JP2004018729A - Novel polyhydroxyalkanoate copolymer containing unit having ester group in side chain in molecule, and its preparation process - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体と、微生物を利用するその製造方法に関し、より具体的には、構成ユニットとして、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニット、及びフェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造のいずれかの構造を有する残基を含む３−ヒドロキシアルカン酸ユニットとを同時に分子中に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体と、ジカルボン酸モノエステル化合物と、フェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造のいずれかの構造を有する残基を含むアルカン酸とを原料として、当該ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の産生能を有する微生物を利用し、構成ユニットとして、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシーアルカン酸ユニット、及びフェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造のいずれかの構造を有する残基を含む３−ヒドロキシアルカン酸ユニットとを同時に分子中に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、多くの微生物が、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産し、その菌体内に蓄積することが報告されている（「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，Ｐ１７８−１９７（１９９５））。これらＰＨＡなどの微生物が産生するポリマーは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、微生物が産生するポリマー、例えば、ＰＨＡなどは、生分解性を有しており、自然界の微生物により完全分解されるという利点を有している。従って、例えば、微生物が産生するＰＨＡは、廃棄した際、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境にそのまま残留し、汚染を引き起こす要因となることがない。また、微生物が産生するＰＨＡは、一般に生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
この微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類、ならびに、培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることも知られている。これまで、主にＰＨＡの物性の改良という観点から、微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を試みる研究がなされてきた。
【０００４】
微生物産生ＰＨＡの組成や構造の制御を目的とする研究の一つとして、近年、ユニット中に芳香環を有するＰＨＡを微生物に生産させる研究が盛んになされている。
【０００５】
Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６５（１９９０）及びＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，５２５６−５２６０（１９９１）には、５−フェニル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００６】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，１７６２−１７６６（１９９６）には、５−（ｐ−トリル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（ｐ−トリル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００７】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２，２８８９−２８９５（１９９９）には、５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸ユニット、及び３−ヒドロキシ−５−（ｐ−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【０００８】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９５，１６６５−１６７２（１９９４）には、１１−フェノキシウンデカン酸を基質として、シュードモナスオレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡコポリマーを生産することが報告されている。
【０００９】
特許掲載公報第２９８９１７５号には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐ）ユニット、あるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエート（３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐ）ユニットからなるホモポリマー；少なくとも、３Ｈ５（ＭＦＰ）Ｐユニットあるいは３Ｈ５（ＤＦＰ）Ｐユニットを含有するコポリマー；これらのポリマーの産生能を有するシュードモナス・プチダ；シュードモナス属を用いた、前記のポリマーの製造法に関する発明が開示されている。加えて、その発明の効果として、置換基を有する長鎖脂肪酸を資化して、側鎖末端に、１から２個のフッ素原子が置換したフェノキシ基をもつポリマーを合成することができ、また、かかるポリマーは、融点が高い上、良い加工性を保持しつつ、加えて、立体規則性、撥水性を与えることができる点を記載している。
【００１０】
このユニット中の芳香環上にフッ素置換を有するフッ素置換ＰＨＡ以外に、ユニット中の芳香環上にシアノ基やニトロ基が置換したＰＨＡの研究もなされている。
【００１１】
Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，３２−４３（１９９５）及びＰｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３９，２０５−２１３（１９９６）には、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２９３４７株及びシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４２株を用いて、オクタン酸と６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸を基質として、３−ヒドロキシ−６−（ｐ−シアノフェノキシ）ヘキサン酸あるいは３−ヒドロキシ−６−（ｐ−ニトロフェノキシ）ヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの生産が報告されている。
【００１２】
これら環状に置換基を持つ芳香環を有するユニットを含むＰＨＡは、融点が高く、加工性も良いという、芳香環に由来するポリマー性状を維持しつつ、芳香環上に存在している置換基に由来する新たな機能も付与された、多機能のＰＨＡとなる。
【００１３】
また、その一方で、ユニット中にエステル基を有するＰＨＡを基に、多機能のＰＨＡを得ることを目的とした研究も盛んに行われている。
【００１４】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９５，１４０５−１４２１（１９９４）には、ポリヒドロキシアルカノエート生産微生物としてシュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を用いて、アルカン酸エステルを原料として側鎖にエステル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの生産が生産されたと報告されている。
【００１５】
また、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ｏｒｄｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ ９１３２８７５（１９９１）には、同じくシュードモナス オレオボランスを生産微生物として、側鎖にベンジルエステル構造を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートが生産されたと報告されている。
【００１６】
その他、側鎖にエステル基を有するユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法としては、ポリリンゴ酸誘導体の報告が多数ある。
【００１７】
米国特許第４，２６５，２４７号には、エステル基を有するラクトン化合物を開環重合による、側鎖にエステル基を有するポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が開示されている。
【００１８】
また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，２５５−２６４（１９９９）には、側鎖にベンジルエステル構造及びアンモニウム塩構造を有するポリヒドロキシアルカノエートを、やはりラクトン化合物の開環重合によりの製造する方法が報告されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
この様な側鎖のエステル構造は、水素添加反応によりカルボキシル基に変換することが可能であり、その後の化学修飾等で様々な物理化学的性質を有するポリヒドロキシアルカノエートを創製することが可能であるが、ガラス転移温度が低い等の問題点があり、また、ポリマー自身の疎水性等を制御することも困難であり、この様な原因がこの種のポリマーの応用範囲を制限していた。この様なことから、ユニット中にエステル基を有するＰＨＡであって、ポリマーとしての応用範囲を広げ得るような、熱的に安定な、更には物性を任意に制御し得るようなＰＨＡそのもの、及びその製造方法が求められていた。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結果、以下のような発明に至った。即ち、本発明は、化学式（１）：
