JP2004018750A - Manufacturing method for hyaluronic acid derivative improved in hydrophilicity - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒアルロン酸がカルボキシル基において、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬と結合したヒアルロン酸誘導体の親水性を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とがβ１，３結合で結合してなる二糖単位が繰り返してβ１，４結合して構成された多糖であり、グリコサミノグリカンの一種である。ヒアルロン酸は重量平均分子量が１０，０００〜３０，０００，０００であるが、各二糖単位にカルボキシル基及び多数のヒドロキシル基を有していることから極めて親水性が高く、例えば自重の約１０００倍の水を保持することが可能である。このようなヒアルロン酸が示す高い親水性には、特に基本骨格中各二糖単位に存在するカルボキシル基が大きく関与していると考えられる。
【０００３】
ヒアルロン酸のカルボキシル基に、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬を結合させてヒアルロン酸を修飾して得られるヒアルロン酸の誘導体としては、例えば光反応性ヒアルロン酸が挙げられる（例えば特開平８−１４３６０４号等）。この先行文献に記載された光反応性ヒアルロン酸は反応液中では溶解した状態であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ヒアルロン酸のカルボキシル基への、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬の結合はヒアルロン酸の親水性の低下を招くという問題点が存在した。すなわち二糖単位１個あたり０．０５個以上のカルボキシル基にこのような求核性試薬を結合したヒアルロン酸の誘導体は、一度単離して固形とした後に再度水に溶解しようとしてもゲル化あるいは白濁して完全には溶解しないという問題点が存在した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを結合した際に、生じたヒアルロン酸誘導体の親水性が低下するという問題を解決すべく鋭意検討した。その結果、ヒアルロン酸にカルボキシル基と結合しうる求核性試薬を結合した後に反応液をアルカリ性とすることで、そのヒアルロン酸誘導体を固体として再度水に溶解させる際に容易に溶解させることができる「親水性が向上したヒアルロン酸誘導体」が得られることを発見し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１） 下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
（２） 更に下記の工程を含む（１）記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
（３） 更にヒアルロン酸誘導体を単離する工程を含む（１）又は（２）記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
（４） 下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。
（５） 更に下記工程を含むことを特徴とする（４）記載のヒアルロン酸誘導体の親水性向上方法。
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。
（６） ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とが結合したヒアルロン酸誘導体であって、固形の状態のヒアルロン酸誘導体を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μｍで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とするヒアルロン酸誘導体。
（７） 下記工程を経て得られうるヒアルロン酸誘導体。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程；
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程；
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明製造方法
本発明製造方法は下記の工程を含むヒアルロン酸誘導体の製造方法である。
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬（光反応性基を含む求核性試薬を除く）とを水性溶媒中で結合させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性とする工程。
【０００８】
本発明製造方法はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で結合させてヒアルロン酸誘導体溶液（水溶液）を得る工程（工程Ａ）を含む。工程Ａにおいて使用されるヒアルロン酸の由来は特に限定はされない。ヒアルロン酸は例えば動物由来、微生物由来等何れであっても使用することができる。ヒアルロン酸の重量平均分子量は特に限定されず、例えば１０，０００〜５，０００，０００が例示され、好ましくは２０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。なお、本発明製造方法に使用されるヒアルロン酸は塩を形成していない遊離した状態でも良く、また薬学的に許容されうる塩の状態でも良い。ヒアルロン酸の薬学的に許容されうる塩とは、例えばナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属イオンとの塩、又はマグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属イオンとの塩が挙げられる。ヒアルロン酸誘導体を生体に適用するための医用材料等に使用する場合に生体への親和性が特に高いことから、使用されるヒアルロン酸塩はアルカリ金属イオンとの塩が好ましく、その中でもナトリウムイオンとの塩が特に好ましい。
【０００９】
本発明製造方法における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子２個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明製造方法における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することできる物質である。本発明製造方法における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、例えば蛍光標識物質（４−アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等））或いはその重合体（すなわちペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等））、その他の医薬品（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）が結合した医薬品（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【００１０】
これらの求核性試薬の分子量は、１００乃至１５，０００であることが好ましく、特に２００乃至１０，０００であることがより好ましい。このような分子量の求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させるとヒアルロン酸の親水性が低下するが、特に本発明製造方法によって親水性の低下が押さえられ、ヒアルロン酸が本来有する親水性が維持されるからである。
【００１１】
なお、光によって架橋する性質を有する光反応性基は本発明製造方法において使用される「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」からは除外されることが好ましい。ここで光反応性基とは、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合反応を生ずる化合物であって、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環のいずれかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン又はこれらの誘導体を示す。
【００１２】
ヒアルロン酸と求核性試薬との結合は、例えば水溶性カルボジイミド等の水溶性の縮合剤を使用する方法、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＨＯＳｕ）やＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の縮合補助剤と上記の縮合剤とを使用する方法、活性エステル法、酸無水物法等が挙げられる。これらの中では水性溶媒の存在下の反応として、水溶性の縮合剤を使用する方法又は反応補助剤と水溶性の縮合剤とを使用する方法が好ましい。このようなヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬との結合はカルボン酸エステル又は酸アミド結合でなされることが好ましい。従って、求核性試薬はその構造中にカルボン酸エステルを形成するためのヒドロキシル基又は酸アミドを形成するためのアミノ基が存在する物質であることが最も好ましい。なお、本来アミノ基が存在しない化合物に上述したアミノアルキルアルコールやアルキルジアミンなどのスペーサーを結合させてアミノ基を導入した化合物も本発明における求核性試薬には包含されることはいうまでもない。
【００１３】
本発明製造方法における水性溶媒とは水、水混和性の有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。水混和性の有機溶媒とは、例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アルコール（メタノール、エタノール等）等が挙げられる。
【００１４】
本発明におけるヒアルロン酸への、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬の導入率（例えば吸光度の測定やアミノ酸分析、質量分析等の方法で測定することができる）は、０．０５〜４０％、好ましくは０．１〜３０％、最も好ましくは０．３〜２５％である。このような導入率の範囲内であると、ヒアルロン酸が有する生体親和性及び保水性を維持しつつ、求核性試薬が有する特有の性質も有したヒアルロン酸誘導体が得られるからである。なお、この値は反応させるヒアルロン酸のモル数と求核性試薬のモル数とを調節することで適宜変更、調節することが可能である。
【００１５】
本発明製造方法はヒアルロン酸誘導体を反応液の状態で、反応液をアルカリ性とする処理（アルカリ処理）をする工程を含む（工程Ｂ）。工程Ｂにおける反応液をアルカリ性とする処理において、反応液をアルカリ性とするために加える塩基は特に限定はされず、反応液に加えることで反応液がアルカリ性となる性質を有する有機塩基又は反応液に加えることで反応液がアルカリ性となる性質を有する無機塩基の何れであっても使用することができる。しかしながら、水性溶媒によってなる反応液中での処理を考慮すると無機塩基の方が安定性の面から好ましい。そして無機塩基の中では、ヒアルロン酸の低分子化や求核性試薬の分解等に影響を及ぼす畏れが低いことから水酸化ナトリウムのような、反応液を強アルカリ性（ｐＨ１２以上）とする無機塩基よりはむしろ炭酸水素ナトリウムや炭酸ナトリウムのような、反応液を弱アルカリ性とする無機塩基の方が好ましい。ここで、アルカリ処理のｐＨ条件は７．２〜１１、好ましくは７．５〜１０が例示される。
【００１６】
