JP2004024024A

JP2004024024A - Method for synthesizing glucide or its derivative using polypeptide having functionality participating in chitosan hydrolytic activity by transglycosylation

Info

Publication number: JP2004024024A
Application number: JP2002181236A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Tokuyasu; 徳安　健; Masaru Mitsutomi; 光富　勝
Original assignee: National Food Research Institute
Current assignee: National Food Research Institute
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2004-01-29

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a method for synthesizing a glucide or its derivative using a polypeptide having functionality participating in the chitosan hydrolytic activity according to transglycosylation and to provide a technique for efficiently synthesizing a functional new material actively utilizable in various regions such as glucide engineering, agriculture, foods and medicines. <P>SOLUTION: The polypeptide having the functionality and participating in the chitosan hydrolytic activity is made to act on chitosan or a compound having a structure similar to that of the chitosan. Thereby, the glucide containing one or several D-glucosamine residues or its derivative is synthesized according to the transglycosylation for a compound having a moiety for nucleophilically attacking an anomeric site of a reaction intermediate. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを用いた糖質あるいはその誘導体の糖転移による合成法に関し、詳しくはキトサン系素材をはじめとする糖質素材の糖転移による合成法に関するものである。
本発明により、機能性新素材の効率的合成が可能となり、糖質工学、農業、食品、医薬等の様々な領域において活用可能な新技術を提供することができる。
発明者らによって、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの設計図となる、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の解明に成功したことから、天然界に存在し、該ポリペプチドとほぼ同質のポリペプチドをスクリーニングし、獲得することが可能である。
さらに、化学修飾法、遺伝子工学的手法、分子育種的手法等を用いて、該ポリペプチドの機能性の殆どを維持した状態で、一部の特性をある程度改変することが可能である。
これらのことにより、該ポリペプチドによる糖転移合成技術を、必要な反応系に対応させる形で発展させ、上記領域を中心とした多岐に亘る分野において、本技術を高度に活用することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを活用した糖質あるいはその誘導体の合成法に関するものである。糖転移作用は、糖質素材関連産業あるいは糖鎖合成に関わる研究開発分野等において、新規糖質合成のための有効な手段として用いられており、リゾチーム、プルラナーゼ、キチナーゼ等、多くの酵素が用いられてきた。
食品素材のみならず、多岐に亘る機能性を有する分子として知られるサイクロデキストリン、サイクロデキストラン、サイクロアミロース等の環状糖を合成する酵素も、本来は糖質加水分解酵素としての触媒特性を示しつつ、分子内糖転移活性によりこれらの糖質を合成することが知られている。
【０００３】
サイクロ糖の様に大幅に糖質の物性が改変される例の他にも、糖転移産物は転移前の物質と比較して水溶性等の物性が向上する例が知られており、糖転移は、物性の改変による糖質素材の高機能化を行うための有効な方法である。
また、糖転移活性を活用し、ラクトース、キチンオリゴ糖等、容易に入手できる糖質素材から機能性糖鎖誘導体を合成する様な研究も広く行われている。
しかしながら、遊離アミノ糖残基を含む糖残基を直接転移する方法はこれまで全く存在しておらず、キトサン加水分解酵素を用いて転移反応を行う方法についても知られていない。
【０００４】
また、生物界においては、遊離アミノ基を有するアミノ糖残基は広く存在しているが、その生合成については、遊離アミノ基を有するアミノ単糖残基を直接転移する活性を有する糖転移酵素及びそのドナー分子としての遊離アミノ基を有するアミノ糖のヌクレオチド誘導体の存在は、現在までに確認されていない。
一般には、Ｎ−アセチル化されたアミノ糖残基が糖転移酵素によりアクセプタに結合した後、Ｎ−脱アセチル化酵素の作用により遊離アミノ糖残基に変換される経路をとると考えられている。
【０００５】
一方、有機合成による遊離アミノ基を有するアミノ糖残基の導入法においても、アクセプタへの結合に先立ち、遊離アミノ基を有するアミノ糖残基のアミノ基部分を誘導体化しておく必要がある。その一般的な脱保護は、アルカリやヒドラジン等を用いた極めて過激な条件下で行うため、本方法によれば、種々の副反応が起こる可能性が高い。
また、脱保護反応における位置選択性は極めて低いと考えられる。そのため、遊離アミノ基を有するアミノ糖を結合させた糖の有機合成による導入は、綿密に計画された複雑な工程を経て、極めて限られた化合物についてのみ実践されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記の背景より、Ｄ−グルコサミン残基を単数、あるいは複数含む糖残基をアクセプタへ酵素的に転移する活性をもつポリペプチドが発見されれば、糖質関連研究の大幅な発展に貢献することが期待される。
キトサン系素材は、凝集剤、動物用人工皮膚、抗菌剤、抗真菌剤、機能性食品素材、生分解性プラスチック等、多方面において活用されている。キトサンは、希酸に可溶な高分子であり、セルロース、キチン、キシラン等の類似糖鎖構造を有する高分子と比較して、取り扱いが格段に容易だという特徴を有する。
キトサン溶液中でキトサンがカチオン性を示す原因となる遊離アミノ基は、酸無水物、アルデヒド等との化学反応性が高いのみならず、イオン結合、配位結合等により、様々な分子とユニークな相互作用を起こす。また、キトサンは安全性が高く、生体適合性があり、天然界においては緩やかな生分解性を示すことが知られている。
【０００７】
そのため、キトサンと他の機能性分子との複合化による、ドラッグデリバリーシステム、成分徐放性マトリックス等としての活用を目指した研究が精力的になされている。一方、キトサンの低分子化によって素材に水溶性が賦与され、免疫賦活剤、腎機能改善剤、植物エリシター等の新用途が見出されている。
しかしながら、機能性分子とキトサンあるいはそのオリゴ糖との複合化法は、キトサン系分子中の遊離アミノ基と機能性分子との化学的共有結合法が主体である。その際には、双方の量比及び反応条件を厳密に制御しなければ、遊離アミノ基の存在に起因するキトサン系素材の特性が発現されにくくなってしまう。
【０００８】
また、グリコシド結合以外の非天然結合を導入することから、安全性、生体適合性という観点において常に注意が必要となる。加水分解酵素による糖転移反応とは、ドナー分子のグリコシド結合を切断して、アクセプタ分子との新たなグリコシド結合を導入する反応であり、糖転移反応によるグリコシド結合は同酵素により加水分解されうる。
グリコシド結合による環境適応性の高い糖転移産物を合成する方法を確立することより、研究成果の蓄積が行われつつあるキトサン誘導体の合成に関する分野は、飛躍的に発展するものと期待される。
【０００９】
オリゴ糖あるいは多糖の加水分解酵素は、基質の分子構造を強く認識し、触媒反応に適する様に酵素分子近傍の空間内に基質分子を配置するという機能性を有することが知られている。糖転移反応は、ドナー分子とアクセプタ分子の双方が収まる空間が存在することにより初めて速やかに進行する。
基質分子またはそのアナログを正しく配置させる機能性は、触媒機能に匹敵する酵素の重要性な特性であり、応用面においても、例えば加水分解酵素活性を大幅に低下させたリテイニング型酵素の変異体を用いたグライコシンテース（Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ）という概念及び活用法を支えるものである。
【００１０】
しかしながら、これまでに、キトサンの構造を強く認識する空間を提供するグライコシンテースを構築するための、リテイニング型キトサン加水分解酵素由来のポリペプチド配列情報は全く知られていなかった。
糖転移活性を示す加水分解酵素は、リテイニング型の分解様式により基質を分解することが知られている。糖転移活性を有するキトサン加水分解酵素が発見され、遺伝子情報が解明されれば、その情報内には、キトサン系基質を認識する酵素近傍の空間に関する情報が含まれており、リテイニング型酵素遺伝子の配列を改変することによってグライコシンテース等を設計する上で活用される有用情報となる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上の背景を考慮し、キトサン加水分解酵素活性の産業における活用を踏まえた酵素特性解明を鋭意行った結果、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドが糖転移活性を有することを見出し、糖転移産物の合成法を開発した。遊離アミノ糖残基をはじめとするドナー分子から糖残基を切り取り、それを様々なアクセプタ分子に転移することが可能となることにより、新規糖質合成のための効率的な手法が提供される。
また、本発明者らは、その設計図となる、該ポリペプチドをコードする遺伝子の単離に成功した。そのことによって、該ポリペプチドと実質的に同質な機能性を有する多くの類似ポリペプチドを天然界から容易に獲得することが可能となった。さらに、該ポリペプチドと実質的にほぼ同質な機能性を有し、一部の特性を改変したポリペプチドを天然から、あるいは工学的技術を用いて人工的に取得することが可能となった。
【００１２】
請求項１記載の本発明は、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを、キトサンもしくはキトサンと類似構造を有する化合物に作用させ、反応中間体のアノメリック位を求核攻撃する部分を有する化合物への糖転移によって１個あるいは数個のＤ−グルコサミン残基を含む糖質あるいはその誘導体を合成する方法である。
請求項２記載の本発明は、機能性を有するポリペプチドが、ストレプトミセスグリセウス　ＨＵＴ６０３７由来キトサン加水分解酵素または該酵素と同質な機能性を有する加水分解酵素である請求項１記載の合成法である。
請求項３記載の本発明は、キトサンと類似構造を有する化合物が、キトサンオリゴ糖、部分脱アセチル化キチン、部分脱アセチル化キチンオリゴ糖、カルボキシメチルセルロース、グリコールキトサン及びセロオリゴ糖の中から選択されたものである請求項１記載の合成法である。
請求項４記載の本発明は、反応中間体のアノメリック位を求核攻撃する部分を有する化合物が、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコース、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びそれらの誘導体の中から選択されたものである請求項１記載の合成法である。
請求項５記載の本発明は、糖質あるいはその誘導体が、１個あるいは数個のＤ−グルコサミン残基を含むものである請求項１記載の合成法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを用いた糖質またはその誘導体の糖転移による合成法に関するものである。本発明の主な部分となる該ポリペプチドの特徴としては、キトサン加水分解酵素の設計図ともいえる遺伝子配列情報が挙げられる。
本情報の獲得により、ポリペプチドが機能性を発現する際の至適ｐＨ、至適温度、安定性、基質特異性等の諸特性を改変し、本質的な機能性の殆どを維持した形で該ポリペプチドの高機能化を行うことができる。
また、本発明の成果として、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドをコードする遺伝子情報が入手されたことにより、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション等、既知の遺伝子工学技術を用いて、独特の生物学的進化を遂げた他の生物から、一部の特性が改変された類似機能酵素をスクリーニングすることが可能となる。
【００１４】
さらに、基質を認識し、配置させるための空間を保持しつつ、酵素活性を大幅に低下させたポリペプチドを遺伝子工学技術等により生産させ、グライコシンテース等としてその空間を活用することが可能となる。上記効果により、キトサンの酵素的低分子化を中心としたキトサンの活用技術が飛躍的に発展し、キトサン系素材に関する新需要の喚起及び新産業の創出へと繋がるものと期待される。以下に、本発明を詳しく説明する。
【００１５】
キトサンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ−１，４結合によって結合した直鎖状多糖であるキチンを主に濃アルカリによって脱アセチル化処理して製造される高分子で、希酸に可溶性の高分子である。
一般には、７０％以上のＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）残基が脱アセチル化されているものをキトサンと呼ぶ。キトサン製品は、世界各国において多社により製造・販売されており、市販品以外にも、微生物菌体等から同様の構造のものが精製できることが知られている。キトサン製品としては、例えば株式会社共和テクノス（千葉県）製のフローナックＣを用いることができる。
キトサンは、水溶液中でポリカチオンとなることから、凝集剤、抗菌剤、抗真菌剤、機能性食品素材、生分解性プラスチック等、多方面において活用されている。キトサンは、生体適合性高く、生分解性を示す素材である点において、その誘導体とともに医薬分野において活用が可能な素材である。
【００１６】
キトサンと類似構造を有する化合物は、キトサンオリゴ糖、部分脱アセチル化キチン、部分脱アセチル化キチンオリゴ糖、カルボキシメチルセルロース、グリコールキトサン、セロオリゴ糖、キシラン及びグリコサミノグリカン誘導体の中から選択される。
キトサン誘導体分子は、親水性等の機能性をキトサンに付与する目的で、種々の置換度でキトサンあるいはそのオリゴ糖のアミノ基、水酸基、アルデヒド基の一つあるいは複数を誘導体化したものであり、グリコールキトサン等が知られている。また、キトサンオリゴ糖は、キトサンの加水分解等の方法により製造されたＧｌｃＮがβ−１，４結合によって結合したオリゴ糖であり、免疫賦活剤、腎機能改善剤、植物エリシター等の用途が見出されている。
【００１７】
キトサンの主鎖グリコシド結合を加水分解する酵素は、一般にキトサナーゼと呼ばれている。Ｅｎｚｙｍｅ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　１９９２によれば、キトサナーゼはＥＣ　３．２．１．１３２と定義されているが、本定義においては、部分脱アセチル化キチンのＧｌｃＮＡｃ−　β−１，４−ＧｌｃＮ　間の結合をエンドタイプに切断がするものだけがキトサナーゼとされており、現在までに、本定義に該当しないキトサン加水分解酵素が数多く報告されている。
さらに、キトサン加水分解酵素のあるものは、部分脱アセチル化キチン、カルボキシメチルセルロース等、他の糖鎖結合を加水分解する活性を有しており、キトサナーゼという定義自体が曖昧なものとなっている。
この点を考慮すると、本発明におけるキトサン加水分解酵素は、厳密に定義されたキトサナーゼとは必ずしも同義でなく、キトサンの主鎖グリコシド結合の加水分解活性を有する酵素一般を意味する。
【００１８】
また、一般的に、酵素機能は、触媒中心残基の機能のみから成立するものでなく、酵素構造自体を安定化する機能、基質を認識する空間の機能、基質を導入する空間の機能等の多様な機能性により支えられている。キトサン加水分解酵素についても、触媒活性のみならず、酵素が有する様々な機能性及びその発現機構がその遺伝子情報に入っているものと見なすことができる。
本発明において、“キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチド”と表現した様に、キトサン加水分解酵素は機能性分子として総合的に認識されるべきである。
【００１９】
本発明者らは、キトサン加水分解酵素の機能を産業において活用する目的で、キトサン加水分解酵素の特性解明を行った結果、高い糖転移活性を有するキトサン加水分解酵素を発見し、その設計図とも言うべき遺伝子配列の解読にも成功した。本酵素遺伝子の配列から酵素のアミノ酸配列を推定した結果、本酵素は糖質加水分解酵素ファミリー５に属する一次配列を有する酵素であることが明らかとなった（糖質加水分解酵素のファミリー分類は、ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／　参照）。ファミリー５に属し、キトサン加水分解活性に関与する機能性及び糖転移活性を有する酵素は全く知られていない。
【００２０】
糖転移活性を有する糖質加水分解酵素は、アノマー保持型の加水分解機構によって基質を分解する。アノマー保持型酵素は、第１段階において基質のグリコシド結合を分解し、基質から糖残基を切り離した後、第２段階として酵素により活性化された水分子が切り離された糖残基のアノメリック位を求核攻撃することにより加水分解が完了する。
その際に、水分子の代わりに他の分子がアノメリック位近傍に来た際には、第１段階に切り出された糖残基とその分子がグリコシド結合する現象が観察される（糖転移）。糖転移反応を糖質あるいはその誘導体の合成に用いることを目的とした研究は、これまで多数報告されている。
【００２１】
酵素反応により糖を合成する方法は、加水分解酵素の糖転移活性を利用する方法以外に、糖転移酵素を用いて、糖ヌクレオチドを基質とした反応を行う方法が知られている。
加水分解酵素による糖転移法の一般的特性としては、（１）基質が安価で、入手しやすい、（２）加水分解反応との競争になるため反応収率が低い、（３）糖転移する場所が１カ所にならず、異性体の生成が問題となる場合がある、という点が指摘されている。
しかしながら、大量に糖質素材を合成する際などは、転移するべきドナー分子の入手が容易であることから、加水分解酵素の糖転移活性を活用するケースが見られている。例えば、プルラナーゼを用いてマルトース残基をサイクロデキストリンに糖転移する方法は工業的に実用化されており、マルトース側鎖の導入により、通常のサイクロデキストリンと比較して、水溶性が飛躍的に向上した分枝サイクロデキストリンとして製品化されている。
【００２２】
一方、上記（２）の特徴である反応収率の低さを克服するために、様々な工夫がなされている。例えば、加水分解活性に対する糖転移活性を上げるために、水分子の存在量及びその形態を変化させる試みがなされている。具体的には、メタノール、アセトニトリル等の有機溶媒中における反応、硫安存在下での反応等が例としてあげられる。
また、酵素の触媒中心に位置する求核基を不活性化した上で、フッ化糖誘導体を糖転移基質として反応を行うという斬新な蛋白質工学的方法（グライコシンテースによる合成法：Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，　Ｌ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１２０，　５５８３−５５８４　（１９９８））が発明された。
この方法は、求核基を不活性化した酵素タンパク質は加水分解活性を殆ど有さず、生成物が再度加水分解基質にならないことを利点としている。この方法の原理は、フッ素により活性化されたドナーのアノメリック位に対して、活性化されたアクセプタが求核攻撃することにより、合成方向にのみ反応が進行するというものであり、加水分解酵素の糖転移活性を実用化しやすい形に発展させたものである。
【００２３】
本発明に用いる酵素は、キトサン加水分解酵素のうち、唯一報告されているアノマー保持型酵素であることから、本発明に記載した配列情報を利用することにより、キトサンをはじめとする糖あるいはその誘導体を糖転移する目的でグライコシンテース等を設計することが可能となる。
キトサン加水分解酵素が糖転移活性をもつことは、本発明者らによる酵素特性の詳細な解明により初めて明らかとなった。糖転移のドナーとしては、通常の条件下で加水分解基質となりうる化合物が挙げられる。
前述したとおり、キトサン加水分解酵素は、キトサン以外にも、キトサンオリゴ糖、部分脱アセチル化キチン、部分脱アセチル化キチンオリゴ糖、カルボキシメチルセルロース、グリコールキトサン等、様々な化合物を基質とする例が知られており、Ｄ−グルコサミンのホモポリマーであるキトサンをドナーとして限定するものではない。
【００２４】
また、アクセプタとしては、反応中間体のアノメリック位を求核攻撃する部分を有する様々な化合物が想定される。重水、アルコール、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの誘導体、複合糖質、人工糖鎖、細胞表面糖鎖等、様々な化合物を想定することができる。その中で、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコース、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びそれらの誘導体は、酵素内の基質認識部位に容易に収まると推定され、それ故に効率的な糖転移を行うことが期待できる。
【００２５】
糖転移活性は、反応生成物をＴＬＣ、ＨＰＬＣ等の分析法を用いて検出することが可能となる。例えば、キトサンオリゴ糖をドナー及びアクセプタとして用いた際にはＴＬＣプレート（ＴＬＣ　ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｓｈｅｅｔｓ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０，　ＭＥＲＣＫ社）に０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウムを噴霧後風乾し、１０５℃で１時間乾熱したものを用いて、ｎ−プロパノール／水／３０％アンモニア水＝７０：１５：１５の割合（ｖ／ｖ）で混合した展開溶媒を用いて、上昇法により３回展開する方法等が考えられる。
酵素が微量の場合あるいは複数の糖転移パターンを有する生成物の混合物になる場合の様な、ＮＭＲによる完全な構造決定が困難な場合は、転移反応の有無はマススペクトロメトリー等により推定される。
さらに、単離した化合物についてＦＴ−ＭＳ　等を用いて精度の高い質量分析を行うことにより、同位体の存在比率を考慮した推定分子式の妥当性について信頼性の高い議論が可能となる。
