JP2004035521A - Liquid-phase peptide synthesizer - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸を特定の順序でペプチド結合してなるペプチドの合成装置に関し、特に、相溶状態と相分離状態とが温度で可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に利用してペプチドの量産を可能にする液相ペプチド合成装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学、薬学、生物学など広範囲の分野においてペプチドの合成技術の重要性はいうまでもない。アミノ酸を特定の順序でペプチド結合させたペプチドは、抗原−抗体相互作用の研究、臨床診断に利用するペプチド抗原の研究、種々の遺伝子研究などきわめて多くの研究にかかわる。免疫でも感染源でもタンパク質の活性はたかだかアミノ酸５個から１０個が結合したペプチドで決まる。したがって、その部分の合成は非常に重要であり研究用として多くの需要がある。
【０００３】
もちろんアミノ酸１０個以上結合したペプチドも重要である。合成可能とされるペプチドの結合数（残基数）の限界は５０程度であり、このアミノ酸結合数の限界を超えたペプチドの合成技術も望まれている。
【０００４】
研究の成果として、特定のタンパクやペプチドの薬効が検証されれば、化学合成ワクチン等の医薬品向けペプチドの大量需要が発生する。よって、商用規模の大量の需要に対応できるペプチド量産技術が強く望まれている。
【０００５】
化学的にアミノ酸を連結していくペプチド合成法は化学合成法と呼ばれ、本発明の装置のプロセスはこれに含まれる。これ以外にも、目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを調製して宿主細胞等に発現させる遺伝子組換え法がある。しかしこれは手間がかかりコスト高で量産には向かない。
【０００６】
その理由は、遺伝子組換え法で５０アミノ酸（残基）以上のペプチドを合成するには、まずそのアミノ酸をコードする１５０ヌクレオチド以上のＤＮＡを人工合成しなければならないからである。しかも、この方法ではＤ体のアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸誘導体を含むペプチドは合成できない。ここで、アミノ酸誘導体を含むペプチドとは、ペプチドのアミノ酸残基に任意化合物が結合したものである。
【０００７】
また、まず短い部分ペプチド（セグメント）を合成してから、それらを側鎖保護基が付いた状
態でカップリングさせるセグメント縮合法がある。しかし、この方法も複数の工程を必要とする
上、各セグメントのＣ末端アミノ酸がＧｌｙ、 Ｐｒｏなど特定のアミノ酸でなければならず、セグメント設計上の制約がある。
【０００８】
量産をねらって反応の自由度が大きく、反応選択性が小さい化学合成法（従来の液相法）をもちいた場合には、アミノ基とカルボキシル基とがとり違えられ結合したり、アミノ酸自体の異性体が間違って結合したりしてしまう。さらに、反応後に多量の試薬、触媒、反応補助剤、副生成物などが残留する。そのため合成反応を行った後、クロマトグラフィなどによって目的とする生成物を分離精製するプロセスを必要とするが、目的とするペプチドの収率が極めて悪いことが多い。そのため、一般の液相法（反応選択性が小さい従来の液相法）はほとんど用いられていない。
【０００９】
反応選択性を向上させ副生成物の発生を抑えるため、固体表面に化学的にアミノ酸を連結していく、固相合成法が現在のペプチド合成の主流となっている。この固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）は、メリフイールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）により開発された。
【００１０】
固相ペプチド合成法を図１〜図２で説明する。固相ペプチド合成では、合成すべきペプチドのカルボキシル基側末端（Ｃ末端）のアミノ酸を、不溶性の微小樹脂（レジンなど）ビーズの表面に化学的に結合させる。この微小樹脂ビーズは固体であり、アミノ酸を担持しつつ結合していくので、「固体担体」と呼ばれる。図１〜図２の９が、固体担体である。
【００１１】
固体担体に結合されたＣ末端アミノ酸のアミノ基側末端（Ｎ末端）に、さらに結合すべきアミノ酸を用意する。この結合すべきアミノ酸では、Ｎ末端を不活性化、Ｃ末端を活性化する処理を行う。この操作を結合前処理と呼ぶことにする。不活性化は、Ｎ末端にＦｍｏｃ （９−ｆｌｏｕｒｅｎｙｌｍｅｔｈｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ） あるいはｔ−Ｂｏｃ （ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ） あるいはＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）などの反応保護基を結合させる。
【００１２】
図１〜図２の１２が、結合すべきアミノ酸に結合前処理をした化合物である。１２の「Ｘ」は、Ｃ末端の活性化基である。このようにして、Ｎ末端の反応をブロックしてＣ末端のみ反応させるのである。
【００１３】
固体担体に結合されたアミノ酸のＮ末端にも保護基が結合されているので、この保護基を図中の１０の操作で除去する。それに続いて、その活性化されたＮ末端にＣ末端を活性化した１２をペプチド結合させる反応操作１１を行う。ペプチド合成反応温度は、アミノ酸が変性しない５０℃程度の比較的低温であり、反応促進剤の添加など公知の方法を適用して行う。その反応後、未反応アミノ酸を洗浄除去する。
【００１４】
図１では、合成すべきペプチドのＣ末端から二つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２）がペプチド結合された部分ができあがる。それに続く図２では、三つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）がペプチド結合された部分ができあがる。こういった操作を繰り返して合成すべきペプチドを得る。
【００１５】
ペプチド結合が完了したら、Ｃ末端を固体担体から開裂させ、必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。この工程は、クリーベイジ（ｃｌｅａｖａｇｅ）と呼ばれる。
【００１６】
このようにアミノ酸を１種ずつ添加結合することで、反応の自由度、選択性をきわめて小さく
し、所望のアミノ酸を所望の順序でペプチド結合させ、所望のペプチドを合成する。固相ペプチド合成では、不溶性の微小樹脂ビーズをアミノ酸系物質の「担体」として用いることに特徴がある。（ここで「アミノ酸系物質」とは、単独のアミノ酸あるいはアミノ酸残基、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドを含む。）固体担体の素材としてはガラス、シリカ、合成樹脂などが知られているが、合成樹脂が最も普通に使用されている。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、固相ペプチド合成も欠点がある。固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、液相反応に比べると反応が起こりにくい。すなわち、固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり、その巨大分子のごく小さな反応部にアミノ酸を結合させる必要があるが、それが確率的に起こりにくい。そのため高価なアミノ酸反応試薬１２を大量に供給しなければならない。通常反応量の１００倍程度を供給する。その結果として反応に関与できない反応試薬が大量に発生し無駄になる。
【００１８】
しかも、ｎ番目のアミノ酸の未反応部には次の結合工程で、ｎ＋１番目のアミノ酸がｎ番目として結合してしまうので所望のペプチドではない不純物となってしまう。こういった未反応が、個々の結合反応で５％しか発生しないとしても、５０アミノ酸（残基）のペプチドを合成すると、最終的な収率はたったの７．７％となってしまう（０．９５の５０乗）。３０アミノ酸（残基）でも２１．５％である（０．９５の３０乗）。
【００１９】
このように、固相ペプチド合成では個々のペプチド結合の未反応を極力減らすべく、前記のように反応試薬を大量に使用せざるを得ないというコスト面での問題、および反応時間を十二分に長く取らざるを得ない、といった生産効率上の問題があった。
【００２０】
この他にも固相ペプチド合成では、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができない、固体担体が微小とはいえ数ミクロンの大きさがあるため反応槽をスケールアップすると、巨大なものになってしまう、固相担体が高価で再利用ができない（使い捨て）といった問題があった。
【００２１】
本発明は、上記のような従来のペプチド合成装置の問題を解決すべく、相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に用いたペプチド合成装置を提供するものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、本案発明者による特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」を利用した液相ペプチド合成装置であって、より具体的には、本案発明者による特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示された方法を実現する装置である。
【００２３】
＜液相ペプチド合成法の溶媒セット＞ まず、相溶性−多相有機溶媒システムを説明し、次にそれを用いた液相ペプチド合成法を説明する。図３が相溶性−多相有機溶媒システムを構成する具体的な溶媒の組み合わせの実験写真である。
【００２４】
特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」にて、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒のセット（組み合わせ）が開示されている。ここで第一の溶媒と第二の溶媒のそれぞれは、複数の溶媒の混合溶媒でもよい。
【００２５】
図３は第一の溶媒と第二の溶媒を混合した例であり、下層の第二の溶媒に染色剤を混合して可視化してある。これらの溶媒の組み合わせ（以下溶媒セットと記載する）にて、２５℃では相分離状態（図３ａ）、これを４５℃に加熱すると相溶状態（図３ｂ）となる。これを冷却すると相分離状態に戻る。図３のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは時間を追って撮影したものを順に並べたもので、ｃ、ｄは４５℃から２５℃に冷却される中間状態である。この実験の溶媒セットは、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆変化することがわかる。
【００２６】
液相ペプチド合成に好適な溶媒セットは、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示されているように、一方の溶媒または混合溶媒（第一の溶媒）を構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなる。
【００２７】
第一の溶媒は、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などで、中でも好ましいものが、シクロアルカン系の化合物であり、特に好適なものとして「シクロヘキサン」を挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連していると推測できる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点もあり、最終工程である回収工程でもメリットがありこの面からも好ましい。回収工程はあとで説明する。
【００２８】
一方、第一の溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒（第二の溶媒）を構成する有機溶媒は、基本的には高極性有機溶媒である。好ましいものとしては、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものである。
【００２９】
第二の溶媒は、さらに具体的には、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が１、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、またハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下である。
【００３０】
上記の第一の溶媒と第二の溶媒との溶媒セットは、図３のように温度により、可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態（相溶状態）と複数相に分離した分離溶媒系の状態（相分離状態）とを可逆的に取り得る。
【００３１】
＜相溶化温度＞ 第一の溶媒あるいは第二の溶媒の構成を変えることによって、相溶状態と相分離状態が切り替わる温度も自在に変えることができる。たとえば、図１８が第一の溶媒であるシクロヘキサン（ＣＨ）と第二の溶媒であるニトロアルカン混合溶媒（ＮＡ）の構成と相溶化温度の変化の説明図である。パラメータとしてＣＨとＮＡの容積比を１：５、２：５、１：１、５：１とし、それぞれのＮＡを構成しているニトロメタン（ＮＭ）とニトロエタン（ＮＥ）の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３２】
また、図１９は第一の溶媒であるシクロヘキサン（ＣＨ）と第二の溶媒を１：１の等容積（それぞれ５０容積％）と固定して、第二の溶媒を、ニトロメタン（ＮＭ）とニトロエタン（ＮＥ）の混合溶媒、または、アセトニトリル（ＡＮ）とプロピオニトリル（ＰＮ）の混合溶媒、または、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の混合溶媒として、第二の溶媒の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３３】
図１８、図１９より、２０℃から６０℃の温度で相溶化温度が、第一・第二の溶媒構成で変化することがわかる。換言すれば、第一の溶媒と第二の溶媒のセットにおいて、第一・第二の溶媒構成を変える手段をもつことによって、両溶媒の相溶化温度を変えることができる。つまり相溶化状態での化学反応を温度が低いレベルでも可能になしうる。
【００３４】
第一・第二の溶媒構成は、第一の溶媒と第二の溶媒の混合比でもよいし、混合溶媒である第一の溶媒あるいは第二の溶媒をなす混合溶媒要素の混合比でもよい。構成変化手段は、第一の溶媒と第二の溶媒の供給混合に際して、前記構成を変化させるべく、第一の溶媒あるいは第二の溶媒の供給量を加減調整したり、新たに混合溶媒要素を付加したりすればよい。
【００３５】
上記のように相溶化温度が変えられることを加味し、混合前の第一・第二溶媒の供給量は、それらに溶解されるアミノ酸、アミノ酸系物質で行うペプチド合成の温度をどうするかを考慮し図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。当然のことながら反応のための温度制御の温度も図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。
【００３６】
＜液体担体＞ さて、特願２００１−３８５４９３（液相ペプチド合成法）において上記の溶媒セットを用いてアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法を提案しているが、この合成法にて溶媒セットと共に重要なものは、固相ペプチド合成の固体担体に相当する「液体の担体」である。
【００３７】
これは、特願２００１−２５４１０９（溶媒システム）において、「第一の溶媒あるいは第二の溶媒いずれか一方のみ溶解する反応に関与する化学成分」と記載したものに相当する。
【００３８】
すなわち、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体の担体である。機能について固体担体と等価であるので、本明細書ではこれを「液体担体」と呼称する。この液体担体について説明する。
【００３９】
従来技術の固相表面反応を液相の反応に置換すれば、従来問題であった反応性の悪さ（固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり反応部位に接近しにくい）を改善できる。さらに、前述の相分離する溶媒セットをうまく使えば、得られた反応生成物の分離が極めて容易に実現できる。このように画期的な利点をもつ液相ペプチド合成法の実現には、固相ペプチド合成の固体担体に相当する液体の担体が必要で、発明者はこれを見出した。その液体担体は以下の機能を必要とする。
【００４０】
すなわち、液体担体はペプチドの形成を開始するアミノ酸との結合部を有すること、アミノ酸を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持できること、さらにアミノ酸と結合した化合物および合成中のペプチド鎖を担持した化合物が、第一の溶媒に溶解されること、である。
【００４１】
これら機能を持つ液体担体の候補化合物は、親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するものであることを特徴とする下記の一般式Ａ（化１）で表される芳香族炭化水素環または炭素数１０以上の炭化水素基を基本骨格化合物である。
【００４２】
【化１】
一般式Ａ（化１）において、Ｌ１は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線とも結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団である。
【００４４】
一般式Ａ（化１）において、点線はＨとの結合または前記Ｌ１と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団の結合であり、ＸはＯ、Ｓ、Ｎ、エステル基、スルフィド基またはイミノ基であり、Ｒは、シクロアルカン系の溶剤への溶解性を高めるＯ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基である。また、ｎは１〜５の整数である。
【００４５】
一般式Ａ（化１）は、より具体的には、下記の一般式群Ｂ（化２）から選択される。一般式群Ｂ（化２）において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａ（化１）と同じ。Ｑは、単結合または炭化水素基であり、Ｒ２はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ３およびＲ４は、一般式Ｃ（化３）の基である。また、一般式Ｃ（化３）のＲ５は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。
【００４６】
【化２】
【化３】
前に説明した第一の溶媒は、分離状態において、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解するが、液体担体と結合していないアミノ酸（ペプチド結合させるべきアミノ酸）は溶解しない（難溶である）。ここで、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドである。
【００４９】
また逆に、第二の溶媒は、分離状態において、アミノ酸（ペプチド結合させるアミノ酸）を溶解するが、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解しない（難溶である）特性を持っている。
【００５０】
液体担体の好適な具体例を図４の１に示す。１は、前記の一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ１８Ｈ３７−であり、ＸがＯであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ２であり、Ｒ２がＯＨである。名称は、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔（３，４，５−ｔｒｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎ−１−ｏｌ 〕である。この液体担体１は、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する。
【００５１】
本案は１に限定されることはないが以下、この液体担体具体例１を用いて、本案装置のプロセスである液相ペプチド合成法を説明する。図４から図６は、固相ペプチド合成法の固体担体９を液体担体１に置換した本案液相ペプチド合成の説明図である。図４から図６は、図１、図２に対応している。図４の２は、液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分である。
【００５２】
図４は、Ｎ末端を保護され、Ｃ末端を活性化された（活性化基Ｘを結合された）Ｒ１残基アミノ酸１２のＣ末端を、液体担体１に結合する反応（図４中の８）を示す反応フロー図である。ここで、液体担体１は、第一の溶媒（Ａ）に１が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）という溶液の状態であり、Ｒ１残基アミノ酸１２は、あらかじめ第二の溶媒（Ｂ）に溶解され、第二溶媒溶液（Ｂ１２）として準備される。（Ａ、Ｂ、Ａ１、Ｂ１２という標記は図４から図６には記載されていないが、これらは後に説明される図１０から図１４に対応している）
【００５３】
前記第一の溶媒（Ａ）に１が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）と、Ｒ１残基アミノ酸１２が第二の溶媒（Ｂ）に溶解された第二溶媒溶液（Ｂ１２）とが混合される。第二溶媒溶液（Ｂ１２）は多少過剰に投入されるのが好ましい。その理由は、相対的に第一溶媒溶液が多いとすべてのペプチド反応が生じても、未反応の末端をもつ担体が残留するからである。これは固相合成法と同様であるが、固相合成法のように必要量の１００倍も過剰に投入する必要はない。