上記の塩基（有機塩基又は無機塩基）の使用量や処理時間は目的とする親水性の程度（後述のフィルター通過性の有無を親水性の程度の判定基準とする）に応じて適宜調節される。例えばヒアルロン酸１ｇ相当量に対して炭酸水素ナトリウム２５０ｍｇ（ヒアルロン酸のモル数に対して５倍量）を使用する場合は４〜６時間、炭酸水素ナトリウム５００ｍｇ以上（ヒアルロン酸のモル数に対して１０倍量以上）を使用する場合は２〜４時間撹拌処理することで親水性が充分に高められたヒアルロン酸誘導体が得られる。
【００１７】
このように調製されたヒアルロン酸誘導体の溶液を、場合により有機酸（酢酸等）又は無機酸（塩酸等）による中和を行う（工程Ｃ）。中和を行わずにヒアルロン酸誘導体の単離・精製を行うことも可能であるが、中和を行うことが好ましい。中和することにより単離されたヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシル基（求核性試薬が結合していないもの）が塩を形成して安定性の面で優れるからである。
【００１８】
本発明製造方法は、アルカリ性処理後（又はその後の中和後）の溶液からヒアルロン酸誘導体を単離する工程（工程Ｄ又はＤ’）を含むことが好ましい。ヒアルロン酸誘導体の単離はヒアルロン酸誘導体の溶液に極性有機溶媒を添加することで行うことができる。ここで極性有機溶媒は例えばエタノール、メタノール、アセトン等が例示され、特にヒアルロン酸誘導体を医用材料等に用いる場合にはエタノールが好ましい。エタノールは生体への毒性が低いからである。ヒアルロン酸誘導体の単離を行う際には、予め溶液に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は、酢酸ナトリウム等のような塩を加えておくことが好ましい。塩は特に塩化ナトリウムが好ましい。塩化ナトリウムは生体への影響が低いからである。塩の添加量は、最終濃度で０．３％以上、好ましくは０．５〜１０％、最も好ましくは４〜８％が挙げられる。塩析の効果により、ヒアルロン酸誘導体を効率的に沈殿として単離できるからである。ただし、上記添加する塩の量に関わらず、エタノール等の非極性有機溶媒を使用することでヒアルロン酸誘導体を沈殿として単離することが可能である。
【００１９】
沈殿として得られたヒアルロン酸誘導体に、必要に応じてエタノール洗浄や乾燥等の各処理を適用することも可能である。
【００２０】
（２）本発明物質
本発明物質はヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とが結合したヒアルロン酸誘導体であって、固形の状態のヒアルロン酸誘導体を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μｍで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍｌ以上通過可能であることを特徴とするヒアルロン酸誘導体である。
【００２１】
本発明物質は上記本発明製造方法によって調製されるヒアルロン酸誘導体である。
このような本発明物質の化学構造は、本発明製造方法によるアルカリ処理を行なう前の「求核性試薬が結合したヒアルロン酸の誘導体」と同じであるが、高次構造（立体構造）は異なっていると考えられる。この相違は物性の相違として把握することが可能である。
【００２２】
従って、本発明物質であるヒアルロン酸誘導体は、その水性溶液中における分子分散特性が高いという物性によって従来のヒアルロン酸誘導体と明確に区別される。この分子分散特性を示す物性としては多孔質フィルターの通過性が挙げられる。そして多孔質フィルターの通過性の高さは上記の分子分散特性の高さを示す。なお、多孔質フィルターの通過性は、多孔質フィルターを通過した前後の水性溶液中のヒアルロン酸誘導体の濃度を比較することにより確認することが可能である。上記条件で本発明物質のヒアルロン酸誘導体水溶液を通過させた場合、通過前後で水溶液中のヒアルロン酸誘導体の濃度の変化がない。
【００２３】
本発明物質におけるヒアルロン酸は例えば動物由来、微生物由来等何れであっても使用することができる。ヒアルロン酸の重量平均分子量は特に限定されず、例えば１０，０００〜５，０００，０００が例示され、好ましくは２０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。なお、本発明物質におけるヒアルロン酸は塩を形成していない遊離した状態でも良く、また薬学的に許容されうる塩の状態でも良い。ヒアルロン酸の薬学的に許容されうる塩とは、例えばナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属イオンとの塩、又はマグネシウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属イオンとの塩が挙げられる。ヒアルロン酸誘導体を生体に適用するための医用材料等に使用する場合に生体への親和性が特に高いことから、使用されるヒアルロン酸塩はアルカリ金属イオンとの塩が好ましく、その中でもナトリウムイオンとの塩が特に好ましい。
【００２４】
本発明物質における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子２個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明物質における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することできる物質である。本発明製造方法における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、、例えば蛍光標識物質（４−アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、スペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサン酸等））或いは重合体（ペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等））、その他の生理活性物質（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）を結合した生理活性物質（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【００２５】
これらの求核性試薬の分子量は、１００乃至１５，０００であることが好ましく、特に２００乃至１０，０００であることがより好ましい。このような分子量の求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させるとヒアルロン酸の親水性が低下するが、特に本発明物質の親水性の低下が押さえられ、ヒアルロン酸が本来有する親水性が維持されるからである。
【００２６】
このような求核性試薬をヒアルロン酸のカルボキシル基に単に結合すると、通常はヒアルロン酸の誘導体の親水性は極めて低いものとなり、一度固形の状態としたヒアルロン酸の誘導体は再度水に充分に溶解することはない。特に上述した多孔質フィルター通過性は極めて低いものとなる。しかし、本発明物質はその製造工程（本発明製造方法）において反応液をアルカリ性とする工程が含まれていることから、多孔質フィルター通過性が極めて高く、この点で従来のヒアルロン酸の誘導体とは明確に区別される。
【００２７】
なお、光によって架橋する性質を有する光反応性基を有する求核性試薬は本発明物質における求核性試薬からは除外される。ここで光反応性基とは、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合反応を生ずる化合物であって、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸（例えばアミノケイ皮酸（ベンゼン環のいずれかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸））、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン又はこれらの誘導体を示す。
【００２８】
ヒアルロン酸のカルボキシル基と求核性試薬との反応は共有結合であり、その中でも特に酸エステル結合又は酸アミド結合が好ましい。
【００２９】
本発明物質におけるヒアルロン酸への求核性試薬の導入率（例えば吸光度の測定やアミノ酸分析、質量分析等の公知の方法で測定することもできる）は、０．０５〜４０％、好ましくは０．１〜３０％、最も好ましくは０．３〜２５％である。このような導入率の範囲内であると、ヒアルロン酸が有する生体親和性及び保水性を維持しつつ、求核性試薬が有する特有の性質も有したヒアルロン酸誘導体が得られるからである。なお、この値は反応させるヒアルロン酸のモル数と求核性試薬のモル数とを調節することで適宜変更、調節することが可能である。
【００３０】
このような本発明物質のうち、特に求核性試薬として蛍光標識物質が結合した本発明物質は例えばヒアルロン酸やそれを使用した医薬・医用材料の生体内での代謝を観察・追跡するためのマーカとして使用することが可能である。また、求核性試薬として生理活性物質やペプチド、タンパク質等が結合した本発明物質は例えば徐放性製剤等の医用材料として使用することが可能である。例えば生理活性物質としてインドメタシン等の鎮痛剤をヒアルロン酸のカルボキシル基に結合させて得た本発明物質は、関節等の密封環境に投与することで潤滑作用と鎮痛作用とを有する優れた医用材料として使用することが可能である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に詳説する。
試験例
フィルター通過性試験
１．０重量％で被検物質を溶解した５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を調製する。２４℃条件下５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径０．４５μｍで直径２５ｍｍ）に上記で調製した被検物質の溶液を通過させ、１分間あたりの通貨量（ｍｌ）を測定する。２ｍｌ以上通過した場合を「○」、２ｍｌ未満通過した場合を「△」、通過しない場合を「×」で示す。
【００３２】
実施例１
４−アミノフルオレセイン（４−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸１．０ｇ（２．５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水１５０ｍＬ／ジオキサン７５ｍＬに溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド３．０ｍｍｏｌ／水１ｍＬ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ１．５ｍｍｏｌ／水１ｍＬ、４−アミノフルオレセイン１．５ｍｍｏｌ／水１ｍＬを順次加え、一昼夜攪拌した。
【００３３】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から２２．５ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１００ｍｇを加え攪拌した後エタノール５０ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで４回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。８１ｍｇの橙色固体を得た。カルボキシル基への４−アミノフルオレセインの導入率を吸光度により算出したところ０．３％だった。
【００３４】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の２２．５ｍＬ抜き出した残りの反応液に炭酸水素ナトリウムを５００ｍｇ加え、４時間３０分攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム６．０ｇを加え攪拌した。エタノール５００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで４回、エタノールで３回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。８３０ｍｇの橙色固体を得た。カルボキシル基への４−アミノフルオロセインの導入率は０．３％だった。