【００２６】
Ｄ−グルコサミンの様な、遊離アミノ糖残基をもつ糖鎖の有機合成法は存在するが、化学反応性が高いアミノ基を予め保護しておく必要が生じる。保護基としては、モノクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基等が選択される。しかしながら、目的の糖残基を導入した後のアルカリによる脱保護には相当な熟練を要し、糖鎖骨格の分解等の副反応が起こりうる点が問題となる。
それに対して、保護・脱保護工程を経ることがない酵素法を用いることにより、多くの研究者が、容易に新規機能性を有する遊離アミノ糖を含む素材のスクリーニングを実施できると期待できる。特に、大量消費素材の効率的合成を行う目的においては、実践的な新技術を提供することが可能となる。
これまでに遊離アミノ糖残基を酵素的に糖転移する方法は報告されていないことから、世界に先駆けて糖転移活性を有する酵素の設計図である遺伝子配列を解読した本発明は、直ちに新産業の創出に道を拓く技術に繋がるものであると考えられる。
【００２７】
機能性分子としての酵素ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、該ポリペプチドを合成する上での設計図となる。配列表の配列番号２のＤＮＡ配列は、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のＤＮＡ配列である。コドンの縮重を考慮することにより、配列表の配列番号１のアミノ酸配列と同等のアミノ酸配列をコードし、配列番号２の配列と異なった多数のＤＮＡ配列を想定することが可能となるが、それら全ては配列番号１の配列をコードするＤＮＡ配列であるという点で配列番号２の情報と同等であり、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの設計図と実質的に同等である。
この様なコドンの改変は、自然界において種々の要因により日常的に起こりうる突然変異であるのみならず、人為的にも、アンバーストップコドンの導入、発現量改変のためのレアコドン配列の改変、制限酵素認識部位の導入あるいは欠失等の目的で行われている。
【００２８】
配列表の配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の情報をもとにしたＰＣＲ法、ハイブリダイズ法等の方法により、様々な生物のＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー等からクローニングされうる、機能的に該ポリペプチドの特性と殆ど変わらないポリペプチドをコードする遺伝子配列については、本発明に記載された情報を知り得て初めて実現可能なものである点及び分子生物学的手法により容易に達成が可能である点において、本発明に包含されると考えられる。機能性分子としての酵素ポリペプチド中のアミノ酸残基を１個または複数個について、欠損、付加、置換もしくは挿入等の少なくとも一つが行われたものが、もとの酵素と同等の機能性を有することは広く知られている。
【００２９】
これまでに多数のポリペプチドについて、本来の機能性の少なくとも一部を保持した状態でのアミノ酸配列改変を目的として、ランダム突然変異導入実験、部位特異的突然変異導入、遺伝子シャッフリング、セクシャルＰＣＲ等が行われてきた。その結果、アミノ酸配列が完全には一致しないポリペプチドでも本質的な機能に大きな違いが見られないという例が多数報告されている。
また、遺伝子工学的手法、化学的手法、代謝工学的手法等を用いて、ポリペプチド鎖の分子構造の一部を改変するという工程は、極めて一般的なものであり、例えば、簡易精製用タグペプチド配列を付加した組換えポリペプチドの合成、糖鎖付加等の翻訳後修飾の制御による構造改変、ポリエチレングリコール、ビオチン誘導体等で修飾したハイブリッドポリペプチドの合成、４塩基認識ｔ−ＲＮＡ　の利用あるいはアミノ酸要求性宿主生物培養液への人工アミノ酸投与による人工アミノ酸残基の導入等が知られている。
【００３０】
本発明の目的は、キトサン加水分解に関わる本ポリペプチドの機能性の活用にあることから、上記の方法により同等な機能を有するポリペプチドの構造を一部改変し、本発明に記載したポリペプチドの機能と大きな違いが見られない機能性が発現されている分子については、本発明に実質的に含まれるものである。
また、遺伝子工学分野の基盤技術をもつ研究者であれば、本発明によって解明された遺伝子情報を利用して、公知の遺伝子工学的手法、例えばコードするＤＮＡ配列を制限酵素等により切り出すあるいはＰＣＲにより増幅する等の方法により単離し、該ポリペプチドを適当なベクター、例えばｐＥＴ系ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ　社）と構造遺伝子配列を連結するのが一般的である。
【００３１】
相同組換え法による構造遺伝子のＤＮＡ配列のベクターへの導入法も知られている。続いて、このベクターを適当な宿主細胞へ導入する。例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）細胞を用いてベクターにより形質転換等を行うことにより組換え大腸菌を作製する。
こうして得た組換え生物を用いて実質的に同等の機能を有する組換えタンパク質を生産することが可能であることは容易に想到される。また、無細胞系を用いて構造遺伝子の発現を行う方法等も知られている。
この様な遺伝子工学技術を用いて、本発明者らが配列を決定したポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを生産し、その糖転移活性に関する機能性を活用することは、実質的に本発明に含まれると考えられる。
【００３２】
また、タンパク質工学的技術等を用いて、配列表の配列番号１に記載した、本遺伝子がコードするアミノ酸配列を改変することについては、これまでに極めて多くの報告例があり、報告された基盤的技術を本ポリペプチドに対して同様に適用することにより、容易に想到、達成することが可能である。
蛋白質工学的技術等により作製され、配列表の配列番号１記載のポリペプチド配列の機能性と大きく変わらない物性を有するポリペプチドについては、たとえアミノ酸配列が多少異なっていても、実質的に本発明の内容に包含されることは明白である。例えば、蛋白質工学的手法によりポリペプチドの比活性を低下させて、同一の反応を行うのに必要なポリペプチド分子数を増加させ、系内の蛋白質濃度の増加により見かけの熱安定性が向上したとしても、その様な類似ポリペプチドの機能が配列表の配列番号１記載のポリペプチドの機能と本質的に変わらない限り、この様なポリペプチドについても本発明に包含される。
【００３３】
また、セクシャルＰＣＲ等の方法により、アミノ酸配列を改変し、蛋白質の耐熱性あるいは至適ｐＨ等の物性を僅かに改変することは、いまや教科書的な手法になっており、糖転移活性が配列表の配列番号１記載のポリペプチドと大きく変わらない限りは、この様な改変ポリペプチド配列も本発明に含まれると考えられる。
キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドは、主にキトサナーゼと呼ばれるキトサン加水分解酵素として、細菌、カビ、酵母等により生産されることが知られているが、該ポリペプチドを生産する生物については、これらに限定しない。例としては、ストレプトミセス　グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）　ＨＵＴ６０３７由来のキトサン分解酵素ＩＩが挙げられる。
【００３４】
先述した様に、キトサン加水分解活性を有するポリペプチドの多くが、キトサン以外の基質を加水分解することが知られており、発見された状況によっては、基質特異性を調べる際にキトサンが用いられておらず、キトサン加水分解活性を有するにも拘わらず発見されていない可能性が十分に考えられる。したがって、現段階でいわゆるキトサナーゼとして報告されていない加水分解酵素の中に、キトサン加水分解活性を有するポリペプチドが存在していると考えるのは自然である。
【００３５】
次に、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの設計図としてのアミノ酸配列情報及びＤＮＡ配列情報を解読する方法を示す。大きく分けて遺伝子工学的スクリーニング法を主体とした技術と、ポリペプチドの一次構造解析情報を活用した方法が考えられる。
ＤＮＡ配列情報を解読する上で必要な工程については、一般的な遺伝子工学的手法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（ｅｄｓ．Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載された方法等によって行うことが可能である。
【００３６】
前者の方法では、まずキトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの存在が予想された生物のＤＮＡを適当な制限酵素で切断するか、あるいは真核生物ならばｍＲＮＡを回収した後に逆転写を行ってｃＤＮＡとした後に、適切なベクターに連結し、これを用いて宿主細胞を形質転換し、キトサン加水分解活性によるスクリーニングを行うのが一般的である。
スクリーニングは、キトサン、キトサンオリゴ糖、キトサン誘導体等を用いて活性を測定する方法、コロイド状のキトサンあるいはカルボキシメチルセルロース等の類似基質を含む培地中でのハロー形成を観察する方法等が考えられる。
【００３７】
ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージ等が考えられる。その後、導入したベクターを組換え生物細胞から回収し、その配列を決定する。配列の決定は、マキサム・ギルバート法あるいはジデオキシ法による解析法が知られているが、後者の方法による解析装置が普及している。しかしながら、ＤＮＡのＧＣ含量が高い場合、マニュアル通りのシーケンス工程ではＤＮＡ配列の決定が極めて困難になるケースが見受けられる。
その様な場合、様々な試行錯誤と条件検討が必要となるが、ジメチルスルフォキシドを添加する方法、シーケンス反応時の変性温度を９７℃以上にする方法、適切なシーケンスプライマーの設計が問題となる場合は両端からデリーションを行い、ベクター配列部分から読む方法などが有効と考えられる。
【００３８】
インサートとしてのＤＮＡ配列が長過ぎる場合は、それを切断したものをベクターに繋ぎ直してサブクローニングし、同様のスクリーニングを行う方法、配列を両端から少しずつ解読し、その情報を用いてさらに内側の配列を解読するという方法等が考えられる。その他にも、一次スクリーニングにおいて発現されたポリペプチドの一次構造情報をペプチドシーケンサあるいは質量分析計等を用いて決定した後に、その情報を活用してコロニーハイブリダイゼーション等により配列を絞り込む方法等が考えられる。
ペプチドシーケンサとしては、エドマン分解によるＮ　末端からの逐次分解及び自動解析を行う機械が市販されている。また、質量分析計を用いたフラグメント解析によるシーケンス解読、あるいはＣ末端からのアミノ酸配列決定法も確立されており、受託解析サービスを行う企業も存在する。Ｎ末端アミノ酸残基がアセチル化、ホルミル化、ピログルタミル化等の誘導体化によりブロックされているケースが見られるが、化学的あるいは酵素的デブロック法が開発されており、殆どの場合、Ｎ末端側から１段目あるいは２段目のアミノ酸残基から読むことが可能となっている。
内部配列情報の取得については、切断部位特異性の高いプロテアーゼあるいは臭化シアン等を用いた化学的方法によりポリペプチドを切断し、これを液体クロマトグラフィーあるいは電気泳動等の方法で分離し、直接溶離液を回収するか、あるいはゲルからＰＶＤＦ等の膜に転写した後に回収して、先述のペプチド配列解析を行う方法が一般的である。
【００３９】
後者の方法では、ペプチドシーケンサあるいは質量分析計等を用いてキトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの一次配列情報を決定することが最初の工程となることが多い。続いて、その情報を用いてＤＮＡプローブを設計し、ＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーションを行うか、あるいはＰＣＲプライマーを設計し、適切なＰＣＲ関連技術を用いて、目的遺伝子を釣り上げる、または増幅することにより回収する。
この方法によれば、最初に、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを精製する必要がある。キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドは、細胞内、細胞表層近辺あるいは細胞外画分に分泌された形で、主にキトサン加水分解酵素活性を有するポリペプチドとして見出される可能性が高い。例示したストレプトミセス　グリセウス　ＨＵＴ６０３７由来キトサン加水分解酵素については、キトサン系基質を加えた液体培地に胞子を接種して培養することにより、培養液に誘導生産される。
【００４０】
該ポリペプチドが見出された画分から粗ポリペプチド液を回収する場合には、必要に応じて細胞破砕処理を行うことがある。細胞破砕法としては、溶菌処理、浸透圧ショック法、超音波破砕法、乳鉢・乳棒等による物理的破砕処理、フレンチプレス法等の方法が考えられる。
キトサン加水分解酵素活性の検出法としては、一般的にはキトサン、キトサンオリゴ糖、キトサン誘導体、あるいはそれらの類似化合物を基質として用いて、酵素活性を有する温度及びｐＨ条件下において、酵素を反応させ、反応により生成する還元糖あるいはキトサン誘導体等の人工基質に結合していた呈色化合物を検出する方法、直接反応生成物をクロマトグラフィーにより検出する方法、高分子化合物の加水分解による粘度低下を指標にして検出する方法、コロイド状キトサン等の基質を分解した際のハロー形成あるいは濁度減少を検出する方法等が考えられる。
【００４１】
分子量に関する情報、あるいはポリペプチドの一次配列情報を得るためには、粗ポリペプチド液からキトサン加水分解に関する活性を有するポリペプチドを単離、精製する必要がある。一般的には、粗ポリペプチド画分を硫安沈殿法、膜分画等による濃縮、透析による脱塩、ゲル濾過カラムによる脱塩・緩衝液置換等の処理により精製度を上げて、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、水素結合クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト法、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動法等の、一般的なポリペプチドの精製法を用いて高度精製が可能となる。
【００４２】
高度精製されたポリペプチドは、ペプチドシーケンサ解析により、Ｎ末端アミノ酸配列を解読する。また、ポリアクリルアミド等を用いたゲル電気泳動を行い、各ポリペプチドをバンドとして分離した後に、泳動蛋白の再活性化処理を経てゲル上での各分離バンドのキトサン加水分解酵素活性による染色を行うことにより、泳動ゲル上の目的ポリペプチド由来のバンドを同定することが可能となる。ゲル上のバンドをＰＶＤＦ膜等にブロットした後に活性を示したバンド部分を切り出し、それを試料としてペプチド配列を解読することが可能である。さらに、先述した様に、酵素法あるいは化学法によりポリペプチドを限定加水分解することにより、その内部アミノ酸配列を解読することが可能である。
【００４３】
一段目のＰＣＲを行う際のプライマーは、アミノ酸配列情報をもとに設計することになることから、コドンの縮重を考慮した複数の配列の混合物とする方法が一般的である。Ｃ末端アミノ酸配列を決定することは他と比較して困難であることから、通常のＰＣＲは、ポリペプチドのＮ末端配列及び内部配列の情報により合成されたプライマーを用いて行うことが多く、一段階では遺伝子全体の配列が解読できなかった。
次のステップとしては、ライブラリーからのスクリーニングを行い、拾い上げたベクター内のＤＮＡ配列を解読する方法等が考えられる。しかし、最近、インバースＰＣＲ、テールＰＣＲ等の手法が確立され、ライブラリーの構築を行わずに構造遺伝子全体のＤＮＡ配列を解読することが可能となった。よって、これらの手法を本発明に適用することは有効である。
【００４４】
得られたＤＮＡ配列のコドンを解読することにより、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を決定することが可能となる。アミノ酸配列情報を殆ど変えることなく、得られたＤＮＡ配列を部分的に変換することは容易な作業である。ＰＣＲ法を主体とした部位特異的突然変異導入法、ランダム変異導入法、遺伝子シャッフリング法、セクシャルＰＣＲ法などの方法により、必要に応じて配列を変えることが可能である。
先述した様に、ポリペプチドの機能を僅かに向上させる目的、遺伝子を導入する細胞のコドン使用頻度を考慮した縮重の制御、制限酵素認識部位の導入、除去等の目的で、ＤＮＡ配列の人為的改変を行うのが一般的である。
該ＤＮＡ配列を種々のベクターへ導入しやすくするために、配列両端に制限酵素認識配列を導入することは一般的に行われている。多くのベクターにはマルチクローニングサイトと呼ばれるユニークな制限酵素の認識部位が存在しており、ベクター及び挿入すべきＤＮＡを制限酵素処理して精製した後、それらをリガーゼ処理により連結し、目的ＤＮＡ配列を含んだベクターを構築するのが一般的である。
【００４５】
相同組換えが可能な特異的配列を両端に付けたＤＮＡ配列を設計し、リガーゼを用いないで相同組み換え法によりそれをベクターに移動・連結させる方法も開発されている。ＤＮＡ配列をベクターに挿入することにより、そのＤＮＡ配列の安定的保持、変異の少ない増幅及び配列がコードするポリペプチドの組換えポリペプチドとしての大量生産が可能となる。
【００４６】
外来遺伝子は、適切なベクターに連結した後、宿主細胞に導入することが可能である。例えば、大腸菌の発現ベクターであるｐＥＴ系プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ　社）のマルチクローニングサイトを制限酵素処理した後に、目的ＤＮＡ配列を先述した方法で挿入することにより、目的ＤＮＡ情報を含んだ発現ベクターの構築が可能となる。
例示したｐＥＴ系ベクターは大腸菌　ＤＨ５α株（東洋紡績株式会社）等の株を形質転換した際には安定的に保持され、挿入遺伝子の発現は起こらないように設計されている。一方、同じプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等の発現用宿主を形質転換することにより、ｐＥＴ系ベクターによる遺伝子発現のための組換え株を取得することが可能となる。
【００４７】
外来遺伝子及びそのプロモータ領域等を含む長いＤＮＡ配列をベクターに挿入した場合、外来遺伝子の発現が独特の制御を受けることがあるが、発現ベクターへは外来構造遺伝子のみを挿入する場合が多く、その発現はベクターのもつ制御系により支配される。一般的には、構成的に、あるいは誘導的に外来遺伝子を発現する様に設計されている。
発現誘導因子としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、メタノール等が挙げられる。遺伝子導入法については、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、感染導入法等の方法が考えられる。
【００４８】
外来遺伝子を含むベクターの導入により、ＤＮＡ配列の安定な保持及び必要に応じた増幅、及び組換えポリペプチドの発現が可能となる。また、ベクターは時として染色体に組み込まれて安定に保持される場合がある。
外来遺伝子をベクターに挿入する際には、遺伝子産物であるポリペプチドの分泌生産を促すシグナル配列の連結、生産されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドタグの付加等を行う様に設計されたベクターが多くの会社から市販されており、例えば適切なベクターの選択により、キレートカラムによる精製を可能とするヒスチジンタグ配列の付加を容易に行うことが可能である。必要に応じて、目的遺伝子の端にその様な機能性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結した後、ベクターに挿入することも簡単に行うことができる。
【００４９】
外来遺伝子の発現は、必要に応じて適切な誘導因子を加えることにより行われるが、遺伝子発現量、ポリペプチドの蓄積部位、比活性及び修飾の有無は、培地組成、温度等の培養条件、誘導因子の添加時期と濃度等の条件によって大幅に変わってくることが経験的に知られている。
ｐＥＴ系ベクターによる発現を例にとると、組換え大腸菌を３７℃で培養した場合に封入体として大量生産された酵素が、２５℃で培養すると、活性酵素として培地に生産される例が知られている。
封入体として生産された組換えポリペプチドあるいは不活性型の形で生産されたものについては、細胞を破砕して封入体を回収した後、変性剤処理を伴う適切なリフォールド手法を用いて再活性化することが可能である場合が多い。例えば、８Ｍ尿素を用いて封入体を変性させ、透析法などにより徐々にその尿素濃度を下げることにより、ポリペプチドの巻き戻りを促す方法などが知られている。
【００５０】
外来遺伝子の大量発現により生産された組換えポリペプチドは、必要に応じて、予め導入しておいた精製用タグ配列を利用するか、あるいは先述した一般的なポリペプチド精製法を用いて精製することが可能である。
本発明に係るキトサン加水分解に関する活性を有するポリペプチドを工業用生体触媒として用いる場合は、組換えポリペプチドとして生産されたものをそのまま用いるか、あるいは必要に応じて夾雑物の濃度を下げるために精製を行うべきである。
一方、医薬品、食品等の分野において本組換えポリペプチド用いる場合は、共存する微量成分が目的製品の安全性あるいは機能性に影響を及ぼすことを考慮して、ポリペプチドの高度精製を行うことが望ましいケースも存在する。
【００５１】
組換えポリペプチドの生産方法を確立した後には、その大量生産により、酵素機能と構造の相関に関する研究が飛躍的に発展するものと期待される。遺伝子工学的に触媒作用に関与する残基を推定することが可能となる他、ポリペプチドの結晶化条件の検討を容易に行うことができる様になる。
Ｘ線結晶解析データが得られた際には、触媒中心アミノ酸残基を置換して酵素活性を大幅に低下させたポリペプチドを用いて、基質またはそのアナログを加えた状態で結晶化を行うことにより、基質サブサイト構造及び基質結合に関与するアミノ酸残基等を決定することが可能となる。
この様な一連の構造生物学的データの取得により、人為的に基質認識性あるいは触媒特性を大幅に改変することによる高機能化ポリペプチドの創製が可能となる。
本発明の主な利用法としては、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドの有する糖転移活性を活用した糖質及びその誘導体の効率的合成が挙げられる。
【００５２】
【実施例】
以下、実施例などにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら限定されるものではない。
製造例１　微生物によるキトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドとしてのキトサナーゼの生産
キトサナーゼ生産菌としては、広島大学工学部の保存菌株であるストレプトミセス　グリセウス　ＨＵＴ６０３７（第三者への分譲可能、ＩＦＯ３２３７）を用いた。キトサンは脱アセチル化度９６％（ＤＡＣ９６，片倉チッカリン社製）を用いた。コロイダルキトサンは、上記キトサンを用いて、Ｙａｂｕｋｉらの方法（Ｙａｂｕｋｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｃｈ．Ｂｕｌｌ．　Ｆａｃ．　Ｈｏｒｔ．　Ｃｈｉｂａ　Ｕｎｉｖ．，　３９，　２３　（１９８７））に従って調製した。