【００５４】
両溶液混合後、それらが相溶状態となる温度に加熱される。すると、液体担体１の末端はアミノ酸と結合する水酸基であるので、Ｒ１残基アミノ酸Ｃ末端とペプチド結合反応（図４中の８）して１ａｆとなる。この１ａｆも、相溶化状態の両溶媒に溶けている。
【００５５】
ペプチド反応後、固相合成では未反応アミノ酸等との分離のために洗浄除去などを行っていたが、本発明では、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却すればよい。このことで、１ａｆは分離された第一の溶媒（Ａ）に溶解されたＡ１ａｆとして、第二溶媒溶液から分離される。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。
【００５６】
排除される第二溶媒溶液中には、過剰に投入したため未反応で残留したＲ１残基アミノ酸、および反応副生物などが溶解している。この分離操作は、従来と比較にならない単純操作であり、かつ不純物の混入もきわめて少ない。したがってクロマトグラフィ等による精製工程も省略が可能である。
【００５７】
分離状態にある第一・第二溶媒溶液にて、第二溶媒溶液を排除するのであるが、この排除操作で第一溶媒溶液だけが残留することが重要である。したがって歩留まりは悪くなるが、第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。残留した第一溶媒溶液には、１にＲ１残基アミノ酸Ｃ末端が結合した１ａｆが溶解している（Ａ１ａｆ）。
【００５８】
次の工程である図５では、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図５中の１０）する。図４同様に、Ｎ末端を保護したＲ２残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ａと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。同様に第二溶媒溶液Ｂ１２は過剰に混合されるのが好ましい。
【００５９】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ａと、Ｒ２残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図５中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆができる。
【００６０】
上記ペプチド反応後、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却し、１ｂｆを分離された第一溶媒溶液に溶解されたＡ１ｂｆとし、第二溶媒溶液から分離する。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。同様に第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。
【００６１】
次の工程である図６も同様に、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図６中の１０）する。同様に、Ｎ末端を保護したＲ３残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ｂと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。
【００６２】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ｂと、Ｒ３残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図６中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基ペプチドが結合した物質１ｃｆができる。以下同様の操作でペプチドを伸長させていく。
【００６３】
このように一連のペプチド結合を行い、それが完了したら、ペプチドＣ末端を液体担体から必要に応じて開裂し、同じく必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。このクリーベイジ（ｃｌｅａｖａｇｅ）工程は固相合成と同様である。すなわち、液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存してもよい。開裂後のペプチドＮ末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【００６４】
固相合成との大きな相違は、溶媒に溶解された溶液での反応であるので、ペプチド合成の個々のペプチド結合での未反応がきわめて少ないことである。したがって、多少は過剰に加えるものの、固相合成のように１００倍といった大量の反応試薬を過剰に投入しなくともよい。液相反応なので当然反応時間も短縮される。
【００６５】
また、溶媒を染料等で着色するなどして、目的の反応の進行を色によって確認することもできる。さらにまた、反応槽などからなる後述の装置のスケールアップも通常の液相プロセス同様に容易に可能となる。
【００６６】
Ｒ１をバリン（Ｖａｌ）、Ｒ２をグリシン（Ｇｌｙ）、Ｒ３をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）とした図４から図６のペプチド液相合成を実施した結果、収率は９５％、９７％、９９％であった。（図２０参照）収率１００％とならないのは、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質が、第二の溶媒に全く溶解しないと言うのではないためである。（難溶性であるためである。）
【００６７】
＜液相ペプチド合成装置＞ 本案の装置を説明する。本案装置は、以上説明した液相ペプチド合成を行う装置である。すなわち、第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせ、および第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体担体を用いて、該液体担体に合成すべきペプチド鎖のアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成装置である。
【００６８】
本案の液相ペプチド合成装置の第一例を図７に示す。本案の液相ペプチド合成装置は、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した、第二溶媒溶液を供給する手段（図７の５）に連結され、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した、第一溶媒溶液と、供給された第二溶媒溶液とを混合する混合槽（図７の３）と、前記混合槽の温度を、混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度、または混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御する混合槽の温度制御手段（図７の６）と、前記混合槽の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段（図７の２０）と、該手段によって得られる界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定量に基づいて混合槽から第二溶媒溶液を排除する手段（図７の７）とを有する。
【００６９】
ここで、アミノ酸とは、アミノ酸残基に任意化合物が結合したアミノ酸誘導物質を含むものであり、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドであり、結合前処理とは、合成すべきペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基側末端を不活性化、カルボキシル基側を活性化する処理である。
【００７０】
合成工程の初期にて、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）によって、あらかじめ液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液を混合槽３に供給する。あるいは、液体担体、第一の溶媒をそれぞれ個別に供給して混合槽３で溶解してもよい。説明の簡単のため、液体担体を１とし、第一の溶媒をＡ、第一の溶媒に液体担体を溶解した第一溶媒溶液をＡ１と記載する。
【００７１】
第二の溶媒をＢと記載し、Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後のアミノ酸を１２と記載し、１２をＢに溶解した、第二溶媒溶液をＢ１２と記載する。合成工程の初期に、混合槽３に供給されたＡ１にＢ１２が供給され混合される。
【００７２】
混合槽３には、温度制御手段６が配備されている。これは公知の加熱ヒータや湯浴や高温ガスによる加熱装置、ぺルチェ素子や冷浴や低温ガスによる冷却装置を任意に採用すればよい。なお図７にて、Ａ０は任意物質を溶解した第一溶媒溶液を示す。Ａ０には、Ａ１、Ａ１ａ、Ａ１ａｆ、Ａ１ｂ、Ａ１ｂｆ、Ａ１ｃ、Ａ１ｃｆ が例として含まれる。これらの意味は符号の説明の項を参照のこと。
【００７３】
混合槽３へＢ１２を供給する手段５が、３に連結されており、これはＢ１２の準備槽４からＢ１２を移送する流路（配管）５ａ、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプ５ｂなどで構成されている。図７に示すように複数の準備槽を配備し、結合前処理後の異なったアミノ酸を第二の溶媒Ｂに溶解させ、あらかじめ準備しておくと便利である。
【００７４】
すなわち、図７のごとく複数のＢ１２の準備槽４から、逐次合成すべき結合前処理後のアミノ酸が選択的に混合槽３へ供給される構成が好適である。
【００７５】
混合槽３に前記第二溶媒溶液Ｂ１２とが供給され、Ａ１（Ａ０）と混合され、温度制御手段６にて、相溶状態にする。その制御温度は、混合槽３に初期供給された第一溶媒溶液の供給量および溶液成分、第二溶媒溶液Ｂ１２の供給量および溶液成分に基づいて決める。具体的には、第一第二の溶媒溶液の種類（溶媒の種類、混同比、溶媒に溶解された液体担体やアミノ酸系物質の種類）および供給手段による供給量が既知であるので、それらと図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で決められる。
【００７６】
また第一第二の溶媒溶液の供給量自体も、あらかじめ図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で調整し、合成反応の温度を適切なものにすることも制御設計上可能である。
【００７７】
すなわち、混合槽の温度制御手段が、混合槽の第一溶媒溶液の量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて温度を制御するのが好適であり、かつ第二溶媒溶液を供給する手段の供給量が、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて決定されるのが好適である。溶液供給量の制御については図２３を用いて後で説明する。
【００７８】
ここで、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【００７９】
相溶状態でペプチド合成反応が行われる。この反応の終了は、たとえば溶媒の着色などによる反応マーカで確認することもできる。もちろん、供給量と反応時間のデータをあらかじめ採取しておき、反応時間で反応終了を判定してもよい。その判定後、相溶化温度より低温である任意の温度に冷却して相分離状態とする。
【００８０】
相分離状態で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する。界面の位置がわかれば、既知である混合槽の形状、容量にて、第二溶媒溶液の量の判定は容易である。よって界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定する。
【００８１】
前記第二溶媒溶液の判定量に基づいて、混合槽３より第二溶媒溶液を排除手段７で排除する。この排除の量は、第二溶媒溶液が完全に排除されるように、前記判定された第二溶媒溶液量よりも多少多めが好適である。図７の７ａは７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなどである。
【００８２】
第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０は、たとえば図８のように混合槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）２０ａ、２０ａのセンサーヘッド２０ｂとからなるものであって、センサーヘッド電極間の導電率など溶液の電気特性を検出し、その相違で界面を検出するもの等を採用すればよい。なお、２０ｃは２０ａの内部電気配線である。
【００８３】
図９は、図中に第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０を別の例とした本案装置の第二例（温度制御手段６は省略した）である。図９中の２０ｅは、光（放射エネルギー）発生器であり、２０ｆは、光（放射エネルギー）受信器である。この受信器で溶液の光学特性、エネルギー透過特性を検知し、その相違で界面を検出する。
【００８４】
界面検知を容易とするために、一方の溶媒に染料を添加して着色するなどすれば上記の光学的界面検知手段は有効であろう。なお図９中、混合槽３の部分のＢ０は、反応後の第二溶媒溶液で未反応の１２、その他の副産物も第二の溶媒に溶解しているのでＢ０（任意物質を溶解した第二溶媒溶液）と記載した。
【００８５】
図１０から図１４が、初期工程の後の本案装置でのペプチド合成工程の説明図である。これらは図４から図６の反応フロー図に対応している。すなわち、図４にて液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合させるまでが図１０の（ａ）（ｂ）（ｃ）である。図１０（ｃ）では、温度制御手段６は相溶化温度に制御されている（６ａ）。
【００８６】
図１１は次工程であり、温度制御手段６を相分離温度として（６ｂ）、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１１（ｅ））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１１（ｆ））。ついで図１２にて、液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質にＲ２残基アミノ酸を結合させる（図１２の（ｇ）（ｈ）（ｉ））。図５の活性化反応１０は省略されている。
【００８７】
以下同様に、図１３は、温度制御手段６を６ｂとして第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１３（ｋ））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１３（ｌ））。ついで図１４にて、液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質にＲ３残基アミノ酸を結合させる（図１４の（ｍ）（ｎ）（ｏ））。図６の活性化反応１０は、混合槽内で行われるが省略されている。
【００８８】
図１５は、本案の液相ペプチド合成装置の第三例であって、これは前例の混合槽３は混合と反応専用とし、これに加えて分離専用の分離槽１７を設けた例である。これらはそれぞれ相溶温度、相分離温度に制御されている。すなわち、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御された混合槽３と、混合槽内で相溶状態となった第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送手段１６を介して、該混合槽と連結され、移送された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に温度制御された分離槽１７と、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段（図１５では省略）と、前記第二溶媒溶液の量に基づいて分離槽から第二溶媒溶液を排除する手段１８とを有する。
【００８９】
混合と反応専用の混合槽には、第一の溶媒に、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解した、第一溶媒溶液（Ａ０）を供給する手段、および第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液（Ｂ１２）を供給する手段が連結されている。
【００９０】
図１５の構成では、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された第一溶媒溶液（Ａ０）が、再度混合槽３に戻って供給される。すなわち、混合槽３に供給される第一溶媒溶液が、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液である。つまり、混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段が、分離槽１７の残留第一溶媒溶液を混合槽に移送する移送手段である。
【００９１】
図１５の構成は、より正確には図２１に示すように、Ａ１を混合槽に供給する手段が配備されている。また、図２１に示すようにＮ末端の保護基であるＦｍｏｃ等を除去して活性化する操作（工程）１０をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段１０ａが付帯配備されている。図２１にて、前述の混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段は、この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されている。この太点線ルートで分離槽１７の残留第一溶媒溶液が混合槽に移送される。
【００９２】
もちろん、第一例、第二例のように末端活性化反応１０を、混合槽３内、または分離槽１７内で行なってもよい。図１５中の１６ａは、１６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどであり、図中の１８は、第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段で、１８ａは、１８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどである。
【００９３】
図１５のように上方に混合槽、下方に分離槽を配備すれば、１６による第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送は容易である。混合槽で相溶化された第一・第二溶媒溶液が重力で落下して、分離槽に移送され、そこで相分離温度となって分離する。分離状態で、判定手段１８にて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定に基づいて第二溶媒溶液（Ｂ０）を排除する。
【００９４】
混合槽、分離槽の制御温度は、第一例第二例と同様に、混合槽に供給される第一溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９５】
また、第一溶媒溶液を供給する手段の供給量、および第二溶媒溶液を供給する手段の供給量自体も、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９６】
ここでも前に説明した通り、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分であって、これらで図１８、図１９等のデータを参照する。
【００９７】
第二溶媒溶液の量を判定して排除する手段１８では、前に説明した分離槽内の界面検出手段（図１５では省略）による第一・第二溶媒溶液界面の検出に基づいて量を判定して排除操作をすればよい。この説明は略す。
【００９８】
一方図１７は、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する別の手段を説明する図である。すなわち、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽３に供給される第一溶媒（Ａ０）および第二溶媒溶液（Ｂ１２）のそれぞれ供給量およびそれぞれ溶液成分と、相溶状態の混合槽３の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段１９を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである。
【００９９】
ここでも、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および
第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【０１００】
これら反応条件と反応前化合物の条件が既知であるので結合反応が予測できる。つまり、分離槽１７のペプチド結合反応は、３に供給される溶液の成分と量、および反応活性化試薬など既知の反応条件情報から予測が可能である。理論的な予測が困難でも、同じ条件で実験データをあらかじめ採取しておいて、実験データから外挿内挿するなどの方法でも可能である。その場合には実験データをテーブル化して推定手段１９に記憶させて引用すればよい。
【０１０１】
推定には、図１７に示すように分離槽の温度、混合槽から分離槽に移送される相溶状態の溶液量を入力して用いてもよい。このようにして分離槽１７での反応を推定し、その推定に基づいてペプチド反応による第一・第二溶媒溶液の量の変化を推定し、センサーレスで分離された分離槽の第二溶媒溶液の量を１８で判定するものである。もちろん前記の界面検知手段等のセンサーと組み合わせて、より精度の高い量の判定を行ってもよい。