【００３５】
（３）フィルター通過性の検討
上記（１）及び（２）で得た対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表１）。
【００３６】
【表１】
表１
実施例２
ロイシンメチルエステル導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸４００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ／二糖単位）を水６０ｍＬ／ジオキサン３０ｍＬに溶解させた後、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６ｍｍｏｌ／水２ｍＬ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ０．３ｍｍｏｌ／水２ｍＬ、ロイシンメチルエステル塩酸塩０．３ｍｍｏｌ／水２ｍＬを順次加え、２時間３０分攪拌した。
【００３８】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から４５ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１．２ｇを加え攪拌した後エタノール１００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。１５０ｍｇの橙色固体を得た。ロイシンエチルエステルの導入率は２０．９％だった。
【００３９】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の４５ｍＬ抜き出した残りの反応液に炭酸水素ナトリウムを２００ｍｇ加え、２時間４０分攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム２．４ｇを加え攪拌した。エタノール１００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。２４７ｍｇの橙色固体を得た。ロイシンエチルエステルの導入率は２０．９％だった。
【００４０】
（３）フィルター通過性の検討
対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表２）。
【００４１】
【表２】
表２
実施例３
水溶性カルボジイミド導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸４００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ／二糖単位）を水６０ｍＬに溶解させ０．１Ｎ塩酸にてｐＨ４．７５に調整した。ＥＤＣＩ・ＨＣｌ１．０ｍｍｏｌ／水２ｍＬを加え２時間１５分攪拌した。
【００４３】
（１）対照の調製（アルカリ処理を行なわず調製）
上記反応液から３０ｍＬを抜き出し、塩化ナトリウム１．２ｇを加え攪拌した後エタノール１５０ｍＬを加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて１０時間真空乾燥した。１６９ｍｇの白色固体を得た。
【００４４】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行なって調製）
（１）の３０ｍＬ抜き出した残りの反応液に３％炭酸水素ナトリウム水溶液４ｍＬを加え、３時間攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム１．３ｇを加え攪拌した。エタノール２００ｍＬを加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて１０時間真空乾燥した。１６４ｍｇの白色固体を得た。
【００４５】
（３）フィルター通過性の検討
対照物質と被検物質について試験例記載の方法でフィルター通過性を検討した。その結果、対照物質は繊維状の不溶物であったが、被検物質は透明の溶液であった。対照はフィルターを全く通過しなかったが、被検物質は容易にフィルターを通過した（表３）。
【００４６】
【表３】
表３
実施例４
各種本発明物質の合成
（１）インドメタシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノアルキルアルコールとインドメタシンを結合して調製したアミノアルキルアルコール結合インドメタシンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００４８】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して、本発明物質であるインドメタシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００４９】
（２）グルタミン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸２００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５Ｍグリシン塩酸塩水溶液５００μＬを順次加え、一晩攪拌する。
【００５０】
反応液に炭酸水素ナトリウムを２００ｍｇ加え、３時間攪拌する。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム２００ｍｇを加え攪拌し、エタノール１００ｍＬに加え沈殿させて沈殿物を得る。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥し、１７６ｍｇの白色固体として、本発明物質であるグルタミン導入ヒアルロン酸を得ることができる。アミノ酸分析により導入されたグリシンを測定すると導入率は２．４％である。
【００５１】
（３）メトトレキセート導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水１５ｍＬ／ジオキサン７．５ｍＬに溶解させた後、０．２ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド水溶液１ｍＬ、０．１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液１ｍＬ、０．１Ｍメトトレキセートを含むジメチルホルムアミド１ｍＬを順次加え、一昼夜攪拌する。
【００５２】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ加え、３時間攪拌する。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム１００ｍｇを加え攪拌し、エタノール１００ｍＬに加え沈殿させて沈殿物を得る。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥し、１００．４ｍｇの白色固体として本発明物質であるメトトレキセート導入ヒアルロン酸を得ることができる。吸光度より算出したメトトレキセート導入率は１７．４％である。
【００５３】
（４）ダウノマイシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５Ｍダウノマイシンを含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５４】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるダウノマイシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５５】
（５）マイトマイシンＣ導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５ＭマイトマイシンＣを含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５６】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるマイトマイシンＣ導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５７】
（６）サラゾスルファピリジン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノエチルアルコールとサラゾスルファピリジンとを結合して調製したアミノエチルアルコール結合サラゾスルファピリジンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００５８】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるサラゾスルファピリジン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００５９】
（７）プロピオン酸導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途ＥＤＣＩ・ＨＣｌで活性化させてエチレンジアミンとプロピオン酸とを結合して調製したエチレンジアミン結合プロピオン酸を０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００６０】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるプロピオン酸導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００６１】
（８）アセメタシン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、別途アミノアルキルアルコールとアセメタシンとを結合して調製したアミノアルキルアルコール結合アセメタシンを０．５Ｍで含むジメチルホルムアミド２ｍＬを順次添加し、撹拌して反応させる。
【００６２】
反応液に炭酸水素ナトリウムを１００ｍｇ添加し、３時間撹拌し、反応液に酢酸を加えて中和し、更に塩化ナトリウム２００ｍｇを添加して撹拌する。その反応液にエタノール１００ｍＬを加えて沈殿させ、沈殿を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃で一晩真空乾燥して本発明物質であるアセメタシン導入ヒアルロン酸を得ることができる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によりカルボキシル基に、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬が結合したヒアルロン酸誘導体の親水性を向上し、単離して固体としたヒアルロン酸誘導体の水性溶媒への溶解を容易とする方法が提供される。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for improving the hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative in which hyaluronic acid is bound to a carboxyl group at a carboxyl group and to a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronic acid is a polysaccharide formed by repeating β1,4 disaccharide units in which N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are linked by β1,3 bonds, and is composed of glycosaminoglycan. It is a kind. Hyaluronic acid has a weight average molecular weight of 10,000 to 30,000,000, but has extremely high hydrophilicity because each disaccharide unit has a carboxyl group and a large number of hydroxyl groups. It is possible to hold twice as much water. It is considered that the carboxyl group present in each disaccharide unit in the basic skeleton particularly greatly contributes to the high hydrophilicity exhibited by such hyaluronic acid.