【００２１】
【化３６】
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシーアルカン酸ユニットと、化学式（２）：
【００２２】
【化３７】
で示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体である。
【００２３】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体は、前記化学式（２）で示すユニットにおけるＲ’、即ちフェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造を有する残基が、
化学式（３）：
【００２４】
【化３８】
化学式（４）：
【００２５】
【化３９】
化学式（５）：
【００２６】
【化４０】
化学式（６）：
【００２７】
【化４１】
化学式（７）：
【００２８】
【化４２】
化学式（８）：
【００２９】
【化４３】
化学式（９）：
【００３０】
【化４４】
化学式（１０）：
【００３１】
【化４５】
化学式（１１）：
【００３２】
【化４６】
であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体とすることができる。
【００３３】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体は、前記化学式（１）に示す末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットが、
【００３４】
【化４７】
化学式（１３）：
【００３５】
【化４８】
化学式（１４）：
【００３６】
【化４９】
【００３７】
なお、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体はその数平均分子量が１０００から１００００００の範囲であるポリヒドロキシアルカノエート共重合体とすることができる。
また本発明は、化学式（１５）：
【００３８】
【化５０】
に示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び
化学式（１６）：
【００３９】
【化５１】
で示す化合物とを含む条件下で、化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物及び化学式（１６）で示す化合物を原料として、化学式（１）：
【００４０】
【化５２】
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシーアルカン酸ユニットと、化学式（２）：
【００４１】
【化５３】
で示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体を生産する能力を有する微生物により生合成せしめることを特徴とする、化学式（１）：
【００４２】
【化５４】
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットと、
化学式（２）：
【００４３】
【化５５】
で示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法である。
【００４４】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（２）及び（１６）におけるＲ’、即ちフェニル構造、チエニル構造、シクロヘキシル構造を有する残基が、
化学式（３）：
【００４５】
【化５６】
化学式（４）：
【００４６】
【化５７】
【００４７】
【化５８】
化学式（６）：
【００４８】
【化５９】
化学式（７）：
【００４９】
【化６０】
化学式（８）：
【００５０】
【化６１】
化学式（９）：
【００５１】
【化６２】
化学式（１０）：
【００５２】
【化６３】
化学式（１１）：
【００５３】
【化６４】
であることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００５４】
更に本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）に示すジカルボン酸モノエステル化合物が、
化学式（１７）：
【００５５】
【化６５】
前記化学式（１）に示す末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットが
化学式（１２）：
【００５６】
【化６６】
化学式（１３）：
【００５７】
【化６７】
【００５８】
更にまた本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）に示すジカルボン酸モノエステル化合物が、
化学式（１８）：
【００５９】
【化６８】
前記化学式（１）に示す末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットが
化学式（１３）：
【００６０】
【化６９】
化学式（１４）：
【００６１】
【化７０】
【００６２】
更に、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物とを含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６３】
更に詳細には、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、ペプチド類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。この場合、培地中に含める前記ペプチド類として、ポリペプトンを用いることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６４】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、酵母エキスをも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６５】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、有機酸或いはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。この場合、培地中に含める前記有機酸或いはその塩として、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、ならびにこれら有機酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６６】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、アミノ酸或いはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とする請求項７に記載のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。この場合、培地中に含める前記アミノ酸或いはその塩として、グルタミン酸、アスパラギン酸、ならびにこれらアミノ酸の塩からなる群より選択される１つ以上を用いることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６７】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、糖類をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とする請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。この場合、培地中に含める前記糖類として、グリセロアルデヒド、エリトロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースからなる群より選択される１つ以上の選ばれる１つ以上の糖類を用いることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００６８】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法は、前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物に加えて、炭素数４から１２の直鎖アルカン酸或いはその塩をも含む培地中で、前記微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法することができる。
【００６９】
【発明の実施の形態】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法における微生物の培養条件の詳細は、以下のとおりである。
【００７０】
リン酸緩衝液及びアンモニウム塩或いは硝酸塩を基本とした無機塩培地に、以下に示すように種々の必要基質及び栄養素を加える。
【００７１】
目的とするポリヒドロキシアルカノエートを生産するための基質として前記化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び前記化学式（１６）で示す化合物を培地あたりそれぞれ０．０１％から１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０２％から０．２％の割合で含有していることが望ましい。
【００７２】
微生物増殖のための炭素源及び窒素源、ポリヒドロキシアルカノエート生産のためのエネルギー供給源として加える上記の共存基質濃度は、通常培地あたり０．１％から５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２％から２％の割合で含有していることが望ましい。
【００７３】
本発明で用いる培地としては、リン酸塩及びアンモニウム塩或いは硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地ならいかなる培地でも良いが、窒素源の濃度を調節することでＰＨＡの生産性を向上せしめることが可能である。
【００７４】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、１５℃から３７℃、更に好ましくは２０℃から３０℃程度が適当である。