【０１０２】
判定された量に基づいて、たとえば流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど（１８ａ）で流量を計測しながら分離槽１７から第二溶媒溶液を排除する。流量センサーなどの流量制御系の図示は略した。
【０１０３】
図１７で説明した第二溶媒溶液の量を判定する手段は、分離槽をもたない混合槽のみである本案第一例（図７）、第二例（図９）でも適用が可能である。すなわち、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽の第一・第二溶媒溶液の量および溶液成分と、相溶状態の混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定すればよい。
【０１０４】
図１６は、本案の液相ペプチド合成装置の第四例であって、工程を連続化した量産向けの装置である。図１６にて１６，１８は省略した。このような構成であれば、複数の別種のペプチドを連続して流れ作業的に合成できる。すなわち、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変えてアミノ酸を結合させればよい。
【０１０５】
図１６の構成の特徴は、混合槽と、該混合槽と連結された分離槽とからなる、複数組の混合槽・分離槽の組み合わせを有し、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に供給される第一溶媒溶液が、他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液となっていることである。
【０１０６】
図１６にて、Ｎ末端の保護基を除去して活性化する操作（工程）１０をなす末端活性化手段１０ａが図示されている。この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されているルートが、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に第一溶媒溶液を供給する手段であって、これが他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽の残留第一溶媒溶液をひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に移送する移送手段である。
【０１０７】
図１６の第四例にて、それぞれの混合槽に供給される第二溶媒溶液Ｂ１２の種類を固定する。すなわち、合成すべきアミノ酸の種類を固定した混合槽・分離槽、たとえば、バリン結合用混合槽・分離槽、グルタミン酸結合用混合槽・分離槽、フェニルアラニン結合用混合槽・分離槽・・・などを近接して配列配備する。そして、合成すべきペプチドのアミノ酸結合順に応じて、分離槽から混合槽に移送する移送手段の連結が自在に切り替えできる装置構成としてもよい。
【０１０８】
すなわち、図１６にて１０ａを介して分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示される部分の配管系にて、切り替え弁などを配備して、分離槽で出た第一溶媒溶液が次に結合されるアミノ酸結合用の混合槽に移送されるよう切り替え自在とする構成である。
【０１０９】
こういった切り替えを実施すると切り替え前の残留物による不純物混入が懸念されるが、図１６中１０ａの末端活性化手段に不純物浄化の工程をおこなう手段を追加配備すれば問題解決できる。これは配管系を固定し、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変える前述の構成でも同様である。
【０１１０】
図２２は、本案の液相ペプチド合成装置の第五例であり、２組の混合槽・分離槽の組み合わせ構成の例である。このように２組、３組（例示略）・・・などと複数組を組み合わせておけば、ペプチドの回収工程操作や混合槽・分離槽の不純物除去、洗浄操作を行いやすい。第五例の説明は第三例、第四例と同様であるので略す。
【０１１１】
＜溶液供給量の制御＞図２３は、図１８、図１９等の相溶化温度のデータに基づいて混合槽への溶液量を制御することの説明図である。図１８、図１９に示したような溶液成分とその混合比率によって相溶化温度が変化するデータが図２３の３０にデータベースとして記憶されている。この３０は、Ｂ１２、Ａ１ｘの成分（溶媒Ａ、溶媒Ｂの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報３５を入力し、データベースの相溶化温度変化データを参照して最適な溶液比、溶液量を決定する。
【０１１２】
３０は第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段３１に最適な溶液比、溶液量を出力し、３１はＢ１２の供給量の制御手段（流量制御装置）３３、Ａ１ｘの供給量の制御手段（流量制御装置）３４へ制御指令を出力する。
【０１１３】
溶液比の最適化に際して、必要に応じて第一の溶媒のみ、あるいは第二の溶媒のみを付加的に追加供給すれば溶液比、溶液量の制御自由度が増し、好適である。したがって、第一・第二の溶媒の準備槽Ａｔａｎｋ・Ｂｔａｎｋと、第一・第二の溶媒Ａ・Ｂを混合槽に供給する手段と、付加追加量の制御手段（流量制御装置）３２を配備し、３１の制御指令が３２に出力されるような構成とすればよい。
【０１１４】
この付加追加は、本装置の第一例から第五例いずれも適用が可能である。すなわち、混合槽あるいは分離槽に連結して、第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を供給する第一・第二溶媒の付加供給手段を配備し、この付加供給手段で溶媒を単独で付加的に混合槽に追加供給して溶媒比率を調整制御すればよい。これによって相溶化温度を変えることができる。
【０１１５】
＜追補＞排除手段７は、ここまで主として図示した混合槽あるいは分離槽の下方から溶液沈殿部を流出させる方式以外、混合槽あるいは分離槽の上方から溶液吸引手段で溶液上澄み部を吸い出す方式で排除する装置、混合槽あるいは分離槽の任意の部位から溶液を部分抽出する機能をもつその他の公知の溶液抽出装置を適用してもよい。
【０１１６】
また、ここまで説明したように、第二溶媒溶液を排除し、残留する第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成する装置構成とは逆に、第一溶媒溶液を逐次抽出して、その第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成していく構成を部分的に採用してもよい。
【０１１７】
合成したペプチドを回収する最終工程は、シクロヘキサンを第一溶媒に用いた場合、その融点が６．５℃であるので、それ以下に冷却して固体として分離し、その後加熱し、シクロヘキサンを蒸発除去することにより液体担体に結合したペプチドを回収する。
【０１１８】
液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存すればよい。開裂後のペプチドＮ末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【０１１９】
【実施例】
ペプチド合成実施例のフローを図２０に示す。図２０における具体的操作を以下実施例１に説明する。また、他の実施例を実施例２から実施例４に示す。以下の実施例では、液体担体を〔ＳＣ〕と一部略記する。これら実施例では、末端活性化反応１０は、混合槽で行なった。また、本案装置を構成する混合槽３、分離槽１７、準備槽４、温度制御手段６等の記載は省略した。実施例中のろ過、攪拌、濃縮乾固等を行なう、ろ過装置、攪拌装置、ロータリーエバポレーターなどは本案の装置構成に適宜付帯、付加すればよい。このような公知の装置を連結した構成とすることは容易である。
【０１２０】
実施例１
液体担体〔ＳＣ〕−バリン（Ｖａｌ）−グリシン（Ｇｌｙ）−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）−Ｆｍｏｃ 〔（ＳＣ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ〕 〕の液相合成。液体担体〔ＳＣ〕として、前記の（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔（３，４，５−ｔｒｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎ−１−ｏｌ 〕を用いる。
【０１２１】
工程１）
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１７０ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、さらにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１２５ｍｇを添加する。本溶液を室温にて１５分間撹拌した後、ろ過する。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、得られた残渣をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍＬ に溶解する。続いて液体担体〔ＳＣ〕を溶解したシクロヘキサン溶液（液体担体５０ｍｇ／３ｍＬ）３ＭｌをＤＭＦ溶液に添加する。それにＤＭＡＰ４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）６．５ｍｇを添加し、反応溶液を５０℃に加温し、３０分反応を行う。このときシクロヘキサン層とＤＭＦ層に分離していた溶液系は均一溶液系になる。
【０１２２】
反応終了後、反応溶液を室温に戻し、反応溶液を再び二相に分離させる。下層のＤＭＦ相を分離、除去し、１０％ジエチルアミン／ＤＭＦ溶液を３ｍＬ添加し、５０℃で２０分間攪拌する。反応液を冷却し、シクロヘキサン層を分離する。このシクロヘキサン層には液体担体結合バリン−ＮＨ２（〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２） が回収される。（収率９５％）
【０１２３】
工程２）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）２５ｍｇをＤＭＦ ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−グリシン−ＯＨ／ＤＭＦ溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２４】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ）を分離する。Ｆｍｏｃ基は同溶液にジエチルアミンを添加することにより、脱離し〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ を得る。（収率９７％）
【０１２５】
工程３）
つぎに、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）２５ｍｇをＤＭＦ ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−フェニルアラニ−ＯＨ／ＤＭＦ溶液として用いる。すなわち、この溶液２ ｍｌを５℃に冷却後工程２）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２６】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成された。（収率９９％）
【０１２７】
構造確認
〔ＳＣ〕シクロヘキサン液体担体；（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール〔（３，４，５−ｔｒｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎ−１−ｏｌ 〕。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）；５．５４（２Ｈ、ｓ）、４．５８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、３．９６（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９６（３Ｈ、ｓ）、１．８２−１．７０（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．４１（６Ｈ、ｍ）、１．３８−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．８８（９Ｈ，６，８Ｈｚ）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００Ｈｚ）；（１００ＭＨｚ δ：１５３．２，１３７．４，１３６．０，１０５．２、７３．４、６９．１、６５．７、３２．０、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２６．２、２２．８、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）、Ｃ６１Ｈ１１６Ｏ４に対する計算値 〔Ｍ＋Ｎａ〕＋ ９３５、実験値９３５．
【０１２８】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ；（ＣＤＣｌ３）δ７．７６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．６０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝２．６、７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、４．３８（２Ｈ、ｍ）、４．２９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．９４（６Ｈ、ｍ）、２．１９（１Ｈ、ｍ）、１，７８（４Ｈ、ｍ）、１．７３（２Ｈ、ｍ）、１．４５（８Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、δ１７２．０、１５６．２、１５３．２、１４３．８、１４１．３、１３８．４、１３０．２、１２８、３、１２７．７、１２７．１、１２５，１、１２０．０、１０７．１、７３．４、６９．２、６７．４、６７．１、５９．０、４７．２、３２．０、３１．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２．７、１４１；ＴＯＦ−ＭＳ（ＰＯＳ）ＭＦ、Ｃ８１Ｈ１３５ＮＯ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２５７、実験値１２５７
【０１２９】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ δ： ６．５４（２Ｈ、ｓ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５０３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１ Ｈｚ）、２．０７−２．０１（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７７（４Ｈ、ｍ）、１．７６−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、
０．８９−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ、１７５．４、１５３．２、１３８．３、１３０．７、１０７．１、７３．４、６９．２、６６．８、５９．９、３２．２、３２．０、３０．９、２９．８、２９．７、２９．６、２９．４、２６．１、２２．７、１９．３、１７．１、１４．１；ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６６Ｈ１２５ＮＯ５〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０３４、実験値１０３４
【０１３０】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ）、７．５９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、６．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４ Ｈｚ）、５．４４−５．３７（１Ｈ、ｂｒ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６２（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．８ Ｈｚ）、４．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．２４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、３．９６−３．９２（８Ｈ、ｍ）、２．２１−２．１６（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７０（２Ｈ、ｍ）、１．４８−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９１（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７１．５、１６８．７、１５６．５、１５３．１、１４３．６、１４１．２、１３８．３、１３０．０、１２７．７、１２７．０、１２５．０、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、５７．１、４７．１、３２．０、３１．４、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２，８、１９．０、１７．７、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ８３Ｈ１３８Ｎ２Ｏ８〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１３１４、実験値１３１４
【０１３１】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２ Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３９（２Ｈ、ｓ）、２．２４−２．１８（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４４（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．９０−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨＺ）δ：１７２．６、１７１．８、１５３．１、１３０．３、１２５．５、１０６．９、７３．４、６９．２、６７．２、５６．６、４４．８、３２．０、３１．３、３０．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６８Ｈ１２８Ｎ２Ｏ６〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０９１、実験値１０９１
【０１３２】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７ Ｈｚ）、７．５３−７．４９（２Ｈ、ｍ）、７．３９（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．３、２２ Ｈｚ）、７．３０−７．２７（４Ｈ、ｍ）、７．２５−７．２１（１Ｈ、ｍ）、７．２０−７．１５（２Ｈ、ｂｒ）、６．７６−６．６９（１Ｈ、ｂｒ）、６．６０−６．５５（１Ｈ、ｂｒ）、６．５０（２Ｈ、ｓ）、５．４０−５．３４（１Ｈ、ｂｒ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．５６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．４６−４．３０（２Ｈ、ｍ）、４．１７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．１０−４．０３（１Ｈ、ｍ）、３．９２（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．８３−３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．１８−３．１１（１Ｈ、ｍ）、３．１０−３．０２（１Ｈ、ｍ）、２．２０−２．１３（１Ｈ、ｍ）、１，７９−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１，４８−１，４１（６Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒｍ）、０．９１−０．８５（１５Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７１．５、１７１．３、１６８．３、１５６．０、１５３，１、１４３．６、１４１．２、１３８．２、１３６．２、１３０．１、１２９．１、１２８．８、１２７．７、１２７．１、１２７．０、１２５．０、１２４．９、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、６７．１、５７．３、４７．２、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．０、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ９２Ｈ１４７Ｎ３Ｏ９〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１４６１、実験値１４６１