[0003]
Examples of the derivative of hyaluronic acid obtained by modifying hyaluronic acid by binding a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group to the carboxyl group of hyaluronic acid include, for example, photoreactive hyaluronic acid (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. No. 143604). The photoreactive hyaluronic acid described in this prior art was in a dissolved state in the reaction solution.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, there has been a problem that the binding of a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group to the carboxyl group of hyaluronic acid causes a decrease in the hydrophilicity of hyaluronic acid. That is, a derivative of hyaluronic acid in which such a nucleophilic reagent is bonded to 0.05 or more carboxyl groups per disaccharide unit is gelled even if it is once isolated and solidified and then dissolved again in water. There was a problem that it became cloudy and did not completely dissolve.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the problem that when a carboxyl group of hyaluronic acid is bonded to a nucleophilic reagent capable of bonding to the carboxyl group, the resulting hyaluronic acid derivative has reduced hydrophilicity. As a result, by binding the nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group to hyaluronic acid and making the reaction solution alkaline, the hyaluronic acid derivative can be easily dissolved when dissolved again in water as a solid. The present inventors have discovered that a "hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity" can be obtained, and have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for producing a hyaluronic acid derivative comprising the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline to obtain a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity.
(2) The method for producing a hyaluronic acid derivative according to (1), further comprising the following steps.
Step C: a step of neutralizing the solution obtained in Step B.
(3) The method for producing a hyaluronic acid derivative according to (1) or (2), further comprising a step of isolating the hyaluronic acid derivative.
(4) A method for improving the hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative, comprising the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline to obtain a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity.
(5) The method for improving hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative according to (4), further comprising the following step.
Step C: a step of neutralizing the solution obtained in Step B.
(6) A hyaluronic acid derivative in which a carboxyl group of hyaluronic acid and a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group are bound, and the hyaluronic acid derivative in a solid state is dissolved in an aqueous solvent at 1.0% by weight. Aqueous solution obtained at a temperature of 24 ° C., 5.0 kg / cm 2 A hyaluronic acid derivative capable of passing 2 mL or more per minute through a porous filter (pore size (pore size) 0.45 μm and diameter 25 mm) under pressure.
(7) A hyaluronic acid derivative obtainable through the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of obtaining a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity by making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline.
Step C: neutralizing the solution obtained in Step B;
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the present invention.
(1) Production method of the present invention
The production method of the present invention is a method for producing a hyaluronic acid derivative comprising the following steps.
Step A: combining a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent (excluding a nucleophilic reagent containing a photoreactive group) in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution; A step of making the obtained hyaluronic acid derivative solution alkaline.
[0008]
The production method of the present invention includes a step (step A) of combining a carboxyl group of hyaluronic acid and a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution (aqueous solution). The origin of the hyaluronic acid used in the step A is not particularly limited. Hyaluronic acid can be used regardless of whether it is derived from an animal or a microorganism. The weight average molecular weight of hyaluronic acid is not particularly limited, and is, for example, 10,000 to 5,000,000, and preferably 20,000 to 3,000,000. The hyaluronic acid used in the production method of the present invention may be in a free state without forming a salt, or may be in a pharmaceutically acceptable salt state. The pharmaceutically acceptable salt of hyaluronic acid includes, for example, a salt with an alkali metal ion such as a sodium salt and a potassium salt, or a salt with an alkaline earth metal ion such as a magnesium salt and a calcium salt. When used as a medical material for applying a hyaluronic acid derivative to a living body, the affinity for the living body is particularly high. Are particularly preferred.