【００７５】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【００７６】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積せしめる方法としては、上に示した方法の他に、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。
【００７７】
更に本発明の製造方法においては、上記のような条件下で前記微生物を培養し、前記微生物が産生した前記化学式（１）で示す３−ヒドロキシ−ジカルボン酸モノエステル化合物ユニット、及び前記化学式（２）で示すユニットを同時に分子中に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体を微生物細胞から回収する工程を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法とすることができる。
【００７８】
微生物細胞から目的のＰＨＡを回収する方法としては、通常行なわれている方法を適用することができる。例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトンなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、それ以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、次亜塩素酸塩、アンモニア、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理、或いは超音波破砕法、ホモジナイザー法、圧力破砕法、ビーズ衝撃法、摩砕法、擂潰法、凍結融解法のいずれかの方法を用いて微生物細胞を物理的に破砕することによって、ＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００７９】
本発明の製造方法で用いる前記微生物としては、前記条件を満たす能力を有する微生物であれば如何なる微生物でも良いが、その中でも特にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が望ましく、更に詳しくはシュードモナス チコリアイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓｅ）、シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ）等が望ましい。更に詳しくは、さらに詳しくは、シュードモナス チコリアイ ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２；ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス チコリアイ Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス ジェッセニイ Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）、シュードモナス プチダ Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）が挙げられる。これら４種の微生物は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、特開２００１−２８８２５６号公報にされている微生物である。
【００８０】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【００８１】
本発明の一方法に用いた無機塩培地（Ｍ９培地）の組成を以下に示す。
【００８２】
［Ｍ９培地］
Ｎａ２ＨＰＯ４ ：６．３
ＫＨ２ＰＯ４ ：３．０
ＮＨ４Ｃｌ ：１．０
ＮａＣｌ ：０．５
ｇ／Ｌ、ｐＨ＝７．０
【００８３】
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加する必要がある。
【００８４】
［微量成分溶液］
ニトリロ 三酢酸：１．５；ＭｇＳＯ４：３．０ ；ＭｎＳＯ４：０．５ ；ＮａＣｌ：１．０ ；ＦｅＳＯ４：０．１ ；ＣａＣｌ２：０．１ ；ＣｏＣｌ２：０．１ ；ＺｎＳＯ４：０．１ ；
ＣｕＳＯ４：０．１ ；ＡｌＫ（ＳＯ４）２：０．１ ；Ｈ３ＢＯ３：０．１ ； Ｎａ２ＭｏＯ４：０．１；
ＮｉＣｌ２：０．１ ｇ／Ｌ
【００８５】
【実施例】
［実施例１］
前記Ｍ９培地１０００ｍＬに、ポリペプトン（和光純薬）５．０ｇ、及び５−フェニル吉草酸、セバシン酸モノメチルエステルをそれぞれ最終濃度４ｍｍ、１ｍｍになるよう添加し、２０００ｍＬ容振とうフラスコに入れてオートクレーブにより滅菌した後室温まで冷却した。調製した培地中に、予めポリペプトン０．５％を含むＭ９培地で３０℃、８時間振とう培養したシュードモナス チコリアイ ＹＮ２株の培養液を５ｍＬ加え、３０℃、４０時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後凍結乾燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、５０℃で４８時間攪拌することによりポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥して、目的とするポリマーを得た。
【００８６】
得られたポリマーの構造決定は、以下のメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行った。即ち、ポリマー５ｍｇを２ｍＬのクロロホルムに溶解し、更に２ｍＬのメタノール−３％硫酸溶液を加え、１００℃で３時間半還流反応を行った。反応終了後室温まで冷却し、脱イオン水を１０ｍＬ加えて攪拌分液し、有機層を硫酸マグネシウム（無水）で脱水した後、反応液をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ／ＭＳ；ＳｈｉｍａｄｚｕＱＰ−５０５０Ａ：カラム：ＤＢ−ＷＡＸＥＴＲ ０．３２ｍｍ×３０ｍ）で測定を行った。そのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を図１に示す。メインピークとして３５．６分、３８．０分、４５．８分の３本が見られた。３５．６分のピークのマススペクトル（ＭＳ）を図２に、３８．０分のピークのＭＳを図３に、４５．８分のピークのＭＳを図４にそれぞれ示す。
その結果、３５．６分のピークは化学式（１３）：
【００８７】
【化７１】
【００８８】
【化７２】
【００８９】
【化７３】
ポリマーの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した（東ソー ＨＬＣ−８２２０ ＧＰＣ、カラム：東ソー ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳｕｐｅｒＨＭ−Ｈ、溶媒：クロロホルム、ポリスチレン換算）。
得られたポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。また、得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表１に示す。
【００９０】
【表１】
［実施例２］
実施例１で用いたＹＮ２株をシュードモナス ジェッセニイ Ｐ１６１株に変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【００９２】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１３）：
【００９３】
【化７４】
【００９４】
【化７５】
【００９５】
【化７６】
【００９６】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【００９７】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表２に示す。
【００９８】
【表２】
［実施例３］
実施例１で用いたＹＮ２株をシュードモナス チコリアイ Ｈ４５株に変更し、ポリペプトンを酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）に変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【０１００】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１３）：
【０１０１】
【化７７】
【０１０２】
【化７８】
【０１０３】
【化７９】
【０１０４】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【０１０５】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表３に示す。
【０１０６】
【表３】
［実施例４］
実施例１で用いたＹＮ２株をシュードモナス プチダ Ｐ９１株に変更し、ポリペプトンをｎ−ノナン酸（キシダ化学；濃度０．１％）に変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【０１０８】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１３）：
【０１０９】
【化８０】
【０１１０】
【化８１】
【０１１１】
【化８２】
【０１１２】
【化８３】
【０１１３】
【化８４】
【０１１４】
【化８５】
【０１１５】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【０１１６】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表４に示す。
【０１１７】
【表４】
［実施例５］
実施例１で用いたポリペプトンをＤ−グルコース（キシダ化学）に変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【０１１９】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１３）：
【０１２０】
【化８６】
【０１２１】
【化８７】
【０１２２】
【化８８】
【０１２３】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【０１２４】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表５に示す。
【０１２５】
【表５】
［実施例６］
実施例１で用いたポリペプトンをピルビン酸ナトリウム（キシダ化学）に変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【０１２７】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１３）：
【０１２８】
【化８９】
【０１２９】
【化９０】
