JP2004037370A

JP2004037370A - 顕微鏡的微粒子を定量および定性測定用に素早く検出して同定する方法および装置

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Publication number: JP2004037370A
Application number: JP2002197349A
Authority: JP
Inventors: David L Haavig; デイヴィッド・エル・ハーヴィグ; Gary Lorden; ゲイリー・ローデン
Original assignee: Micro Imaging Technology Inc
Current assignee: Micro Imaging Technology Inc
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2004-02-05
Also published as: US6639672B2; US20020186372A1; CA2393402A1; US6421121B1; EP1367382A1

Abstract

【課題】流体や気体中に浮遊する原虫や他の微生物のような顕微鏡的微粒子を素早く同定するための方法と装置を提供する。
【解決手段】この方法および装置は、レーザのような強力光源を被検出微粒子に照明し、検出帯を囲む光学センサのアレーを用いて散乱光を検出し、検出光を電気信号に変換し、この派生信号を少なくとも１つの発生頻度／確率ヒストグラムと比較し、存在する顕微鏡的微粒子を定量的および／あるいは定性的に同定するものである。
【選択図】　図１

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、流体や気体中に浮遊する原虫や他の微生物のような顕微鏡的微粒子を同定するための独自な方法と装置を提供する。
【０００２】
病原性顕微鏡的微粒子の同定に対して現在の公認方法は比較的長い労働集約型プロセスを必要とする。例えば、飲料水にクリプトスポリジウムパーバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）やランバムべん毛虫（Ｇｉａｌｄｉａ　ｌａｍｂｌｉａ）が存在するかどうかを判定するには、供給者は「ＵＳＥＰＡ法１６２２」（ＵＳＥＰＡ　ｍｅｔｈｏｄ　１６２２）の長い労働集約型手順を使わなければならない。臨床検査室や食品検査員も病原菌を見つけて同定するために長い労働集約型手順を使わなければならない。
【０００３】
あいにく、微生物の陽性同定が期待できない多くの状況がある。飲料水が家庭に供給される前に、クリプトスポリジウムによる飲料水の汚染を即座に見分けなければならない。同じく、細菌性髄膜炎のような特殊な病気の原因の同定は何度も必要な時間を待つことができない。最後に、牛肉のような食物源における細菌の検出と同定は多くの場合に長い時間を要するので、問題を発見する前に食品が配給されてしまう。
【０００４】
微視的生物を検出するために各種の方法と装置が存在する。例えば、ド・レオン（Ｄｅ　Ｌｅｏｎ）等による米国特許番号５，７７０，３６８はクリプトスポリジウム検出方法を開示する。被包形態の生育性や感染性は、原虫の特定の属や種に対して固有のプライアを用いて誘導ＨＳＰ　ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成し、その後にｃＤＮＡの酵素増幅をすることによって判断される。さらに、感染性は原虫の特定の属や種に対して固有のプライヤ対を用いて感染細胞からＨＳＰ　ＤＮＡを増幅することにより判断される。
【０００５】
スティール（Ｓｔｅｅｌｅ）等による米国特許番号５，６９３，４７２はクリプトスポリジウムパーバムの検出法を開示する。地上水や大便のような水生および生物試料内でのクリプトスポリジウムパーバムの検出法およびキットを開示する。この方法はプライマの使用に依存してクリプトスポリジウムパーバムの少なくとも１つのＤＮＡ配列特性の全て、あるいは一部を検出する。この配列は組換プラスミドｐＩＮＶ３８ＧとｐＨｅｍ４のそれぞれに含まれる３８ＧとＨｅｍＡと呼ばれるゲノム領域の全て、あるいは一部である。
【０００６】
プリース（Ｐｌｅａｓｓ）等による米国特許番号５，２２９，８４９は微視的生物体の挙動の統計的研究用のドップラーレーザ分光計を開示する。流体内を遊泳したり液体の表面を移動する微生物を監視して同定する改良された方法と装置は、非常に小さな活動の変化を素早く計測し、さらに退廃物が存在しても比較的大容積の液体内の個々の微生物を検出し同定する感度の良い方法を提供する。この装置はレーザステーション、サンプルコレクタステーション、撮像ステーションおよび監視ステーションを備える。
