JP2004012975A

JP2004012975A - Fluorescent microscope and vertical illuminator for fluorescent observation, and vertical illumination method

Info

Publication number: JP2004012975A
Application number: JP2002168546A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Uozumi; 魚住　孝之
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2002-06-10
Filing date: 2002-06-10
Publication date: 2004-01-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To avoid the situation that part of the illumination light emitted from a light source to an objective lens side is guided in the form of leak light into a viewing visual field and degrades the S/N (Signal-to-Noise) ratio of a fluorescent image. <P>SOLUTION: The fluorescent microscope has the objective lens 21 and is provided with imaging means 21 and 23 for forming the fluorescent image of a specimen 20 marked by a fluorescent substance, vertical illumination means 13 to 18 for illuminating the specimen 20 and beam attenuating means 14 for attenuating the light intensity near an optical axis 20a of the objective lens 21 out of the incident light for illumination on the objective lens 21. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に使用される蛍光顕微鏡、並びに、蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明装置および落射照明方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、蛍光物質で標識された標本の蛍光観察が、蛍光顕微鏡などを用いて行われている。標本の蛍光観察とは、光源からの照明光で標本内の蛍光物質を励起して、蛍光物質から蛍光を発生させ、この蛍光に基づいて標本の像（蛍光像）を観察する方法である。照明光による蛍光物質の励起、つまり標本の照明は、対物レンズを利用して行われる（落射照明）。
【０００３】
また、このような蛍光観察では、標本からの蛍光が微弱なため、迷光（特に照明光の漏れ光）をできるだけ遮断して、蛍光のみを効率良く観察視野内に導き、蛍光（シグナル）と迷光（ノイズ）との比（Ｓ／Ｎ比）を向上させることが重要となる。Ｓ／Ｎ比が高いほど、コントラストの良い蛍光像を観察できるからである。基本的には、蛍光像の形成面と対物レンズとの間にダイクロイックミラーおよびバリアフィルタを配置して、照明光の漏れ光を遮断し、蛍光像のＳ／Ｎ比を向上させるようにしている。
【０００４】
ダイクロイックミラーは、照明光を反射して蛍光を透過する。バリアフィルタは、照明光を吸収して蛍光を透過する。そして、バリアフィルタは、ダイクロイックミラーよりも蛍光像の形成面側に配置される。つまり、照明光の漏れ光を遮断可能な光学素子の最終段が、バリアフィルタとなっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、照明光の漏れ光は、進行方向が様々であり、バリアフィルタに斜め入射することがある。そして、入射する際の角度によっては、バリアフィルタを透過してしまう。バリアフィルタを透過した後の漏れ光は、当然、蛍光と共にそのまま観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる要因となる。
【０００６】