【０１３０】
【化９１】
【０１３１】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【０１３２】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表６に示す。
【０１３３】
【表６】
［実施例７］
実施例１で用いたポリペプトンをＬ−グルタミン酸ナトリウム（キシダ化学）に変更し、ポリマー合成のための基質の一つであるセバシン酸モノメチルエステルをスベリン酸モノメチルエステルに変更した以外は実施例１と同様の方法で、目的とするポリマーを得た。
【０１３５】
得られたポリマーの構造決定を、実施例１と同様にメチル化分解−ＧＣ／ＭＳ法を用いて行ったところ、本ポリマーは化学式（１４）：
【０１３６】
【化９２】
【０１３７】
【化９３】
【０１３８】
【化９４】
【０１３９】
ポリマーの分子量は、実施例１と同様にＧＰＣにより測定した。
【０１４０】
得られた菌体及びポリマーの重量、菌体あたりのポリマー重量比、得られたポリマーの分子量及び分子量分布を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
【発明の効果】
本発明の方法により、新規ポリヒドロキシアルカノエート共重合体である、側鎖にエステル構造を有するユニットと、側鎖にフェニル構造、チオフェン構造、シクロヘキシル構造を有する残基を含むユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体及びその製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で取得されたポリエステルメチル化分解物のＧＣ−ＭＳ ＴＩＣスペクトルを示す。
【図２】実施例１で取得されたポリエステルメチル化分解物の化学式（１３）に示すユニットに由来するピークのマススペクトルを示す。
【図３】実施例１で取得されたポリエステルメチル化分解物の化学式（１９）に示すユニットに由来するピークのマススペクトルを示す。
【図４】実施例１で取得されたポリエステルメチル化分解物の化学式（１２）に示すユニットに由来するピークのマススペクトルを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a polyhydroxyalkanoate copolymer containing a novel unit and a method for producing the same using a microorganism. More specifically, a 3-hydroxy-alkanoic acid unit having a terminal ester structure as a constituent unit And a phenyl structure, a thienyl structure, a polyhydroxyalkanoate copolymer simultaneously containing a 3-hydroxyalkanoic acid unit containing a residue having any of the structures of a cyclohexyl structure in a molecule, and a dicarboxylic acid monoester compound, Phenyl structure, thienyl structure, and alkanoic acid containing a residue having any structure of cyclohexyl structure as a raw material, using a microorganism capable of producing the polyhydroxyalkanoate copolymer, as a constituent unit, at the terminal 3-hydroxy-alkanoic acid having an ester structure Knit, and a phenyl structure, a thienyl structure, a method of manufacturing a polyhydroxyalkanoate copolymer comprising at the same time in the molecule and a 3-hydroxyalkanoic acid unit containing a residue having the structure of any of cyclohexyl structure.
[0002]
[Prior art]
Many microorganisms have been reported to produce and accumulate poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) or other poly-3-hydroxyalkanoates (PHA) in their cells ("Biodegradation"). Plastic Handbook ", edited by Biodegradable Plastics Study Group, NTT Co., Ltd., pp. 178-197 (1995)). These polymers produced by microorganisms such as PHA can be used for production of various products by melt processing or the like, similarly to conventional plastics. Furthermore, polymers produced by microorganisms, such as PHA, are biodegradable and have the advantage of being completely degraded by microorganisms in nature. Therefore, for example, when the PHA produced by the microorganism is discarded, it does not remain in the natural environment as in many conventional synthetic polymer compounds and does not become a factor causing pollution. In addition, PHA produced by microorganisms is generally excellent in biocompatibility and is expected to be applied as a medical soft member or the like.
[0003]
It is also known that this microorganism-produced PHA can have various compositions and structures depending on the type of microorganism used for its production, as well as the medium composition, culture conditions, and the like. Until now, mainly from the viewpoint of improving the physical properties of PHA, studies have been made to try to control the composition and structure of microbial PHA.
[0004]
As one of the studies aimed at controlling the composition and structure of a microorganism-produced PHA, studies on producing a PHA having an aromatic ring in a unit by a microorganism have been actively conducted in recent years.
[0005]
Makromol. Chem. , 191, 1957-1965 (1990) and Macromolecules, 24,5256-5260 (1991), using 5-phenylvaleric acid as a substrate and Pseudomonas oleovorans as a unit of 3-hydroxy-5-phenylvaleric acid. It has been reported to produce PHA containing
[0006]
In Macromolecules, 29, 1762-1766 (1996), PHA containing 5- (p-tolyl) valeric acid as a substrate and Pseudomonas oleovorans containing a 3-hydroxy-5- (p-tolyl) valeric acid unit was used. Has been reported to produce.
[0007]
Macromolecules, 32, 2889-2895 (1999) discloses that Pseudomonas oleovorans is 3-hydroxy-5- (2,4-dinitrophenyl) using 5- (2,4-dinitrophenyl) valeric acid as a substrate. It has been reported to produce PHA containing a valeric acid unit and a 3-hydroxy-5- (p-nitrophenyl) valeric acid unit.
[0008]
Macromol. Chem. Phys. , 195,1665-1672 (1994), Pseudomonas oleovorans using 3-hydroxy-5-phenoxyvaleric acid unit and 3-hydroxy-9-phenoxynonanoic acid using 11-phenoxyundecanoic acid as a substrate. It has been reported to produce PHA copolymers containing units.