【０００７】
ワイアット（Ｗｙａｔｔ）等による米国特許番号４，５４８，５００は小さな微粒子を同定し特性を決めるプロセスと装置を開示する。各微粒子が光のビームや他の電磁放射線を通過するときに生じた光学観測量の計測に基づいた個々の微粒子の特性把握および／あるいは同定用の装置とプロセスを開示する。微細ビーム、好ましくは単色直線偏光光は検出器の球面アレー、あるいはファイバ光学手段を通過して入射光を１組の検出器手段に通し、微粒子の流れは球面アレーの中心でビームに交差する。次に、検出散乱放射線から計算された選択観測量を用いて計算機メモリ手段から各観測量に対して１つ、特定マップを読み出す。
【０００８】
リー（Ｌｅｅ）等による米国特許番号５、４７３、４２８は、振幅を先のフィードバックレーザビームにより調整する結合レーザダイオードを有する干渉温度検知装置を開示する。干渉温度検知装置は簡素に設計され、レーザ検知素子の自己結合効果により干渉縞パターンを正確に処理する。レーザダイオードと光学検出素子は１つのパッケージに組み込まれる。
【０００９】
カーチス・トンプソン（Ｃｕｒｔｉｓ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等による米国特許番号５，５８２、９８５はマイコバクテリアの検出法を開示する。本発明は試料内のマイコバクテリアを検出するのに有効な方法、構成、キットを提供する。この方法は、マイコバクテリア特定核酸を試料に混成する前に、試料のホルムアルデヒド溶液、有機溶媒、および蛋白質分解薬剤との接触を含む。本発明は結核菌のようなマイクロバクテリアに起因する人間の病気の検知に特定の効用を持ち、この病気を感受性良く選別する。
【００１０】
（発明の要約）
本発明の独自の装置は、流体や気体中に浮遊する原虫や他の微生物のような広範囲の顕微鏡的微粒子を同定する正確で有効な測定法を提供する。この独創的な方法は、便利で信頼性のある方法で、浮遊微粒子を囲む光学センサのアレーにより収集される微粒子による散乱光の測定から得た微粒子種の定性的および定量的同定の手順を提供する。
【００１１】
詳細に述べると、浮遊微粒子により散乱された光はセンサのアレーにより検出され、電気信号、例えば電圧に変換される。各センサからの電圧は電圧をディジタル化する変更手段コンポネントに入力され、その結果の値を微粒子同定用のフィンガプリントとして用いる。独自の変更コンポネントは、ディジタル電圧の１つ以上の数学的組合せの関数である１組以上の経験的に確定した一次元ないしは多次元確率ヒストグラムから得た予測公式を備える。各組は個々の確率ヒストグラムで構成される。このヒストグラムはディジタル電圧の特定の組合せの観測値が特定微粒子種により作成される可能性を示す。したがって、この独創的装置の独自の変更コンポネントは、予測公式が特定種に対して大きい確率値をもたらす場合に、測定信号を“種の特定”として解釈する
【００１２】
実施例では、顕微鏡的微粒子の定性的および定量的測定に対する素早い検出と同定の独自の方法は、以下の工程を備える。
【００１３】
ａ）試料室内に含まれた制御流体内に被同定微粒子を浮遊する工程、
ｂ）強力光源に対して規定方向に試料室を保持する工程、
ｃ）前記光源により試料室を照明する工程、
ｄ）試料室を囲む光学センサのアレーを用いて試料室からの散乱光を集めて測定する工程、
ｅ）微粒子が強力光源を通過するときにセンサのアレーから出力した電圧をディジタル信号に変換する工程、
ｆ）派生信号を確率ヒストグラムのライブラリと比較し、その合成データを統計的に分類し、存在する顕微鏡的微粒子を同定する工程。
【００１４】
本発明によれば、このライブラリは、関連信号がそれらの微粒子種により作成される確率を計算する統計的分類アルゴリズムにより包含される各微粒子種に対するヒストグラムからなる。確率ヒストグラムは、微粒子の種がディジタルセンサ電圧の数学的組合せの特定範囲の値に連動する頻度の測定から経験的に得られる。したがって、発生頻度ヒストグラムは１つの数学的組合せに対して作成される。すなわち、１次元解析は複数の数学的組合せに対して同時に、すなわち多次元解析が作成される。
【００１５】
現在の好ましい実施例では、独創的装置は、以下ものを組合せてなる。
ａ）ビームウエストを作る偏光レーザ、