【０１３３】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．９９−７．９３（１Ｈ、ｍ）、７．３５−７．３０（２Ｈ、ｍ）、７．２７−７．２１（３Ｈ、ｍ）、６．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．５８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、ｍｉｎｏｒ）、４．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、ｍａｊｏｒ）、３．９８−３．９１（７Ｈ、ｍ）、３．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０ Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、３，９ Ｈｚ）、２．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、１０．０ Ｈｚ）、２，２４−２．１５（１Ｈ、ｍ）、１．８２−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．３９（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８ Ｈｚ）、０．９０−０．８５（１２Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７５．２、１７１．５、１６８．９、１５３．１、１５１．４、１３７．７、１２９．２、１２８．８、１２６．９、１２５．５、１０７．０、７３．５、６９．２、６７．５、５７．２、５６．５、４３．４、４０．９、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．７、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ７７Ｈ１３７Ｎ３Ｏ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２３９、実験値１２３９
【０１３４】
実施例２
〔ＳＣ〕−バリン−フェニルアラニン−Ｆｍｏｃ（〔ＳＣ〕―Ｖａｌ―Ｐｈｅ―Ｆｍｏｃ）の液相合成
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ ６３ｍｇ、ＨＯＢｔ ６３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ｐｈｅ／ＤＭＦ溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３５】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３６】
実施例３
〔ＳＣ〕−バリン−プロリン−Ｆｍｏｃ（〔ＳＣ〕―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ｆｍｏｃ）の液相合成
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ５３ｍｇ、ＨＯＢｔ ５７ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ／ＤＭＦ溶液として用いる。すなわち、この溶液２ ｍｌを５℃に冷却後、実施例１の１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍｌ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３７】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３８】
実施例４
液体担体−バリン−アラニン−Ｆｍｏｃ（〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ）の液相合成
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ ５０ｍｇ、ＨＯＢｔ５３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ／ＤＭＦ溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ ｍｌ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３９】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１４０】
【発明の効果】
従来の固相反応ペプチド合成装置では、固相にアミノ酸結合基が存在するためアミノ酸との反応性が悪く、反応する量の１００倍といった大過剰量のアミノ酸を反応系に供給しなければならないという問題があった。これに対して本発明の液相ペプチド合成装置では、合成反応が相溶状態の均一溶液系で進行するため、反応効率が極めて高く、担体に結合したペプチド末端に対して、外部から添加して反応させるためのアミノ酸分子の量は過剰量必要としない。同様に液相のため反応も早く、固相合成とは比較にならない短時間で合成が進む。
【０１４１】
また本装置では、合成途中のペプチドの活性化された末端での未反応がきわめて少ないので、未反応が原因の誤結合による所望ペプチド以外の不純物ペプチドの発生が少ない。よって、従来必須であったクロマトグラフィ等による精製工程が省略可能であるし、限界とされているペプチドの結合数（残基数）５０程度以上のペプチドの実用的な合成が可能となる。
【０１４２】
さらにまた、固相ペプチド合成では困難であった目的の反応が進行チェックも、溶媒を染料等で着色するなどで可能である。本装置のスケールアップも通常の液相プロセス装置と同様に容易であるので、望まれていたペプチドの安価な量産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固相ペプチド合成のフロー説明図（その１）
【図２】固相ペプチド合成のフロー説明図（その２）
【図３】温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の
実験例：下層の第二の溶媒に染色剤を混合したものの写真
【図４】液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図５】液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ２残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図６】液体担体１とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ３残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図７】本案の液相ペプチド合成装置の第一例
【図８】液体導電率センサーヘッド
【図９】本案の液相ペプチド合成装置の第二例（温度制御手段６は省略した）
【図１０】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その１）
【図１１】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その２）
【図１２】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その３）
【図１３】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その４）
【図１４】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その５）
【図１５】本案の液相ペプチド合成装置の第三例：分離槽１７を設けた例
【図１６】本案の液相ペプチド合成装置の第四例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図１７】合成層でのペプチド結合反応の前後の条件から排除量を推定する原理の説明図
【図１８】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その１）
【図１９】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その２）
【図２０】本案の液相ペプチド合成装置を用いた液相ペプチド合成の実施例の説明図
【図２１】本案の液相ペプチド合成装置の第三例補足説明図
【図２２】本案の液相ペプチド合成装置の第五例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図２３】溶液供給量の制御の説明図
【符号の説明】
１ 液体担体の例
１ａ 液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質
１ａｆ １ａのＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｂ 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質
１ｂｆ １ｂのＲ２残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｃ 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸の結合物質
１ｃｆ １ｃのＲ３残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
２ 液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分
３ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とを混合する混合槽
４ 第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液Ｂ１２の準備槽
５ 第二溶媒溶液Ｂ１２を混合槽３に供給する手段
５ａ ５の一部で、第二溶媒溶液の移送流路（配管）
５ｂ ５の一部で、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプなど
６ 合成槽３の温度制御手段
６ａ 第一・第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御（加熱）中である温度制御手段
６ｂ 第一・第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御（冷却）中である温度制御手段
７ 第二溶媒溶液の量を２０より得られる界面位置から判定して混合槽３から排除する手段
７ａ ７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなど
８ 液相担体にＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃを結合したＲ１残基アミノ酸を結合
する反応
９ 固相担体（レジンなどの樹脂）
１０ Ｎ末端の保護基であるＦｍｏｃ等を除去して活性化する操作
１０ａ １０の操作（工程）をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段
１１ 活性化されたＮ末端部分に１２をペプチド結合反応させる操作
１２ Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後のアミノ酸
１６ 混合槽内で相溶状態となった第一・第二溶媒溶液の移送手段
１６ａ １６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１７ 第一・第二溶媒溶液を相分離状態とする分離槽
１８ 第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段
１８ａ １８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１９ 混合槽の反応を推定する手段
２０ 第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段
２０ａ 合成槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）
２０ｂ ２０ａのセンサーヘッドの例で、２０ａの先端に配設された電気特性測定電極
２０ｃ ２０ａの内部電気配線
２０ｅ 光（放射エネルギー）発生器
２０ｆ 光（放射エネルギー）受信器
３０ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率を決定する手段
３１ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段
３２ 第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を付加追加する量の制御手段（流量制御装置）
３３ Ｂ１２の供給量の制御手段（流量制御装置）
３４ Ａ１ｘの供給量の制御手段（流量制御装置）
３５ Ｂ１２、Ａ１ｘの成分（溶媒Ａ、溶媒Ｂの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報
Ａ 第一の溶媒
Ａ０ 任意物質を溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ 液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａ 液体担体とＲ１残基アミノ酸との結合物質（１ａ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａｆ １ａに保護基を結合した物質（１ａｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂ 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸との結合物質（１ｂ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂｆ １ｂに保護基を結合した物質（１ｂｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃ 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖の結合物質（１ｃ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃｆ １ｃに保護基を結合した物質（１ｃｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｘ 液体担体と任意アミノ酸系物質との結合物質（１ｘ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｘｆ １ｘに保護基を結合した物質（１ｘｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａｔａｎｋ 第一の溶媒の準備槽
Ｂ 第二の溶媒
Ｂ０ 任意物質を溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２ １２を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
Ｂｔａｎｋ 第二の溶媒の準備槽
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 図面上の記載であってＲ１、Ｒ２、Ｒ３と同じ
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 合成すべきペプチド鎖を構成するアミノ酸残基[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an apparatus for synthesizing a peptide in which amino acids are peptide-bonded in a specific order, and in particular, preferably utilizes a combination of solvents in which a compatible state and a phase-separated state are reversibly changed with temperature. The present invention relates to a liquid-phase peptide synthesizer capable of mass production.
[0002]
[Prior art]
It goes without saying that peptide synthesis technology is important in a wide range of fields such as medicine, pharmacy, and biology. Peptides in which amino acids are peptide-bonded in a specific order are involved in an extremely large number of studies such as studies on antigen-antibody interactions, studies on peptide antigens used for clinical diagnosis, and studies on various genes. The activity of a protein, whether immunized or infected, is determined by a peptide of at most 5 to 10 amino acids. Therefore, the synthesis of that part is very important and in great demand for research.
[0003]
Of course, peptides having 10 or more amino acids are also important. The limit of the number of bonds (residue number) of a peptide that can be synthesized is about 50, and a technique for synthesizing a peptide exceeding the limit of the number of amino acid bonds is also desired.
[0004]
If the efficacy of specific proteins and peptides is verified as a result of research, mass demand for peptides for pharmaceuticals such as chemically synthesized vaccines will arise. Therefore, there is a strong demand for a peptide mass production technology that can meet a large demand on a commercial scale.
[0005]
A peptide synthesis method for chemically linking amino acids is called a chemical synthesis method, and the process of the apparatus of the present invention is included therein. In addition, there is a gene recombination method in which a DNA comprising a nucleotide sequence encoding a target peptide is prepared and expressed in a host cell or the like. However, this is troublesome, costly, and not suitable for mass production.
[0006]
The reason is that in order to synthesize a peptide having 50 amino acids (residues) or more by a gene recombination method, a DNA of 150 nucleotides or more encoding the amino acid must first be artificially synthesized. Moreover, this method cannot synthesize a D-form amino acid or a peptide containing a non-naturally occurring amino acid derivative. Here, a peptide containing an amino acid derivative is one in which an arbitrary compound is bound to an amino acid residue of the peptide.
[0007]
First, short partial peptides (segments) were synthesized, and then they were added with side-chain protecting groups.
There is a segment condensation method of coupling in a state. However, this method also requires multiple steps
In addition, the C-terminal amino acid of each segment must be a specific amino acid such as Gly or @Pro, and there are restrictions on segment design.