[0009]
Patent Publication No. 2989175 discloses a 3-hydroxy-5- (monofluorophenoxy) pentanoate (3H5 (MFP) P) unit or a 3-hydroxy-5- (difluorophenoxy) pentanoate (3H5 (DFP) P) unit. A homopolymer comprising at least a 3H5 (MFP) P unit or a 3H5 (DFP) P unit; a Pseudomonas putida having an ability to produce these polymers; and a method for producing the above polymer using Pseudomonas sp. The invention has been disclosed. In addition, as an effect of the invention, it is possible to synthesize a polymer having a phenoxy group in which one or two fluorine atoms are substituted at a side chain terminal by utilizing a long-chain fatty acid having a substituent, It is described that such a polymer has a high melting point and can impart stereoregularity and water repellency while maintaining good processability.
[0010]
In addition to the fluorine-substituted PHA having a fluorine substitution on the aromatic ring in this unit, PHA in which a cyano group or a nitro group is substituted on the aromatic ring in the unit has also been studied.
[0011]
Can. J. Microbiol. , 41, 32-43 (1995) and Polymer International, 39, 205-213 (1996), Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 strain and Pseudomonas putida strain KT2442 using Pseudomonas putida strain 6- and KT2442. Using (p-cyanophenoxy) hexanoic acid or 6- (p-nitrophenoxy) hexanoic acid as a substrate, 3-hydroxy-6- (p-cyanophenoxy) hexanoic acid or 3-hydroxy-6- (p-nitrophenoxy) Production of PHA containing hexanoic acid as a monomer unit has been reported.
[0012]
The PHA containing a unit having an aromatic ring having a substituent in the ring has a high melting point and good processability, while maintaining the polymer properties derived from the aromatic ring, while maintaining the polymer properties derived from the aromatic ring. It is a multifunctional PHA to which new functions derived from it are also provided.
[0013]
On the other hand, research for obtaining a multifunctional PHA based on a PHA having an ester group in a unit has been actively conducted.
[0014]
Macromol. Chem. Phys. , 195, 1405-1421 (1994), using Pseudomonas oleovorans as a polyhydroxyalkanoate-producing microorganism, a polyhydroxyalkanoate containing a unit having an ester group in a side chain using an alkanoic acid ester as a raw material. Production is reported to have been produced.
[0015]
In addition, the University of Massachusetts Ph. D. Dissertation Order Number 9132875 (1991) reports that a polyhydroxyalkanoate containing a unit having a benzyl ester structure in a side chain was produced using Pseudomonas oleovorans as a producing microorganism.
[0016]
In addition, as a method for producing a polyhydroxyalkanoate containing a unit having an ester group in a side chain, there are many reports of polymalic acid derivatives.
[0017]
U.S. Pat. No. 4,265,247 discloses a method for producing a polyhydroxyalkanoate having an ester group in a side chain by ring-opening polymerization of a lactone compound having an ester group.
[0018]
Int. J. Biol. Macromol. , 25, 255-264 (1999) discloses a method for producing a polyhydroxyalkanoate having a benzyl ester structure and an ammonium salt structure in a side chain, also by ring-opening polymerization of a lactone compound.
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
Such a side chain ester structure can be converted into a carboxyl group by a hydrogenation reaction, and it is possible to create polyhydroxyalkanoates having various physicochemical properties by subsequent chemical modification or the like. However, there are problems such as a low glass transition temperature, and it is also difficult to control the hydrophobicity of the polymer itself, and such causes have limited the application range of this type of polymer. Therefore, PHA having an ester group in the unit, which is capable of expanding the range of application as a polymer, is thermally stable, and furthermore can be controlled in physical properties arbitrarily, and There has been a demand for a method of manufacturing the same.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have reached the following invention. That is, the present invention provides a compound represented by the chemical formula (1):
[0021]
Embedded image
And a 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal, and a chemical formula (2):
[0022]
Embedded image
And a polyhydroxyalkanoate copolymer simultaneously containing the units represented by the following formulas in the molecule.
[0023]
In the polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention, R ′ in the unit represented by the chemical formula (2), that is, a residue having a phenyl structure, a thienyl structure, or a cyclohexyl structure,
Chemical formula (3):
[0024]
Embedded image
Chemical formula (4):
[0025]
Embedded image
Chemical formula (5):
[0026]
Embedded image
Chemical formula (6):
[0027]
Embedded image
Chemical formula (7):
[0028]
Embedded image
Chemical formula (8):
[0029]
Embedded image
Chemical formula (9):
[0030]
Embedded image
Chemical formula (10):
[0031]
Embedded image
Chemical formula (11):
[0032]
Embedded image
A polyhydroxyalkanoate copolymer can be obtained.
[0033]
Further, in the polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention, a 3-hydroxyalkanoic acid unit having an ester structure at a terminal represented by the chemical formula (1) is
[0034]
Embedded image
Chemical formula (13):
[0035]
Embedded image
Chemical formula (14):
[0036]
Embedded image
[0037]
The polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention can be a polyhydroxyalkanoate copolymer having a number average molecular weight in the range of 1,000 to 1,000,000.