ｂ）レーザビームウエストに関する共通領域を曖昧さなしに見えるように位置決めされ方向づけられた光検出器で、複数の光検出器を含む光学シャーシ、
ｃ）被分析流体試料を含む試料室、
ｄ）レーザビームウエストに関して規定方向に、且つ、光検出器の当該共通領域に試料室を保持する手段、
ｅ）試料内に微粒子をレーザビームウエストを通じて循環させる手段、
ｆ）暗密閉容器を作るために光源と光学シャーシをカバーする手段、
ｇ）検出器により測定した光強度値をディジタル値に変換する手段、
ｈ）ディジタル値を計算機に連続して入力する手段、
ｉ）ディジタル測定値に基づく当該共通領域で粒子が光ビームに入るときを決める手段、
ｊ）ディジタル値を較正値に変換する手段、
ｋ）ディジタル化された較正事象データから事象記述子を抽出する手段、
ｌ）事象記述子から判別関数値を計算する手段、
ｍ）測定値から計算した判別関数値が特定微粒子種に起因する確率を計算できる確率ヒストグラムを形成する手段、
ｎ）最有効判別関数を判別する手段、
ｏ）確率ヒストグラムと判別関数を同定ライブラリ、同定される各微粒子種の１つのヒストグラム、および各判別関数に記憶する手段、
ｐ）先に記憶した確率ヒストグラムと判別関数、同定ライブラリで同定される各微粒子種に対する１つの確率ヒストグラムおよび判別関数を検索する手段、
ｑ）判別関数の任意値に対するライブラリ内の各微粒子種の確率を計算する手段、
ｒ）同定ライブラリで同定される各微粒子種の確率を組み合わせる手段、
ｓ）未知微粒子を閾値に基づいて同定する手段。
【００１６】
【実施例の詳細な説明】
本発明は、測定データの統計的解析に基づく顕微鏡的微粒子同定の独自な方法と装置を提供する。この方法は、計測機器と生データ処理装置、同定ライブラリの作成法、および同定ライブラリの使用法の３つの相互関連部から成る（図１参照）。
【００１７】
本発明は微生物や他の種類の微粒子を素早く検出して同定する手段を提供する。この装置は、強力平行光源を通過する微粒子を散乱する光の測定と分析に基づく。微粒子が入射光の波長に匹敵するか、それより少し大きい場合、光は主に微粒子を回折し、あらゆる方向に光エネルギーを拡散する。各種の方向の光強度は微粒子の寸法と形状と入射光の波長に明確に依存する。原理的に、光強度の高角度分解能測定値と全散乱放射線の電磁波相から微粒子寸法と形状を計算できる。これは、実際に、移動体のレーダ特徴を扱う場合の航空宇宙では普通の業務である。しかし、この技術は可視光線を取扱う場合には実用向きではない。さらに、細菌のような微粒子の正確な寸法や形状を測定することは寸法と形状の自然な変動による同定には有用ではない。本発明により、散乱光の小部分のみを測定することによる微粒子同定用の装置を提供する。各種の微粒子について行った測定結果をあらかじめ行った測定値と比較することにより、正確な微粒子同定を達成した。
【００１８】
下記の定義は実施例をより完全に説明するのに役に立つ。
用語“流体”（ｆｌｕｉｄ）　は、液体や気体媒質を意味する。
用語“光”（ｌｉｇｈｔ）は、電磁放射線を意味する。
用語“当該共通領域”（ｃｏｍｍｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｇａｒｄ）は、全光検出器により同時に観察される空間内の小領域を意味する。
用語“曖昧さのない”（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）　は、視野を遮るもの、ゆがみ、あるいは、ぼかしのないことを意味する。
用語“透明な”（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ）は、使用する光の波長で光学的に透明であることを意味する。
用語“試料室”（ｓａｍｐｌｅ　ｃｈａｍｂｅｒ）は、試料を含む透明密閉容器を意味する。
用語“検出器”（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）は、感光性であり、入射光を入射光強度に比例する振幅を有する電圧や電流に変換する電子機器を意味する。
用語“光学シャーシ”（ｏｐｔｉｃａｌ　ｃｈａｓｓｉｓ）は、試料室を囲むフレームワーク、光学検出器、およびエレクトロニクスを意味する。
用語“較正を加える”（ａｐｐｌｙ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）は、標準の測定値が正しい値をもたらすように生の測定データを修正することを意味する。
用語“微粒子種”（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ）は、微生物や花粉の種のような微粒子の個々のクラスや、赤血球等のような微粒子の種類を意味する。