[0008]
When using a chemical synthesis method (conventional liquid phase method) that has a high degree of freedom of reaction and low reaction selectivity for mass production, the amino group and the carboxyl group are interchanged and bonded, The isomers combine incorrectly. Furthermore, a large amount of reagents, catalysts, reaction aids, by-products, etc. remain after the reaction. Therefore, a process of separating and purifying the target product by chromatography or the like after the synthesis reaction is required, but the yield of the target peptide is often extremely poor. Therefore, a general liquid-phase method (a conventional liquid-phase method having a small reaction selectivity) is hardly used.
[0009]
In order to improve the reaction selectivity and suppress the generation of by-products, solid phase synthesis, in which amino acids are chemically linked to the solid surface, has become the mainstream of peptide synthesis at present. This solid phase peptide synthesis method (Solid \ Phase \ Peptide \ Synthesis method) was developed by Merrifield.
[0010]
The solid phase peptide synthesis method will be described with reference to FIGS. In solid phase peptide synthesis, the amino acid at the carboxyl group end (C-terminus) of the peptide to be synthesized is chemically bonded to the surface of insoluble microresin (eg, resin) beads. Since the fine resin beads are solid and bind while carrying amino acids, they are called “solid carriers”. 9 in FIGS. 1 and 2 is a solid carrier.
[0011]
An amino acid to be further bound is prepared at the amino-terminal side (N-terminus) of the C-terminal amino acid bound to the solid support. The amino acids to be bound are subjected to a treatment for inactivating the N-terminus and activating the C-terminus. This operation is called pre-combination processing. For the inactivation, a reactive protecting group such as Fmoc {(9-fluorenylmethyoxycarbonyl)} or t-Boc {(tert-butyloxycarbonyl)} or Cbz (benzyloxycarbonyl) is bonded to the N-terminus.
[0012]
12 in FIG. 1 and FIG. 2 are compounds obtained by pre-binding amino acids to be bound. The “X” of 12 is a C-terminal activating group. In this way, the reaction at the N-terminal is blocked and only the C-terminal is reacted.
[0013]
Since the protecting group is also bound to the N-terminus of the amino acid bound to the solid support, this protecting group is removed by the
[0014]
In FIG. 1, a portion where two amino acids (residues R1 and R2) are peptide-bonded from the C-terminal of the peptide to be synthesized is completed. In FIG. 2 that follows, a portion in which three amino acids (residues R1, R2, and R3) are peptide-bonded is completed. These operations are repeated to obtain a peptide to be synthesized.
[0015]
Upon completion of the peptide bond, the C-terminus is cleaved from the solid support, removing or adding protecting groups as needed. This step is called "clearage".
[0016]
By adding and binding amino acids one by one in this manner, the degree of freedom and selectivity of the reaction is extremely small.
Then, desired amino acids are peptide-bonded in a desired order, and a desired peptide is synthesized. Solid phase peptide synthesis is characterized by using insoluble microresin beads as a "carrier" for amino acid-based substances. (Here, "amino acid-based substance" includes a single amino acid or an amino acid residue, and a peptide in which a plurality of amino acids are peptide-bonded.) As a material of the solid carrier, glass, silica, synthetic resin, etc. are known. , Synthetic resins are most commonly used.
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
However, solid phase peptide synthesis also has disadvantages. Since the chemical reaction has to be performed on the solid surface, the reagent is hard to approach the solid surface, and the reaction hardly occurs as compared with the liquid phase reaction. That is, the solid carrier is a molecule that is extremely large compared to the amino acid, and it is necessary to bind the amino acid to a very small reaction part of the macromolecule, but this is unlikely to occur stochastically. Therefore, a large amount of expensive amino
[0018]
In addition, since the (n + 1) th amino acid binds to the unreacted portion of the nth amino acid in the next binding step as the nth amino acid, it becomes an impurity which is not a desired peptide. Even if such unreacted reactions occur in only 5% of the individual coupling reactions, the synthesis of a peptide of 50 amino acids (residues) results in a final yield of only 7.7% (0%). .95 to the 50th power). Even 30 amino acids (residues) are 21.5% (0.95 to the 30th power).
[0019]
As described above, in solid-phase peptide synthesis, in order to minimize unreacted individual peptide bonds, there is a problem in terms of cost that a large amount of reaction reagents must be used as described above, and the reaction time is more than sufficient. Production efficiency.
[0020]
In addition, in solid-phase peptide synthesis, it is not possible to easily confirm that the target reaction has proceeded. There is a problem that the solid phase carrier is expensive and cannot be reused (disposable).
[0021]
The present invention provides a peptide synthesizer that preferably uses a combination of solvents in which a compatible state and a phase-separated state are reversibly changed in order to solve the problems of the conventional peptide synthesizer as described above. is there.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a liquid-phase peptide synthesizing apparatus using the Japanese Patent Application No. 2001-254109 “Compatibility-Multiphase Organic Solvent System” by the present inventor. More specifically, the present invention relates to a Japanese Patent Application No. 2001-385493. This is an apparatus for realizing the method disclosed in "Liquid-phase peptide synthesis method in which amino acids are sequentially added by a compatible-multiphase organic solvent system".
[0023]
<Solvent Set for Liquid-Phase Peptide Synthesis Method> First, a compatible-multiphase organic solvent system will be described, and then a liquid-phase peptide synthesis method using the same will be described. FIG. 3 is an experimental photograph of a specific combination of solvents constituting a compatible-multiphase organic solvent system.
[0024]
Japanese Patent Application No. 2001-254109 “Compatibility—Multiphase Organic Solvent System” discloses a set (combination) of a first solvent and a second solvent in which a compatible state and a phase-separated state are reversibly changed depending on temperature. Have been. Here, each of the first solvent and the second solvent may be a mixed solvent of a plurality of solvents.
[0025]
FIG. 3 is an example in which the first solvent and the second solvent are mixed, and the mixture is visualized by mixing the dye with the lower second solvent. A combination of these solvents (hereinafter referred to as a solvent set) enters a phase-separated state at 25 ° C. (FIG. 3a) and a compatible state when heated to 45 ° C. (FIG. 3b). When this is cooled, it returns to a phase separated state. 3A, 3B, 3C, 3D, and 3E are images obtained by sequentially photographing images, and c and d are intermediate states in which the temperature is cooled from 45 ° C. to 25 ° C. It can be seen that the solvent set in this experiment reversibly changes between a compatible state and a phase-separated state depending on the temperature.
[0026]
A solvent set suitable for liquid-phase peptide synthesis includes one solvent, as disclosed in Japanese Patent Application No. 2001-385493, "Liquid-phase peptide synthesis method for sequentially adding amino acids by a compatible-multiphase organic solvent system". Alternatively, the organic solvent constituting the mixed solvent (first solvent) is a cycloalkane-based compound.
[0027]
The first solvent is basically a low-polarity organic solvent, and as a group of compounds constituting the solvent, alkanes, cycloalkanes, alkenes, alkynes, aromatic compounds and the like, among which preferred are cycloalkane-based compounds And "cyclohexane" as a particularly preferred compound. It can be speculated that the conversion of the chair-boat conformer of cyclohexane is related to the relatively mild thermal conditions occurring with other solvents. Cyclohexane has a relatively high melting point of 6.5 ° C., and has the advantage that the product after the reaction can be solidified and separated, and has an advantage even in the final recovery step, which is also preferable from this aspect. The recovery process will be described later.
[0028]
On the other hand, the organic solvent constituting the other solvent or the mixed solvent (second solvent) combined with the first solvent is basically a highly polar organic solvent. Preferred are those composed of at least one selected from the group consisting of nitroalkanes, nitriles, alcohols, alkyl halides, amide compounds and sulfoxides.
[0029]
More specifically, the second solvent has a nitroalkane alkyl group having 1, 2 or 3 carbon atoms, a nitrile alkyl group having 1, 2 or 3 carbon atoms, and an amide compound having N- The total number of carbon atoms of the alkyl group and acyl group or formyl group of the dialkyl or N-monoalkylamide is 6 or less, the alcohol has 8 or less carbon atoms, and the alkyl group of the sulfoxide has 1, 2 or 3 carbon atoms. And the alkyl group of the alkyl halide has 6 or less carbon atoms.
[0030]
As shown in FIG. 3, the solvent set of the first solvent and the second solvent is a reversibly homogeneous mixed solvent system state (compatible state) and a separated solvent system separated into a plurality of phases. (Phase-separated state).
[0031]
<Compatibilization temperature> The temperature at which the compatible state and the phase-separated state are switched can be freely changed by changing the configuration of the first solvent or the second solvent. For example, FIG. 18 is an explanatory diagram of the configuration of cyclohexane (CH) as the first solvent and the nitroalkane mixed solvent (NA) as the second solvent and the change in the compatibilization temperature. The volume ratio of CH to NA is 1: 5, 2: 5, 1: 1, 5: 1 as a parameter, and the volume mixing ratio of nitromethane (NM) and nitroethane (NE) constituting each NA is shown on the horizontal axis. The solvent temperature was plotted with the solvent temperature as the vertical axis, when both solvents were mixed.
[0032]
FIG. 19 shows that the first solvent, cyclohexane (CH), and the second solvent are fixed at an equal volume of 1: 1 (each 50% by volume), and the second solvent is nitromethane (NM) and nitroethane. A mixed solvent of (NE) or a mixed solvent of acetonitrile (AN) and propionitrile (PN) or a mixed solvent of dimethylformamide (DMF) and dimethylacetamide (DMA); Is plotted on the abscissa and the solvent temperature is plotted on the ordinate.
[0033]
From FIGS. 18 and 19, it can be seen that the compatibilization temperature changes between 20 ° C. and 60 ° C. in the first and second solvent configurations. In other words, in the set of the first solvent and the second solvent, by having means for changing the constitution of the first and second solvents, the compatibilization temperature of both solvents can be changed. That is, the chemical reaction in the compatibilized state can be performed even at a low temperature level.
[0034]
The configuration of the first and second solvents may be a mixing ratio of the first solvent and the second solvent, or a mixing ratio of a mixed solvent element forming the first solvent or the second solvent which is a mixed solvent. The composition changing means, when supplying and mixing the first solvent and the second solvent, adjusts the supply amount of the first solvent or the second solvent to change the composition, or newly adds a mixed solvent element. It may be added.
[0035]
Taking into account that the compatibilization temperature can be changed as described above, the supply amounts of the first and second solvents before mixing take into account the temperature of amino acids dissolved in them and the temperature of peptide synthesis performed with amino acid-based substances. Then, it may be determined based on data as shown in FIGS. Naturally, the temperature of the temperature control for the reaction may be determined based on data as shown in FIGS.
[0036]
<Liquid carrier> Now, Japanese Patent Application No. 2001-385493 (liquid phase peptide synthesis method) proposes a liquid phase peptide synthesis method in which amino acids are sequentially added using the above solvent set. Of importance together with the solvent set is a "liquid carrier" which corresponds to a solid carrier for solid phase peptide synthesis.
[0037]
This corresponds to the description in Japanese Patent Application No. 2001-254109 (solvent system) as “a chemical component involved in a reaction in which only one of the first solvent and the second solvent is dissolved”.
[0038]
That is, it is a liquid carrier derived from a compound that is soluble in the first solvent and hardly soluble in the second solvent, and that binds to the amino acid-based substance. Since it is equivalent in function to a solid carrier, it is referred to herein as a "liquid carrier". This liquid carrier will be described.
[0039]
Replacing the solid-phase surface reaction of the prior art with a liquid-phase reaction can improve the problem of poor reactivity (the solid support is a very large molecule compared to amino acids and it is difficult to access the reaction site). . Furthermore, if the above-mentioned solvent set for phase separation is used properly, the obtained reaction product can be very easily separated. The realization of the liquid phase peptide synthesis method having such epoch-making advantages requires a liquid carrier corresponding to a solid carrier for solid phase peptide synthesis, and the inventors have found this. The liquid carrier needs the following functions.
[0040]
That is, the liquid carrier has a binding portion with an amino acid that initiates peptide formation, can carry a peptide chain that is extended by binding amino acids sequentially, and a compound that binds to an amino acid and a compound that carries a peptide chain during synthesis. Is dissolved in the first solvent.
[0041]
A candidate liquid carrier compound having these functions is a compound having a functional group capable of binding to a cycloalkane-based solvent portion and an amino acid, and wherein the aromatic compound is represented by the following general formula A (Chemical Formula 1). A basic skeleton compound is a hydrogen ring or a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms.
[0042]
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In the general formula A (Formula 1), L1 is a single bond bonded to a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid, or an atomic group bonded to the hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group. Or an atomic group that also binds to a dotted line to form a two-ring fused aromatic ring.
[0044]
In the general formula A (Formula 1), a dotted line represents a bond to H or a bond of an atomic group forming the fused aromatic ring by bonding to L1, and X represents O, S, N, an ester group, or a sulfide group. Alternatively, R is an imino group, and R is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain O, S, or N as a bonding atom for enhancing solubility in a cycloalkane-based solvent. N is an integer of 1 to 5.
[0045]
The general formula A (formula 1) is more specifically selected from the following general formula group B (formula 2). In the general formula group B (Chemical formula 2), X, R and n are the same as in the general formula A (Chemical formula 1). Q is a single bond or a hydrocarbon group;2Is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid;3And R4Is a group of the general formula C Further, R of the general formula C (Chem. 3)5Is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid.