そこで近年、バリアフィルタに到達する漏れ光を低減することで、観察視野内に導かれる漏れ光を低減し、蛍光像のＳ／Ｎ比を向上させる方策が提案された。例えば特開２００１−２２１９５３号公報では、光源側からダイクロイックミラーに入射した照明光のうち、ダイクロイックミラーで反射されずに透過した成分（漏れ光）に注目し、この漏れ光がバリアフィルタに到達しないよう工夫している。
【０００７】
しかし、上記の方策では、次のような漏れ光がバリアフィルタに到達する事態（つまり観察視野内に導かれる事態）を回避することはできなかった。その漏れ光とは、光源側からダイクロイックミラーに入射し、このダイクロイックミラーで反射した照明光（対物レンズ側に射出された照明光）のうち、例えば対物レンズ表面で反射してしまうなど、何らかの原因で標本に到達できなかった照明光である。
【０００８】
本発明の目的は、光源から対物レンズ側に射出された照明光の一部が漏れ光となって観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる事態を回避できる蛍光顕微鏡、並びに、蛍光観察用の落射照明装置および落射照明方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の蛍光顕微鏡は、対物レンズを有し、蛍光物質で標識された標本の蛍光像を形成する結像手段と、前記標本を照明する落射照明手段と、前記対物レンズに入射する照明光のうち、前記対物レンズの光軸付近の光強度を低減させる減光手段とを備えたものである。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、前記対物レンズの瞳面に共役な基準面を規定する光学系を備え、前記減光手段は、前記光学系の光軸上でかつ前記基準面の近傍に配置された開口絞りを含み、前記開口絞りには、前記照明光が当該開口絞りに入射する際の径よりも小さく、かつ前記光学系の光軸を含む領域に、前記照明光の光強度を低減させる部位が設けられたものである。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の蛍光顕微鏡において、前記開口絞りの前記部位が、前記照明光の光強度を略零に低減させる遮光部位である。
請求項４に記載の発明は、照明光を対物レンズに向けて射出することにより、蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明装置において、前記対物レンズの瞳面に共役な基準面を規定する光学系と、前記光学系の光軸上でかつ前記基準面の近傍に配置された開口絞りとを備え、前記開口絞りには、前記照明光の光軸付近の領域に、前記照明光の光強度を低減させる部位が設けられたものである。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の蛍光観察用の落射照明装置において、前記開口絞りの前記部位が、前記照明光の光強度を略零に低減させる遮光部位である。
請求項６に記載の発明は、蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明方法において、照明光を対物レンズ側に向けて射出させ、前記対物レンズに入射する前記照明光のうち、前記対物レンズの光軸付近の光強度を低減させるものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態は、請求項１〜請求項６に対応する。ここでは、図１（ａ）と図２に示すように、標本２０の蛍光観察に使用される蛍光顕微鏡１０に組み込まれ、標本２０を照明する落射照明装置（１３〜１８）の例を説明する。
【００１４】
蛍光顕微鏡１０には、蛍光観察用の落射照明装置（１３〜１８）の他に、光源（１１）とコレクタレンズ（１２）とを有するランプハウス（３７）と、観察系（２１〜２８）とが設けられている。まず初めに、観察対象の標本２０について説明し、その後で、順に、蛍光顕微鏡１０の観察系（２１〜２８）とランプハウス（３７）と落射照明装置（１３〜１８）とについて説明する。
【００１５】
標本２０は、少なくとも１種類の蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）であり、ステージ１９上に載置されている。そして、ランプハウス（３７）中の光源（１１）と落射照明装置（１３〜１８）によって照明されると、標本２０内の蛍光物質が励起され、蛍光を発生する。蛍光の発生方向は、照明方向に拘わらず四方八方となる。
【００１６】
蛍光顕微鏡１０の観察系（２１〜２８）は、図２に示すように、光軸２０ａに沿って標本２０側から順に、無限遠系の対物レンズ２１と、バリアフィルタ２２と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２３と、プリズム２４〜２７と、接眼レンズ２８とが配置された構成となっている。
バリアフィルタ２２は、標本２０から発生する蛍光の波長域を選択的に透過すると共に、標本２０に対する照明光の波長域（標本２０内の蛍光物質を励起可能な波長域）を吸収する分光特性の波長選択フィルタである。バリアフィルタ２２には、例えば干渉フィルタや色素フィルタが用いられる。