用語“事象”（ｅｖｅｎｔ）は、１つの微粒子が光ビームを通過する際に得た１組の測定散乱光データを意味する。
用語“発生頻度ヒストグラム”（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｏｆ−ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）は、微粒子種の測定が特殊測定値の数学的組合せの任意計算に対する特殊値範囲にどれくらい入るかの尺度を意味する。
用語“確率ヒストグラム”（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）は、（一次元の場合）曲線下の面積あるいは（多次元の場合）曲線下の体積が１であるような正規化発生頻度ヒストグラムを意味する。
【００１９】
実施例において、顕微鏡的微粒子を定性的および定量的計測用に素早く検出して同定する独創的方法（３つの相互関連部の３番目）は、図２に示す計測機器を使用し、以下の工程を含む。
ａ）被同定微粒子をガラス瓶内に含まれる超高質水に浮遊する工程、
ｂ）ビームウエストが中央を通過するように強力レーザ源に試料ガラス瓶を保持する工程、
ｃ）試料室を囲む光学センサのアレーを用いてガラス瓶から散乱光を集めて測定する工程、
ｄ）微粒子が強力光源を通過する際にセンサのアレーから出力された電圧をディジタル信号に変換する工程、
ｅ）この派生信号を少なくとも１組の確率ヒストグラムと比べ、存在する顕微鏡的微粒子を同定する工程。
【００２０】
それゆえ、微粒子種の同定は、微粒子種の統計的に有意な数をはじめに計測し、この測定値から適切な情報を引き出すことで進める。同定ライブラリ内に関連情報を集めて記録保管した後に、未知の微粒子の同定は、新しい測定値を微粒子特性の記録保管ライブラリと比較することにより進める。
【００２１】
この装置は強力光源を通過する微粒子を散乱する光を利用する。図２は散乱光を計測し、ライブラリ作成と微粒子同定を行うための機器の実施例の概要を示す。
【００２２】
光学シャシは光学検出器を支え、検出器の当該単一共通領域への視野を束縛するフレームワークを作る。光学検出器は試料室の外側に散乱した光を集め、光の強度を測定する。イベントプロセッササブシステムは光学検出器により作成した電圧を連続してディジタル化し、このディジタル電圧を監視して背景信号を動的に抽出し、微粒子がレーザビームを通過するときを判定する。
【００２３】
イベントプロセッサがレーザビームを通過する微粒子を検出すると、このプロセッサは、微粒子がビームを完全に通過するまで、各検出器からのディジタル電圧を保持する。微粒子がビームを通過した後、イベントプロセッサは較正を行い、次にディジタルデータから、微粒子同定アルゴリズムにより必要とされる特殊データ（事象記述子）を抽出し、この記述子をＩＤプロセッササブシステムに通す。
【００２４】
このＩＤプロセッササブシステムは事象記述子により判別関数値を微粒子種同定ライブラリを相互参照して形成する。このライブラリは多数組の確率ヒストグラムを含み、特定微粒子種から生じた判別関数値を観測する確率を計算するのに用いる。ＩＤプロセッサは確率ヒストグラムと統計的分類アルゴリズムを用いてレーザビームを通過した微粒子の同定の結論を引き出す。ＩＤプロセッサは微粒子の同定をディスプレーに表示する。
【００２５】
それゆえ、第１の独創的プロセス段階は計測機器による非常に多くの測定値を利用する同定ライブラリを作成する。第２の独創的プロセス段階は測定機器とライブラリを使い、未知の微粒子を同定する。
【００２６】
ライブラリ作成プロセスの理解は球状微粒子のために測定したデータの理解に依る。球状微粒子が平行ビームを通過するとき、光検出器は微粒子速度とレーザの断面強度プロファイルの双方に依存する時間従属強度を測る。図３は、レーザがガウス断面強度プロファイルを持つ場合に、球状微粒子もガウス散乱光強度対時間（注記：微粒子はビームの直径よりもはるかに小さい）を持つことを示す。それゆえ、ν（ｄ，ｔ）もガウスである。ｄは検出器で測定した電圧で、時間ｔの関数である。異なる径路に沿ってビームウエストを通過する同じ微粒子は異なる振幅を持つガウス・プロファイルを示す。各瞬時での測定値を同じ瞬時での１つ以上の検出器の値の合計で割ると径路依存性を取除く。それゆえ、
ν’（ｄ，ｔ）＝ν（ｄ，ｔ）／Σ_ｄ’　ν（ｄ，ｔ）　　　　　式（１）