[0046]
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The first solvent described above dissolves the liquid carrier and the binding substance between the liquid carrier and the amino acid-based substance in a separated state, but dissolves the amino acid not bound to the liquid carrier (the amino acid to be peptide-bonded). Not (slightly soluble). Here, the amino acid-based substance is a single amino acid or peptide.
[0049]
Conversely, the second solvent dissolves amino acids (amino acids to be peptide-bonded) in the separated state, but does not dissolve (slightly soluble) the liquid carrier and the binding substance between the liquid carrier and the amino acid-based substance. have.
[0050]
A preferred specific example of the liquid carrier is shown in FIG. 1 is a compound represented by the general formula group B, wherein R is C18H37, X is O, n is 3, Q is CH2And R2 is OH. The name is (3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol, [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol}. The
[0051]
Although the present invention is not limited to 1, the liquid phase peptide synthesis method, which is the process of the apparatus of the present invention, will be described below using this liquid carrier specific example 1. FIGS. 4 to 6 are explanatory diagrams of the liquid-phase peptide synthesis of the present invention in which the solid carrier 9 in the solid-phase peptide synthesis method is replaced with the
[0052]
FIG. 4 shows the reaction of binding the C-terminus of
[0053]
A first solvent solution (A1) in which 1 is dissolved in the first solvent (A) is mixed with a second solvent solution (B12) in which R1
[0054]
After mixing both solutions, they are heated to a temperature at which they become compatible. Then, since the terminal of the
[0055]
After the peptide reaction, in solid phase synthesis, washing and removal were performed for separation from unreacted amino acids and the like, but in the present invention, if the first solvent solution and the second solvent solution are cooled to a temperature at which phase separation occurs, Good. As a result, 1af is separated from the second solvent solution as A1af dissolved in the separated first solvent (A). In the separated state, the second solvent solution is eliminated.
[0056]
In the second solvent solution to be eliminated, the R1 residue amino acid, the reaction by-product, and the like which have remained unreacted due to the excessive addition are dissolved. This separation operation is a simple operation that is incomparable with the conventional one, and contains very little impurities. Therefore, the purification step by chromatography or the like can be omitted.
[0057]
In the first and second solvent solutions in the separated state, the second solvent solution is excluded. It is important that only the first solvent solution remains in this removing operation. Therefore, although the yield is deteriorated, some first solvent solution may be excluded together with the second solvent solution. In the remaining first solvent solution, 1af in which the R1 residue amino acid C-terminal is bonded to 1 is dissolved (A1af).
[0058]
In the next step, FIG. 5, the Fmoc protecting the amino terminus of the substance 1af in which the
[0059]
After the mixing, the mixed solution is heated again to the compatibilizing temperature, and 1a in the solution and the C-terminal of the R2 residue amino acid are peptide-bonded in the compatible state (11 in FIG. 5). As a result, a substance 1bf in which the R1 and R2 residue peptides are bound to the
[0060]
After the peptide reaction, the mixture is cooled to a temperature at which the first solvent solution and the second solvent solution are phase-separated, and 1bf is converted into A1bf dissolved in the separated first solvent solution, and separated from the second solvent solution. In the separated state, the second solvent solution is eliminated. Similarly, some first solvent solution may be excluded along with the second solvent solution.
[0061]
Similarly, FIG. 6, which is the next step, is similarly activated by removing the Fmoc protecting the amino terminus of the substance 1bf to which the
[0062]
After the mixing, the mixed solution is heated again to the compatibilization temperature, and 1b in the solution and the C-terminal of the amino acid at the R3 residue are peptide-bonded in the compatible state (11 in FIG. 6). As a result, a substance 1cf in which the R1, R2, and R3 residue peptides are bound to the
[0063]
In this manner, a series of peptide bonds is performed, and upon completion, the C-terminal of the peptide is cleaved as necessary from the liquid carrier, and the protecting group is removed or added as necessary. This cleavage step is similar to solid phase synthesis. That is, the peptide bound to the liquid carrier may be stored at low temperature until use, or may be stored by separating the bond using a known compound or enzyme reagent that cleaves the binding portion. The N-terminus of the peptide after cleavage may be preserved as it is, or may be bound with a known protecting group.
[0064]
The major difference from solid phase synthesis is that there is very little unreacted individual peptide bond in peptide synthesis, as it is a reaction in a solution dissolved in a solvent. Therefore, although it is added in a slightly excessive amount, it is not necessary to excessively inject a large amount of reaction reagent such as 100 times as in solid phase synthesis. Since it is a liquid phase reaction, the reaction time is naturally shortened.
[0065]
The progress of the desired reaction can also be confirmed by color, for example, by coloring the solvent with a dye or the like. Furthermore, the scale-up of an apparatus described below including a reaction tank or the like can be easily performed in the same manner as in a normal liquid phase process.
[0066]
As a result of performing the peptide liquid phase synthesis shown in FIGS. 4 to 6 in which R1 was valine (Val), R2 was glycine (Gly), and R3 was phenylalanine (Phe), the yields were 95%, 97%, and 99%. Was. (See FIG. 20) The reason that the yield does not become 100% is not that the liquid carrier or the binding substance of the liquid carrier and the amino acid-based substance is not completely dissolved in the second solvent. (Because it is hardly soluble.)
[0067]
<Liquid-phase peptide synthesis device> (1) The device of the present invention will be described. The apparatus of the present invention is an apparatus for performing the liquid phase peptide synthesis described above. That is, a combination of a first solvent and a second solvent, and a liquid carrier that is derived from a compound that is soluble in the first solvent and hardly soluble in the second solvent, and binds to an amino acid-based substance. Is a liquid-phase peptide synthesizer in which amino acids of a peptide chain to be synthesized are sequentially peptide-bonded to the liquid carrier.
[0068]
FIG. 7 shows a first example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention. The liquid-phase peptide synthesizer of the present invention supplies a liquid carrier and a first solvent (omitted in FIG. 7), and supplies a second solvent solution in which the amino acid after the pre-binding treatment is dissolved in the second solvent. A first solvent solution in which a liquid carrier or a binding substance of a liquid carrier and an amino acid-based substance is dissolved in a first solvent and a supplied second solvent solution are connected to the means (5 in FIG. 7). The temperature of the mixing tank (3 in FIG. 7) and the mixing tank is set to a temperature at which the mixed first solvent solution and second solvent solution are in a compatible state, or the mixed first solvent solution and second solvent solution Temperature control means (6 in FIG. 7) for controlling the temperature of the mixing tank to a phase separation state, and interface detection means (20 in FIG. 7) for detecting the interface of the first solvent solution / second solvent solution in the mixing tank. ) And determining the amount of the second solvent solution based on the interface position obtained by the means. And means (7 in FIG. 7) to eliminate the second solvent solution from the mixing tank on the basis of the determination amount.
[0069]
Here, an amino acid includes an amino acid derivative in which an arbitrary compound is bonded to an amino acid residue, an amino acid-based substance is a single amino acid or a peptide, and a pre-bonding treatment is a peptide to be synthesized. Is a process for inactivating the amino group side terminal of the amino acid constituting the above and activating the carboxyl group side.
[0070]
At the beginning of the synthesis step, a first solvent solution in which the liquid carrier is previously dissolved in the first solvent is supplied to the
[0071]
The second solvent is described as B, the amino acid after the pre-binding treatment in which a protecting group Fmoc or the like is bonded to the N-terminus is described as 12, and the second solvent solution obtained by dissolving 12 in B is described as B12. At the beginning of the synthesis step, B12 is supplied to A1 supplied to the
[0072]
The
[0073]
A means 5 for supplying B12 to the
[0074]
That is, as shown in FIG. 7, it is preferable that the amino acids after the pre-binding treatment to be sequentially synthesized are selectively supplied to the
[0075]
The second solvent solution B12 is supplied to the
[0076]
In addition, the supply amount of the first and second solvent solutions themselves is adjusted in advance by referring to the data of the compatibilization temperature in FIG. 18 and FIG. 19, so that the temperature of the synthesis reaction can be adjusted appropriately. It is possible.
[0077]
That is, the temperature control means of the mixing tank controls the temperature based on the amount of the first solvent solution in the mixing tank and the solution component and the supply amount of the second solvent solution supplied to the mixing tank and the solution component. It is preferable that the supply amount of the means for supplying the second solvent solution is determined based on the solution components of the first solvent solution and the solution components of the second solvent solution. Control of the solution supply amount will be described later with reference to FIG.
[0078]
Here, the solution component of the first solvent solution is a chemical component of the solvent constituting the first solvent, and a compound component of the liquid carrier and the amino acid-based substance dissolved in the first solvent, respectively, the second solvent The solution component of the solution is a compound component of the solvent constituting the second solvent and a compound component of the amino acid after the pre-binding treatment dissolved in the second solvent.
[0079]
A peptide synthesis reaction is performed in a compatible state. Completion of this reaction can also be confirmed by a reaction marker obtained by coloring the solvent, for example. Of course, the data of the supply amount and the reaction time may be collected in advance, and the end of the reaction may be determined based on the reaction time. After the determination, the mixture is cooled to an arbitrary temperature lower than the compatibilization temperature to be in a phase separated state.
[0080]
In the phase separation state, the interface between the first solvent solution and the second solvent solution is detected by the interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution. If the position of the interface is known, it is easy to determine the amount of the second solvent solution using the known shape and volume of the mixing tank. Therefore, the amount of the second solvent solution is determined based on the interface position.
[0081]
The second solvent solution is removed from the
[0082]
The interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution is, for example, a sensor head of a solvent physical property sensor inserted into the
[0083]
FIG. 9 shows a second example (the temperature control means 6 is omitted) of the device of the present invention in which the interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution in the figure is another example. In FIG. 9,
[0084]
The above-mentioned optical interface detecting means would be effective if a dye is added to one of the solvents and colored to make the interface detection easier. In FIG. 9, B0 in the portion of the
[0085]
FIG. 10 to FIG. 14 are explanatory diagrams of the peptide synthesis step in the device of the present invention after the initial step. These correspond to the reaction flow diagrams of FIG. 4 to FIG. That is, FIGS. 10 (a), 10 (b), and 10 (c) show the process until the R1 residue amino acid is bonded to the
[0086]
FIG. 11 shows the next step, in which the temperature control means 6 is set to a phase separation temperature (6b), and cooled to a temperature at which the first solvent solution and the second solvent solution undergo phase separation (FIG. 11 (e)). The second solvent solution B0 is eliminated (FIG. 11 (f)). Next, in FIG. 12, the R2 residue amino acid is bound to the binding substance between the liquid carrier and the R1 residue amino acid ((g), (h), and (i) in FIG. 12). The
[0087]
Similarly, in FIG. 13, the temperature control means 6 is set to 6b and cooled to a temperature at which the first solvent solution and the second solvent solution are phase-separated (FIG. 13 (k)). It is eliminated (FIG. 13 (l)). Next, in FIG. 14, the R3 residue amino acid is bound to the binding substance of the liquid carrier and the R1 and R2 residue amino acids ((m) (n) (o) in FIG. 14). The
[0088]
FIG. 15 shows a third example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention, in which the
[0089]
Means for supplying a first solvent solution (A0) in which a liquid carrier or a binding substance of a liquid carrier and an amino acid-based substance is dissolved in a first solvent, and a second solvent A means for supplying a second solvent solution (B12), in which the amino acid after the pretreatment for binding is dissolved, is connected.
[0090]
In the configuration of FIG. 15, the first solvent solution (A0) from which the second solvent solution has been removed in the
[0091]
In the configuration of FIG. 15, more precisely, as shown in FIG. 21, means for supplying A1 to the mixing tank is provided. As shown in FIG. 21, a
[0092]
Of course, the
[0093]
If the mixing tank is provided above and the separation tank is provided below as shown in FIG. 15, the transfer of the first solvent solution and the second solvent solution by 16 is easy. The first and second solvent solutions compatibilized in the mixing tank fall by gravity and are transferred to a separation tank where they are separated at a phase separation temperature. In the separated state, the determination means 18 determines the amount of the second solvent solution, and based on the determination, excludes the second solvent solution (B0).
[0094]
The control temperature of the mixing tank and the separation tank, as in the first example and the second example, the supply amount of the first solvent solution supplied to the mixing tank and the solution components, and the second solvent solution supplied to the mixing tank. It is preferable that the determination be made with reference to data as shown in FIGS. 18 and 19 based on the supply amount and the solution component.
[0095]
Also, the supply amount of the means for supplying the first solvent solution and the supply amount of the means for supplying the second solvent solution themselves are based on the solution components of the first solvent solution and the solution components of the second solvent solution, as shown in FIG. , Is preferably determined with reference to data as shown in FIG.
[0096]
As described above, the solution component of the first solvent solution is a chemical component of the solvent constituting the first solvent, and a compound component of each of the liquid carrier and the amino acid-based substance dissolved in the first solvent. The solution components of the second solvent solution are the compound components of the solvent constituting the second solvent and the compound components of the amino acid after the pre-binding treatment dissolved in the second solvent. , FIG. 19 and the like.