菌株の培養には、保存用斜面培地　（１．０％　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，　０．２％　Ｐｅｐｔｏｎｅ，　０．１％　Ｍｅａｔｅｘｔｒａｃｔ，　０．１％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　２．０％　Ａｇａｒ，　０．０５％　ＭｇＳＯ_４／７Ｈ_２Ｏ，　ｐＨ　７．０）、種培養用液体培地（１．０％　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，　０．２％　Ｐｅｐｔｏｎｅ，　０．１％　Ｍｅａｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　０．１％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　ｐＨ　７．０）、酵素生産用液体培地　（０．２％　Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　（ＤＡＣ９６），　０．０５％　ＫＣｌ，　０．１％　Ｋ_２ＨＰＯ_４，　０．０５％　ＭｇＳＯ_４／７Ｈ_２Ｏ，　０．００１％　ＦｅＳＯ_４，　ｐＨ　７．０）を用いた。
【００５３】
保存用斜面培地に保存されていたストレプトミセス　グリセウス　ＨＵＴ６０３７の胞子１白金耳を種培養用培地に接種し、３０℃で２日間振盪培養したものを種培養液とした。酵素生産用培地１Ｌに対し種培養液４０ｍＬを接種し、３０℃で４日間振盪培養した。
得られた培養液は遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）　を行い、上清を東洋濾紙ＮＯ．２で濾過し、濾液を精製実験に供した。
【００５４】
製造例２　キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドとしてのキトサナーゼの精製
前記製造例１の方法に従って培養濾液を３７２２ｍＬ回収した。キトサナーゼ活性の測定は、０．５５％キトサン溶液（ｐＨ５．７）を基質として用い、生成する還元糖量をＩｍｏｔｏ　とＹａｇｉｓｈｉｔａ　の方法（Ｉｍｏｔｏ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｙａｇｉｓｈｉｔａ，　Ｋ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３５，　１１５４　（１９７１））によるＳｃｈａｌｅｓ　法（Ｓｃｈａｌｅｓ，　Ｏ．　ａｎｄ　Ｓｃｈａｌｅｓ，　Ｓ．　Ｓ．，　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　８，　２８５　（１９４５））　の改良法を用いて測定した。
反応測定基質溶液は、０．５５ｇのＤＡＣ９６　を０．１Ｍ酢酸溶液約４０ｍＬに溶解させた後、１Ｎ　ＮａＯＨをｐＨ５．５程度になるまで加え、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液によりｐＨ５．７に調整し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．７）を加えて全量を１００ｍＬとした。
基質溶液０．９ｍＬに酵素溶液０．１ｍＬを加えて３７℃で１０分間反応させた後、Ｓｃｈａｌｅｓ　試薬２．０ｍＬを混合して反応を停止させ、蒸留水０．５ｍＬを加えて１５分間煮沸した。冷却後、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５５】
キトサナーゼ活性の１ｕｎｉｔの定義は、１分間に１μｍｏｌ　のグルコサミンに相当する還元糖を遊離する酵素量とした。タンパク質は牛血清アルブミンを標準タンパク質として、Ｌｏｗｒｙ　法のＨａｒｔｒｅｅ　による改良法（Ｈａｒｔｒｅｅ，　Ｅ．　Ｆ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　４８，　４２２　（１９７２））により測定した。
酵素液中のタンパク質量は、牛血清アルブミンを標準タンパク質として得られた標準曲線を用いて、標準タンパク質に換算した量を求めた。カラムクロマトグラフィーにおける各画分のタンパク質量は、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。
本定義に基づくと、培養濾液の総キトサナーゼ活性は６６７０ｕｎｉｔｓ　、比活性は１２．４　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　であった。これに２００ｍＭ　ＰＭＳＦアセトン溶液を終濃度１ｍＭになるように添加し、４℃で一晩放置した。
【００５６】
続いて、以下の様に培養濾液を逆透析法によって濃縮した。氷冷下で、粉末硫安を詰めた透析膜を培養濾液に浸し、膜内に水が溜まったら中の水を出し、再び硫安を詰め、培養濾液に浸した。この操作によって培養濾液の水分が透析膜内に吸収され、粉末硫安が溶解して膜外へ浸出し、培養濾液の濃縮と硫安塩析が同時に行われた。
液量が約１／３になったところで４℃下において一晩放置した。透析膜を引き上げ、１００％飽和になるように粉末硫安を培養濾液に添加し、４℃で３日間放置した。生じた沈殿物を遠心分離（７，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）により回収して０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶解させた。
【００５７】
この溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×２０ｍｉｎ）し、上清を粗酵素液として回収した。このとき生じた沈殿を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で再溶解させ、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ×２０ｍｉｎ）し、上清を先の粗酵素液に加えた。このとき生じた沈殿をさらに０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で再溶解させ、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ×２０ｍｉｎ）し、上清を先の粗酵素液に加えた。
この粗酵素液を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２　（バイオラッド社）に供し脱塩した。この段階での総活性は５０９０ｕｎｉｔｓ　、比活性は５２．８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度は４．１７倍、収率は７６．３％であった。
【００５８】
次に、Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２　により脱塩された活性画分を、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化されたＣＭ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　製、ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｚｅ　：　２．６　×２６．６　ｃｍ，　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　：　３３．０　ｍｌ／ｈ）カラムに供した。カラムによる精製操作は全て４℃で行った。平衡化に用いた緩衝液で未吸着画分を溶出後、０〜０．４Ｍ　ＮａＣｌ直線濃度勾配により吸着画分を溶出した。ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ付近にキトサナーゼ活性画分が溶出されたので、これを回収した。この段階での総活性は４３９０ｕｎｉｔｓ　、比活性は６５．４ｕｎｉｔｓ　／ｍｇ　、精製度は５．２６倍、収率は６５．８％であった。
【００５９】
次に、ＣＭ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５により得られた活性画分を、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　製、ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｚｅ　：　２．６　×９７　ｃｍ，　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　：　２２．６　ｍｌ／ｈ）カラムに供し、同緩衝液で溶出した。波長２８０ｎｍにおける吸光度と一致した活性のピークが２つ見られ、それぞれをｐｅａｋ１，　ｐｅａｋ２として回収した（図１）。図中、−●−は波長２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はキトサナーゼ活性を示す。
この段階でのｐｅａｋ１の総活性は４３０ｕｎｉｔｓ　、比活性は５１．２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度は４．１２倍、収率は６．５％であった。ｐｅａｋ２の総活性は３４５０ｕｎｉｔｓ　、比活性は９６．９ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度は７．７９倍、収率は５１．７％であった。
【００６０】
前工程において得られたｐｅａｋ１、　ｐｅａｋ　２をそれぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５　（ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｚｅ　：　２．６　×９７　ｃｍ，　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　：　２２．６　ｍｌ／ｈ）カラムに供した。ｐｅａｋ１をカラムに供した結果、２つの活性のピークが見られ、先に溶出された活性画分を精製酵素キトサナーゼＩとして回収した（図２）。図中、−●−は波長２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はキトサナーゼ活性を示す。また、ｐｅａｋ２をカラムに供した結果、活性画分が得られたので、これをキトサナーゼＩＩとして回収した（図３）。図中、−●−は波長２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
最終的に、キトサナーゼＩの総活性は１６７ｕｎｉｔｓ　、比活性は５８．２ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度は４．６７倍、収率は２．５％であった。キトサナーゼＩＩの総活性は２４２０　ｕｎｉｔｓ、比活性は９２．０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度は７．４０倍、収率は３６．３％であった。
【００６１】
試験例１　キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドとしてのキトサナーゼの特性解明
精製キトサナーゼの酵素化学的性質について下記の検討を行った。
分子量測定：精製したキトサナーゼＩおよびキトサナーゼＩＩの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過法により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ　の方法に従って行った（Ｌａｅｍｍｌｉ　、Ｕ．　Ｋ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０　（１９７０））。分離用ゲルには０．１％ＳＤＳ　を含む１２．５％ポリアクリルアミドゲルを、濃縮ゲルには０．１％ＳＤＳ　を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いた。
マーカー色素として０．００１％ブロモフェノールブルーを用いた。ゲルの１レーン当たり試料１μｇを添加した後、室温で３０ｍＡの定電流を流して電気泳動を行った。染色にはクーマシーブリリアントブルー　Ｒ−２５０を用いた。標準タンパク質として、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｂ　（分子量９４，０００）、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（同６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　（同４３，０００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ（同３０，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ　Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（同２０，１００）、α−　Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ　（同１４，４００）を用いた。
【００６２】
ゲル濾過法は、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５　カラム（２．６×９７ｃｍ）を用いて、流速２２．６ｍｌ／ｈで、Ａｎｄｒｅｗの方法に従って行った（Ａｎｄｒｅｗｓ，　Ｐ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　９１，　２２２　（１９６４））。標準タンパク質として、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（分子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　（同４３，０００）、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ　Ａ（同２５，０００）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（同１３，７００）を用いた。
その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではキトサナーゼＩ、ＩＩともに１本のバンドが得られ、電気泳動的に均一であり、分子量はともに約３４，０００と推定された。一方、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５　ゲル濾過法によってキトサナーゼＩ、ＩＩの分子量はそれぞれ約１７，３００、約１０，４００と算出された。
【００６３】
等電点電気泳動：キトサナーゼＩおよびキトサナーゼＩＩの等電点を等電点電気泳動により調べた。等電点電気泳動は、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　（ｐＨ３．５〜１０．０）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いてディスク型で行った。ゲルの１レーン当たり試料５μｇを添加して、室温で２００ｖの定電圧で泳動を行った。染色には０．０４％クーマシーブリリアントブルー　Ｇ−２５０を含む３．５％過塩素酸溶液を用いた。ｐＩマーカーには、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ　社のＨｉｇｈ　ｐＩ　Ｋｉｔ　（ｐＨ５．０〜１０．０）を用いた。この結果、キトサナーゼＩ、ＩＩの等電点はそれぞれｐＩ１０．３、ｐＩ１０．１であった。
【００６４】
至適ｐＨ：キトサナーゼＩの至適ｐＨについて検討した。各ｐＨの緩衝液に溶解した脱アセチル化度９６％（ＤＡＣ９６　）の可溶性キトサン（０．５５％）を基質として３７℃、１０分間の酵素反応を行い、活性を測定した。基質を溶解するために用いた緩衝液は、ｐＨ３．０では０．１Ｍ塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０〜６．４では０．１Ｍ酢酸緩衝液であった。ｐＨ６．５〜８．０ではＤＡＣ９６　キトサンを０．１Ｍ酢酸で溶解後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液でｐＨを調整した基質を用いた。最も高い活性値を１００％として相対活性を算出した。この結果、相対活性は図３の様になり、至適ｐＨは６．３であった。キトサナーゼＩＩのｐＨ特性についてはこれと同様の結果が得られた。
【００６５】
ｐＨ安定性：本酵素のｐＨ安定性について以下の様に検討した。各ｐＨの緩衝液に酵素液を混合した後、３０℃で２時間放置し、その後上清の残存活性を通常の活性測定法により測定した。緩衝液には、ｐＨ３．０〜８．０はＭｃＩｌｖａｉｎｅ　緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０はＡｔｋｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐａｎｔｉｎｓ緩衝液を用いた。最も高い活性値を１００％として相対活性を算出した。この結果、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定であり、８０％以上の残存活性を示した。キトサナーゼＩＩのｐＨ安定性についても同様の結果が得られた。
【００６６】
至適温度：キトサナーゼＩを用いて各温度（３０〜７０℃）で１０分間の酵素反応を行い、活性を測定した。最も高い活性値を１００％として相対活性を算出した。この結果、至適温度は６０℃であった。キトサナーゼＩＩの温度特性についても同様の結果が得られた
熱安定性：キトサナーゼＩ酵素液を各温度（２０〜７０℃）で１５分間放置し、その後上清の残存活性を通常の活性測定法により測定した。最も高い活性値を１００％として相対活性を算出した。この結果、本酵素は４０℃まで安定であり、それ以上では急激に活性が失われ、５５℃、１５分の加熱で失活した。キトサナーゼＩＩの熱安定性についても同様の結果が得られた
【００６７】
基質特異性：基質として、コロイダルキチン（Ｊｅｕｎｉａｕｘ（Ｊｅｕｎｉａｕｘ，　Ｃ．，　Ａｒｃｈ．　Ｉｎｔ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６６，　４０８−４２７　（１９５８））の方法により調製）、グライコールキチン（ＹａｍａｄａとＩｍｏｔｏ　（Ｙａｍａｄａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｉｍｏｔｏ，　Ｙ．，　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．，９２，　１６０−１６２　（１９８１））の方法により調製）、リケナン（β−１，３−１，４−　グルカン、新潟大学より供与）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ　、片山化学工業株式会社製）、脱アセチル化度３０％（ＤＡＣ３０）の水溶性キチン（焼津水産化学工業株式会社製）、脱アセチル化度６０％（ＤＡＣ６０）の部分Ν−アセチルキトサン（味の素株式会社製）、脱アセチル化度７０％，　８０％，　９０％，　１００％　（ＤＡＣ７０，　８０，　９０，　１００）のキトサン（フナコシ株式会社製）を用いた。キトサナーゼＩを用いてｐＨ５．７、３７℃で１０分間の酵素反応を行った後、生成した還元糖量を測定した。
【００６８】
コロイダルキトサンは不溶性の基質であるため、均等に反応液中に分散するように撹拌しながら活性測定を行った。その結果、本酵素は脱アセチル化度６０％の部分Ｎ−アセチルキトサンを最もよく分解し、脱アセチル化度７０％、８０％の部分Ｎ−アセチルキトサンにおいても比較的よく分解した。また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に対して脱アセチル化度６０％の部分Ｎ−アセチルキトサンの約２３％の活性を示し、高いＣＭＣａｓｅ活性を有していた。キトサナーゼＩＩの基質特異性についても同様の結果が得られた。
【００６９】
試験例２　キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の決定
製造例２記載の方法により精製したキトサナーゼＩＩ酵素標品をＣａｖｉｎｓら（Ｃａｖｉｎｓ，　Ｊ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｆｒｉｅｄｍａｎ，　Ｍ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３５，　４８９−４９３　（１９７０））の方法で還元ピリジルエチル化し、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．８）で一晩透析した。透析膜内液を回収し、減圧濃縮後、Ｖ８プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ　製）で分解した。分解産物を１５％ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜イモビロンＰＳＱ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　社製）　にブロッティングした。０．２５％ＣＢＢ　Ｒ−２５０　で染色後、６０％メタノールで脱色した。視認できるバンドを切り出した。切り出したペプチドバンドは、分子量の大きい順に、　Ｖ８−１　、−２、−３、−４、−５、−６および−７とし、これらのＮ末端アミノ酸配列をＰｒｏｃｉｓｅ　４９１ｃプロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で分析した。Ｖ８−２、Ｖ８−３およびＶ８−６はキトサナーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列と一致した。
【００７０】
キトサナーゼＩＩおよび各ペプチドバンドのＮ末端アミノ酸配列は、配列表の配列番号３〜７の様に決定することができた。配列番号３はＮ末端アミノ酸配列データに、配列番号４〜７はそれぞれＶ８−１、Ｖ８−４、Ｖ８−７及びＶ８−５に対応する。
また、キトサナーゼＩについても、同様の処理を行った結果、電気泳動パターン、Ｎ末端アミノ酸配列、内部配列共に同様のデータが得られた。この結果及び触媒特性に全く差異が見られないことから、キトサナーゼＩとキトサナーゼＩＩは同じ遺伝子産物によるものであると推定し、クローニングを行った。
【００７１】
試験例３　キトサン加水分解に関わる活性を有するポリペプチドのクローニングとシーケンシング
製造例１に記載したストレプトミセス　グリセウス　ＨＵＴ　６０３７　の染色体ＤＮＡは、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄｓ．，　Ｈｏｐｗｏｏｄ，　Ｄ．　Ａ．，　Ｂｉｂｂ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｃｈａｔｅｒ，　Ｋ．　Ｆ．，　Ｋｉｅｓｅｒ，　Ｔ．，　Ｂｒｕｔｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．，　Ｋｉｅｓｅｒ，　Ｈ．　Ｍ．，　Ｌｙｄｉａｔｅ　Ｄ．　Ｌ．，　Ｓｍｉｔｈ　Ｃ．　Ｐ．，　Ｗａｒｄ　Ｊ．　Ｍ．，　Ｓｃｈｒｅｍｐｆ　Ｈ．　Ｓ．，　Ｎｏｒｗｉｃｈ，　Ｕ．Ｋ．，　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　（１９８５）のｐｐ．７２−７４に記載されたＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ　“ｔｏｔａｌ”　ＤＮＡ：　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　１に従って操作を行い、抽出した。
【００７２】
試験例２記載のアミノ酸配列から推定される塩基配列をもとに縮重プライマーを以下のように設計した。まず、キトサナーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列からセンス鎖プライマーとして配列表の配列番号８の合成ＤＮＡを設計した。なお、５’側にＰｓｔＩサイトを付加した。また、他のＦａｍｉｌｙ　５に属する酵素とのホモロジーから活性触媒部位と思われるＶ８−４断片のＮ末端アミノ酸配列から、アンチセンス鎖プライマーとして配列表の配列番号９の合成ＤＮＡを設計した。なお、５’側にＨｉｎｄＩＩＩ　サイトを付加した。