ここで、ｄ’は検出器の一部、あるいは全部である。微粒子が球形である場合、正規化値ν’（ｄ，ｔ）は信号強度が十分に大きい限り、一定である。さらに、この値は微粒子がレーザビームを通過するときに微粒子がとる径路に依存しない。
【００２７】
波長、微粒子直径、および微粒子と流体の屈折率が周知であれば、式（１）から球状微粒子の割合の値は予測可能である。それゆえ、球状微粒子では、ビームを通過する微粒子の特性把握をするには各検出器からの単一比例値を用いることで十分である。各検出器からのこれらの単一比例値は事象記述子と呼ばれる。なぜなら、単一比例値が事象の源、つまり、事象を引き起こす微粒子を独自に記述するからでる。次に、ＥＤ（ｄ）は検出器ｄの事象記述子を表す、つまりＥＤ（ｄ）＝ν’（ｄ，ｔ_１）、ここでｔ_１は特定瞬時時間である。同じ寸法の全ての球状微粒子は同じ事象記述子ＥＤ（ｄ）を作る。それゆえ、球状微粒子事象の測定を行うと、微粒子の直径は原理的に事象記述子の値から得られる。
【００２８】
微粒子が球形でない場合、式（１）の事象記述子はもはや一定ではない。ν’（ｄ，ｔ）対時間のプロットは直線にならない。この曲線の形状は微粒子がビームを通過するときの微粒子の方向に依存する。レーザビームを繰返し通過する同じ微粒子は多くのプロット形状を作ることになる。同じく、同じ微粒子種の異なる微粒子も多くのプロット形状を作る。結果として、上述の事象記述子は時間に依存する。その結果、非球形微粒子を説明するために、事象記述子の概念が緩和され、たとえ記述子値が微粒子種に対して時間的に一定でないとしても事象の特性が単一であるというデータを示す。
【００２９】
同定方法は事象データから事象記述子を抽出するのに特殊なスキームを必要とする。多くのスキームがある。その２つは；
１．事象中に得たＥＤ（ｄ，ｔ）＝ν’（ｄ，ｔ）の最大値、すなわち、
ＥＤ_ｄ＝ｍａｘ（ν（ｄ，ｔ）／Σ_ｄν（ｄ’，ｔ））の事象記述子値を選定する。
２．値ν’（ｄ_ｎ，ｔ）が事象中の特定検出器ｄ_ｎに対する最大値である場合に、時間ｔ_ｎでのＥＤ（ｄ，ｔ_ｎ）＝ν’（ｄ，ｔ_ｎ）の値である事象記述子を選定する。つまり、ＥＤ_ｄ＝ν（ｄ，ｔ’_ｎ）／Σ_ｄν（ｄ’，ｔ’_ｎ）、ここで、ｔ’_ｎは検出器ｄ＝ｎが最大である場合の時間である。
【００３０】
非球状微粒子がレーザビームを通過するときに測定した事象データは微粒子の方向に依存するので、事象記述子値を与えられた微粒子を直接に同定できない。しかし、統計的解析を用いて微粒子が何であるかを予測できる。同一種の多くの微粒子を測定すると、一系統の事象記述子値を作ることになる。この系統の値は事象記述子が取る値の範囲を記述する。この値の範囲の程度を制限することに注目することが重要である。これらの測定値を発生頻度ヒストグラム対事象記述子値としてプロットすると、図４に示すものに類似したグラフになる。このグラフが示すように、事象記述子の値の範囲は制限され、とりわけ、値の中には他の値よりも可能性が高いものがある。
【００３１】
種々の微粒子種に対してプロットした発生頻度ヒストグラムは少し異なるヒストグラムになる。なぜならば、微粒子が異なる寸法、形状や光学特性を持つことになるからである。図４は、３つの異なる微粒子種（ランブルべん毛虫、クリプトスポリジウムパーバム、および事象記述子ＥＤ_１の１．５８８マイクロメータ直径のポリスチレン球形の試料）に対してプロットした正規化ヒストグラムを示す。ＥＤ_１に対して特定測定値、例えばグラフ上の点αを与えると、微粒子がランブルべん毛虫やクリプトスポリジウムである可能性が高いという結論を引き出すことができる。同様に、値がβであれば、微粒子は１．５８８マイクロメータ直径の球である可能性が高い。しかし、この同定は絶対的ではない。点αとβの両方で、事象が三つの微粒子種のどれか１つに起因する機会は零ではない。
【００３２】
明らかに、正確な同定の可能性を高めるには、このプロセスは付加情報を必要とする。この付加情報は異なる事象記述子ＥＤ_２等の別組のヒストグラムを用いることから生じる。この同定プロセスは、測定事象記述子値が前置測定ヒストグラム曲線のデータ組内に異なる微粒子により作成される確率から微粒子種の結論を引き出す内容になる。前置測定正規化ヒストグラムのデータ組は同定ライブラリと呼ばれる。
【００３３】
ライブラリ作成段は事象データから抽出され、測定機器により処理された事象記述子ではじまる。この事象記述子は大きな組の判別関数に再編成される。各関数とライブラリに含まれる各異なる微粒子種とに対する確率ヒストグラムを計算する。種と種の判別を行う際の各判別関数の強度を計算する。最良の判別関数が同定され、同定手順により適切なデータを使用のためにセーブした。