[0009]
The nucleophilic reagent in the production method of the present invention is a reagent called a nucleophile, and according to the Chemical Dictionary (published by Tokyo Chemical Dojin Co., Ltd.), "a reagent having a high affinity for the nucleus, ie, the electron-deficient reaction center. In general, some agents have a lone pair of electrons and have a negative charge, and when they attack another molecule to form a bond, they donate two bonding electrons. It is a reagent shown. " However, the "nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group" in the production method of the present invention is such a nucleophile, and further has an affinity for the carbon atom of the carboxyl group of hyaluronic acid, and forms a bond. Is a substance that has aggressiveness of donating an electron pair to the carboxyl group. Preferred examples of the "nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group" in the production method of the present invention include, for example, fluorescent labeling substances (4-aminofluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), etc.). , An amino acid (e.g., leucine, glycine, histidine, glutamine, phenylalanine, tranekimsan acid, etc.) or a derivative thereof (e.g., methyl ester, ethyl ester, benzyl ester, etc.), or an amino acid (leucine, etc.) bound with a spacer (e.g., aminoalkyl alcohol or alkylamine). Glycine, histidine, glutamine, phenylalanine, tranekimsanic acid, etc.) or polymers thereof (ie, peptides, proteins, etc. (eg, enkephalin, bradykinin, oxy Syndio, angiotensin, etc.), condensing agent (water-soluble carbodiimide (eg, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI.HCl), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide- Met-p-toluenesulfonate, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethylcarbodiimide hydrochloride, etc.), other pharmaceuticals (methotrexate, daunomycin, mitomycin C, cytosine arabinoside, adriamycin, bestatin, etc.) or spacer (amino) Pharmaceuticals (indomethacin, acemetacin, salazosulfapyridine, methotrexate, bestatin, etc.) and fatty acids (propionic acid, caproic acid, caprylic acid, lauri) bound with alkyl alcohol or alkyl diamine) Acid, palmitic acid, spacer-linked fatty acids spacers (aminoalkyl alcohol or alkyl diamine) is bonded to stearic acid) preferably exemplified.
[0010]
The molecular weight of these nucleophilic reagents is preferably from 100 to 15,000, and more preferably from 200 to 10,000. When a nucleophilic reagent having such a molecular weight is bonded to the carboxyl group of hyaluronic acid, the hydrophilicity of hyaluronic acid is reduced. In particular, the decrease in hydrophilicity is suppressed by the production method of the present invention. Is maintained.
[0011]
The photoreactive group having the property of being crosslinked by light is preferably excluded from the "nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group" used in the production method of the present invention. Here, the photoreactive group is a compound that causes a photodimerization reaction or a photopolymerization reaction by irradiation with ultraviolet light, and includes cinnamic acid, substituted cinnamic acid (for example, aminocinnamic acid (where one hydrogen of a benzene ring is an amino group) Is substituted by cinnamic acid)), acrylic acid, maleic acid, fumaric acid, sorbic acid, coumarin, thymine or derivatives thereof.
[0012]
The bond between hyaluronic acid and the nucleophilic reagent can be formed by, for example, a method using a water-soluble condensing agent such as a water-soluble carbodiimide, or a condensation aid such as N-hydroxysuccinimide (HOSu) or N-hydroxybenzotriazole (HOBt). A method using an agent and the above-mentioned condensing agent, an active ester method, an acid anhydride method and the like can be mentioned. Among these, as the reaction in the presence of the aqueous solvent, a method using a water-soluble condensing agent or a method using a reaction auxiliary and a water-soluble condensing agent is preferable. Such a bond between the carboxyl group of hyaluronic acid and the nucleophilic reagent is preferably formed by a carboxylic acid ester or acid amide bond. Accordingly, the nucleophilic reagent is most preferably a substance having a hydroxyl group for forming a carboxylic acid ester or an amino group for forming an acid amide in its structure. In addition, it goes without saying that a compound in which an amino group is introduced by binding a spacer such as the above-described aminoalkyl alcohol or alkyldiamine to a compound that does not originally have an amino group is also included in the nucleophilic reagent in the present invention. .
[0013]
The aqueous solvent in the production method of the present invention includes water, a water-miscible organic solvent, or a mixed solvent thereof. Examples of the water-miscible organic solvent include dioxane, dimethylformamide (DMF), acetone, alcohol (methanol, ethanol, and the like).
[0014]
In the present invention, the rate of introduction of a nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group into hyaluronic acid (which can be measured by a method such as absorbance measurement, amino acid analysis, or mass spectrometry) is 0.05 to 40%. , Preferably 0.1 to 30%, most preferably 0.3 to 25%. This is because a hyaluronic acid derivative having the specific properties of a nucleophilic reagent while maintaining the biocompatibility and water retention of hyaluronic acid can be obtained when the rate of introduction is within such a range. This value can be appropriately changed or adjusted by adjusting the number of moles of the hyaluronic acid to be reacted and the number of moles of the nucleophilic reagent.
[0015]
The production method of the present invention includes a step of subjecting a hyaluronic acid derivative to a reaction solution in a state of a reaction solution to make the reaction solution alkaline (alkali treatment) (step B). In the treatment for making the reaction solution alkaline in the step B, the base added to make the reaction solution alkaline is not particularly limited, and an organic base or a reaction solution having a property that the reaction solution becomes alkaline by adding to the reaction solution is added. Any inorganic base having the property of making the reaction solution alkaline by adding it can be used. However, considering the treatment in a reaction solution containing an aqueous solvent, an inorganic base is preferred from the viewpoint of stability. Among inorganic bases, inorganic bases, such as sodium hydroxide, which make the reaction solution strongly alkaline (pH 12 or more), such as sodium hydroxide, are less likely to affect the reduction of molecular weight of hyaluronic acid and the decomposition of nucleophilic reagents. Rather, an inorganic base, such as sodium hydrogen carbonate or sodium carbonate, that makes the reaction solution slightly alkaline is preferable. Here, the pH condition of the alkali treatment is, for example, 7.2 to 11, preferably 7.5 to 10.
[0016]
The amount of the base (organic base or inorganic base) used and the treatment time are appropriately adjusted in accordance with the desired degree of hydrophilicity (the presence or absence of filter passage described below is used as a criterion for determining the degree of hydrophilicity). . For example, when using 250 mg of sodium hydrogen carbonate (5 times the number of moles of hyaluronic acid) per 1 g of hyaluronic acid, 500 mg or more of sodium hydrogen carbonate (with respect to the number of moles of hyaluronic acid) for 4 to 6 hours. (10 times or more), a hyaluronic acid derivative having sufficiently enhanced hydrophilicity can be obtained by stirring for 2 to 4 hours.
[0017]
The solution of the hyaluronic acid derivative thus prepared is optionally neutralized with an organic acid (such as acetic acid) or an inorganic acid (such as hydrochloric acid) (Step C). Although it is possible to perform isolation and purification of the hyaluronic acid derivative without performing the neutralization, it is preferable to perform the neutralization. This is because the carboxyl group (having no nucleophilic reagent) in the hyaluronic acid derivative isolated by neutralization forms a salt and is excellent in stability.