これらのプライマーとＬＡ　Ｔａｑ　ｗｉｔｈ　ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）　を用いて、次のような組成の反応液でＰＣＲを行った。１２．５μｌの２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ）、７．５μｌの２．５ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ　、１μｌの１００μＭセンス鎖ｐｒｉｍｅｒ（終濃度４μＭ）、１μｌの１００μＭアンチセンス鎖ｐｒｉｍｅｒ（終濃度４μＭ）、２．５μｌのｔｅｍｐｌａｔｅ（１０μｇ／ｍｌゲノムＤＮＡ）、０．５μｌのＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ　Ｔａｑ）、合計２５μｌ。
【００７３】
ＰＣＲの反応プログラムは次の通りである。Ｓｔｅｐ　１（４℃、１０ｍｉｎ；９８℃、５ｍｉｎ）　を１　ｃｙｃｌｅ（コールドスタート）　、Ｓｔｅｐ　２（９８℃、３０ｓｅｃ；４０℃、３０ｓｅｃ；７２℃、１ｍｉｎ）　を３５ｃｙｃｌｅｓ、Ｓｔｅｐ　３（４℃、９９’９９）を１ｃｙｃｌｅ　。
ＰＣＲ産物の全量をアガロースゲル電気泳動に供し、目的遺伝子が増幅されたかどうか確認した。低分子量の増幅断片の正確なサイズを知るために、ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒに溶解後凝固させた２．５％アガロースゲルを用いた。ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒを満たしたＭｕｐｉｄ−３　（超小型電気泳動システム、コスモバイオ製）にゲルを装填し、サンプルをアプライしてから１００Ｖで１時間２０分通電した。
低分子量マーカーには、東洋紡績株式会社の１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　を用いた。また、泳動マーカー、泳動用ローディングダイには、１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　に添付の６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ　（３０％グリセロール、０．０６％ブロモフェノールブルー、０．０３％キシレンシアノールＦＦ、０．１２％オレンジ　Ｇ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用いた。
【００７４】
泳動後、エチジウムブロマイド溶液にゲルを２０分浸して染色した。染色したゲルに紫外線を当てエチジウムブロマイドによる発光バンドを撮影した。
プライマー設計時に予想した通り４５０−４６０　ｂｐ付近に明確な増幅バンドが確認できたので、この増幅断片を切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ回収には、ＢＩＯ　１０１　のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩＩ　Ｋｉｔ　を用い、添付のプロトコールに従って操作した。
回収した目的増幅断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ　およびＰｓｔＩで３７℃、一晩のダブルダイジェストを行った。ベクターｐＵＣ１１９も同様に消化した。制限酵素処理した目的増幅断片は再び電気泳動し、ゲルから抽出した。
制限酵素処理したベクターは、６５℃、３０ｍｉｎのアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理後、同様に電気泳動してゲル抽出した。目的増幅断片には２．５％、ベクターには１％アガロースゲルを用いた。東洋紡績株式会社のＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ＫｉｔであるＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　を用いて、目的増幅断片とベクターのライゲーションを行った。
消化済増幅断片５μｌ、消化済ｐＵＣ１１９を５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　を１０μｌ混合して１６℃で一晩放置した。
【００７５】
このライゲーション液を大腸菌ＪＭ１０９　株に形質転換した。目的の増幅断片を保持するクローンからプラスミドを抽出し、インサート部分のＤＮＡシーケンスを行った。ＡＢＩ　のＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを使用し、キャピラリー型ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　ＤＮＡ　シークエンサー用のサンプル調製を行った。
反応液組成は、Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘ　１．３μｌ　、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　３．４μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ　１ｐｍｏｌ相当量１μｌ、ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　１５０ｎｇ相当量ｘμｌ、水を（１４．３−ｘ）μｌ、合計２０μｌとした。
シーケンス反応用のプログラムは、Ｓｔｅｐ　１（９６℃、１ｍｉｎ、１ｃｙｃｌｅ）、Ｓｔｅｐ　２（９６℃、３０ｓｅｃ；４５℃、３０ｓｅｃ；６０℃、４ｍｉｎ、３０　ｃｙｃｌｅｓ　）、Ｓｔｅｐ　３（２５℃、９９’９９　、１ｃｙｃｌｅ）である。その結果、４１２　ｂａｓｅの配列（配列番号１０）を決定することができた。
【００７６】
これらはストレプトミセス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）６６のβ−１，４−ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ遺伝子やサーモモノスポラ　フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｆｕｓｃａ）のｃｅｌｌｕｌａｓｅ　遺伝子と高い相同性を持っていた。内部アミノ酸配列をコードする配列を確認することができたことから、目的遺伝子の増幅が行えたと考え、この増幅断片からスクリーニングに用いるジゴキシゲニンラベルしたプローブを合成した。合成には、ベーリンガー・マンハイム製ＤＩＧ　ＤＮＡ　標識及び検出キットを用い、キット付属のマニュアル通りに操作した。また、合成したプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションも製品添付のマニュアルに従った。
ストレプトミセス　グリセウス　ＨＵＴ６０３７のゲノムを　ＳａｌＩ　処理したものをアガロース電気泳動し、アルカリトランスファー法により、Ｎｙｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　^＋　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写した。合成プローブとのサザンハイブリダイゼーションにより約２ｋｂのフラグメントが検出された。この電気泳動位置からＤＮＡフラグメントを回収し、ベクターｐＵＣ１９　に組み込んだ。同じプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的遺伝子を含むプラスミドを保持すると考えられるクローンを得た。
【００７７】
このクローンを用いてＤＮＡシークエンスを行うことにした。まず、インサートの方向を確認するため、先のＰＣＲ増幅断片から明らかになった内部配列からセンス鎖プライマーとアンチセンス鎖プライマーを設計し、ベクター側のＭ１３−Ｍ４プライマー（配列番号１１）およびＭ１３−ＲＶプライマー（配列番号１２）との組み合わせで、コロニーダイレクトＰＣＲを行った。ここでＲＶプライマーからセンス鎖が、Ｍ４プライマーからアンチセンス鎖がシーケンスできるようにインサートされていることがわかった。そこで、インサート方向が逆になったクローンを作製した。
順方向クローンと逆方向クローンの両方でデリーションミュータントを作製し、センス鎖とアンチセンス鎖ともにＭ４プライマーでシーケンスできるように計画した。デリーションミュータントの作製には、ニッポンジーン社のＤｅｌｅｔｉｏｎ　ｋｉｔを使用し、メーカーカタログ・マニュアル記載の方法に従って操作した。得られたミュータントを単離し、プラスミドを抽出して、分子量順に並ぶように分類した。
【００７８】
これらを用いてＤＮＡシーケンスを行い、配列がベクター側からインサート全域にかけてつながるようにセンス鎖、アンチセンス鎖ともに大体の配列を決定した（配列番号１３）。その後、Ｄｅｌｅｔｉｏｎを行う前のプラスミドを用いて、配列番号１４から配列番号２２までのプライマーを設計し、シーケンス反応を行った。
シーケンス反応用のプログラムは、Ｓｔｅｐ１（９８℃、１０ｓｅｃ；５０℃、５ｓｅｃ；６０℃、４ｍｉｎ、２５　ｃｙｃｌｅｓ　）、Ｓｔｅｐ２（４℃、９９’９９　、１　ｃｙｃｌｅ）である。
これらの試料を用いてシーケンス解析を行った結果、以下の様に１２０８ｂａｓｅの配列（配列番号２３）を決定することができた。
【００７９】
キトサナーゼＩＩをコードするＤＮＡ配列が解読されたことから、その配列を解析した結果、開始コドンとなりうるメチオニンをコードするＡＴＧ　の６塩基上流にＳＤ配列に相当する配列（ＡＡＧＧＡＧＡ　）が存在し、本酵素のシグナル配列を含んだ全アミノ酸配列を配列番号２４の様に推定することができた。また、ペプチドシーケンサによるＮ末端アミノ酸配列情報から、本キトサナーゼの成熟酵素配列は、配列番号１に示すものであると推定された。
配列番号１のアミノ酸配列には、配列番号３〜７の全てのアミノ酸配列を含むことが確認された。配列番号１の情報から、成熟酵素の分子量は３３，７００程度であると推定された。この値は、試験例１記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果に極めて近いものである。さらに、配列番号１のアミノ酸配列の設計図ともなるべき、本成熟酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、配列番号２３の配列内部より見出し、配列番号２のとおり決定した。配列番号２のＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＵＣ１９系プラスミド（ｐＭＭＣｈｉｔｏＩＩ）により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９　株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ　Ｐ−１８８９２である。
【００８０】
実施例１　キトサンオリゴ糖を用いた糖転移活性の検出
製造例２の方法で精製したキトサナーゼＩあるいはキトサナーゼＩＩのキトペンタオース［（ＧｌｃＮ）_５　］に対する作用を調べるために、酵素分解生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した。０．４％　（ＧｌｃＮ）_５溶液２５μｌに０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）１２．５μｌを加え、キトサナーゼＩ（１ｕｎｉｔ／ｍｌ　）１２．５μｌあるいはキトサナーゼＩＩ（０．０８２５　ｕｎｉｔ／　５０　μｌ　反応液）　を添加し、３７℃で所定時間（１０　ｍｉｎ，　３０　ｍｉｎ，　１　ｈｒ，　２　ｈｒ，　８ｈｒ，　２４　ｈｒ）反応を行った。その後、１００℃、５分間の煮沸で反応を停止した。
【００８１】
この分解生成物をＴＬＣにより分析した。ＴＬＣプレートは、ＭＥＲＣＫ　製ＴＬＣ　ａｌｕｍｉｎｉｕｍ　ｓｈｅｅｔｓ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０を用いて、０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウムを噴霧後風乾し、１０５℃で１時間乾熱した。ｎ−プロパノール、水、３０％アンモニア水を容積比で７０：１５：１５の割合で混合した展開溶媒で上昇法により３回展開した。
乾燥後、ジフェニルアミン−アニリン試薬を噴霧して１０５℃で３０分間加熱し発色させた。標準物質には（ＧｌｃＮ）_１ _〜 _６　を用いた。この結果、（ＧｌｃＮ）_２　，　（ＧｌｃＮ）_３　，　（ＧｌｃＮ）_４　の発色は見られたが、（ＧｌｃＮ）_１　の発色は見られなかったことから（図４、図５）、本酵素が（ＧｌｃＮ）_５　と反応する際に、糖転移反応が起こったと推定された。図中、●ｎはキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮ）_ｎ］を示し、数字は重合度を表す。
【００８２】
実施例２　キトサナーゼによるキチンオリゴ糖存在下での糖転移活性の検出
製造例２の方法で生成したキトサナーゼＩＩを０．０６２５　ｕｎｉｔ　含み、最終濃度１０％の（ＧｌｃＮ）_５　及び１％のキチン３糖［（ＧｌｃＮＡｃ）_３］　及び１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ５．７）より成る５０μｌの反応液を３７℃において８時間反応させ、１００℃、５分間の煮沸で反応を停止した。
その後、ＨＰＬＣにより反応生成物を分離した（カラム：Ｒａｄｉａｌ−Ｐａｋ　ＮＨ２（８．０　ｍｍ　ｘ　１００　ｍｍ　）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：６５％アセトニトリル、検出：２１０　ｎｍにおける吸光度を測定）。その結果、反応液については（ＧｌｃＮＡｃ）_３　より遅れて２つのピークが見られた（図６）。図中、（ａ）は反応８時間後の酵素反応液、（ｂ）はキチン３糖、（ｃ）はキチンオリゴ糖（数字は重合度）の結果をそれぞれ示す。
ピークＡ及びＢを分取し、減圧濃縮した試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳにより分析した。その結果、ピークＡ回収液からは、糖転移産物ＧｌｃＮ−（ＧｌｃＮＡｃ）_３に対応する分子イオンピーク［　Ｍ＋Ｎａ^＋　］＝８１１．６　及び［Ｍ＋Ｋ^＋　］＝８２７．６　を検出し、ピークＢ回収液からは、糖転移産物ＧｌｃＮ_２−（ＧｌｃＮＡｃ）_３　に対応する分子イオンピーク［　Ｍ＋Ｎａ^＋　］＝９７２．６　及び［Ｍ＋Ｋ^＋　］＝９８８．６　を検出した。
【００８３】
実施例３　キトサナーゼによる糖誘導体への糖転移活性の検出
製造例２の方法で生成したキトサナーゼＩＩを０．０６１ｕｎｉｔ含み、最終濃度１％の（ＧｌｃＮ）_５　及び１　％のキチン２糖誘導体［　ｐ−ニトロフェニルβ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド（ＧｌｃＮＡｃ）_２−ｐＮＰ　、生化学工業株式会社製］　及び６０ｍＭ炭酸ナトリウムより成る３０μｌの反応液（ｐＨ８．０）を３７℃において反応させた。所定時間（０　ｍｉｎ，　３０　ｍｉｎ　１　ｈｒｓ，　２　ｈｒｓ，　４　ｈｒｓ，　６　ｈｒｓ，　８ｈｒｓ）反応させた後、これを試料として糖転移生成物と予想される高分子側の反応生成物をＨＰＬＣによりモニターした。
ＨＰＬＣカラムとしては、Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ　（４．６　ｘ　２５０　ｍｍ，　Ｗａｔｅｒｓ社製）　を用い、７０％アセトニトリルを流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、紫外・可視分光検出器を用いて３００ｎｍの吸光度によりモニターした。
【００８４】
酵素反応サンプルを分析した結果、４．３分付近、５．４分付近、７．６分付近そして１０．５分付近にピークが検出された。各々を順に化合物１、化合物２、化合物３、化合物４と名付けた。キチン４糖誘導体［ｐ−　ニトロフェニルβ−Ｎ，　Ｎ’，　Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラアセチルキトテトラオシド（ＧｌｃＮＡｃ）_４−ｐＮＰ　、生化学工業株式会社製］　を標準物質として、各反応生成物がモルあたり一つのｐ−ニトロフェニル基を有すると仮定し、それぞれのピーク面積から各ピークを構成する反応生成物の対ドナーモル生成率を推定した結果、図７に示す様な結果が得られた。反応系内の化合物で３００ｎｍに強い吸収を示す化合物はｐ−ニトロフェニル基由来のものである可能性が高く、糖転移反応を鋭敏に検出できると推察された。
【００８５】
実施例４　キトサナーゼによる糖誘導体への糖転移反応の結果生じた生成物の分子式推定
実施例３の方法に準じ、１２ｍｌにスケールアップして反応を行った。反応は３７℃において１２時間行い、酵素をスピンカラムＵＶ４ＢＧＣ００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　社製）により除き、通過画分を回収した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ　Ｐｌｕｓ　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、マニュアルに従い水−メタノールによる段階的分離を行うことにより、水による素通り画分としてキトサンオリゴ糖、無機塩を除き、メタノール溶出画分としてｐ−ニトロフェニル基を有する糖誘導体を回収した。
これを減圧乾燥により乾固し、７．８ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。続いて、この試料を同緩衝液により平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（１　ｍｌ，　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）　に流速１ｍｌで添加し、同じ流速で同緩衝液により洗浄した（試料添加を含めて９０分間）。
【００８６】
反応生成物の溶出は紫外・可視分光検出器を用いて３００ｎｍの吸光度によりモニターし、試料添加時から１ｍｌずつ分画回収した。洗浄後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで直線的グラジェントにより緩衝液中の食塩濃度を増加させた（グラジェント開始時の食塩濃度は０Ｍ、７５分後の食塩濃度は１．５Ｍ）、続けて１ｍｌずつ回収した。
その結果、実施例３の化合物１がフラクションＮｏ．３６−９０に溶出され、化合物２及び３は、それぞれフラクションＮｏ．１１１−１２４、Ｎｏ．１２６−１３５に溶出された。それぞれの化合物に対応する画分を纏め、再度Ｓｅｐ−Ｐａｋ　Ｐｌｕｓ　Ｃ１８処理を行うことにより脱塩した。
【００８７】
これらを遠心濃縮乾固したものをＦＴ−ＭＳ　分析に供した。その結果、化合物１〜３について以下の通り精密質量分析を行うことに成功した。化合物１をＧｌｃＮ−（ＧｌｃＮＡｃ）_２−ｐＮＰとした場合の分子イオンピークの理論値７０７．２６１７７　、実測値７０７．２５９７１　、化合物２をＧｌｃＮ_２−（ＧｌｃＮＡｃ）_２−ｐＮＰ　とした場合の分子イオンピークの理論値８６８．３３０５８　、実測値８６８．３２８４４　、化合物３をＧｌｃＮ_３−（ＧｌｃＮＡｃ）_２−ｐＮＰ　とした場合の分子イオンピークの理論値１０２９．３９９３９、実測値１０２９．４０１７４となった。
以上の結果は、各反応生成物が糖転移反応生成物であると予測した際の分子式を有することを強く裏付ける。
【００８８】
実施例５　高分子ドナーを用いた場合の糖転移反応のモニター
実施例３の方法に準じ、ドナーを変え、ＨＰＬＣ分離により検出される新規ピークの有無とそのモル濃度を算出した。ドナー基質としては、キトサン（フローナックＣ）、グリコールキトサン（和光純薬工業株式会社製）、カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ　社製）及び部分脱アセチル化水溶性キチン（脱アセチル化度３０％、焼津水産化学工業株式会社製）を用いた。キトサンについては２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いてｐＨ５．７に調整した。
後者３つについては２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）によりｐＨ７．５に合わせた。反応は３７℃において１２時間行った。その後、実施例３のＨＰＬＣ分析法に従い、反応後に生成した３００ｎｍに吸収を示す化合物のピークの面積から、生成モル濃度を推定した。その結果、それぞれの反応系における糖転移化合物の推定生成濃度は、順に１．１９ｍＭ、１４．７μＭ、４８．０μＭ、３４．９μＭとなった。
【００８９】
実施例６　低分子アクセプタを用いた糖転移反応のモニター
実施例３の方法に準じ、アクセプタを変え、ＨＰＬＣ分離により検出される新規ピークの有無とそのモル濃度を算出した。アクセプタ分子としては、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドＧｌｃＮＡｃ−ｐＮＰ、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドＧｌｃ−ｐＮＰ　、ｐ−ニトロフェニルβ−セロビオシド（Ｇｌｃ）_２−ｐＮＰ（全て生化学工業株式会社製）の３種類を用いた。
反応は３７℃において２時間行った。その後、実施例３のＨＰＬＣ分析法に従い、反応後に生成した３００ｎｍに吸収を示す化合物のピークの面積から、生成モル濃度を推定した。その結果、それぞれの反応系における糖転移化合物の推定生成濃度は、順に５１．９μＭ、３０．０μＭ、３３６μＭとなった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、キトサン加水分解活性に関与する機能性を有するポリペプチドを用いた糖質あるいはその誘導体の糖転移による合成法が提供される。
本発明により、機能性新素材の効率的な合成が可能となり、糖質工学、農業、食品、医薬品等の様々な領域において活用可能な新技術を提供することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】製造例２記載のゲル濾過クロマトグラフィーによる酵素活性画分の分離パターンを示す。
【図２】製造例２記載のゲル濾過リクロマトグラフィーによるｐｅａｋ１の分離パターンを示す。
【図３】製造例２記載のゲル濾過リクロマトグラフィーによるｐｅａｋ２の分離パターンを示す。
【図４】実施例１記載のキトサナーゼＩＩによる糖転移活性のＴＬＣによるモニターの結果を示す。
【図５】実施例１記載のキトサナーゼＩによる糖転移活性のＴＬＣによるモニターの結果を示す。
【図６】実施例２記載のキトサナーゼＩＩによる糖転移反応生成物のＨＰＬＣによるモニターの結果を示す。
【図７】実施例３におけるドナー分子に対する反応生成物のモル比を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for synthesizing a saccharide or a derivative thereof by glycosyl transfer using a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolysis activity, and more particularly, to a method for synthesizing a saccharide material such as a chitosan-based material by glycosyl transfer. It is about the law.