[0097]
In the
[0098]
FIG. 17 is a view for explaining another means for determining the amount of the second solvent solution in the
[0099]
Again, the solution component of the first solvent solution is the chemical component of the solvent constituting the first solvent, and
The liquid carrier and the amino acid-based substance are each a compound component dissolved in the first solvent, and the solution component of the second solvent solution is a compound component of the solvent constituting the second solvent, and is dissolved in the second solvent. Of the amino acid after the pre-binding treatment.
[0100]
Since these reaction conditions and the conditions of the compound before the reaction are known, a binding reaction can be predicted. That is, the peptide binding reaction in the
[0101]
For the estimation, as shown in FIG. 17, the temperature of the separation tank and the amount of the solution in a compatible state transferred from the mixing tank to the separation tank may be input and used. In this way, the reaction in the
[0102]
Based on the determined amount, the second solvent solution is removed from the
[0103]
The means for determining the amount of the second solvent solution described with reference to FIG. 17 can be applied to the first example (FIG. 7) and the second example (FIG. 9) of the present invention in which only the mixing tank having no separation tank is used. . That is, the means for determining the amount of the second solvent solution in the mixing tank is based on the amounts of the first and second solvent solutions and the solution components in the mixing tank and the temperature of the mixed tank in a compatible state. And an amount of the second solvent solution in the mixing tank may be determined based on the estimation of the reaction by the estimating means.
[0104]
FIG. 16 shows a fourth example of the liquid-phase peptide synthesis device of the present invention, which is a device for mass production in which steps are continuous. 16 and 18 are omitted in FIG. With such a configuration, a plurality of different kinds of peptides can be continuously and flow-wise synthesized. That is, amino acids may be combined by sequentially changing the type of the second solvent solution (B12) supplied from the top of the figure according to the amino acid to be synthesized.
[0105]
The feature of the configuration in FIG. 16 is that a combination of a plurality of sets of mixing tanks / separation tanks including a mixing tank and a separation tank connected to the mixing tank is provided. Is the first solvent solution remaining after the second solvent solution is removed in the separation tank of another combination tank / separation tank combination.
[0106]
FIG. 16 shows a terminal activating means 10a that performs an operation (step) 10 for removing and activating the protecting group at the N-terminal. A route indicated by a bold dotted line connecting the
[0107]
In the fourth example of FIG. 16, the type of the second solvent solution B12 supplied to each mixing tank is fixed. That is, a mixing tank / separation tank in which the type of amino acid to be synthesized is fixed, for example, a valine-binding mixing tank / separation tank, a glutamic acid-binding mixing tank / separation tank, a phenylalanine-binding mixing tank / separation tank, etc. Arrange in close proximity. The apparatus may be configured such that the connection of the transfer means for transferring from the separation tank to the mixing tank can be freely switched according to the amino acid binding order of the peptide to be synthesized.
[0108]
That is, a switching valve and the like are provided in a piping system indicated by a thick dotted line connecting the
[0109]
When such switching is performed, there is a concern that impurities may be mixed due to residues before the switching. However, the problem can be solved by additionally providing a means for purifying impurities in the terminal activation means 10a in FIG. The same applies to the above-described configuration in which the piping system is fixed and the type of the second solvent solution (B12) supplied from the top of the figure is sequentially changed according to the amino acid to be synthesized.
[0110]
FIG. 22 shows a fifth example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention, which is an example of a combination configuration of two sets of mixing tank and separation tank. By combining a plurality of sets such as two sets, three sets (not illustrated), etc., it is easy to perform a peptide recovery step operation, an impurity removal in a mixing tank / separation tank, and a washing operation. The description of the fifth example is the same as that of the third and fourth examples, and is therefore omitted.
[0111]
<Control of Solution Supply Amount> FIG. 23 is an explanatory diagram of controlling the solution amount to the mixing tank based on the compatibilization temperature data shown in FIGS. Data in which the compatibilization temperature changes depending on the solution components and their mixing ratios as shown in FIGS. 18 and 19 are stored as a database at 30 in FIG. This 30 inputs B12 and A1x components (solvent A and solvent B components, and 12 and 1x amino acid-based substance components)
[0112]
[0113]
When optimizing the solution ratio, it is preferable to additionally supply only the first solvent or only the second solvent as needed, since the degree of freedom in controlling the solution ratio and the solution amount is increased, which is preferable. Therefore, the first and second solvent preparation tanks Atan and Btank, the means for supplying the first and second solvents A and B to the mixing tank, and the control means (flow rate control device) 32 for the additional amount are provided. However, the configuration may be such that the control command of 31 is output to 32.
[0114]
This additional addition can be applied to any of the first to fifth examples of the present apparatus. That is, connected to the mixing tank or the separation tank, an additional supply means for the first and second solvents for supplying the first solvent or the second solvent is provided, and the additional supply means solely adds the solvent. May be additionally supplied to the mixing tank to adjust and control the solvent ratio. This can change the compatibilization temperature.
[0115]
<Supplement> The elimination means 7 is eliminated by a method in which the solution supernatant is sucked from above the mixing tank or the separation tank by the solution suction means, except for the method in which the solution settling section is mainly flown out from below the mixing tank or the separation tank shown above. Another known solution extraction device having a function of partially extracting a solution from an arbitrary portion of a mixing tank or a separation tank may be applied.
[0116]
In addition, as described above, the second solvent solution is eliminated, and the first solvent solution is sequentially extracted and the second solvent solution is extracted, contrary to the apparatus configuration for synthesizing the peptide to be synthesized in the remaining first solvent solution. A configuration for synthesizing a peptide to be synthesized in one solvent solution may be partially adopted.
[0117]
In the final step of recovering the synthesized peptide, when cyclohexane is used as the first solvent, its melting point is 6.5 ° C., so that it is cooled to a lower temperature and separated as a solid, and then heated to evaporate and remove cyclohexane. By doing so, the peptide bound to the liquid carrier is recovered.
[0118]
The peptide bound to the liquid carrier may be stored at low temperature until use, or the peptide may be bound and cleaved using a known compound or enzyme reagent that cleaves the binding portion. The N-terminus of the peptide after cleavage may be preserved as it is, or may be bound with a known protecting group.
[0119]
【Example】
FIG. 20 shows the flow of the peptide synthesis example. A specific operation in FIG. 20 will be described below in a first embodiment. Further, other embodiments are shown in
[0120]
Example 1
Liquid phase synthesis of liquid carrier [SC] -valine (Val) -glycine (Gly) -phenylalanine (Phe) -Fmoc {[(SC) -Val-Gly-Phe-Fmoc]}. As the liquid carrier [SC], the above-mentioned (3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methane-1-ol, [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol}] is used.
[0121]
Step 1)
Fmoc-Val (170 mg) is dissolved in 3 mL of dichloromethane, and 125 mg of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) is further added. The solution is stirred at room temperature for 15 minutes and then filtered. After the filtrate is concentrated to dryness by a rotary evaporator, the obtained residue is dissolved in 3 mL of dimethylformamide (DMF). Subsequently, 3 Ml of a cyclohexane solution (
[0122]
After completion of the reaction, the reaction solution is returned to room temperature, and the reaction solution is separated into two phases again. The lower DMF phase is separated and removed, 3 mL of a 10% diethylamine / DMF solution is added, and the mixture is stirred at 50 ° C. for 20 minutes. Cool the reaction and separate the cyclohexane layer. The cyclohexane layer contains a liquid carrier bound valine-NH2([SC] -Val-NH2) Is recovered. (95% yield)
[0123]
Step 2)
57 mg of Fmoc-Gly, 55 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-glycine-OH / DMF solution. That is, after cooling 2 mL of this solution to 5 ° C., the [SC] -Val-
[0124]
Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it is separated into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Gly-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). The Fmoc group is eliminated by adding diethylamine to the solution to remove [SC] -Val-Gly-NH2Get. (Yield 97%)
[0125]
Step 3)
Next, 57 mg of Fmoc-Phe, 55 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-phenylalani-OH / DMF solution. That is, after cooling 2 ml of this solution to 5 ° C, the [SC] -Val-Gly-NH2 / cyclohexane solution (2 mL) obtained in step 2) is added. The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and left at 50 ° C. for 30 minutes.
[0126]
Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it is separated into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Gly-Phe-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). By repeating the above operation, amino acids were sequentially bonded to the liquid carrier, and the target peptide was synthesized. (99% yield)
[0127]
Structure confirmation
[SC] Cyclohexane liquid carrier; (3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methane-1-ol [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol}].
1H-NMR (400 MHz); 5.54 (2H, s), 4.58 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.96 (4H, t, J = 6.6 Hz), 3.96 ( 3H, s), 1.82-1.70 (6H, m), 1.50-1.41 (6H, m), 1.38-1.20 (84H, br), 0.88 (9H, m) (6,8 Hz), 13C-NMR (100 Hz); (100 MHz δ: 153.2, 137.4, 136.0, 105.2, 73.4, 69.1, 65.7, 32.0, 30. 4, 29.8, 29.7, 29.5, 26.2, 22.8, 14.2; calculated value for MALDI {TOF-MS (pos), C61H116O4} [M + Na] + $ 935, experimental value 935.
[0128]
[SC] -Val-Fmoc; (CDCl3) [delta] 7.76 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.40 (2H, dt, J) = 2.6, 7.3 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.3 Hz), 6.53 (2H, s), 5.31 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5 .11 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.05 (1H, d, J = 12.1), 4.38 (2H, m), 4.29 (1H, t, J = 7. 3 Hz), 3.94 (6H, m), 2.19 (1H, m), 1,78 (4H, m), 1.73 (2H, m), 1.45 (8H, m), 1. 35-1.23 (84H, br), 0.96 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.88 (12H, m); 13C-NMR (CDCl3), δ172.0, 156.2 , 153.2, 143.8, 141.3, 138.4, 130.2, 128, 3, 127.7, 127.1, 125, 1, 120.0, 107.1, 73.4, 69. 2, 67.4, 67.1, 59.0, 47.2, 32.0, 31.4, 30.3, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 26.1, 22.7, 141; TOF-MS (POS) MF, calculated for C81H135NO7 [M + Na] + 1257, experimental 1257
[0129]
[SC] -Val-NH2
1H-NMR (400 δ: 6.54 (2H, s), 5.07 (1H, d, J = 12.1 Hz), 503 (1H, d, J = 12.1 Hz), 3.95 (4H , T, J = 6.6 Hz, 3.94 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.33 (2H, d, J = 5.1 Hz), 2.07-2.01 (1H, m), 1.81-1.77 (4H, m), 1.76-1.71 (2H, m), 1.49-1.43 (6H, m), 1.37-1 .23 (84H, br), 0.96 (3H, d, J = 7.0 Hz),
0.89-0.86 (12H, m); 13C-NMR (150 @ MHz) [delta], 175.4, 153.2, 138.3, 130.7, 107.1, 73.4, 69.2. , 66.8, 59.9, 32.2, 32.0, 30.9, 29.8, 29.7, 29.6, 29.4, 26.1, 22.7, 19.3, 17 , 14.1; calculated 1034 for TOF-MS (pos) C66H125NO5 [M + Na] +, experimental 1034
[0130]
[SC] -Val-Gly-Fmoc
1H-NMR (400 @ MHz)?: 7.77 (2H, d, J = 7.3 @Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.31 (2H, dt, J = 7.3 Hz), 6.52 (2H, s), 6.38 (1H, d, J = 8.4 Hz), 5.44-5 .37 (1H, br), 5.10 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.02 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.62 (2H, dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 4.42 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.24 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.96-3.92 ( 8H, m), 2.21-2.16 (1H, m), 1.81-1.76 (4H, m), 1.75-1.70 (2H, m), 1.48-1. 43 (6H, m), 1.3 -1.21 (84H, br), 0.91 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.88 (9H, t, J = 7.0 Hz), 0.86 (3H, d, J) 13C-NMR (150 MHz) δ: 171.5, 168.7, 156.5, 153.1, 143.6, 141.2, 138.3, 130.0, 127 0.7, 127.0, 125.0, 120.0, 107.0, 73.4, 69.2, 67.5, 57.1, 47.1, 32.0, 31.4, 30.4 , 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 26.1, 22, 8, 19.0, 17.7, 14.2; MALDI @ TOF-MS (pos) C83H138N2O8 [M + Na] + 1314, experimental 1314
[0131]
[SC] -Val-Gly-NH2
1H-NMR (600 MHz) δ: 7.74 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.53 (2H, s), 5.11 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.02 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.61 (1H, dd, J = 9.2, 5.1 Hz), 3.95 (4H, t, J = 6.6 Hz) ), 3.94 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.39 (2H, s), 2.24-2.18 (1H, m), 1.81-1.76 (4H, m), 1.75-1.71 (2H, m), 1.49-1.44 (6H, m), 1.37-1.20 (84H, br), 0.93 (3H, d, J = 7.0 ° Hz), 0.90-0.86 (12H, m); 13C-NMR (150 ° MHZ) δ: 172.6, 171.8, 153.1, 130.3, 125.5. , 106.9, 73.4, 69.2, 67.2, 56.6, 44.8, 32.0, 31.3, 30.4, 30.3, 29.8, 29.7, 29. 5, 29.4, 26.2, 22.8, 19.1, 17.8, 14.2; calculated value 1091 for MALDI @ TOF-MS (pos) C68H128N2O6 [M + Na] +, experimental value 1091
[0132]
[SC] -Val-Gly-Phe-Fmoc
1H-NMR (600 MHz) δ: 7.75 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.53-7.49 (2H, m), 7.39 (2H, dd, J = 7. 3, 22 Hz), 7.30-7.27 (4H, m), 7.25-7.21 (1H, m), 7.20-7.15 (2H, br), 6.76-6 .69 (1H, br), 6.60-6.55 (1H, br), 6.50 (2H, s), 5.40-5.34 (1H, br), 5.07 (1H, d) , J = 12.1 Hz), 4.99 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.56 (1H, dd, J = 8.8, 4.8 Hz), 4.46-4 .30 (2H, m), 4.17 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.10-4.03 (1H, m), 3.92 (6H, t, J = 6.6) Hz), 3.83-3 76 (2H, m), 3.18-3.11 (1H, m), 3.10-3.02 (1H, m), 2.20-2.13 (1H, m), 1,79- 1.69 (6H, m), 1,48-1,41 (6H, m), 1.35-1.23 (84H, brm), 0.91-0.85 (15H, m); 13C- NMR (150 MHz) [delta]: 171.5, 171.3, 168.3, 156.0, 153, 1, 143.6, 141.2, 138.2, 136.2, 130.1, 129.1, 128.8, 127.7, 127.1, 127.0, 125.0, 124.9, 120.0, 107.0, 73.4, 69.2, 67.5, 67.1, 57. 3, 47.2, 32.0, 31.3, 30.4, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 26.2, 22.8, 19 0,17.8,14.2; MALDITOF-MS (pos) C92H147N3O9 [M + Na] calcd for + 1461, experimental values 1461
[0133]
[SC] -Val-Gly-Phe-NH2
1H-NMR (400 MHz) δ: 7.99 to 7.93 (1H, m), 7.35 to 7.30 (2H, m), 7.27 to 7.21 (3H, m), 6. 66 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.52 (2H, s), 5.11 (1H, d, J = 12.1), 5.02 (1H, d, J = 12. 1Hz), 4.58 (1H, dd, J = 8.8, 4.8 Hz), 4.05 (1H, d, J = 5.9 Hz, minor), 4.01 (1H, d, J) = 5.9 Hz, major), 3.98-3.91 (7H, m), 3.66 (1H, d, J = 10.0 Hz), 3.32 (1H, dd, J = 13.2 Hz). 6, 3, 9 Hz), 2.67 (1H, dd, J = 13.6, 10.0 Hz), 2,24-2.15 (1H, m), 1.82-1.69 (6H , M), .50-1.39 (6H, m), 1.37-1.21 (84H, br), 0.92 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.90-0.85 (12H , M); 13C-NMR (150 @ MHz) δ: 175.2, 171.5, 168.9, 153.1, 151.4, 137.7, 129.2, 128.8, 126.9, 125 0.5, 107.0, 73.5, 69.2, 67.5, 57.2, 56.5, 43.4, 40.9, 32.0, 31.3, 30.4, 29.8 , 29.7, 29.5, 29.4, 26.2, 22.8, 19.1, 17.7, 14.2; calculated 1239 for MALDI @ TOF-MS (pos) C77H137N3O7 [M + Na] +. Experimental value 1239
[0134]
Example 2
Liquid phase synthesis of [SC] -valine-phenylalanine-Fmoc ([SC] -Val-Phe-Fmoc)
63 mg of Fmoc-Phe, 63 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Phe / DMF solution. That is, after cooling 2 mL of this solution to 5 ° C., the [SC] -Val-
[0135]
Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it is separated into two layers again, and thus the desired product [SC] -Val-Phe-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). By repeating the above operation, amino acids are sequentially bonded to the liquid carrier, and the target peptide is synthesized.