【００３４】
判別関数は微粒子種間の差を強調する。二つの異なる球径に対するデータを考慮する。値ＥＤ_１が大きい球と小さい球があり、一方で値ＥＤ_２が第一の球では小さく、第二の球では大きい場合を見出す。この場合に、割合ＥＤ_１／ＥＤ_２は二つの異なる球間の優れた識別子である。この割合はある球径に対しては大きく、別の球径に対しては小さい。この場合、判別関数ＤＦ＝ＥＤ_１／ＥＤ_２から生じる値のヒストグラムは二つの異なる微粒子種の曲線間の分離において個々の事象記述子のヒストグラムよりも大きい。
【００３５】
判別関数は事象記述子概念を単に一般化したものである。例えば、事象記述子間の三つの関係は次のように各判別関数：ＤＦ_１＝ＥＤ_１、ＤＦ_２＝１／ＥＤ_２およびＤＦ_３＝ＥＤ_１／ＥＤ_２である。判別関数が個々の事象記述子を含むので、下記の議論は判別関数を用いる場合にのみ当てはまる。
【００３６】
ヒストグラムは正規化される場合に使い易い。すなわち、曲線化の面積は１（一次元の場合）であり、曲線化の体積は１（多次元の場合）である。この合成曲線は類似の確率密度である。これらの確率ヒストグラムは今、特定判別関数値が特定微粒子種の測定から生じる確率を直接に与える。
【００３７】
上述のように、各微粒子種に対する確率ヒストグラムは特定微粒子種として測定事象を分類できない。その結果、１組の判別関数から得た１組の確率密度が必要になる。あいにく、既存の判別関数は図４に示すように異なる微粒子種に対する確率ヒストグラム曲線間の分離は優れていない。ジアルジア属と球の間およびクリプトスポリジウムと球の間の分離は優れており、一方で、ジアルジア属とクリプトスポリジウムの間の分離は優れているものではない。その結果、図４にプロットした判別関数はジアルジア属とクリプトスポリジウムの間に有効な同定情報の差異を与える。同定のためにどの組の判別関数を使用するかの選択は重要である：判別関数は偶然に選択されるものではない。さらに、ある組の判別関数を選ぶのに別の組より優先する理由はない。幸いにも、最新計算機の高速で多量のデータ処理能力により、大きな組の関数に対する密度を単純に計算し、結果を分類し、個々の微粒子種に対する確率ヒストグラム曲線間に優れた分離を与えるものを同定できる。
【００３８】
最良運用組の判別関数を同定して、同定ライブラリを作成し、記録保管する。このライブラリは確率ヒストグラムにより包含された種のリストを含まなければならない。各組の確率ヒストグラムはその関連判別関数を持たなければならない。
【００３９】
未知の微粒子を同定ライブラリで同定するために、このライブラリを同定計算機メモリに装填する。測定機器と生データ解析手順は未知の微粒子を計測し、既述のように事象記述子データを抽出する。
【００４０】
同定手順は未知微粒子がレーザビームを通過するときに未知微粒子のデータを測定し集めることで始まる。イベントプロセッサは合成信号をディジタル化し、この事象から事象記述子データを抽出する。次にイベントプロセッサは事象記述子を、微粒子を同定しようと試みるＩＤプロセッサに伝える。
【００４１】
このＩＤプロセッサはライブラリ内の第１組の確率ヒストグラムに対する事象記述子から判別関数に対する値を計算することにより始める。各それぞれの微粒子種に対する確率ヒストグラムから確率値を調べて補間し、統計的分類アルゴリズムを適用することで、特定微粒子種がこれらの判別関数値を作成した確率を判別する。この結果はこれらの第一判別関数に関連した確率：ｐ（ｄｆ、種）のアレーである。この場合のｄｆは判別関数組番号であり、この場合は１、つまり第１組の判別関数である。ＩＤプロセッサはライブラリ内の全組の判別関数とそれらに関連した確率ヒストグラムに対してこのプロセスを繰返す。
【００４２】
ある可能な統計的分類アルゴリズムはｐ（ｄｆ、種）として記述した１組の確率値を用いる。ここで、ｄｆは特定判別関数であり、種は微粒子種である。次のように、各異なる微粒子種（種）に対する確率を組合せ、その種に対する単一確率値を形成する。
ｐ（種）＝Σ_ｄｆＷ（ｄｆ）ｘｐ（ｄｆ、種）
ここで、Ｗ（ｄｆ）は判別関数組ｄｆから生じる確率ヒストグラムの重みづけである。
【００４３】
微粒子種同定はこれらの最終値の適切な判読により起こる。ある実施の判読は閾値を用いることである。ｐ（種）＞ｔ（種）であれば（ここで、ｔ（種）は特定微粒子種の閾値であり、他の全ての値はそれらの閾値以下である）、微粒子はその種として同定される。１つ以上の確率がそれぞれの閾値を超えるなら、あるいは、確率が閾値を超えないなら、微粒子は同定されない。