According to the present invention, a functional new material can be efficiently synthesized, and a new technology that can be used in various fields such as carbohydrate engineering, agriculture, food, and medicine can be provided.
The inventors succeeded in elucidating a DNA sequence encoding the polypeptide, which is a design drawing of a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolyzing activity. It is possible to screen for and obtain polypeptides of substantially the same quality.
Furthermore, it is possible to modify some of the properties to some extent by using chemical modification methods, genetic engineering techniques, molecular breeding techniques, etc., while maintaining most of the functionality of the polypeptide.
These facts make it possible to develop the glycosyltransfer synthesis technology using the polypeptide in a manner corresponding to the required reaction system, and to make the most of the technology in a wide variety of fields centering on the above-mentioned regions. Become.
[0002]
[Prior art]
The present invention relates to a method for synthesizing a saccharide or a derivative thereof using a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity. Glycosyltransferase is used as an effective means for new carbohydrate synthesis in the carbohydrate material-related industry or the research and development field related to carbohydrate synthesis, and many enzymes such as lysozyme, pullulanase, and chitinase are used. I have been.
Not only food materials, but also enzymes that synthesize cyclic sugars such as cyclodextrin, cyclodextran, and cycloamylose, which are known as molecules having a wide variety of functions, while originally exhibiting catalytic properties as a carbohydrate hydrolase, It is known that these carbohydrates are synthesized by intramolecular glycosyltransferase activity.
[0003]
In addition to examples in which the physical properties of carbohydrates are significantly modified like cyclosaccharides, there are also known examples in which glycosyltransfer products have improved physical properties such as water solubility as compared to the substances before translocation. Is an effective method for enhancing the functionality of a saccharide material by altering physical properties.
Also, studies have been widely conducted on synthesizing functional sugar chain derivatives from easily available carbohydrate materials such as lactose and chitin oligosaccharides by utilizing glycosyltransferase activity.
However, there is no method for directly transferring sugar residues including free amino sugar residues, and no method for performing a transfer reaction using chitosan hydrolase has been known.
[0004]
Also, in the living world, amino sugar residues having free amino groups are widely present, but for their biosynthesis, glycosyltransferases having an activity of directly transferring amino monosaccharide residues having free amino groups are known. And the presence of a nucleotide derivative of an amino sugar having a free amino group as its donor molecule has not been confirmed to date.
In general, it is considered that an N-acetylated amino sugar residue is bound to an acceptor by a glycosyltransferase and then converted into a free amino sugar residue by the action of an N-deacetylase. .
[0005]
On the other hand, also in the method of introducing an amino sugar residue having a free amino group by organic synthesis, it is necessary to derivatize the amino group portion of the amino sugar residue having a free amino group before binding to an acceptor. The general deprotection is performed under extremely extreme conditions using an alkali, hydrazine, or the like. Therefore, according to this method, there is a high possibility that various side reactions will occur.
In addition, regioselectivity in the deprotection reaction is considered to be extremely low. Therefore, introduction of a sugar to which an amino sugar having a free amino group is bound by organic synthesis has been practiced only for a very limited number of compounds through a carefully planned complicated process.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
From the above background, the discovery of a polypeptide having the activity of enzymatically transferring a sugar residue containing one or more D-glucosamine residues to an acceptor will contribute to the significant development of carbohydrate-related research. There is expected.
Chitosan-based materials are used in various fields such as flocculants, artificial skin for animals, antibacterial agents, antifungal agents, functional food materials, and biodegradable plastics. Chitosan is a polymer that is soluble in dilute acid and has a feature that handling is much easier than polymers having a similar sugar chain structure such as cellulose, chitin, and xylan.
Free amino groups, which cause chitosan to show cationicity in chitosan solution, are not only highly reactive with acid anhydrides and aldehydes, but also unique with various molecules due to ionic bonds, coordination bonds, etc. Cause an interaction. It is also known that chitosan has high safety, is biocompatible, and exhibits moderate biodegradability in the natural world.
[0007]
For this reason, research has been energetically made aiming to utilize chitosan and other functional molecules as a drug delivery system, a sustained-release component matrix, and the like by complexation. On the other hand, the lower molecular weight of chitosan imparts water solubility to the material, and new uses such as immunostimulants, renal function improvers, and plant elicitors have been found.
However, a method of conjugating a functional molecule with chitosan or its oligosaccharide is mainly a chemical covalent bonding method between a free amino group in a chitosan-based molecule and a functional molecule. In that case, unless the ratio between the two and the reaction conditions are strictly controlled, the characteristics of the chitosan-based material due to the presence of free amino groups will not be easily exhibited.
[0008]
In addition, since a non-natural bond other than a glycoside bond is introduced, attention must always be paid to safety and biocompatibility. The glycosyl transfer reaction by a hydrolase is a reaction in which a glycosidic bond of a donor molecule is cleaved to introduce a new glycosidic bond with an acceptor molecule, and the glycosidic bond by the glycosyl transfer reaction can be hydrolyzed by the enzyme.
By establishing a method for synthesizing glycosyltransfer products having high environmental adaptability through glycosidic bonds, the field of synthesis of chitosan derivatives, which has been accumulating research results, is expected to dramatically develop.
[0009]
It is known that an oligosaccharide or polysaccharide hydrolase has a function of strongly recognizing the molecular structure of a substrate and arranging the substrate molecule in a space near the enzyme molecule so as to be suitable for a catalytic reaction. The glycosyltransfer reaction proceeds rapidly only when there is a space in which both the donor molecule and the acceptor molecule can be accommodated.
The ability to correctly arrange a substrate molecule or its analog is an important property of an enzyme that is comparable to the catalytic function.In applications, for example, a mutant of a retaining enzyme that has greatly reduced hydrolase activity can be used. It supports the concept and utilization of Glycosyntheses used.
[0010]
However, to date, no polypeptide sequence information derived from a retaining-type chitosan hydrolase has been known for constructing a glycosynthesis that provides a space for strongly recognizing the structure of chitosan.
Hydrolases exhibiting glycosyltransferase activity are known to degrade substrates in a retaining-type degradation mode. If a chitosan hydrolase with glycosyltransferase activity is discovered and the genetic information is clarified, the information includes information on the space near the enzyme that recognizes the chitosan-based substrate, By modifying the sequence, it becomes useful information to be utilized in designing glycosyntheses and the like.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above background, the present inventors have intensively elucidated the enzyme properties based on the utilization of chitosan hydrolase activity in industry, and as a result, a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolase activity has been transglycosylated. They found that they have activity and developed a method for synthesizing glycosyltransfer products. The ability to cut sugar residues from donor molecules including free amino sugar residues and transfer them to various acceptor molecules provides an efficient method for new sugar synthesis .
In addition, the present inventors have succeeded in isolating a gene encoding the polypeptide, which serves as a design drawing. As a result, many similar polypeptides having substantially the same functionalities as the polypeptide can be easily obtained from the natural world. Furthermore, it has become possible to obtain a polypeptide having substantially the same functionality as that of the polypeptide and having some of its properties modified from nature or artificially using engineering techniques.
[0012]
The present invention according to claim 1 provides a polypeptide which has a function relating to chitosan hydrolysis activity, acting on chitosan or a compound having a similar structure to chitosan, and a portion which nucleophilically attacks the anomeric position of the reaction intermediate. This is a method for synthesizing a saccharide containing one or several D-glucosamine residues or a derivative thereof by transglycosylation to a compound having the same.
The present invention according to claim 2 is the method according to claim 1, wherein the functional polypeptide is a chitosan hydrolase derived from Streptomyces griseus HUT6037 or a hydrolase having a function equivalent to the enzyme. is there.
According to the present invention, the compound having a structure similar to that of chitosan is selected from chitosan oligosaccharide, partially deacetylated chitin, partially deacetylated chitin oligosaccharide, carboxymethylcellulose, glycol chitosan and cellooligosaccharide. The synthesis method according to claim 1, wherein
The present invention according to claim 4, wherein the compound having a moiety that nucleophilically attacks the anomeric position of the reaction intermediate is D-glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, D-glucose, chitin oligosaccharide, cellooligosaccharide, and the like. 2. The method according to claim 1, wherein the compound is selected from the derivatives of
The present invention according to claim 5 is the synthesis method according to claim 1, wherein the saccharide or a derivative thereof contains one or several D-glucosamine residues.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for synthesizing a saccharide or a derivative thereof by glycosyl transfer using a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity. A feature of the polypeptide which is a main part of the present invention is gene sequence information which can be regarded as a design drawing of chitosan hydrolase.
With the acquisition of this information, various characteristics such as optimal pH, optimal temperature, stability, substrate specificity, etc., when the polypeptide expresses its functionality are modified, and most of the essential functionalities are maintained. The function of the polypeptide can be enhanced.
In addition, as a result of the present invention, by obtaining genetic information encoding a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolysis activity, PCR, hybridization and the like, using a known genetic engineering technology, It is possible to screen similar functional enzymes with some modified properties from other organisms that have undergone biological evolution.
[0014]
Furthermore, it is possible to produce a polypeptide with greatly reduced enzyme activity by genetic engineering technology etc. while retaining the space for recognizing and arranging the substrate, and to utilize that space as glycosynthesis etc. Become. Due to the above effects, it is expected that chitosan utilization technology centering on the enzymatic depolymerization of chitosan will be remarkably developed, which will lead to stimulation of new demand for chitosan-based materials and creation of new industries. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0015]
Chitosan is a polymer produced by deacetylating chitin, which is a linear polysaccharide in which N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) is linked by β-1,4 bonds, mainly with concentrated alkali, and is a rare polymer. It is a polymer soluble in acid.
Generally, those in which 70% or more of D-glucosamine (GlcN) residues are deacetylated are called chitosan. Chitosan products are manufactured and sold by many companies around the world, and it is known that besides commercially available products, those having the same structure can be purified from microbial cells and the like. As a chitosan product, for example, Flownac C manufactured by Kyowa Technos Co., Ltd. (Chiba Prefecture) can be used.
Since chitosan becomes a polycation in an aqueous solution, it is used in various fields such as a flocculant, an antibacterial agent, an antifungal agent, a functional food material, and a biodegradable plastic. Chitosan is a material that has high biocompatibility and exhibits biodegradability, and can be used in the pharmaceutical field together with its derivatives.
[0016]
The compound having a structure similar to chitosan is selected from chitosan oligosaccharide, partially deacetylated chitin, partially deacetylated chitin oligosaccharide, carboxymethylcellulose, glycol chitosan, cellooligosaccharide, xylan, and glycosaminoglycan derivative.
The chitosan derivative molecule is obtained by derivatizing one or more amino groups, hydroxyl groups, and aldehyde groups of chitosan or its oligosaccharide with various degrees of substitution for the purpose of imparting functionality such as hydrophilicity to chitosan, Glycol chitosan and the like are known. In addition, chitosan oligosaccharide is an oligosaccharide in which GlcN produced by a method such as hydrolysis of chitosan is bonded by β-1,4 bond, and is expected to be used as an immunostimulant, a renal function improving agent, a plant elicitor, and the like. Has been issued.
[0017]
An enzyme that hydrolyzes the main chain glycosidic bond of chitosan is generally called chitosanase. According to Enzyme {Nomenclature} 1992, chitosanase is defined as EC {3.2.1.132}, but in the present definition, the binding between GlcNAc- {β-1,4-GlcN} of partially deacetylated chitin is end-type. Only the chitosanase that cleaves at this point is regarded as chitosanase. To date, many chitosan hydrolases that do not fall under this definition have been reported.
Furthermore, some chitosan hydrolases have an activity of hydrolyzing other sugar chain bonds such as partially deacetylated chitin and carboxymethylcellulose, and the definition of chitosanase itself is ambiguous.
In view of this point, the chitosan hydrolase in the present invention is not necessarily synonymous with the strictly defined chitosanase, but means an enzyme having a chitosan main chain glycoside bond hydrolyzing activity in general.
[0018]
In general, the enzyme function does not consist only of the function of the catalytic central residue, but also includes the function of stabilizing the enzyme structure itself, the function of the space for recognizing the substrate, and the function of the space for introducing the substrate. It is supported by various functions. For chitosan hydrolase, not only catalytic activity but also various functions of the enzyme and its expression mechanism can be considered to be included in the genetic information.
In the present invention, chitosan hydrolase should be comprehensively recognized as a functional molecule, as described as "a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity".
[0019]
The present inventors have elucidated the characteristics of chitosan hydrolase in order to utilize the function of chitosan hydrolase in industry, and as a result, discovered a chitosan hydrolase having high glycosyltransferase activity, The successful decoding of the gene sequence was also successful. As a result of estimating the amino acid sequence of the enzyme from the sequence of the present enzyme gene, it was revealed that the present enzyme is an enzyme having a primary sequence belonging to carbohydrate hydrolase family 5 (family classification of carbohydrate hydrolases is , Homepage: http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）). An enzyme belonging to family 5 and having a functional and glycosyltransferring activity involved in chitosan hydrolysis activity is not known at all.
[0020]
A saccharide hydrolase having glycosyl transfer activity degrades a substrate by an anomer-retaining hydrolysis mechanism. In the first step, the anomeric retention enzyme degrades the glycosidic bond of the substrate to separate the sugar residue from the substrate, and then, in the second step, removes the water molecule activated by the enzyme from the anomeric position of the removed sugar residue. Is subjected to nucleophilic attack to complete the hydrolysis.
At that time, when another molecule comes near the anomeric position instead of the water molecule, a phenomenon in which the sugar residue cut out in the first step and the molecule are glycoside-bonded is observed (glycosylation). A number of studies aimed at using the transglycosylation reaction for the synthesis of carbohydrates or derivatives thereof have been reported so far.
[0021]
As a method for synthesizing a sugar by an enzymatic reaction, in addition to a method utilizing a glycosyltransferase activity of a hydrolase, a method of performing a reaction using a sugar nucleotide as a substrate using a glycosyltransferase is known.
The general characteristics of the glycosyltransfer method using a hydrolase are (1) the substrate is inexpensive and readily available, (2) the reaction yield is low due to competition with the hydrolysis reaction, and (3) the transglycosylation. It has been pointed out that the location is not one place and the generation of isomers may be a problem.
However, when synthesizing a large amount of a saccharide material, for example, it is easy to obtain a donor molecule to be transferred. Therefore, there are cases in which the glycosyl transfer activity of a hydrolase is utilized. For example, a method for transglycosylating a maltose residue to cyclodextrin using pullulanase has been industrially practically used, and the introduction of a maltose side chain has dramatically improved the water solubility as compared with ordinary cyclodextrin. It has been commercialized as a branched cyclodextrin.
[0022]
On the other hand, various attempts have been made to overcome the low reaction yield characteristic of the above (2). For example, attempts have been made to change the abundance of water molecules and their morphology in order to increase the transglycosylation activity relative to the hydrolysis activity. Specific examples include a reaction in an organic solvent such as methanol and acetonitrile, and a reaction in the presence of ammonium sulfate.
In addition, a novel protein engineering method in which a nucleophilic group located at the catalytic center of the enzyme is inactivated and a reaction is performed using a fluorosaccharide derivative as a glycosyltransferase (synthesis method by glycosynthesis: Mackenzie, ｃｋL) Fet et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 5583-5584 (1998)).
This method has the advantage that the enzyme protein in which the nucleophilic group has been inactivated has almost no hydrolysis activity, and the product does not become a hydrolysis substrate again. The principle of this method is that the activated acceptor makes a nucleophilic attack on the anomeric position of the fluorine-activated donor, so that the reaction proceeds only in the synthesis direction. Glycosyltransferase activity has been developed to make it easier to put into practical use.
[0023]
Since the enzyme used in the present invention is the only reported anomeric enzyme among chitosan hydrolases, the use of the sequence information described in the present invention makes it possible to use chitosan and other sugars or derivatives thereof. It is possible to design glycosyntheses and the like for the purpose of transglycosylation.