[0136]
Example 3
Liquid phase synthesis of [SC] -valine-proline-Fmoc ([SC] -Val-Pro-Fmoc)
53 mg of Fmoc-Pro, 57 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Pro-OH / DMF solution. That is, after cooling 2 ml of this solution to 5 ° C., the [SC] -Val-
[0137]
Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it is separated into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Pro-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). By repeating the above operation, amino acids are sequentially bonded to the liquid carrier, and the target peptide is synthesized.
[0138]
Example 4
Liquid phase synthesis of liquid carrier-valine-alanine-Fmoc ([SC] -Val-Ala-Fmoc)
50 mg of Fmoc-Ala, 53 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Ala-OH / DMF solution. That is, after cooling 2 mL of this solution to 5 ° C., [SC] -Val-NH obtained in step 1) of Example 1 was used.2/ Cyclohexane solution (2 ml) is added. The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and left at 50 ° C. for 30 minutes.
[0139]
Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, the reaction solution is separated into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Ala-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). By repeating the above operation, amino acids are sequentially bonded to the liquid carrier, and the target peptide is synthesized.
[0140]
【The invention's effect】
In a conventional solid-phase reaction peptide synthesizer, the presence of an amino acid binding group on the solid phase causes poor reactivity with amino acids, and a large excess of amino acids, such as 100 times the amount reacted, must be supplied to the reaction system. There was a problem. On the other hand, in the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention, since the synthesis reaction proceeds in a homogeneous solution system in a compatible state, the reaction efficiency is extremely high, and the peptide is externally added to the peptide terminal bound to the carrier. No excess amount of amino acid molecules is required for the reaction. Similarly, the reaction is fast because of the liquid phase, and the synthesis proceeds in a short time that is incomparable with solid phase synthesis.
[0141]
Further, in the present apparatus, since the unreacted portion at the activated terminal of the peptide in the course of synthesis is extremely small, the generation of impurity peptides other than the desired peptide due to erroneous binding due to the unreacted portion is small. Therefore, a purification step by chromatography or the like, which has been conventionally required, can be omitted, and practical synthesis of a peptide having a limit of about 50 or more bonds (number of residues) of the peptide can be achieved.
[0142]
Furthermore, the progress of the target reaction, which was difficult in solid phase peptide synthesis, can be checked by coloring the solvent with a dye or the like. Since the scale-up of the present apparatus is easy as in the case of an ordinary liquid-phase process apparatus, low-cost mass production of the desired peptide becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flow chart of solid phase peptide synthesis (part 1)
FIG. 2 is a flow chart of solid-phase peptide synthesis (part 2)
FIG. 3 shows the relationship between a first solvent and a second solvent in which a compatible state and a phase-separated state change reversibly depending on temperature.
Experimental example: Photograph of a mixture of a dye and a second solvent in the lower layer
FIG. 4 is a reaction flow diagram for binding an R1 residue amino acid to a
FIG. 5 is a reaction flow chart for removing and activating Fmoc of a substance 1af in which a
FIG. 6 is a reaction flow chart for removing and activating Fmoc of substance 1bf in which
FIG. 7 is a first example of a liquid-phase peptide synthesizer of the present invention.
FIG. 8 is a liquid conductivity sensor head.
FIG. 9 shows a second example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention (temperature control means 6 is omitted).
FIG. 10 is an explanatory view of a peptide synthesis step using the present invention device (part 1)
FIG. 11 is an explanatory view of a peptide synthesis step using the apparatus of the present invention (part 2).
FIG. 12 is an explanatory view of a peptide synthesis step using the apparatus of the present invention (part 3).
FIG. 13 is an explanatory view of a peptide synthesis step by the present device (part 4).
FIG. 14 is an explanatory view of a peptide synthesis step by the present device (part 5).
FIG. 15 shows a third example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention: an example in which a
FIG. 16 shows a fourth example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention: a continuous apparatus (16 and 18 are omitted).
FIG. 17 is a diagram illustrating the principle of estimating the amount of exclusion from conditions before and after a peptide binding reaction in a synthesis layer.
FIG. 18 is an explanatory diagram of the configuration of the first solvent and the second solvent and the change of the compatibilization temperature (part 1).
FIG. 19 is an explanatory diagram of the composition of the first solvent and the second solvent and the change of the compatibilization temperature (part 2).
FIG. 20 is an explanatory diagram of an embodiment of liquid-phase peptide synthesis using the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention.
FIG. 21 is a supplementary explanatory diagram of the third example of the liquid phase peptide synthesizer of the present invention.
FIG. 22 is a fifth example of the liquid-phase peptide synthesizer of the present invention: a continuous apparatus (16 and 18 are omitted).
FIG. 23 is an explanatory diagram of controlling a solution supply amount.
[Explanation of symbols]
1. Examples of liquid carriers
1a: Binding substance of R1 residue amino acid with liquid carrier
Substance in which a protecting group Fmoc is bound to the N-terminal of the amino acid at residue R1 of 1afａ1a
1b—Binding substance of R1 and R2 residue amino acids with liquid carrier
Substance in which a protecting group Fmoc is bonded to the N-terminal of the R2 residue amino acid of
1c Binding substance of R1, R2, R3 residue amino acids with liquid carrier
A substance in which a protecting group Fmoc is bonded to the N-terminal of an amino acid at residue R3 of 1cfｃ1c.
2. Part of the liquid phase carrier in the binding substance of the liquid carrier and the amino acid
3. Mixing tank for mixing first and second solvent solutions
4—Preparation tank for the second solvent solution B12 in which the amino acid after pre-binding is dissolved in the second solvent
5—Means for supplying the second solvent solution B12 to the
6 Temperature control means for
6a: Temperature control means for controlling (heating) to a temperature at which the first and second solvent solutions become compatible with each other
6b—Temperature control means controlling (cooling) to a temperature at which the first and second solvent solutions enter a phase separated state
7. Means for judging the amount of the second solvent solution from the interface position obtained from 20, and removing it from the
7a 7, a flow path (piping) for excluding the second solvent solution, a flow path opening / closing means (valve, etc.), a pump, etc.
8 Binding R1 residue amino acid with protecting group Fmoc bound to N terminal of R1 residue amino acid to liquid phase carrier
Reaction
9 solid phase carrier (resin such as resin)
Operation to remove and activate Fmoc, etc., which is a protecting group at the 10N terminal
Terminal activation means which is a reaction tank / reactor that performs the operation (process) of
11 Operation to carry out peptide bond reaction of 12 with activated N-terminal part
Amino acid after binding pretreatment in which a protecting group Fmoc or the like is bound to the 12N terminus
16 ° Means for transferring the first and second solvent solutions in a mixed state in the mixing tank
17 Separation tank that makes the first and second solvent solution phase separated
18 means for determining the amount of the second solvent solution and removing it from the
19 Means for estimating the reaction of the mixing tank
20 ° Interface detecting means for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution
20a Solvent property sensor probe (probe) inserted into the
An example of a sensor head of
20c 配線 20a internal electrical wiring
20e @ light (radiant energy) generator
20f @ light (radiant energy) receiver
30 ° Means for determining the amount and ratio of the first solvent solution and the second solvent solution
31. Means for controlling the amounts and ratios of the first solvent solution and the second solvent solution
32. Control means (flow rate control device) for adding the first solvent or the second solvent.
33 B12 supply amount control means (flow control device)
34 A1x supply amount control means (flow control device)
35 B12, A1x components (solvent A, solvent B components, 12, 1x amino acid-based material components) information
A First solvent
A0 First solvent solution in which any substance is dissolved
A1 A first solvent solution in which a liquid carrier is dissolved in a first solvent
A1a A first solvent solution in which a binding substance (1a) of a liquid carrier and an R1 residue amino acid is dissolved in a first solvent
First solvent solution in which substance (1af) in which a protecting group is bonded to A1af @ 1a is dissolved in a first solvent
A1b A first solvent solution in which a binding substance (1b) between a liquid carrier and R1 and R2 residue amino acids is dissolved in a first solvent
A1bf @ 1b: A first solvent solution in which a substance (1bf) in which a protecting group is bonded to 1b is dissolved in a first solvent
A1c A first solvent solution in which a liquid carrier and a binding substance (1c) of R1, R2, and R3 residue amino acid chains are dissolved in a first solvent.
First solvent solution in which a substance (1cf) in which a protecting group is bonded to A1cf @ 1c is dissolved in a first solvent
A1x A first solvent solution in which a binding substance (1x) of a liquid carrier and an arbitrary amino acid-based substance is dissolved in a first solvent
A1xf @ 1x A first solvent solution in which a substance (1xf) in which a protecting group is bonded to 1x is dissolved in a first solvent.
Atank 1st solvent preparation tank
B second solvent
B0 Second solvent solution in which any substance is dissolved
A second solvent solution in which B12 溶媒 12 is dissolved in a second solvent
Btank second solvent preparation tank
R1, R2, R3記載 Same as R1, R2, R3 on the drawing
R1, R2, R3: amino acid residues constituting the peptide chain to be synthesized
Claims (15)
混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである、請求項７の液相ペプチド合成装置The means for determining the amount of the second solvent solution in the separation tank includes the supply amount of the first solvent solution supplied to the mixing tank and the solution component, and the supply amount of the second solvent solution supplied to the mixing tank and the solution Ingredients and
8. The method according to claim 7, further comprising: means for estimating the reaction of the mixed layer based on the temperature of the mixing tank, and determining the amount of the second solvent solution in the separation tank based on the estimation of the reaction by the estimating means. Liquid phase peptide synthesizer
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