[0018]
The production method of the present invention preferably includes a step of isolating the hyaluronic acid derivative from the solution after the alkaline treatment (or after the subsequent neutralization) (Step D or D ′). Isolation of the hyaluronic acid derivative can be performed by adding a polar organic solvent to the solution of the hyaluronic acid derivative. Here, as the polar organic solvent, for example, ethanol, methanol, acetone and the like are exemplified. In particular, when a hyaluronic acid derivative is used for a medical material or the like, ethanol is preferable. This is because ethanol has low toxicity to living organisms. When isolating the hyaluronic acid derivative, it is preferable to add a salt such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, or sodium acetate to the solution in advance. The salt is particularly preferably sodium chloride. This is because sodium chloride has a low effect on living organisms. The amount of salt added is 0.3% or more, preferably 0.5 to 10%, and most preferably 4 to 8% in final concentration. This is because the hyaluronic acid derivative can be efficiently isolated as a precipitate by the effect of salting out. However, the hyaluronic acid derivative can be isolated as a precipitate by using a nonpolar organic solvent such as ethanol regardless of the amount of the salt to be added.
[0019]
Each treatment such as ethanol washing and drying can be applied to the hyaluronic acid derivative obtained as a precipitate, if necessary.
[0020]
(2) Substance of the present invention
The substance of the present invention is a hyaluronic acid derivative in which a carboxyl group of hyaluronic acid and a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group are bonded, and the hyaluronic acid derivative in a solid state is dissolved in an aqueous solvent at 1.0% by weight. Aqueous solution obtained at a temperature of 24 ° C. under the condition of 5.0 kg / cm 2 A hyaluronic acid derivative characterized in that it can pass 2 ml or more per minute through a porous filter (pore size (pore size) 0.45 μm and diameter 25 mm) under pressure.
[0021]
The substance of the present invention is a hyaluronic acid derivative prepared by the production method of the present invention.
The chemical structure of the substance of the present invention is the same as that of the “derivative of hyaluronic acid to which a nucleophilic reagent is bound” before the alkali treatment by the production method of the present invention, but the higher-order structure (steric structure) is different. It is thought that it is. This difference can be grasped as a difference in physical properties.
[0022]
Therefore, the hyaluronic acid derivative which is the substance of the present invention is clearly distinguished from the conventional hyaluronic acid derivative by its physical property of having a high molecular dispersion property in an aqueous solution. The physical properties exhibiting the molecular dispersion characteristics include the permeability through a porous filter. The high permeability of the porous filter indicates the high molecular dispersion characteristics described above. The passability of the porous filter can be confirmed by comparing the concentration of the hyaluronic acid derivative in the aqueous solution before and after passing through the porous filter. When an aqueous solution of a hyaluronic acid derivative of the substance of the present invention is passed under the above conditions, there is no change in the concentration of the hyaluronic acid derivative in the aqueous solution before and after the passage.
[0023]
The hyaluronic acid in the substance of the present invention can be used, for example, whether it is derived from an animal or a microorganism. The weight average molecular weight of hyaluronic acid is not particularly limited, and is, for example, 10,000 to 5,000,000, and preferably 20,000 to 3,000,000. The hyaluronic acid in the substance of the present invention may be in a free state without forming a salt, or may be in a pharmaceutically acceptable salt state. The pharmaceutically acceptable salt of hyaluronic acid includes, for example, a salt with an alkali metal ion such as a sodium salt and a potassium salt, or a salt with an alkaline earth metal ion such as a magnesium salt and a calcium salt. When used as a medical material for applying a hyaluronic acid derivative to a living body, the affinity for the living body is particularly high. Are particularly preferred.
[0024]
The nucleophilic reagent in the substance of the present invention is a reagent called a nucleophile, and according to the Chemical Dictionary (published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), it is a reagent having a high affinity for the nucleus, ie, the electron-deficient reaction center. In general, some of them have an unshared electron pair and have a negative charge, and when they attack another molecule to form a bond, they donate two bonding electrons.In a broad sense, they behave as Lewis bases It is a reagent. " However, the "nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group" in the substance of the present invention is such a nucleophile, which further has an affinity for the carbon atom of the carboxyl group of hyaluronic acid, and It is a substance that has aggressiveness to donate an electron pair and, specifically, can bind to the carboxyl group. Preferred examples of the “nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group” in the production method of the present invention include, for example, fluorescent labeling substances (4-aminofluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), etc. ), Amino acids (e.g., leucine, glycine, histidine, glutamine, phenylalanine, tranekimsanoic acid) or derivatives thereof (e.g., methyl ester, ethyl ester, benzyl ester, etc.) and spacers (e.g., aminoalkyl alcohol or alkylamine) (e.g., leucine, Glycine, histidine, glutamine, phenylalanine, tranekimsanic acid, etc.) or polymer (peptide, protein, etc. (eg, enkephalin, bradykinin, oxytocin, angio) Carbodiimide (e.g., 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI.HCl), 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth- p-toluenesulfonate, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethylcarbodiimide hydrochloride, etc.), other physiologically active substances (methotrexate, daunomycin, mitomycin C, cytosine arabinoside, adriamycin, bestatin, etc.) or spacer (amino) Physiologically active substances (indomethacin, acemetacin, salazosulfapyridine, methotrexate, bestatin, etc.) and fatty acids (propionic acid, caproic acid, caprylic acid, lauric acid) bonded with alkyl alcohol or alkyl diamine) Palmitic acid, spacer-linked fatty acids spacers (aminoalkyl alcohol or alkyl diamine) is bonded to stearic acid) preferably exemplified.
[0025]
The molecular weight of these nucleophilic reagents is preferably from 100 to 15,000, and more preferably from 200 to 10,000. When a nucleophilic reagent having such a molecular weight is bonded to the carboxyl group of hyaluronic acid, the hydrophilicity of hyaluronic acid is reduced.In particular, the decrease in hydrophilicity of the substance of the present invention is suppressed, and the hydrophilicity inherent to hyaluronic acid is reduced. Because it is maintained.
[0026]
When such a nucleophilic reagent is simply bonded to the carboxyl group of hyaluronic acid, the hyaluronic acid derivative usually has extremely low hydrophilicity, and the hyaluronic acid derivative once in a solid state is sufficiently dissolved in water again. I will not. In particular, the above-mentioned permeability through the porous filter is extremely low. However, since the substance of the present invention includes a step of making the reaction solution alkaline in the production process (the production method of the present invention), the substance has extremely high permeability through a porous filter, and in this respect, it differs from a conventional hyaluronic acid derivative. Are clearly distinguished.
[0027]
Note that a nucleophilic reagent having a photoreactive group having a property of being crosslinked by light is excluded from the nucleophilic reagent in the substance of the present invention. Here, the photoreactive group is a compound that causes a photodimerization reaction or a photopolymerization reaction by irradiation with ultraviolet light, and includes cinnamic acid, substituted cinnamic acid (for example, aminocinnamic acid (where one hydrogen of a benzene ring is an amino group) Is substituted by cinnamic acid)), acrylic acid, maleic acid, fumaric acid, sorbic acid, coumarin, thymine or derivatives thereof.
[0028]
The reaction between the carboxyl group of hyaluronic acid and the nucleophile is a covalent bond, and among them, an acid ester bond or an acid amide bond is particularly preferable.
