin-4 retaining cells, and interferon-γ retaining cells. 6. The pharmaceutical composition according to claim 5, which is one or more.

A functional product comprising ultramicronized chlorella having an average size of at least 0.1 micron and less than 1.0 micron.

The functional product according to claim 7, wherein the ultramicronized chlorella is produced by the method according to claim 1.