【００４４】
現時点で好ましい実施例では、独創的装置は以下の構成を組合わせてなる。
ａ）ビームウエストを作る偏光レーザ、
ｂ）周りに位置決めされ、レーザビームウエストの当該共通領域を曖昧さなく観察するように方向づけた光検出器で、複数の光検出器を含む光学シャシ、
ｃ）被分析流体試料を含む試料室、
ｄ）レーザビームウエストに対して規定方向と光検出器の当該共通領域内に試料室を保持する手段、
ｅ）試料内の微粒子をレーザビームウエストを通じて循環させる手段、
ｆ）光源と光学シャシをカバーして暗密閉容器を作る手段、
ｇ）検出器により測定した光強度値をディジタル値に変換する手段、
ｈ）ディジタル値を計算機に連続して入力する手段、
ｉ）微粒子がディジタル測定値に基づいて当該共通領域で光ビームに入るときを決める手段、
ｊ）ディジタル値を較正値に変換する手段、
ｋ）ディジタル化されて較正された事象データから事象記述子を抽出する手段、ｌ）事象記述子から判別関数値を計算する手段、
ｍ）測定値から計算した判別関数値が特定微粒子種に起因する確率の計算が可能な確率ヒストグラムを形成する手段、
ｎ）最も有効な判別関数を同定する手段、
ｏ）同定される各微粒子種に対する１つの確率ヒストグラムと各判別関数で、確率ヒストグラムと判別関数を同定ライブラリに記憶する手段、
ｐ）同定ライブラリにより同定される各微粒子種に対する１つの確率ヒストグラムと各判別関数で、先に記憶した確率ヒストグラムと判別関数を検索する手段、
ｑ）判別関数の任意値に対するライブラリ内の各特定種の確率を計算する手段、
ｒ）同定ライブラリで同定される各微粒子種の確率を組合わせる手段、
ｓ）未知の微粒子を閾値に基づいて同定する手段。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例により同定ライブラリを作成する工程と、この同定ライブラリを用いて微粒子を同定する工程を示すフローチャートを示す。
【図２】全同定システムの概要図を示す。
【図３】レーザのビームウエストの拡大図である。レーザがガウス強度プロファイルを持つ場合、レーザビームを通過する球状微粒子はガウス形状対時間を持つ光を散乱する。
【図４】三つの正規化発生頻度ヒストグラムを示す。これらのプロットは三つの微粒子種、すなわち、１．５８８±０．０２５マイクロメータ直径のポリスチレン球体（０．０１６マイクロメータの標準偏差）の試料、ランブルべん毛虫とクリプトスポリジウムパーバムの測定データに対する結果を示す。

Claims

顕微鏡的微粒子を定量および定性測定用に素早く検出して同定する方法であって、
ａ）試料室内に含まれた制御液体内に被同定微粒子を浮遊する工程、
ｂ）強力光源に対して規定方向に試料室を保持する工程、
ｃ）前記光源により試料室を照明する工程、
ｄ）試料室を囲む光学センサのアレーを用いて試料室からの散乱光を集めて測定する工程、
ｅ）各瞬時にセンサのアレーから出力した電圧をディジタル検出器値に変換し、１つ以上のディジタル化検出器値の和により正規化して事象記述子を作る工程、
ｆ）派生信号を１組の発生頻度／確率ヒストグラムと比較し、統計的分類アルゴリズムを用いて存在する顕微鏡的微粒子の同定を可能にする工程、
から成ることを特徴とする方法。
被同定微粒子を気体中に浸けることを特徴とする請求項１記載の方法。
被同定微粒子を流体中に浸けることを特徴とする請求項１記載の方法。
各々が異なる波長で放出された複数の共に整列したレーザにより強力光源を作ることを特徴とする請求項１記載の方法。
単一多波長レーザにより強力光源を作ることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサが固体光起電力素子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサが固体光電流素子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサが固体アバランシェ素子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサが光電子倍増素子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサが偏光アナライザを組み込み、ある偏光方向にのみセンサの感度を持たせることを特徴とする請求項１記載の方法。
光センサがファイバ光学ケーブルを用いて入射光を集め、この光を検出器に移送することを特徴とする請求項１記載の方法。