[0029]
The rate of introduction of a nucleophilic reagent into hyaluronic acid in the substance of the present invention (can also be measured by a known method such as measurement of absorbance, amino acid analysis, or mass spectrometry) is 0.05 to 40%, preferably 0 to 40%. 0.1-30%, most preferably 0.3-25%. This is because a hyaluronic acid derivative having the specific properties of a nucleophilic reagent while maintaining the biocompatibility and water retention of hyaluronic acid can be obtained when the rate of introduction is within such a range. This value can be appropriately changed or adjusted by adjusting the number of moles of the hyaluronic acid to be reacted and the number of moles of the nucleophilic reagent.
[0030]
Among such substances of the present invention, the substance of the present invention to which a fluorescent labeling substance is bound as a nucleophilic reagent is particularly useful for observing and tracking in vivo metabolism of hyaluronic acid or a medical or medical material using the same. It can be used as a marker. The substance of the present invention to which a physiologically active substance, a peptide, a protein, or the like is bound as a nucleophilic reagent can be used as a medical material such as a sustained-release preparation. For example, the substance of the present invention obtained by binding an analgesic such as indomethacin to a carboxyl group of hyaluronic acid as a physiologically active substance is an excellent medical material having a lubricating action and an analgesic action by being administered to a sealed environment such as a joint. It is possible to use.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
Test example
Filter passage test
A 5 mM phosphate buffered saline in which a test substance is dissolved at 1.0% by weight is prepared. The solution of the test substance prepared above was passed through a porous filter (pore diameter: 0.45 μm, diameter: 25 mm) under a pressure of 5.0 kg / cm 2 at 24 ° C., and the amount of currency (ml) per minute was measured. I do. The symbol “○” indicates the case of passing 2 ml or more, “△” indicates the case of passing less than 2 ml, and “×” indicates the case of not passing.
[0032]
Example 1
4-Aminofluorescein-introduced hyaluronic acid
After dissolving 1.0 g (2.5 mmol / disaccharide unit) of hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 150 mL of water / 75 mL of dioxane, 3.0 mmol of N-hydroxysuccinimide / 1 mL of water, EDCI · HCl 1.5 mmol / Water 1 mL, 4-aminofluorescein 1.5 mmol / water 1 mL were sequentially added, and the mixture was stirred overnight.
[0033]
(1) Preparation of control (prepared without alkali treatment)
22.5 mL was withdrawn from the above reaction solution, 100 mg of sodium chloride was added, and the mixture was stirred and precipitated by adding to 50 mL of ethanol. The precipitate was washed four times with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried under vacuum at 40 ° C. overnight. did. 81 mg of an orange solid were obtained. The rate of introduction of 4-aminofluorescein into the carboxyl group was calculated from the absorbance and found to be 0.3%.
[0034]
(2) Preparation of test substance (prepared by alkali treatment)
500 mg of sodium hydrogencarbonate was added to the remaining reaction liquid extracted from 22.5 mL of (1), and the mixture was stirred for 4 hours and 30 minutes. Acetic acid was added to the reaction solution for neutralization, and then 6.0 g of sodium chloride was added and stirred. The precipitate was added to 500 mL of ethanol and precipitated. The precipitate was washed four times with 80% ethanol and three times with ethanol, and dried in vacuo at 40 ° C. overnight. 830 mg of an orange solid were obtained. The introduction ratio of 4-aminofluorocein into the carboxyl group was 0.3%.
[0035]
(3) Examination of filter passability
For the control substance and the test substance obtained in the above (1) and (2), the filter permeability was examined by the method described in the test examples. As a result, the control substance was a fibrous insoluble substance, but the test substance was a clear solution. The control did not pass through the filter at all, but the test substance passed through the filter easily (Table 1).
[0036]
[Table 1]
Table 1
Example 2
Leucine methyl ester-introduced hyaluronic acid
After dissolving 400 mg (1.0 mmol / disaccharide unit) of hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in water 60 mL / dioxane 30 mL, N-hydroxysuccinimide 0.6 mmol / water 2 mL, EDCI · HCl 0.3 mmol / water 2 mL and leucine methyl ester hydrochloride 0.3 mmol / water 2 mL were sequentially added, followed by stirring for 2 hours and 30 minutes.
[0038]
(1) Preparation of control (prepared without alkali treatment)
45 mL was withdrawn from the above reaction solution, 1.2 g of sodium chloride was added, and the mixture was stirred and precipitated by adding to 100 mL of ethanol. The precipitate was washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuo at 40 ° C. overnight. did. 150 mg of an orange solid were obtained. The introduction ratio of leucine ethyl ester was 20.9%.
[0039]
(2) Preparation of test substance (prepared by alkali treatment)
200 mg of sodium hydrogencarbonate was added to the remaining reaction liquid extracted from 45 mL of (1), and the mixture was stirred for 2 hours and 40 minutes. Acetic acid was added to the reaction solution for neutralization, and then 2.4 g of sodium chloride was added and stirred. The precipitate was added to 100 mL of ethanol and precipitated. The precipitate was washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuo at 40 ° C. overnight. 247 mg of an orange solid were obtained. The introduction ratio of leucine ethyl ester was 20.9%.
[0040]
(3) Examination of filter passability
The filter substances of the control substance and the test substance were examined by the method described in the test examples. As a result, the control substance was a fibrous insoluble substance, but the test substance was a clear solution. The control did not pass through the filter at all, but the test substance passed through the filter easily (Table 2).
[0041]
[Table 2]
Table 2
Example 3
Water-soluble carbodiimide-introduced hyaluronic acid
400 mg (1.0 mmol / disaccharide unit) of hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 was dissolved in 60 mL of water, and adjusted to pH 4.75 with 0.1 N hydrochloric acid. EDCI · HCl 1.0 mmol / water 2 mL was added and the mixture was stirred for 2 hours and 15 minutes.
[0043]
(1) Preparation of control (prepared without alkali treatment)
30 mL was withdrawn from the above reaction solution, 1.2 g of sodium chloride was added and stirred, and 150 mL of ethanol was added for precipitation. The precipitate was washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuo at 40 ° C. for 10 hours. did. 169 mg of a white solid were obtained.
[0044]
(2) Preparation of test substance (prepared by alkali treatment)
4 mL of a 3% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to the remaining reaction liquid extracted from 30 mL of (1), and the mixture was stirred for 3 hours. After acetic acid was added to the reaction solution to neutralize it, 1.3 g of sodium chloride was added and stirred. 200 mL of ethanol was added for precipitation, and the precipitate was washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuum at 40 ° C. for 10 hours. 164 mg of a white solid were obtained.