The present invention also provides a compound of the formula (15):
[0038]
Embedded image
A dicarboxylic acid monoester compound, and
Chemical formula (16):
[0039]
Embedded image
Under the conditions including the compound represented by the formula (1), a dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16) are used as raw materials, and the chemical formula (1):
[0040]
Embedded image
And a 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal, and a chemical formula (2):
[0041]
Embedded image
A compound represented by the formula (1), wherein the compound is biosynthesized by a microorganism having an ability to produce a polyhydroxyalkanoate copolymer containing the same in a molecule:
[0042]
Embedded image
A 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal,
Chemical formula (2):
[0043]
Embedded image
A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer containing, in a molecule, a unit represented by
[0044]
The method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention is characterized in that R ′ in the chemical formulas (2) and (16), that is, a residue having a phenyl structure, a thienyl structure, or a cyclohexyl structure,
Chemical formula (3):
[0045]
Embedded image
Chemical formula (4):
[0046]
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[0047]
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Chemical formula (6):
[0048]
Embedded image
Chemical formula (7):
[0049]
Embedded image
Chemical formula (8):
[0050]
Embedded image
Chemical formula (9):
[0051]
Embedded image
Chemical formula (10):
[0052]
Embedded image
Chemical formula (11):
[0053]
Embedded image
A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, characterized in that:
[0054]
Further, in the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention, the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) may be
Chemical formula (17):
[0055]
Embedded image
The 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal represented by the chemical formula (1) is
Chemical formula (12):
[0056]
Embedded image
Chemical formula (13):
[0057]
Embedded image
[0058]
Furthermore, in the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention, the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) is
Chemical formula (18):
[0059]
Embedded image
The 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal represented by the chemical formula (1) is
Chemical formula (13):
[0060]
Embedded image
Chemical formula (14):
[0061]
Embedded image
[0062]
Further, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention comprises culturing the microorganism in a medium containing the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16). And producing a polyhydroxyalkanoate copolymer.
[0063]
More specifically, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention comprises a dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and a compound represented by the chemical formula (16), as well as a peptide. A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, comprising culturing the microorganism in a medium containing the same. In this case, a method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, characterized by using polypeptone as the peptides to be contained in the medium, can be provided.
[0064]
In addition, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention is a method for preparing a polyhydroxyalkanoate copolymer in a medium containing a yeast extract in addition to the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16) Then, a method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, which comprises culturing the microorganism, can be provided.
[0065]
In addition, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention includes an organic acid or a salt thereof in addition to the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16). A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, comprising culturing the microorganism in a medium containing the same. In this case, the organic acids or salts thereof contained in the medium include pyruvic acid, oxaloacetic acid, citric acid, isocitric acid, ketoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, lactic acid, and salts of these organic acids. A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer characterized by using at least one selected from the group consisting of:
[0066]
The method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention also includes an amino acid or a salt thereof in addition to the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16). The method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer according to claim 7, wherein the microorganism is cultured in a medium. In this case, production of a polyhydroxyalkanoate copolymer characterized by using, as the amino acid or its salt contained in the medium, at least one selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, and salts of these amino acids. Method.
[0067]
In addition, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention is characterized in that a dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and a compound represented by the chemical formula (16) are added to a medium containing a saccharide. The method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer according to claim 6, wherein the microorganism is cultured. In this case, the saccharides contained in the medium include glyceraldehyde, erythrose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, glycerol, erythritol, xylitol, gluconic acid, glucuronic acid, galacturonic acid, maltose, sucrose, and lactose. A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, characterized in that one or more saccharides selected from the group are used.
[0068]
In addition, the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention includes a dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and a compound represented by the chemical formula (16), wherein A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer, which comprises culturing the microorganism in a medium containing a chain alkanoic acid or a salt thereof, can also be provided.
[0069]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Details of the culture conditions of the microorganism in the method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer of the present invention are as follows.
[0070]
Various necessary substrates and nutrients are added to a phosphate buffer and an inorganic salt medium based on ammonium salts or nitrates as shown below.
[0071]
The dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16) are each used as a substrate for producing a target polyhydroxyalkanoate in an amount of 0.01% to 1% (w / v), and more preferably 0.02% to 0.2%.
[0072]
The co-substrate concentration added as a carbon source and a nitrogen source for the growth of microorganisms and an energy source for the production of polyhydroxyalkanoate is usually 0.1% to 5% (w / v) per culture medium, and more preferably. Desirably, the content is 0.2% to 2%.
[0073]
As the medium used in the present invention, any medium may be used as long as it is an inorganic salt medium containing a nitrogen source such as a phosphate and an ammonium salt or a nitrate, but PHA productivity can be improved by adjusting the concentration of the nitrogen source. It is possible.
[0074]
The culturing temperature may be any temperature at which the above strain can be satisfactorily grown, and is suitably from 15 ° C to 37 ° C, more preferably from about 20 ° C to 30 ° C.
[0075]
The culture can be performed by any culture method, such as liquid culture and solid culture, in which the microorganism grows and PHA is produced. Further, any type of batch culture, fed-batch culture, semi-continuous culture, continuous culture and the like may be used. As a form of the liquid batch culture, there are a method of supplying oxygen by shaking with a shaking flask and a method of supplying oxygen by stirring and aeration using a jar fermenter.
[0076]
As a method for producing and accumulating PHA in microorganisms, in addition to the method described above, once the cells are sufficiently grown, the cells are transferred to a medium having a limited nitrogen source such as ammonium chloride, and the substrate of the target unit is prepared. In some cases, further culturing in a state in which the compound is added may improve the productivity.
[0077]
Further, in the production method of the present invention, the microorganism is cultured under the above conditions, and the 3-hydroxy-dicarboxylic acid monoester compound unit represented by the chemical formula (1) produced by the microorganism and the chemical formula (2) And b) recovering from the microbial cells a polyhydroxyalkanoate copolymer containing simultaneously the unit represented by the formula (1) in a molecule, thereby producing a polyhydroxyalkanoate copolymer.
[0078]
As a method for recovering the target PHA from the microbial cells, a commonly used method can be applied. For example, extraction with an organic solvent such as chloroform, dichloromethane, or acetone is the simplest, but dioxane, tetrahydrofuran, or acetonitrile may be used in some cases. In an environment where an organic solvent is difficult to use, treatment with a surfactant such as SDS, treatment with an enzyme such as lysozyme, treatment with a chemical such as hypochlorite, ammonia, EDTA, or ultrasonic crushing, By physically crushing the microbial cells using a homogenizer method, pressure crushing method, bead impact method, crushing method, crushing method, freeze-thaw method, the cell components other than PHA are removed. And a method of recovering PHA.