光ファイバーケーブルが偏光アナライザを組み込み、このケーブルをある偏光方向のみに感度を持たせることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
試料室がガラス瓶であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
試料室がプラスチック薬瓶であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
試料室が流体の連続流を可能にすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
確率ヒストグラムが、各微粒子種に対する一次元ヒストグラムにおいて生じるｎ次（ｎは整数）判別関数のうちの１つの関数であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
ｎ次元ヒストグラムと各関数に対するｎ次判別関数の全組を同定の際にライブラリにセーブすることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
同定ライブラリにおけるｎ次元確率ヒストグラムと各ヒストグラムに対するｎ次判別関数との全組をあらかじめメモリ手段から検索することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
各微粒子種に対する確率ヒストグラムに基づく統計的分類アルゴリズムの出力を、閾値を超えれば１の単一値に、また閾値より下であれば０の値に減らすことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
前記試料室が微粒子循環手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
微粒子循環手段が試料室の外側に取付けたヒータであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
前記ヒータを試料室の底部に取付けることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
微粒子循環手段が試料室の外側に取付けたクーラであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
前記クーラが熱電素子であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
事象検出器値が事象中に各センサにより測定した最大値であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
事象記述子がある瞬時にディジタル検出器値に等しいことを特徴とする請求項１の記載の方法。
顕微鏡的微粒子を定量および定性測定用に素早く検出して同定する装置であって、
ａ）ビームウエストを作る偏光レーザ、
ｂ）レーザビームウエストの当該共通領域を曖昧さなしに見えるように位置決めされ方向づけられた光検出器で、複数の光検出器を含む光学シャーシ、
ｃ）被分析流体試料を含む試料室、
ｄ）レーザビームウエストに関して規定方向に、且つ、光検出器の当該共通領域に試料室を保持する手段、
ｅ）試料内に微粒子をレーザビームウエストを通じて循環させる手段、
ｆ）暗密閉容器を作るために光源と光学シャーシをカバーする手段、
ｇ）検出器により測定した光強度値をディジタル値に変換する手段、
ｈ）ディジタル値を計算機に連続して入力する手段、
ｉ）ディジタル測定値に基づく当該共通領域で粒子が光ビームに入るときを決める手段、
ｊ）ディジタル値を較正値に変換する手段、
ｋ）ディジタル化された較正事象データから事象記述子を抽出する手段、
ｌ）事象記述子から判別関数値を計算する手段、
ｍ）測定値から計算した判別関数値が特定微粒子種に起因する確率を計算できる確率ヒストグラムを形成する手段、
ｎ）最有効判別関数を同定する手段、
ｏ）同定される各微粒子種に対する１つのヒストグラムと各判別関数で、確率ヒストグラムと判別関数を同定ライブラリに記憶する手段、
ｐ）この同定ライブラリにより同定される各微粒子に対する１つの確率ヒストグラムと各判別関数で、先に記憶した確率ヒストグラムと判別関数を検索する手段、
ｑ）判別関数の任意値に対するライブラリ内の各微粒子種の確率を計算する手段、
ｒ）同定ライブラリで同定される各微粒子種の確率を組合わせる手段、
ｓ）未知微粒子を閾値に基づいて同定する手段、
から成ることを特徴とする装置。