The fact that chitosan hydrolase has glycosyltransferase activity was first clarified by the present inventors by detailed elucidation of the enzyme properties. Glycosyltransfer donors include compounds that can be hydrolysis substrates under normal conditions.
As described above, chitosan hydrolases are known to use various compounds as substrates, such as chitosan oligosaccharide, partially deacetylated chitin, partially deacetylated chitin oligosaccharide, carboxymethylcellulose, and glycol chitosan, in addition to chitosan. And chitosan, which is a homopolymer of D-glucosamine, is not limited to the donor.
[0024]
As the acceptor, various compounds having a portion that nucleophilically attacks the anomeric position of the reaction intermediate are assumed. Various compounds such as heavy water, alcohols, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides and derivatives thereof, complex carbohydrates, artificial sugar chains, cell surface sugar chains, and the like can be envisioned. Among them, D-glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, D-glucose, chitin oligosaccharides, cellooligosaccharides and their derivatives are presumed to easily fit into the substrate recognition site in the enzyme, and therefore are efficient. It can be expected to perform a sugar transfer.
[0025]
Glycosyltransferase activity allows the reaction product to be detected using an analytical method such as TLC or HPLC. For example, when chitosan oligosaccharide is used as a donor and an acceptor, 0.05 M sodium dihydrogen phosphate is sprayed on a TLC plate (TLC aluminum sheets silicaca gel 60, MERCK), air-dried, and dried at 105 ° C. for 1 hour. A method of developing the solution three times by an ascending method using a developing solvent mixed at a ratio (v / v) of n-propanol / water / 30% ammonia water = 70: 15: 15 using the obtained solution is considered. .
When it is difficult to completely determine the structure by NMR, such as when the amount of the enzyme is small or when a mixture of products having a plurality of glycosyltransfer patterns is present, the presence or absence of the transposition reaction is estimated by mass spectrometry or the like.
Further, by performing high-precision mass spectrometry on the isolated compound using FT-MS or the like, it is possible to make a highly reliable discussion on the validity of the estimated molecular formula in consideration of the isotope abundance ratio.
[0026]
Although there is an organic synthesis method of a sugar chain having a free amino sugar residue such as D-glucosamine, it is necessary to protect an amino group having high chemical reactivity in advance. As the protecting group, a monochloroacetyl group, a trifluoroacetyl group or the like is selected. However, deprotection with an alkali after introduction of a target sugar residue requires considerable skill, and there is a problem in that side reactions such as decomposition of a sugar chain skeleton may occur.
On the other hand, by using an enzymatic method that does not go through a protection / deprotection step, many researchers can be expected to be able to easily screen a material containing a free amino sugar having a novel functionality. In particular, practical new technology can be provided for the purpose of efficiently synthesizing mass consumption materials.
Since no method has been reported for enzymatic transglycosylation of free amino sugar residues, the present invention, which has been the first in the world to decipher the gene sequence, which is the design drawing of an enzyme having glycosyltransferase activity, is immediately available. It is thought that this will lead to technology that will pave the way for the creation of industry.
[0027]
A DNA sequence encoding an enzyme polypeptide as a functional molecule is a design drawing for synthesizing the polypeptide. The DNA sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a DNA sequence of a gene encoding a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity. By considering the codon degeneracy, it is possible to code for an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and assume a large number of DNA sequences different from the sequence of SEQ ID NO: 2, All of them are equivalent to the information of SEQ ID NO: 2 in that they are DNA sequences encoding the sequence of SEQ ID NO: 1, and substantially equivalent to the design drawing of a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolysis activity. is there.
Such codon modifications are not only mutations that can occur routinely due to various factors in nature, but also artificially introduce amber stop codons, modify or restrict rare codon sequences for modifying expression levels. It is performed for the purpose of introducing or deleting an enzyme recognition site.
[0028]
Functionally cloned from DNA or cDNA libraries of various organisms by a method such as PCR or hybridization based on the information of the DNA sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A gene sequence encoding a polypeptide that hardly differs from the characteristics of the polypeptide can be realized only by knowing the information described in the present invention and can be easily achieved by molecular biological techniques. Is considered to be included in the present invention. One or more amino acid residues in an enzyme polypeptide as a functional molecule, in which at least one of deletion, addition, substitution or insertion has been performed, has the same functionality as the original enzyme It is widely known.
[0029]
For many polypeptides, random mutagenesis experiments, site-directed mutagenesis, gene shuffling, sexual PCR, etc. have been performed for the purpose of amino acid sequence modification while retaining at least a part of the original functionality of many polypeptides. Has been done. As a result, many examples have been reported in which polypeptides whose amino acid sequences do not completely match do not show significant differences in essential functions.
In addition, the step of modifying a part of the molecular structure of a polypeptide chain using a genetic engineering technique, a chemical technique, a metabolic engineering technique, or the like is an extremely common step. Synthesis of a recombinant polypeptide to which a peptide sequence is added, structural modification by controlling post-translational modification such as glycosylation, synthesis of a hybrid polypeptide modified with polyethylene glycol, a biotin derivative, etc., use of 4-base recognition t-RNA or It is known to introduce artificial amino acid residues by administering artificial amino acids to the culture medium of an amino acid-requiring host organism.
[0030]
Since the object of the present invention is to utilize the functionality of the present polypeptide involved in chitosan hydrolysis, the polypeptide described in the present invention is partially modified by modifying the structure of a polypeptide having an equivalent function by the above method. Molecules expressing a function that does not show a significant difference from the above function are substantially included in the present invention.
In addition, if a researcher has a basic technology in the field of genetic engineering, using the genetic information elucidated by the present invention, a known genetic engineering technique, for example, cutting out a DNA sequence to be coded by a restriction enzyme or by PCR. In general, the polypeptide is isolated by a method such as amplification, and the polypeptide is ligated with an appropriate vector, for example, a pET-based vector (Novagen) and a structural gene sequence.
[0031]
A method for introducing a DNA sequence of a structural gene into a vector by a homologous recombination method is also known. Subsequently, the vector is introduced into a suitable host cell. For example, a recombinant Escherichia coli is produced by performing transformation or the like with a vector using Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene) cells.
It is easily conceived that a recombinant protein having substantially the same function can be produced using the recombinant organism thus obtained. In addition, a method of expressing a structural gene using a cell-free system is also known.
Using such genetic engineering techniques to produce a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide whose sequence has been determined by the present inventors, and utilizing the functionality relating to the glycosyltransferase activity, It is considered that this is included in the present invention.
[0032]
In addition, there have been numerous reports on modifying the amino acid sequence encoded by this gene described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing using protein engineering techniques and the like. It can be easily conceived and achieved by applying the technical technique to the present polypeptide in the same manner.
Polypeptides prepared by protein engineering techniques and having physical properties that are not significantly different from the functionality of the polypeptide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, even if the amino acid sequence is slightly different, are substantially the same as those of the present invention. Is clearly included in the contents of the above. For example, the specific activity of the polypeptide was reduced by protein engineering techniques, the number of polypeptide molecules required for performing the same reaction was increased, and the apparent thermal stability was improved by increasing the protein concentration in the system. However, as long as the function of such a similar polypeptide is not substantially different from the function of the polypeptide described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, such a polypeptide is also included in the present invention.
[0033]
Altering the amino acid sequence by a method such as sexual PCR or the like to slightly alter the properties of the protein, such as heat resistance or optimal pH, is now a textbook method, and the glycosyltransferase activity is determined by the sequence listing. Such modified polypeptide sequences are considered to be included in the present invention, as long as they are not significantly different from the polypeptides described in SEQ ID NO: 1.
It is known that a polypeptide having a function relating to chitosan hydrolysis activity is mainly produced as a chitosan hydrolase called chitosanase by bacteria, mold, yeast and the like, but produces the polypeptide. Organisms are not limited to these. An example is chitosan-degrading enzyme II from Streptomyces {griseus} HUT6037.
[0034]
As described above, many polypeptides having chitosan hydrolyzing activity are known to hydrolyze substrates other than chitosan, and chitosan is used in investigating substrate specificity depending on the discovered situation. It is highly likely that they have not been discovered despite having chitosan hydrolysis activity. Therefore, it is natural to consider that a polypeptide having chitosan hydrolyzing activity exists among hydrolases which have not been reported as so-called chitosanase at this stage.
[0035]
Next, a method for decoding amino acid sequence information and DNA sequence information as a design drawing of a polypeptide having a function related to the chitosan hydrolysis activity will be described. It can be roughly categorized into technologies mainly based on genetic engineering screening methods and methods utilizing information on the primary structure analysis of polypeptides.
The steps required to decode the DNA sequence information are performed by general genetic engineering techniques, for example, Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition (eds. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
[0036]
In the former method, first, the DNA of an organism in which the presence of a polypeptide having a function related to the chitosan hydrolysis activity is expected to be cut with an appropriate restriction enzyme, or in the case of eukaryotes, mRNA is recovered and then inverted. It is common practice to transcribe the cDNA, ligate it to an appropriate vector, transform the host cell using this, and conduct screening by chitosan hydrolysis activity.
The screening may be carried out by a method of measuring activity using chitosan, chitosan oligosaccharide, chitosan derivative or the like, a method of observing halo formation in a medium containing colloidal chitosan or a similar substrate such as carboxymethylcellulose, and the like.
[0037]
Plasmids, cosmids, phages and the like can be considered as vectors. Thereafter, the introduced vector is recovered from the recombinant organism cell and its sequence is determined. For the determination of the sequence, an analysis method by the Maxam-Gilbert method or the dideoxy method is known, but an analysis device by the latter method is widely used. However, when the GC content of the DNA is high, there are cases where it is extremely difficult to determine the DNA sequence in the sequence step according to the manual.
In such a case, various trial and error and examination of conditions are required.However, the method of adding dimethyl sulfoxide, the method of increasing the denaturation temperature during the sequence reaction to 97 ° C. or higher, and the design of an appropriate sequence primer are problems. In such a case, a method of performing deletion from both ends and reading from the vector sequence portion is considered to be effective.
[0038]
If the insert DNA sequence is too long, cut the fragment and reconnect it to the vector for subcloning, and perform the same screening method.Decode the sequence little by little from both ends and use the information to further sequence the inner sequence. Can be deciphered. Alternatively, a method may be considered in which after determining the primary structural information of the polypeptide expressed in the primary screening using a peptide sequencer or a mass spectrometer, etc., the information is used to narrow down the sequence by colony hybridization or the like. .
As the peptide sequencer, a machine that performs sequential analysis from the N end by Edman degradation and automatic analysis is commercially available. In addition, sequence decoding by fragment analysis using a mass spectrometer, or a method for determining an amino acid sequence from the C-terminus have been established, and some companies provide contract analysis services. In some cases, N-terminal amino acid residues are blocked by derivatization such as acetylation, formylation, pyroglutamylation, etc. However, chemical or enzymatic deblocking methods have been developed, and in most cases, N-terminal It is possible to read from the first or second amino acid residue from the side.
For the acquisition of internal sequence information, the polypeptide is cleaved by a chemical method using a protease or cyanogen bromide with high cleavage site specificity, separated by liquid chromatography or electrophoresis, etc., and directly eluted It is common to collect the liquid or transfer it from a gel to a membrane such as PVDF and then collect it to perform the peptide sequence analysis described above.
[0039]
In the latter method, the first step is often to determine the primary sequence information of a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity using a peptide sequencer or a mass spectrometer. Subsequently, using the information to design a DNA probe and perform hybridization with a DNA library, or designing PCR primers and using appropriate PCR-related techniques to fish or amplify the target gene To collect.
According to this method, first, it is necessary to purify a polypeptide having a function involved in chitosan hydrolysis activity. A polypeptide having a function related to chitosan hydrolyzing activity may be found as a polypeptide having chitosan hydrolase activity mainly in a form secreted into a cell, near a cell surface or an extracellular fraction. high. The exemplified chitosan hydrolase derived from Streptomyces griseus HUT6037 is induced and produced in a culture solution by inoculating spores in a liquid medium containing a chitosan-based substrate and culturing the spores.
[0040]
When a crude polypeptide solution is recovered from a fraction in which the polypeptide is found, cell disruption treatment may be performed as necessary. Examples of the cell crushing method include a lysing treatment, an osmotic shock method, an ultrasonic crushing method, a physical crushing treatment using a mortar or pestle, a French press method, and the like.
As a method for detecting chitosan hydrolase activity, generally, chitosan, chitosan oligosaccharide, chitosan derivative, or a similar compound thereof is used as a substrate, and the enzyme is reacted under temperature and pH conditions having enzyme activity. , A method for detecting color compounds bound to artificial substrates such as reducing sugars or chitosan derivatives generated by the reaction, a method for directly detecting reaction products by chromatography, and an index of viscosity decrease due to hydrolysis of polymer compounds. And a method of detecting halo formation or turbidity reduction when a substrate such as colloidal chitosan is decomposed.
[0041]
In order to obtain information on molecular weight or primary sequence information on a polypeptide, it is necessary to isolate and purify a polypeptide having an activity on chitosan hydrolysis from a crude polypeptide solution. Generally, the crude polypeptide fraction is concentrated by ammonium sulfate precipitation, membrane fractionation, etc., desalting by dialysis, desalting by gel filtration column, buffer replacement, etc. Advanced purification can be performed using a general polypeptide purification method such as chromatography, hydrophobic chromatography, hydrogen bond chromatography, gel filtration, hydroxyapatite, affinity chromatography, and isoelectric focusing.
[0042]
The N-terminal amino acid sequence of the highly purified polypeptide is decoded by peptide sequencer analysis. In addition, gel electrophoresis using polyacrylamide or the like is performed, and each polypeptide is separated as a band. After reactivation of the electrophoretic protein, each separated band is stained with chitosan hydrolase activity on the gel. This makes it possible to identify a band derived from the target polypeptide on the electrophoresis gel. After blotting the band on the gel onto a PVDF membrane or the like, it is possible to cut out the band portion showing the activity and use the sample as a sample to decode the peptide sequence. Furthermore, as described above, the internal amino acid sequence can be deciphered by limited hydrolysis of the polypeptide by an enzymatic method or a chemical method.
[0043]
Since primers used in the first-stage PCR are designed based on amino acid sequence information, a method of using a mixture of a plurality of sequences in consideration of degeneracy of codons is generally used. Since it is difficult to determine the C-terminal amino acid sequence compared to others, ordinary PCR is often performed using primers synthesized based on the information on the N-terminal sequence and internal sequence of the polypeptide. At this stage, the sequence of the entire gene could not be decoded.
As the next step, a method of screening from the library and decoding the DNA sequence in the picked up vector can be considered. However, recently, techniques such as inverse PCR and tail PCR have been established, and it has become possible to decode the DNA sequence of the entire structural gene without constructing a library. Therefore, it is effective to apply these methods to the present invention.
[0044]
By decoding the codons of the obtained DNA sequence, the amino acid sequence constituting the polypeptide can be determined. It is an easy task to partially convert the obtained DNA sequence with little change in the amino acid sequence information. The sequence can be changed as necessary by a method such as site-directed mutagenesis based on PCR, random mutagenesis, gene shuffling, or sexual PCR.
As described above, the DNA sequence is artificially modified for the purpose of slightly improving the function of the polypeptide, controlling the degeneracy in consideration of the codon usage of the cell into which the gene is to be introduced, and introducing or removing a restriction enzyme recognition site. It is common to make a technical modification.
In order to facilitate introduction of the DNA sequence into various vectors, it is common practice to introduce restriction enzyme recognition sequences at both ends of the sequence. Many vectors have a unique restriction enzyme recognition site called a multicloning site. After the vector and the DNA to be inserted are treated with restriction enzymes and purified, they are ligated by ligase treatment, and the target DNA sequence is ligated. It is common to construct a vector containing
[0045]
A method has also been developed in which a DNA sequence having specific sequences capable of homologous recombination attached to both ends is designed, and the resulting DNA sequence is transferred and ligated to a vector by a homologous recombination method without using ligase. Insertion of a DNA sequence into a vector allows for stable retention of the DNA sequence, amplification with fewer mutations, and mass production of the polypeptide encoded by the sequence as a recombinant polypeptide.
[0046]
The foreign gene can be introduced into a host cell after being linked to an appropriate vector. For example, after a multicloning site of a pET-type plasmid (Novagen II), which is an expression vector of Escherichia coli, is treated with a restriction enzyme, a target DNA sequence is inserted by the above-described method to construct an expression vector containing target DNA information. It becomes possible.
The exemplified pET-based vector is designed to be stably retained when a strain such as Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.) is transformed, and is designed so that the expression of the inserted gene does not occur. On the other hand, by transforming an expression host such as Escherichia coli BL21 (DE3) strain (Stratagene) using the same plasmid, it becomes possible to obtain a recombinant strain for gene expression using a pET-type vector.
[0047]
When a long DNA sequence containing a foreign gene and its promoter region is inserted into a vector, the expression of the foreign gene may be subject to unique control.In many cases, only a foreign structural gene is inserted into an expression vector. Expression is controlled by the control system of the vector. In general, it is designed to express a foreign gene constitutively or inducibly.
Examples of the expression inducing factor include isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, methanol and the like. Examples of the gene transfer method include a heat shock method, an electroporation method, an infection transfer method, and the like.
[0048]
The introduction of a vector containing a foreign gene enables stable retention of the DNA sequence, amplification as needed, and expression of the recombinant polypeptide. In addition, the vector is sometimes integrated into the chromosome and stably maintained.
When inserting a foreign gene into a vector, it was designed to connect a signal sequence that promotes secretory production of the polypeptide that is the gene product, and to add a peptide tag that facilitates purification of the produced polypeptide. Vectors are commercially available from many companies. For example, by selecting an appropriate vector, it is possible to easily add a histidine tag sequence that enables purification using a chelate column. If necessary, a DNA sequence encoding a peptide having such functionality can be ligated to the end of the target gene, and then inserted into a vector.
[0049]
Expression of a foreign gene is performed by adding an appropriate inducer as necessary.However, the gene expression level, the accumulation site of the polypeptide, the specific activity and the presence or absence of modification are determined by culture conditions such as medium composition, temperature, etc. It is empirically known that it greatly changes depending on conditions such as the timing of addition of the factor and the concentration.
Taking the expression with a pET-based vector as an example, it is known that an enzyme produced in large quantities as an inclusion body when recombinant Escherichia coli is cultured at 37 ° C is produced in a medium as an active enzyme when cultured at 25 ° C. ing.
For recombinant polypeptides produced as inclusion bodies or those produced in an inactive form, cells are crushed to recover the inclusion bodies and then refolded using an appropriate refolding technique involving denaturant treatment. It can often be activated. For example, a method is known in which the inclusion body is denatured using 8M urea, and the urea concentration is gradually reduced by dialysis or the like, thereby promoting rewinding of the polypeptide.
[0050]
The recombinant polypeptide produced by the large-scale expression of the foreign gene is purified, if necessary, using a previously introduced purification tag sequence or using the general polypeptide purification method described above. It is possible.