【００１７】
なお、バリアフィルタ２２の前段には、落射照明装置（１３〜１８）のダイクロイックミラー１８が配置されている。このダイクロイックミラー１８は、標本２０に対する照明光の波長域を反射すると共に、標本２０から発生する蛍光の波長域を透過する分光特性を有している。
標本２０の蛍光観察時、標本２０から発生した蛍光は、対物レンズ２１とダイクロイックミラー１８とバリアフィルタ２２と結像レンズ２３とプリズム２４〜２７とを介して、接眼レンズ２８の手前の結像面２８ａに入射し、対物レンズ２１と結像レンズ２３の作用によって集光される。
【００１８】
このとき、結像面２８ａには、蛍光に基づく標本２０の蛍光像が形成される。結像面２８ａの蛍光像は、観察者が接眼レンズ２８を覗くことによって観察される。上記の対物レンズ２１および結像レンズ２３は、請求項の「結像手段」に対応する。
蛍光顕微鏡１０のランプハウス（３７）および落射照明装置（１３〜１８）は、図１（ａ），図２に示すように、光軸１０ａに沿って順に、光源１１と、コレクタレンズ１２と、レンズ１３と、開口絞り１４（図１（ａ）のみで図示）と、視野絞り１５（図２のみで図示）と、レンズ１６と、励起フィルタ１７と、ダイクロイックミラー１８とが配置された構成となっている。
【００１９】
また、ランプハウス（３７）および落射照明装置（１３〜１８）は、光軸１０ａが上記の観察系（２１〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２１〜２８）の対物レンズ２１とバリアフィルタ２２との間に組み込まれる。このとき、光軸２０ａ上には、落射照明装置（１３〜１８）のダイクロイックミラー１８が配置される。
【００２０】
標本２０の蛍光観察時、光源１１からの照明光は、概略、コレクタレンズ１２とレンズ１３と開口絞り１４（図１（ａ））と視野絞り１５（図２）とレンズ１６と励起フィルタ１７を透過した後、ダイクロイックミラー１８で反射して、観察系（２１〜２８）の光軸２０ａ上に導かれる。そして、対物レンズ２１を通過した後、標本２０に照射される。このように、落射照明装置（１３〜１８）は、対物レンズ２１を利用して標本２０を照明するように構成されている。
【００２１】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１３〜１８）では、対物レンズ２１の瞳面２１ａ（図１（ａ）のみで図示）に共役な基準面がレンズ１６によって規定され、この基準面の近傍でかつ光軸１０ａ上に、開口絞り１４が配置されている。なお、対物レンズ２１の瞳面２１ａは、入射瞳面または後側焦点面とも言う。レンズ１６は、請求項の「光学系」に対応する。落射照明装置（１３〜１８）は「落射照明手段」に対応する。
【００２２】
光源１１は、例えば水銀ランプなどの高輝度光源であり、紫外線や可視光線などの照明光（標本２０の蛍光物質を励起するために適切な波長域を含む照明光）をランプ芯から対物レンズ２１側のコレクタレンズ１２に向けて射出する。図１（ａ）は、光源１１からの照明光のうち、光軸１０ａ上の一点から射出された照明光の光路を示している。図２は、光軸１０ａに沿って射出された照明光の光路を示している。
【００２３】
コレクタレンズ１２およびレンズ１３は、光源１１からの照明光を集光し、図１（ａ），（ｂ）に示すように、開口絞り１４の近傍（対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面の近傍）に光源像１１ａを形成する。コレクタレンズ１２とレンズ１３の間において、照明光は平行光束である。
開口絞り１４には、図１（ｂ）に示すように、円形状の遮光部位１４ａが光軸１０ａに中心を揃えて設けられている。この遮光部位１４ａは、レンズ１３からの照明光が開口絞り１４に入射する際の断面（つまり光源像１１ａ）よりも小さいものである。遮光部位１４ａの径は、対物レンズ２１の倍率に応じて決定することが好ましい。
【００２４】
また、開口絞り１４には、遮光部位１４ａを支持するための部位１４ｂ，１４ｃも設けられている。部位１４ｂは棒状である。部位１４ｃはリング状である。部位１４ｃの径は、遮光部位１４ａの径より大きい。そして、遮光部位１４ａは、リング状の部位１４ｃの中心付近に棒状の部位１４ｂを介して支持されている。
このため、遮光部位１４ａとリング状の部位１４ｃとの間には、略リング状の開口１４ｄが確保されることになる。開口１４ｄは、開口絞り１４に入射した照明光を通過させるための素通し部位である。このように、本実施形態の開口絞り１４は、円形状の遮光部位１４ａとリング状の開口１４ｄとが、略同心状に配置されたものである。
【００２５】
そして、開口絞り１４に入射した照明光の断面（つまり光源像１１ａ）のうち、光軸１０ａを含む領域（遮光部位１４ａと重なる領域）では、照明光の光強度が略零に低減され、後段の視野絞り１５（図２）に向けて通過することはない。また、それ以外の領域（開口１４ｄと重なる領域）では、照明光の光強度が低減されることなく、後段の視野絞り１５（図２）に向けて通過する。