[0079]
As the microorganism used in the production method of the present invention, any microorganism may be used as long as it has the ability to satisfy the above conditions. Among them, a microorganism belonging to the genus Pseudomonas is particularly desirable, and more specifically, a microorganism belonging to the genus Pseudomonas. cichorii), Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorecense), Pseudomonas oleovorans (Pseudomonas oleovorans), Pseudomonas Aruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas Sutsuttsueri (Pseudomonas stutzeri), Pseudomonas jessenii (Pseudomonas jessenii) and the like are desirable. More specifically, more specifically, Pseudomonas chicory eye YN2 strain (Pseudomonas cicholii YN2; FERM BP-7375), Pseudomonas chicory eye strain H45 (Pseudomonas cichori H45, FERM BP-7374, Jesi Punis mons) 7376) and Pseudomonas putida P91 strain (FERM BP-7373). These four types of microorganisms have been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary and are microorganisms described in JP-A-2001-288256.
[0080]
The culture of the microorganism of the present invention, the production and accumulation of PHA by the microorganism of the present invention, and the recovery of PHA from the bacterial cells in the present invention are not limited to the above-mentioned methods.
[0081]
The composition of the inorganic salt medium (M9 medium) used in one method of the present invention is shown below.
[0082]
[M9 medium]
Na 2 HPO 4 : 6.3
KH 2 PO 4 : 3.0
NH 4 Cl: 1.0
NaCl: 0.5
g / L, pH = 7.0
[0083]
Furthermore, in order to achieve good growth and PHA production, it is necessary to add about 0.3% (v / v) of a minor component solution shown below to the above-mentioned inorganic salt medium.
[0084]
[Small component solution]
Nitrilo triacetic acid: 1.5; MgSO 4 : 3.0; MnSO 4 : 0.5; NaCl: 1.0; FeSO 4 : 0.1; CaCl 2 : 0.1; CoCl 2 : 0.1; ZnSO 4 : 0.1;
CuSO 4 : 0.1; AlK (SO 4 ) 2 : 0.1; H 3 BO 3 : 0.1; Na 2 MoO 4 : 0.1;
NiCl 2 : 0.1 g / L
[0085]
【Example】
[Example 1]
To 1000 mL of the M9 medium, 5.0 g of polypeptone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5-phenylvaleric acid, and monomethyl sebacate were added to a final concentration of 4 mm and 1 mm, respectively. After sterilization, it was cooled to room temperature. To the prepared medium, 5 mL of a culture solution of Pseudomonas chicory eye YN2 strain previously cultured with shaking at 30 ° C. for 8 hours in an M9 medium containing 0.5% of polypeptone was added, and cultured at 30 ° C. for 40 hours. After the culture, the cells were harvested by centrifugation, washed with methanol, and lyophilized. After weighing the dried cells, chloroform was added and the polymer was extracted by stirring at 50 ° C. for 48 hours. After chloroform from which the polymer was extracted was filtered and concentrated by an evaporator, a portion precipitated and solidified with cold methanol was collected and dried under reduced pressure to obtain a target polymer.
[0086]
The structure of the obtained polymer was determined by the following methylation-decomposition-GC / MS method. That is, 5 mg of the polymer was dissolved in 2 mL of chloroform, 2 mL of a methanol-3% sulfuric acid solution was further added, and a reflux reaction was performed at 100 ° C. for 3.5 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was cooled to room temperature, 10 mL of deionized water was added, and the mixture was stirred and separated. 5050A: Column: DB-WAXETR 0.32 mm × 30 m). FIG. 1 shows the total ion chromatogram (TIC). As the main peak, three lines were observed at 35.6 minutes, 38.0 minutes, and 45.8 minutes. FIG. 2 shows the mass spectrum (MS) of the peak at 35.6 minutes, FIG. 3 shows the MS at 38.0 minutes, and FIG. 4 shows the MS at 45.8 minutes.
As a result, the peak at 35.6 minutes is represented by the chemical formula (13):
[0087]
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[0088]
Embedded image
[0089]
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The molecular weight of the polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC) (Tosoh HLC-8220 GPC, column: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, solvent: chloroform, converted to polystyrene).
Of the resulting polymer 1 The H-NMR spectrum is shown in FIG. Table 1 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0090]
[Table 1]
[Example 2]
A target polymer was obtained in the same manner as in Example 1 except that the strain YN2 used in Example 1 was changed to Pseudomonas jessennii strain P161.
[0092]
The structure of the obtained polymer was determined using methylation-decomposition-GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (13):
[0093]
Embedded image
[0094]
Embedded image
[0095]
Embedded image
[0096]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0097]
Table 2 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0098]
[Table 2]
[Example 3]
A target polymer was obtained in the same manner as in Example 1 except that the YN2 strain used in Example 1 was changed to Pseudomonas chicory eye strain H45 and the polypeptone was changed to yeast extract (DIFCO).
[0100]
The structure of the obtained polymer was determined by methylation / decomposition / GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (13):
[0101]
Embedded image
[0102]
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[0103]
Embedded image
[0104]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0105]
Table 3 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0106]
[Table 3]
[Example 4]
The objective was obtained in the same manner as in Example 1 except that the YN2 strain used in Example 1 was changed to Pseudomonas putida strain P91 and polypeptone was changed to n-nonanoic acid (Kishida Chemical; concentration: 0.1%). A polymer was obtained.