When the polypeptide having an activity related to chitosan hydrolysis according to the present invention is used as an industrial biocatalyst, the polypeptide produced as a recombinant polypeptide may be used as it is, or in order to reduce the concentration of contaminants as necessary. Purification should be performed.
On the other hand, when the recombinant polypeptide is used in the fields of pharmaceuticals, foods, etc., it is necessary to carry out advanced purification of the polypeptide in consideration of the fact that coexisting trace components affect the safety or functionality of the target product. There are also desirable cases.
[0051]
After a method for producing a recombinant polypeptide has been established, it is expected that research on the correlation between enzyme function and structure will be dramatically advanced by its mass production. In addition to being able to estimate residues involved in catalysis by genetic engineering, it becomes possible to easily examine the crystallization conditions of the polypeptide.
When X-ray crystallographic data is obtained, use a polypeptide that has significantly reduced enzymatic activity by substituting the catalytic amino acid residue for crystallization with a substrate or its analog added. This makes it possible to determine the substrate subsite structure, amino acid residues involved in substrate binding, and the like.
The acquisition of such a series of structural biological data makes it possible to create highly functionalized polypeptides by artificially altering the substrate recognition or catalytic properties significantly.
The main use of the present invention includes efficient synthesis of carbohydrates and derivatives thereof utilizing the transglycosylation activity of a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity.
[0052]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and the like, but the present invention is not limited to these examples and the like.
Production Example 1 Production of Chitosanase as Polypeptide Having Functionality Involved in Chitosan Hydrolysis Activity by Microorganism
As a chitosanase-producing bacterium, Streptomyces Griseus HUT6037 (available to a third party, IFO3237), which is a stock strain of Hiroshima University School of Engineering, was used. As the chitosan, a degree of deacetylation of 96% (DAC96, manufactured by Katakura Tikkalin Co., Ltd.) was used. Colloidal chitosan was prepared using the above chitosan according to the method of Yabuki et al. (Yabuki, M. et al., Tech. Bull. Fac. Hort. Chiba Univ., 39, 23) (1987).
For the culture of the strain, a slant medium for preservation (1.0% Mannitol, 0.2% Peptone, 0.1% Meatextract, 0.1% Yeast extract, 2.0% Agar, 0.05% MgSO4)₄/ 7H₂O, pH 7.0, liquid medium for seed culture (1.0% Mannitol, 0.2% Peptone, 0.1% Meat extract, 0.1% Yeast extract, pH 7.0), liquid for enzyme production Medium (0.2% Colloidal chitosan (DAC96), 0.05% KCl, 0.1% K₂HPO₄, {0.05%} MgSO₄/ 7H₂O, {0.001%} FeSO₄, {PH} 7.0).
[0053]
One loopful of platinum loops of Streptomyces griseus HUT6037 stored in the preservation slant medium was inoculated into the seed culture medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days to obtain a seed culture solution. A seed culture solution (40 mL) was inoculated to 1 L of the enzyme-producing medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 4 days.
The obtained culture solution was centrifuged (6,000 rpm × 10 min) ｍｉｎ, and the supernatant was subjected to Toyo Filter Paper NO. 2 and the filtrate was subjected to purification experiments.
[0054]
Preparation Example 2 Purification of Chitosanase as a Polypeptide Having Functionality Related to Chitosan Hydrolysis Activity
According to the method of Production Example 1, 3722 mL of the culture filtrate was collected. The chitosanase activity was measured using a 0.55% chitosan solution (pH 5.7) as a substrate, and the amount of reducing sugars generated was determined by the method of Imoto and Yagishita (Imoto, {T. and T. Yagishita, K., Agric. Biol. Chem. , {35, {1154} (1971)) using the improved method of Schales (Schales, {O. and And Schales, S. S., Arch. Biochem., 8, 8, 285 (1945))}.
The reaction measurement substrate solution was prepared by dissolving 0.55 g of DAC96 in about 40 mL of a 0.1 M acetic acid solution, adding 1N NaOH until the pH reached about 5.5, and adjusting the pH to 5.7 with a 0.1 M sodium acetate solution. , 0.1 M acetate buffer (pH 5.7) was added to make a total volume of 100 mL.
After 0.1 mL of the enzyme solution was added to 0.9 mL of the substrate solution and reacted at 37 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by mixing 2.0 mL of Schales® reagent, and 0.5 mL of distilled water was added and the mixture was boiled for 15 minutes. . After cooling, the absorbance at a wavelength of 420 nm was measured.
[0055]
One unit of the chitosanase activity was defined as the amount of enzyme that releases reducing sugar corresponding to 1 μmol glucosamine per minute. The protein was measured using a bovine serum albumin as a standard protein and an improved method by the Hartree of the Lowry method (Harttree, {EF}, {Anal. Biochem., 48, {422} (1972)).
The amount of protein in the enzyme solution was determined by using a standard curve obtained using bovine serum albumin as a standard protein, and the amount was converted into a standard protein. The protein amount of each fraction in the column chromatography was measured by measuring the absorbance at a wavelength of 280 nm.
Based on this definition, the culture filtrate had a total chitosanase activity of 6670 units and a specific activity of 12.4 units / mg. A 200 mM @ PMSF acetone solution was added thereto to a final concentration of 1 mM, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C overnight.
[0056]
Subsequently, the culture filtrate was concentrated by the reverse dialysis method as follows. Under ice-cooling, the dialysis membrane filled with powdered ammonium sulfate was immersed in the culture filtrate, and when water was accumulated in the membrane, the water in the dialysis membrane was drained, filled with ammonium sulfate again, and immersed in the culture filtrate. By this operation, the moisture of the culture filtrate was absorbed into the dialysis membrane, the ammonium sulfate powder was dissolved and leached out of the membrane, and the concentration of the culture filtrate and salting out of ammonium sulfate were simultaneously performed.
When the liquid volume was reduced to about 1/3, it was left overnight at 4 ° C. The dialysis membrane was pulled up, ammonium sulfate powder was added to the culture filtrate so as to be 100% saturated, and the mixture was left at 4 ° C. for 3 days. The resulting precipitate was collected by centrifugation (7,000 rpm × 15 min) and dissolved in a 0.02 M phosphate buffer (pH 6.0).
[0057]
This solution was centrifuged (10,000 rpm × 20 min), and the supernatant was recovered as a crude enzyme solution. The precipitate formed at this time was redissolved in a 0.02 M phosphate buffer (pH 6.0), centrifuged (12,000 rpm × 20 min), and the supernatant was added to the above crude enzyme solution. The resulting precipitate was further redissolved in a 0.02 M phosphate buffer (pH 6.0), centrifuged (12,000 rpm × 20 min), and the supernatant was added to the crude enzyme solution.
This crude enzyme solution was subjected to Bio {Gel} P-2} (Bio-Rad) equilibrated with a 0.02 M phosphate buffer (pH 6.0) to desalinate. At this stage, the total activity was 5090 units, the specific activity was 52.8 units / mg, the degree of purification was 4.17 times, and the yield was 76.3%.
[0058]
Next, the active fraction desalted with Bio {Gel} P-2} was separated from CM {Sephadex} C-25 (Amersham Pharmacia Biotech AB Pharmacia, column size) equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 6.0). : {2.6} × 26.6 cm, {flow rate}: {33.0} ml / h). All purification operations using the column were performed at 4 ° C. After the unadsorbed fraction was eluted with the buffer used for equilibration, the adsorbed fraction was eluted with a linear concentration gradient of 0 to 0.4 M NaCl. A chitosanase-active fraction was eluted at a NaCl concentration of around 0.15 M, which was collected. At this stage, the total activity was 4390 units, the specific activity was 65.4 units / mg 精製, the degree of purification was 5.26 times, and the yield was 65.8%.
[0059]
Next, the active fraction obtained by CM Sephadex C-25 was subjected to Sephadex G-75 equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) (Amersham Pharmacia Biotech AB Pharmacia, column size: 2. (6 cm x 97 cm, flow rate: 22.6 ml / h) and eluted with the same buffer. Two activity peaks corresponding to the absorbance at a wavelength of 280 nm were observed, and each was collected as peak1 and Δpeak2 (FIG. 1). In the figure,-●-indicates the absorbance at a wavelength of 280 nm, and-○-indicates the chitosanase activity.
At this stage, the total activity of peak1 was 430 units, the specific activity was 51.2 units / mg, the degree of purification was 4.12 times, and the yield was 6.5%. The total activity of peak2 was 3450 units, the specific activity was 96.9 units / mg, the degree of purification was 7.79 times, and the yield was 51.7%.
[0060]
Sephadex G-75 (column size: 2.6 x 97 cm, flow rate: 22.6 ml), wherein peak 1 and peak 2 obtained in the previous step were each equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8). / H) applied to the column. When peak1 was applied to the column, two peaks of activity were observed, and the previously eluted active fraction was recovered as purified enzyme chitosanase I (FIG. 2). In the figure,-●-indicates the absorbance at a wavelength of 280 nm, and-○-indicates the chitosanase activity. In addition, as a result of applying peak2 to the column, an active fraction was obtained, which was collected as chitosanase II (FIG. 3). In the figure,-●-indicates the absorbance at a wavelength of 280 nm.
Finally, the total activity of chitosanase I was 167 units, the specific activity was 58.2 units / mg, the degree of purification was 4.67 times, and the yield was 2.5%. The total activity of chitosanase II was 2420 units, the specific activity was 92.0 units / mg, the degree of purification was 7.40 times, and the yield was 36.3%.
[0061]
Test Example 1 Characterization of chitosanase as a polypeptide having a function related to chitosan hydrolysis activity
The following studies were performed on the enzymatic chemical properties of the purified chitosanase.
Molecular weight measurement: The molecular weights of purified chitosanase I and chitosanase II were measured by SDS-PAGE and gel filtration. SDS-PAGE was performed according to the method of Laemmli (Laemmli, U.K., Nature, 227, 680 (1970)). The separation gel used was 12.5% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS ゲル, and the concentrated gel was 5% polyacrylamide gel containing 0.1% SDS.
0.001% bromophenol blue was used as a marker dye. After adding 1 μg of the sample per lane of the gel, a constant current of 30 mA was passed at room temperature to perform electrophoresis. Coomassie Brilliant Blue R-250 was used for staining. As standard proteins, Phosphorylase b (molecular weight 94,000), Bovine Serum Albumin (67,000), Ovalbumin (43,000), Carbonic Anhydrase (30,000), Soybean, Trypsin, and Inhibitor (100,000). α- {Lactalbumin} (14,400) was used.
[0062]
The gel filtration method was performed according to the method of Andrew using a Sephadex {G-75} column (2.6 × 97 cm) equilibrated with a 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) at a flow rate of 22.6 ml / h. (Andrews, P., Biochem. J., 91, 222 (1964)). Bovine Serum Albumin (molecular weight 67,000), Ovalbumin II (43,000), Chemotrypsinogen A (25,000), and Ribonuclease (13,700) were used as standard proteins.
As a result, in SDS-PAGE, one band was obtained for both chitosanase I and II, and the band was electrophoretically uniform, and both molecular weights were estimated to be about 34,000. On the other hand, the molecular weights of chitosanase I and II were calculated to be about 17,300 and about 10,400 by Sephadex {G-75} gel filtration method, respectively.
[0063]
Isoelectric focusing: The isoelectric points of chitosanase I and chitosanase II were examined by isoelectric focusing. Isoelectric focusing was performed in a disk form using a 5% polyacrylamide gel containing Ampholin® (pH 3.5 to 10.0). 5 μg of sample was added per lane of the gel, and electrophoresis was performed at room temperature at a constant voltage of 200 v. For staining, a 3.5% perchloric acid solution containing 0.04% Coomassie Brilliant Blue @ G-250 was used. As pI marker, High pI Kit (pH 5.0 to 10.0) from Amersham Pharmacia Biotech AB was used. As a result, the isoelectric points of chitosanase I and II were pI 10.3 and pI 10.1, respectively.
[0064]
Optimum pH: The optimum pH of chitosanase I was examined. Enzyme reaction was performed at 37 ° C. for 10 minutes using soluble chitosan (0.55%) having a degree of deacetylation of 96% (DAC96 °) dissolved in a buffer at each pH as a substrate, and the activity was measured. The buffer used to dissolve the substrate was 0.1 M hydrochloric acid-sodium acetate buffer at pH 3.0, and 0.1 M acetate buffer at pH 4.0-6.4. At pH 6.5 to 8.0, a substrate obtained by dissolving DAC96 chitosan in 0.1 M acetic acid and adjusting the pH with a saturated sodium hydrogen carbonate solution was used. The relative activity was calculated with the highest activity value as 100%. As a result, the relative activity was as shown in FIG. 3, and the optimum pH was 6.3. Similar results were obtained for the pH characteristics of chitosanase II.
[0065]
pH stability: The pH stability of the present enzyme was examined as follows. After the enzyme solution was mixed with the buffer at each pH, the mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 2 hours, and then the residual activity of the supernatant was measured by a usual activity measurement method. As the buffer, McIlvine buffer was used for pH 3.0 to 8.0, and Atkins and Pantins buffer was used for pH 9.0 to 11.0. The relative activity was calculated with the highest activity value as 100%. As a result, it was stable in the pH range of 5.0 to 9.0, and showed a residual activity of 80% or more. Similar results were obtained for the pH stability of chitosanase II.
[0066]
Optimum temperature: The enzyme reaction was performed for 10 minutes at each temperature (30 to 70 ° C.) using chitosanase I, and the activity was measured. The relative activity was calculated with the highest activity value as 100%. As a result, the optimum temperature was 60 ° C. Similar results were obtained for the temperature characteristics of chitosanase II.
Thermal stability: The enzyme solution of chitosanase I was left at each temperature (20 to 70 ° C.) for 15 minutes, and then the residual activity of the supernatant was measured by a usual activity measurement method. The relative activity was calculated with the highest activity value as 100%. As a result, the enzyme was stable up to 40 ° C., above which activity was rapidly lost, and was inactivated by heating at 55 ° C. for 15 minutes. Similar results were obtained for the thermostability of chitosanase II
[0067]
Substrate specificity: As a substrate, colloidal chitin (prepared by the method of Jeuniaux (Jeuniaux, C., Arch. Int. Physiol. Biochem., 66, 408-427 (1958))), and glycoal chitin (Yamada and Imotoa) , H. and Imoto, Y., Carbohydr. Res., 92, 160-162 (1981)), lichenan (β-1,3-1,4- glucan, provided by Niigata University), carboxy Methylcellulose (CMC, manufactured by Katayama Chemical Industry Co., Ltd.), water-soluble chitin having a deacetylation degree of 30% (DAC30) (manufactured by Yaizu Fisheries Chemical Industry Co., Ltd.), and partial deacetylation degree of 60% (DAC60)}-acetylchitosan (Taste of Chitosan (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) having a degree of deacetylation of 70%, 80%, 90%, 100% (DAC70, 80, 90, 100). After performing an enzymatic reaction at pH 5.7 and 37 ° C. for 10 minutes using chitosanase I, the amount of reducing sugars generated was measured.
[0068]
Since colloidal chitosan is an insoluble substrate, the activity was measured while stirring so as to be uniformly dispersed in the reaction solution. As a result, the present enzyme decomposed the N-acetyl chitosan with a degree of deacetylation of 60% most frequently, and decomposed relatively well even with a partial N-acetyl chitosan having a degree of deacetylation of 70% and 80%. In addition, the activity of partial N-acetylchitosan having a degree of deacetylation of 60% with respect to carboxymethylcellulose (CMC) was about 23%, indicating a high CMCase activity. Similar results were obtained for the substrate specificity of chitosanase II.
[0069]
Test Example 2 Determination of Amino Acid Sequence of Polypeptide Having Functionality Related to Chitosan Hydrolysis Activity
A chitosanase II enzyme preparation purified by the method described in Production Example 2 was reduced pyridylethyl by the method of Cavins et al. (Cavins, {J.} F. And Friedman, M., Anal. Biochem., 35, 489-493} (1970)). And dialyzed against 100 mM ammonium bicarbonate (pH 7.8) overnight. The solution in the dialysis membrane was collected, concentrated under reduced pressure, and then decomposed with V8 protease (manufactured by Sigma). The degradation products were separated by SDS-PAGE using a 15% polyacrylamide gel, and blotted on a PVDF membrane Immobilon PSQ (manufactured by Millipore). After staining with 0.25% CBB {R-250}, destaining was performed with 60% methanol. A band that can be seen was cut out. The excised peptide bands were designated as {V8-1}, -2, -3, -4, -5, -6 and -7 in descending order of molecular weight, and their N-terminal amino acid sequences were changed to the sequence of Procise 491c protein sequencer (Applied Biosystems). Was analyzed. V8-2, V8-3 and V8-6 were consistent with the N-terminal amino acid sequence of chitosanase II.
[0070]
The N-terminal amino acid sequences of chitosanase II and each peptide band could be determined as shown in SEQ ID NOs: 3 to 7 in the sequence listing. SEQ ID NO: 3 corresponds to the N-terminal amino acid sequence data, and SEQ ID NOs: 4 to 7 correspond to V8-1, V8-4, V8-7, and V8-5, respectively.
In addition, as for chitosanase I, the same treatment was performed. As a result, the same data was obtained for the electrophoresis pattern, the N-terminal amino acid sequence, and the internal sequence. Since there was no difference between the results and the catalytic properties, it was presumed that chitosanase I and chitosanase II were derived from the same gene product, and cloning was performed.
[0071]
Test Example 3 Cloning and Sequencing of a Polypeptide Having Activity Related to Chitosan Hydrolysis
The chromosomal DNA of Streptomyces griseus HUT 6037 described in Preparation Example 1 was obtained from Genetic Manufacturing Up of Streptomyces: a Laboratory Manual. {Eds. , Hopwood, D. A. , Bibbb, M. {J. , @Chater, @K. F. , Kieser, T. , @Bruton, @C. {J. , Kieser, H. M. , {Lydiate} D. L. , {Smith} C. P. , {Ward} J. M. , {Schrempf} H. S. , @Norwich, @U. K. , {John \ Innes \ Foundation} (1985) pp. The operation was performed according to Isolation of STREPTOMYCES "total" DNA: Procedure 1 described in 72-74 and extracted.
[0072]
Based on the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence described in Test Example 2, degenerate primers were designed as follows. First, a synthetic DNA of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was designed from the N-terminal amino acid sequence of chitosanase II as a sense strand primer. A PstI site was added to the 5 'side. Also, a synthetic DNA of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing was designed as an antisense strand primer from the N-terminal amino acid sequence of the V8-4 fragment which is considered to be an active catalytic site based on homology with other enzymes belonging to Family # 5. A HindIII site was added to the 5 'side.