[0045]
(3) Examination of filter passability
The filter substances of the control substance and the test substance were examined by the method described in the test examples. As a result, the control substance was a fibrous insoluble substance, but the test substance was a clear solution. The control did not pass through the filter at all, but the test substance passed through the filter easily (Table 3).
[0046]
[Table 3]
Table 3
Example 4
Synthesis of various substances of the present invention
(1) Indomethacin-introduced hyaluronic acid
Hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 was dissolved in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, and then 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous solution of EDCI / HCl, and separately prepared by binding aminoalkyl alcohol and indomethacin. 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M of aminoalkyl alcohol-bound indomethacin is sequentially added, and the mixture is stirred and reacted.
[0048]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction mixture is precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuum at 40 ° C. overnight to obtain indomethacin-introduced hyaluronic acid as the substance of the present invention. Can be.
[0049]
(2) Glutamine-introduced hyaluronic acid
After dissolving 200 mg (0.5 mmol / disaccharide unit) of hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous EDCI / HCl solution, and 0.1 μL of a 0.1 M aqueous solution. 500 μL of a 5M glycine hydrochloride aqueous solution is sequentially added, and the mixture is stirred overnight.
[0050]
200 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. Acetic acid is added to the reaction solution to neutralize it, 200 mg of sodium chloride is added thereto, and the mixture is stirred, added to 100 mL of ethanol and precipitated to obtain a precipitate. The precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried under vacuum at 40 ° C. overnight to obtain glutamine-introduced hyaluronic acid of the present invention as 176 mg of a white solid. When the introduced glycine was measured by amino acid analysis, the introduction rate was 2.4%.
[0051]
(3) Methotrexate-introduced hyaluronic acid
After dissolving 100 mg (0.25 mmol / disaccharide unit) of hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 15 mL of water / 7.5 mL of dioxane, 1 mL of a 0.2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 0.1 M EDCI · 1 mL of an aqueous HCl solution and 1 mL of dimethylformamide containing 0.1 M methotrexate are sequentially added, and the mixture is stirred for 24 hours.
[0052]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. Acetic acid is added to the reaction solution to neutralize it, 100 mg of sodium chloride is added thereto, and the mixture is stirred and added to 100 mL of ethanol for precipitation to obtain a precipitate. The precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried under vacuum at 40 ° C. overnight to obtain 100.4 mg of a methotrexate-introduced hyaluronic acid, which is a substance of the present invention, as a white solid. The methotrexate introduction rate calculated from the absorbance is 17.4%.
[0053]
(4) Daunomycin-introduced hyaluronic acid
After dissolving hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous solution of EDCI / HCl, and 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M daunomycin are sequentially added. And react with stirring.
[0054]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction solution is precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried under vacuum at 40 ° C. overnight to obtain the daunomycin-introduced hyaluronic acid of the present invention. it can.
[0055]
(5) Mitomycin C-introduced hyaluronic acid
After dissolving hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous EDCI / HCl solution, and 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M mitomycin C are sequentially added. Add and stir to react.
[0056]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction mixture is precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and vacuum-dried at 40 ° C. overnight to obtain the mitomycin C-introduced hyaluronic acid of the present invention. Can be.
[0057]
(6) Salazosulfapyridine-introduced hyaluronic acid
After dissolving hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous EDCI / HCl solution, and separately bonding aminoethyl alcohol and salazosulfapyridine 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M of the aminoethyl alcohol-bound salazosulfapyridine prepared in this manner is added in sequence, and the mixture is stirred and reacted.
[0058]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction solution was precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate was washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and vacuum-dried at 40 ° C. overnight to remove the salazosulfapyridine-introduced hyaluronic acid of the present invention. Obtainable.
[0059]
(7) Propionic acid-introduced hyaluronic acid
Hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 is dissolved in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, and then 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous solution of EDCI / HCl, and separately activated with EDCI / HCl to obtain ethylenediamine and propion 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M of ethylenediamine-bonded propionic acid prepared by bonding with an acid is sequentially added, and the mixture is stirred and reacted.
[0060]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction solution is precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried in vacuum at 40 ° C. overnight to obtain the propionic acid-introduced hyaluronic acid of the present invention. Can be.
[0061]
(8) Acemethasin-introduced hyaluronic acid
Hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 900,000 is dissolved in 30 mL of water / 15 mL of dioxane, and then 250 μL of a 2 M aqueous solution of N-hydroxysuccinimide, 250 μL of a 1 M aqueous solution of EDCI / HCl, and separately prepared by combining aminoalkyl alcohol and acemethasin. 2 mL of dimethylformamide containing 0.5 M of the thus obtained aminoalkyl alcohol-bonded acemethasin is sequentially added, and the mixture is stirred and reacted.
[0062]
100 mg of sodium hydrogen carbonate is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for 3 hours. The reaction solution is neutralized by adding acetic acid, and 200 mg of sodium chloride is further added and stirred. The reaction solution is precipitated by adding 100 mL of ethanol, and the precipitate is washed twice with 80% ethanol and twice with ethanol, and dried under vacuum at 40 ° C. overnight to obtain the acemethacin-introduced hyaluronic acid of the present invention. it can.
[0063]
【The invention's effect】
According to the present invention, a method for improving the hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative in which a nucleophilic reagent capable of binding to a carboxyl group is bonded to a carboxyl group and facilitating dissolution of the isolated and solid hyaluronic acid derivative in an aqueous solvent. Is provided.
Claims (7)
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。A method for producing a hyaluronic acid derivative, comprising the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline to obtain a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity.
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。The method for producing a hyaluronic acid derivative according to claim 1, further comprising the following steps.
Step C: a step of neutralizing the solution obtained in Step B.
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基と結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として、親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程。A method for improving the hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative, comprising the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline to obtain a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity.
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。The method for improving hydrophilicity of a hyaluronic acid derivative according to claim 4, further comprising the following steps.
Step C: a step of neutralizing the solution obtained in Step B.
工程Ａ：ヒアルロン酸のカルボキシル基と、カルボキシル基に結合しうる求核性試薬とを水性溶媒中で反応させてヒアルロン酸誘導体溶液を得る工程；
工程Ｂ：工程Ａで得たヒアルロン酸誘導体溶液をアルカリ性として親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の溶液を得る工程；
工程Ｃ：工程Ｂで得た溶液を中和する工程。A hyaluronic acid derivative obtainable through the following steps.
Step A: a step of reacting a carboxyl group of hyaluronic acid with a nucleophilic reagent capable of binding to the carboxyl group in an aqueous solvent to obtain a hyaluronic acid derivative solution;
Step B: a step of obtaining a solution of the hyaluronic acid derivative having improved hydrophilicity by making the hyaluronic acid derivative solution obtained in Step A alkaline.
Step C: a step of neutralizing the solution obtained in Step B.
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