[0108]
The structure of the obtained polymer was determined by methylation / decomposition / GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (13):
[0109]
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[0110]
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[0111]
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[0112]
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[0113]
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[0114]
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[0115]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0116]
Table 4 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0117]
[Table 4]
[Example 5]
A target polymer was obtained in the same manner as in Example 1 except that the polypeptone used in Example 1 was changed to D-glucose (Kishida Chemical).
[0119]
The structure of the obtained polymer was determined by methylation / decomposition / GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (13):
[0120]
Embedded image
[0121]
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[0122]
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[0123]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0124]
Table 5 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0125]
[Table 5]
[Example 6]
A target polymer was obtained in the same manner as in Example 1, except that the polypeptone used in Example 1 was changed to sodium pyruvate (Kishida Chemical).
[0127]
The structure of the obtained polymer was determined by methylation / decomposition / GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (13):
[0128]
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[0129]
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[0130]
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[0131]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0132]
Table 6 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0133]
[Table 6]
[Example 7]
Same as Example 1 except that the polypeptone used in Example 1 was changed to sodium L-glutamate (Kishida Chemical), and monomethyl sebacate, one of the substrates for polymer synthesis, was changed to monomethyl suberate. Thus, the desired polymer was obtained.
[0135]
The structure of the obtained polymer was determined by methylation / decomposition-GC / MS method in the same manner as in Example 1. As a result, the polymer was identified by chemical formula (14):
[0136]
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[0137]
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[0138]
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[0139]
The molecular weight of the polymer was measured by GPC in the same manner as in Example 1.
[0140]
Table 7 shows the weight of the obtained cells and the polymer, the weight ratio of the polymer per cell, the molecular weight and the molecular weight distribution of the obtained polymer.
[0141]
[Table 7]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, a novel polyhydroxyalkanoate copolymer, a unit having an ester structure in a side chain and a unit having a residue having a phenyl structure, a thiophene structure, and a cyclohexyl structure in a side chain are included in a molecule. A polyhydroxyalkanoate copolymer containing the same and a method for producing the same are provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a GC-MS TIC spectrum of a polyester methylated decomposition product obtained in Example 1.
FIG. 2 shows a mass spectrum of a peak derived from a unit represented by the chemical formula (13) of the polyester methylated decomposition product obtained in Example 1.
FIG. 3 shows a mass spectrum of a peak derived from a unit represented by the chemical formula (19) of the polyester methylated decomposition product obtained in Example 1.
FIG. 4 shows a mass spectrum of a peak derived from the unit represented by the chemical formula (12) of the polyester methylated decomposition product obtained in Example 1.
Claims (17)
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットと、
化学式（２）：
で示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体。Chemical formula (1):
A 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal,
Chemical formula (2):
A polyhydroxyalkanoate copolymer containing, in a molecule, a unit represented by the formula:
化学式（３）：
化学式（４）：
化学式（５）：
化学式（６）：
化学式（７）：
化学式（８）：
化学式（９）：
化学式（１０）：
化学式（１１）：
であることを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート共重合体。R ′ in the chemical formula (2), that is, a residue having a phenyl structure, a thienyl structure, or a cyclohexyl structure is
Chemical formula (3):
Chemical formula (4):
Chemical formula (5):
Chemical formula (6):
Chemical formula (7):
Chemical formula (8):
Chemical formula (9):
Chemical formula (10):
Chemical formula (11):
化学式（１２）：
化学式（１３）：
化学式（１４）：
Chemical formula (12):
Chemical formula (13):
Chemical formula (14):
に示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び
化学式（１６）：
で示す化合物とを含む条件下で、化学式（１５）で示すジカルボン酸モノエステル化合物、及び化学式（１６）で示す化合物を原料として、化学式（１）：
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットと、
化学式（２）：
で示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体を生産する能力を有する微生物により生合成せしめることを特徴とする、化学式（１）：
に示す、末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシ−アルカン酸ユニットと、
化学式（２）：
に示すユニットとを分子中に同時に含むポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法。Chemical formula (15):
And a dicarboxylic acid monoester compound represented by the following formula:
Under the conditions including the compound represented by the formula (1), the dicarboxylic acid monoester compound represented by the chemical formula (15) and the compound represented by the chemical formula (16) are used as raw materials, and the chemical formula (1):
A 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal,
Chemical formula (2):
A compound represented by the formula (1), wherein the compound is biosynthesized by a microorganism having an ability to produce a polyhydroxyalkanoate copolymer containing the same in a molecule:
A 3-hydroxy-alkanoic acid unit having an ester structure at the terminal,
Chemical formula (2):
A method for producing a polyhydroxyalkanoate copolymer containing, in a molecule, the following units:
化学式（３）：
化学式（４）：
化学式（６）：
化学式（７）：
化学式（８）：
化学式（９）：
化学式（１０）：
化学式（１１）：
であることを特徴とする請求項５に記載のポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法。R ′ in chemical formulas (2) and (16), that is, a residue having a phenyl structure, a thienyl structure, or a cyclohexyl structure is
Chemical formula (3):
Chemical formula (4):
Chemical formula (6):
Chemical formula (7):
Chemical formula (8):
Chemical formula (9):
Chemical formula (10):
Chemical formula (11):
化学式（１７）：
前記化学式（１）に示す末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットが
化学式（１２）：
化学式（１３）：
Chemical formula (17):
The 3-hydroxyalkanoic acid unit having an ester structure at the terminal represented by the chemical formula (1) is represented by the chemical formula (12):
Chemical formula (13):
化学式（１８）：
前記化学式（１）に示す末端にエステル構造を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットが
化学式（１３）：
化学式（１４）：
Chemical formula (18):
The 3-hydroxyalkanoic acid unit having an ester structure at the terminal represented by the chemical formula (1) is represented by the chemical formula (13):
Chemical formula (14):
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