Using these primers and LA {Taq} with {GC} buffer (TaKaRa)}, PCR was performed in a reaction solution having the following composition. 12.5 μl 2 × PCR buffer (GC buffer I), 7.5 μl 2.5 mM dNTPs, 1 μl 100 μM sense strand primer (final concentration 4 μM), 1 μl 100 μM antisense strand primer (final concentration 4 μM), 5 μl template (10 μg / ml genomic DNA), 0.5 μl DNA polymerase (LA @ Taq), total 25 μl.
[0073]
The PCR reaction program is as follows. Step {1 (4 ° C., 10 min; 98 ° C., 5 min)} is 1 cycle (cold start), Step 2 (98 ° C., 30 sec; 40 ° C., 30 sec; 72 ° C., 1 min) is 35 cycles, Step {3 (4 ° C., 99 ′). 99) is 1 cycle $.
The entire amount of the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis to confirm whether the target gene was amplified. In order to know the exact size of the low molecular weight amplified fragment, a 2.5% agarose gel dissolved in TAE buffer and coagulated was used. The gel was loaded into Mupid-3} (micro electrophoresis system, manufactured by Cosmo Bio) filled with TAE buffer, and the sample was applied, followed by applying electricity at 100 V for 1 hour and 20 minutes.
As a low molecular weight marker, 100 bp DNA Ladder manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used. In addition, the electrophoresis marker and the loading die for electrophoresis include 6x Loading {Dye} (30% glycerol, 0.06% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 0.12% orange) attached to 100 bp DNA Ladder. G, 10 mM @ Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM @ EDTA).
[0074]
After the electrophoresis, the gel was immersed in an ethidium bromide solution for 20 minutes for staining. Ultraviolet light was applied to the stained gel, and the emission band due to ethidium bromide was photographed.
As expected at the time of primer design, a clear amplification band could be confirmed at around 450-460 bp, and this amplified fragment was cut out. The DNA was recovered from the agarose gel using GENECLEAN {III} Kit of BIO {101} according to the attached protocol.
The collected target amplified fragment was subjected to a double digest at 37 ° C. overnight with HindIII and PstI. Vector pUC119 was similarly digested. The target amplified fragment treated with the restriction enzyme was subjected to electrophoresis again and extracted from the gel.
The vector treated with the restriction enzyme was treated with alkaline phosphatase (BAP) at 65 ° C. for 30 minutes, and then subjected to electrophoresis and gel extraction in the same manner. An agarose gel of 2.5% was used for the amplified fragment of interest and a 1% agarose gel for the vector. Ligation of the target amplified fragment and the vector was performed using Ligation High which is DNA Ligation Kit of Toyobo Co., Ltd.
5 μl of the digested amplified fragment, 5 μl of the digested pUC119, and 10 μl of Ligation {high} were mixed and allowed to stand at 16 ° C. overnight.
[0075]
This ligation solution was transformed into E. coli strain JM109Ｍ. Plasmids were extracted from clones retaining the desired amplified fragment, and DNA sequencing of the insert was performed. Using ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits, sample preparation for capillary-type ABI PRISM 310 DNA sequencer was performed.
The composition of the reaction solution was as follows: Ready \ Reaction \ mix \ 1.3 [mu] l, 5 * Sequence \ buffer \ 3.4 [mu] l, 1 [mu] m equivalent to 1 pmol of Primer, x [mu] l equivalent to 150 ng of plasmid [DNA], and (14.3-x) [mu] l water, for a total of 20 [mu] l.
The program for the sequence reaction is as follows: Step {1 (96 ° C., 1 min, 1 cycle), Step {2 (96 ° C., 30 sec; 45 ° C., 30 sec; 60 ° C., 4 min, 30 cycles), Step {3 (25 ° C., 99′99}, 1 cycle). As a result, a 412-base sequence (SEQ ID NO: 10) could be determined.
[0076]
These had high homology with the β-1,4-endoglucanase gene of Streptomyces lividans 66 and the cellulase gene of Thermomonospora fusca. Since the sequence encoding the internal amino acid sequence could be confirmed, it was considered that the target gene could be amplified, and a digoxigenin-labeled probe used for screening was synthesized from the amplified fragment. For the synthesis, a DIG {DNA} labeling and detection kit manufactured by Boehringer Mannheim was used, and the operation was performed according to the manual attached to the kit. In addition, Southern hybridization using the synthesized probe followed the manual attached to the product.
The genome of Streptomyces griseus HUT6037 treated with SalI was subjected to agarose gel electrophoresis, and Nylon membrane branch Hybond-N was obtained by the alkali transfer method.⁺(Pharmacia Biotech). A Southern hybridization with a synthetic probe detected a fragment of about 2 kb. The DNA fragment was recovered from this electrophoresis position and incorporated into the vector pUC19. Colony hybridization was performed using the same probe to obtain a clone that was thought to retain a plasmid containing the target gene.
[0077]
DNA sequencing was performed using this clone. First, in order to confirm the direction of the insert, a sense strand primer and an antisense strand primer are designed from the internal sequence revealed from the PCR amplified fragment, and the M13-M4 primers (SEQ ID NO: 11) and M13- Colony direct PCR was performed in combination with the RV primer (SEQ ID NO: 12). Here, it was found that the sense strand was inserted from the RV primer and the antisense strand was inserted from the M4 primer so that the antisense strand could be sequenced. Therefore, a clone having the insert direction reversed was prepared.
A deletion mutant was prepared for both the forward clone and the reverse clone, and the sense strand and the antisense strand were designed to be sequenced with the M4 primer. The deletion mutant was prepared using Nippon Gene's Deletion @ kit and operated according to the method described in the manufacturer's catalog and manual. The obtained mutants were isolated, plasmids were extracted, and classified so as to be arranged in order of molecular weight.
[0078]
DNA sequencing was performed using these, and the approximate sequence of both the sense strand and the antisense strand was determined so that the sequence was connected from the vector side to the entire region of the insert (SEQ ID NO: 13). Thereafter, primers from SEQ ID NO: 14 to SEQ ID NO: 22 were designed using the plasmid before the deletion, and a sequence reaction was performed.
The programs for the sequence reaction are Step 1 (98 ° C., 10 sec; 50 ° C., 5 sec; 60 ° C., 4 min, 25 cycles) and Step 2 (4 ° C., 99′99 °, 1 cycle).
As a result of performing a sequence analysis using these samples, a 1208 base sequence (SEQ ID NO: 23) could be determined as follows.
[0079]
Since the DNA sequence encoding chitosanase II was decoded, the sequence was analyzed. As a result, a sequence (AAGGAGA （) corresponding to the SD sequence was found 6 bases upstream of ATG encoding methionine, which could be an initiation codon, and Was deduced as shown in SEQ ID NO: 24. Also, from the N-terminal amino acid sequence information obtained by the peptide sequencer, it was estimated that the mature enzyme sequence of the present chitosanase was represented by SEQ ID NO: 1.
It was confirmed that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contained all the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 7. From the information of SEQ ID NO: 1, the molecular weight of the mature enzyme was estimated to be about 33,700. This value is very close to the analysis result by SDS-PAGE described in Test Example 1. Further, a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the present mature enzyme, which should serve as a design drawing of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, was found from within the sequence of SEQ ID NO: 23 and determined as shown in SEQ ID NO: 2. The Escherichia coli JM109 strain transformed with the plasmid pUC19-based plasmid (pMMChitoII) containing the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, under the accession number FERM P-18892 It is.
[0080]
Example 1 Detection of glycosyltransferase activity using chitosan oligosaccharide
Chitopentaose [(GlcN)] of chitosanase I or chitosanase II purified by the method of Production Example 2.₅], The enzymatic degradation products were analyzed by thin layer chromatography (TLC). 0.4% (GlcN)₅To 25 μl of the solution, 12.5 μl of 0.04 M phosphate buffer (pH 5.7) was added, and 12.5 μl of chitosanase I (1 unit / ml) or chitosanase II (0.0825 unit / {50 μl reaction solution)} was added, and 37 The reaction was carried out at a temperature of 10 ° C. for a predetermined time (10 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 8 hr, 24 hr). Thereafter, the reaction was stopped by boiling at 100 ° C. for 5 minutes.
[0081]
The decomposition product was analyzed by TLC. The TLC plate was spray-dried with 0.05 M sodium dihydrogen phosphate using TLC aluminum seats silica gel 60 manufactured by MERCK Corporation, air-dried, and dried at 105 ° C. for 1 hour. It was developed three times by an ascending method using a developing solvent in which n-propanol, water, and 30% ammonia water were mixed at a volume ratio of 70:15:15.
After drying, a diphenylamine-aniline reagent was sprayed and heated at 105 ° C. for 30 minutes to develop a color. The standard material is (GlcN)₁ _~ ₆Was used. As a result, (GlcN)₂, (GlcN)₃, (GlcN)₄Although the coloring of was observed, (GlcN)₁Was not observed (FIGS. 4 and 5), indicating that the enzyme was (GlcN)₅It was presumed that a transglycosylation reaction occurred when reacting with 反応. In the figure, ● n indicates chitosan oligosaccharide [(GlcN)_nAnd the numbers represent the degree of polymerization.
[0082]
Example 2 Detection of glycosyltransferase activity by chitosanase in the presence of chitin oligosaccharide
The chitosanase II produced by the method of Preparation Example 2 contains 0.0625 unit and has a final concentration of 10% (GlcN).₅And 1% chitin trisaccharide [(GlcNAc)₃] And a 50 µl reaction solution consisting of 10 mM sodium / potassium phosphate buffer (pH 5.7) were reacted at 37 ° C for 8 hours, and stopped by boiling at 100 ° C for 5 minutes.
Thereafter, the reaction product was separated by HPLC (column: Radial-Pak NH2 (8.0 mm x 100 mm), flow rate: 2 ml / min, eluent: 65% acetonitrile, detection: absorbance at 210 nm). As a result, regarding the reaction solution, (GlcNAc)₃Two peaks were observed later than (FIG. 6). In the figure, (a) shows the results of the enzyme reaction solution 8 hours after the reaction, (b) shows the results of chitin trisaccharide, and (c) shows the results of chitin oligosaccharide (the numbers indicate the degree of polymerization).
Peaks A and B were separated, and the sample concentrated under reduced pressure was analyzed by MALDI-TOF @ MS. As a result, the glycosyltransfer product GlcN- (GlcNAc)₃Ion peak [ΔM + Na⁺{] = 811.6} and [M + K⁺{} = 827.6}, and the glycosyltransfer product GlcN₂-(GlcNAc)₃イオン molecular ion peak [M + Na⁺{} = 972.6} and [M + K⁺{] = 988.6} was detected.
[0083]
Example 3 Detection of glycosyl transfer activity to sugar derivative by chitosanase
The chitosanase II produced by the method of Production Example 2 contains 0.061 unit and has a final concentration of 1% (GlcN).₅And 1% of chitin disaccharide derivative [p-nitrophenyl β-N, N'-diacetylchitobioside (GlcNAc)₂-PNP {manufactured by Seikagaku Corporation]} and 30 mM sodium carbonate (pH 8.0) at 37 ° C. After reacting for a predetermined time (0 min, {30 min} 1 hrs, 2 hrs, 4 hrs, 6 hrs, 8 hrs), use this as a sample to monitor the reaction product on the polymer side expected to be a glycosyltransfer product by HPLC. did.
As the HPLC column, High Performance Carbohydrate Column (4.6 mm x 250 mm, manufactured by Waters) was used, 70% acetonitrile was flowed at a flow rate of 1 ml / min, and the absorbance at 300 nm was monitored using an ultraviolet / visible spectrophotometer. .
[0084]
As a result of analyzing the enzyme reaction sample, peaks were detected at around 4.3 minutes, 5.4 minutes, 7.6 minutes, and 10.5 minutes. These were named Compound 1, Compound 2, Compound 3, and Compound 4, respectively. Chitin tetrasaccharide derivative [p- {nitrophenyl [beta] -N, "N", "N", N ""-tetraacetylchitotetraoside (GlcNAc)₄-PNP {manufactured by Seikagaku Corporation]} as a standard substance, assuming that each reaction product has one p-nitrophenyl group per mole, and a pair of reaction products constituting each peak from each peak area. As a result of estimating the donor mole generation rate, the result as shown in FIG. 7 was obtained. Among the compounds in the reaction system, compounds showing strong absorption at 300 nm are highly likely to be derived from p-nitrophenyl groups, and it was presumed that the transglycosylation reaction could be detected sharply.
[0085]
Example 4 Molecular Formula Estimation of Product Resulting from Glycosyltransfer Reaction to Sugar Derivative by Chitosanase
According to the method of Example 3, the reaction was carried out by scaling up to 12 ml. The reaction was carried out at 37 ° C. for 12 hours, the enzyme was removed by a spin column UV4BGC00 (manufactured by Millipore Co.), and after collecting the passing fraction, water-methanol was used according to the manual using Sep-Pak Plus C18 (manufactured by Waters). By performing stepwise separation, chitosan oligosaccharides and inorganic salts were removed as a flow-through fraction with water, and a saccharide derivative having a p-nitrophenyl group was recovered as a fraction eluted with methanol.
This was dried to dryness under reduced pressure and dissolved in 7.8 ml of 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.0). Subsequently, this sample was added to CM-Sephadex {C-25 (1 mL, manufactured by Pharmacia)} equilibrated with the same buffer at a flow rate of 1 ml, and washed with the same buffer at the same flow rate (90% including the sample addition). Minutes).
[0086]
The elution of the reaction product was monitored by absorbance at 300 nm using an ultraviolet / visible spectrophotometer, and fractions were collected 1 ml at a time after the sample was added. After the washing, the salt concentration in the buffer solution was increased by a linear gradient at a flow rate of 1 ml / min (the salt concentration at the start of the gradient was 0 M, and the salt concentration after 75 minutes was 1.5 M). Collected.
As a result, Compound 1 of Example 3 was in the fraction No. Compounds 2 and 3 were eluted in fractions Nos. 36-90, respectively. 111-124, no. Eluted at 126-135. The fractions corresponding to each compound were combined and desalted by performing Sep-Pak + Plus \ C18 treatment again.
[0087]
These were concentrated by centrifugation to dryness and subjected to FT-MS analysis. As a result, accurate mass spectrometry was performed on Compounds 1 to 3 as follows. Compound 1 was converted to GlcN- (GlcNAc)₂The theoretical value of the molecular ion peak in the case of −pNP was 707.262677 °, the measured value was 707.25971 °, and the compound 2 was GlcN.₂-(GlcNAc)₂The theoretical value of the molecular ion peak in the case of −pNP} was 888.333058 °, the measured value was 868.32844 °, and the compound 3 was GlcN.₃-(GlcNAc)₂In the case of −pNP ピーク, the theoretical value of the molecular ion peak was 1029.39393, and the measured value was 1029.4174.
The above results strongly support that each reaction product has a molecular formula when predicted to be a glycosyltransfer reaction product.
[0088]
Example 5 Monitoring of Transglycosylation Reaction Using Polymer Donor
According to the method of Example 3, the presence of a new peak detected by HPLC separation and the molar concentration thereof were calculated by changing the donor. Donor substrates include chitosan (Flownac C), glycol chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), carboxymethyl cellulose (manufactured by Sigma II) and partially deacetylated water-soluble chitin (deacetylation degree 30%, Yaizu Fisheries Chemicals) Industrial Co., Ltd.) was used. Chitosan was adjusted to pH 5.7 using a 200 mM sodium phosphate buffer (pH 7).
The latter three were adjusted to pH 7.5 with a 200 mM sodium phosphate buffer (pH 8). The reaction was performed at 37 ° C. for 12 hours. Thereafter, according to the HPLC analysis method of Example 3, the molar concentration of the product was estimated from the area of the peak of the compound generated at the end of the reaction and having an absorption at 300 nm. As a result, the estimated production concentrations of the glycosyltransferred compound in each reaction system were 1.19 mM, 14.7 μM, 48.0 μM, and 34.9 μM, respectively.
[0089]
Example 6 Monitoring of Glycosyltransfer Reaction Using Small Molecule Acceptor
According to the method of Example 3, the acceptor was changed and the presence or absence of a new peak detected by HPLC separation and the molar concentration thereof were calculated. Examples of the acceptor molecule include p-nitrophenyl β-N-acetyl-D-glucosaminide GlcNAc-pNP, p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside Glc-pNP, and p-nitrophenyl β-cellobioside (Glc).₂-Three types of pNP (all manufactured by Seikagaku Corporation) were used.
The reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, according to the HPLC analysis method of Example 3, the molar concentration of the product was estimated from the area of the peak of the compound generated at the end of the reaction and having an absorption at 300 nm. As a result, the estimated production concentrations of the glycosyltransferred compound in each reaction system were 51.9 μM, 30.0 μM, and 336 μM, respectively.
[0090]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a method for synthesizing a saccharide or a derivative thereof by transglycosylation using a polypeptide having a function relating to chitosan hydrolysis activity.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention enables efficient synthesis of a new functional material, and provides a new technology that can be used in various fields such as carbohydrate engineering, agriculture, food, and pharmaceuticals.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a separation pattern of an enzyme activity fraction by gel filtration chromatography described in Production Example 2.
FIG. 2 shows a separation pattern of peak 1 by gel filtration rechromatography described in Production Example 2.
FIG. 3 shows a separation pattern of peak 2 by gel filtration rechromatography described in Production Example 2.
FIG. 4 shows the results of monitoring by TLC the glycosyltransferase activity of chitosanase II described in Example 1.
FIG. 5 shows the results of monitoring by TLC the glycosyltransferase activity of chitosanase I described in Example 1.
FIG. 6 shows the results of HPLC monitoring of the glycosyltransfer reaction product of chitosanase II described in Example 2.
FIG. 7 shows a molar ratio of a reaction product to a donor molecule in Example 3.

Claims

A polypeptide having a function involved in chitosan hydrolysis activity is allowed to act on chitosan or a compound having a similar structure to chitosan, and saccharides are transferred to a compound having a moiety that nucleophilically attacks the anomeric position of a reaction intermediate. Alternatively, a method of synthesizing a derivative thereof.

2. The method according to claim 1, wherein the functional polypeptide is a chitosan hydrolase derived from Streptomyces griseus HUT6037 or a hydrolase having a function equivalent to the enzyme.

The compound according to claim 1, wherein the compound having a structure similar to chitosan is selected from chitosan oligosaccharide, partially deacetylated chitin, partially deacetylated chitin oligosaccharide, carboxymethylcellulose, glycol chitosan and cellooligosaccharide. Law.

The compound having a moiety that nucleophilically attacks the anomeric position of the reaction intermediate is selected from D-glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, D-glucose, chitin oligosaccharide, cellooligosaccharide and derivatives thereof. The synthesis method according to claim 1, wherein

The method according to claim 1, wherein the saccharide or a derivative thereof contains one or several D-glucosamine residues.