【００２６】
なお、上記のような開口絞り１４は、例えば、プレス加工で成形された板部材に黒色の艶消し塗装を施すことによって、容易に得ることができる。艶消し塗装に代えて、反射防止膜や吸収膜などの遮光膜を塗布してもよい。また、ベルベットなどの布を張ってもよい。
開口絞り１４の開口１４ｄを透過した後の照明光は、視野絞り１５（図２）を介してレンズ１６に入射する。視野絞り１５は、標本２０と接眼レンズ２８の手前の結像面２８ａとの双方に共役な面に配置されている。この視野絞り１５により標本２０の照明領域が規定される。
【００２７】
レンズ１６は、既に説明したように、対物レンズ２１の瞳面２１ａ（図１）に共役な基準面を規定する光学系である。このため、その基準面の近傍に配置された開口絞り１４の開口１４ｄからの照明光は、レンズ１６の作用によって対物レンズ２１の瞳面２１ａに集光される。
ただし、レンズ１６を透過した照明光は、観察系（２１〜２８）の光軸２０ａ上に導かれる前、つまり、落射照明装置（１３〜１８）の光軸１０ａ上を進行している間に、励起フィルタ１７を透過する。この励起フィルタ１７は、標本２０内の蛍光物質を励起するために適切な波長域を透過する分光特性のフィルタである。
【００２８】
したがって、励起フィルタ１７を透過した照明光は、標本２０内の蛍光物質を励起可能な波長域の照明光となってダイクロイックミラー１８に入射し、そこでの反射により、対物レンズ２１側に向けて射出される。そして、蛍光物質を励起可能な波長域の照明光が、対物レンズ２１の瞳面２１ａに集光される。
このとき、対物レンズ２１の瞳面２１ａには、開口絞り１４の像（以下「開口絞り像３４」という）が形成される。また、開口絞り像３４には、図３（ａ）に示すように、円形状の暗部３４ａとリング状の明部３４ｂとが含まれている。
【００２９】
図３（ａ）は、図１（ａ）の励起フィルタ１７とダイクロイックミラー１８を省略し、光軸１０ａと光軸２０ａを同一直線上に揃えて示した図である。図３（ａ）から分かるように、開口絞り像３４の暗部３４ａと明部３４ｂとは、各々、開口絞り１４の遮光部位１４ａと開口１４ｄとに対応している。なお、開口絞り像３４の暗部３４ａの径が対物レンズ２１の瞳径の例えば３割程度となるように、開口絞り１４の遮光部位１４ａの径を決定することが好ましい。
【００３０】
このように、本実施形態では、対物レンズ２１の瞳面２１ａに開口絞り像３４が形成されるため、瞳面２１ａのうち、光軸２０ａを含む円形状の中心領域（暗部３４ａ）には照明光が到達せず、その周りのリング状の周辺領域（明部３４ｂ）のみに照明光が到達する。図３（ａ）に実線で示す照明光Ｌ_１は実在するが、破線で示す照明光Ｌ_２は実在しないものである。
【００３１】
そして、上記の開口絞り像３４を形成後、照明光は、対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過して、対物レンズ２１の一方のレンズ面２１ｂに入射する。このとき、照明光の断面３５（図３（ｂ））には、円形状の暗部３５ａとリング状の明部３５ｂとが含まれている。
【００３２】
つまり、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂのうち、光軸２０ａを含む円形状の中心領域（暗部３５ａ）には照明光が到達せず、その周りのリング状の周辺領域（明部３５ｂ）のみに照明光が到達する。これは、対物レンズ２１の瞳面２１ａの中心領域（暗部３４ａ）に照明光が到達しなかったからである。
このようにして、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂのうちリング状の周辺領域（明部３５ｂ）に到達した照明光の多くは、そのままレンズ面２１ｂを透過し、他方のレンズ面２１ｃに入射する。このとき、照明光の断面には、断面３５（図３（ｂ））と同様、円形状の暗部とリング状の明部とが含まれている。
【００３３】
つまり、対物レンズ２１のレンズ面２１ｃのうち、光軸２０ａを含む円形状の中心領域には照明光が到達せず、その周りのリング状の周辺領域のみに照明光が到達する。これも、対物レンズ２１の瞳面２１ａの中心領域（暗部３４ａ）に照明光が到達しなかったからである。
そして、対物レンズ２１のレンズ面２１ｃの周辺領域に到達した照明光の多くは、そのままレンズ面２１ｃを透過し、標本２０の領域２０ｂに到達する。ここで、対物レンズ２１の瞳面２１ａに形成された開口絞り像３４の明部３４ｂの各点から発せられた照明光は、対物レンズ２１を通過したのち平行光束となり、標本２０ａの同じ領域２０ｂに照射される。
【００３４】
本実施形態の蛍光顕微鏡１０は、前述したように、光源１１のランプ芯と開口絞り１４と対物レンズ２１の瞳面２１ａとが共役（図１（ａ））であり、標本２０と視野絞り１５と結像面２８ａとが共役（図２）なため、ケーラー照明が実現している。このため、対物レンズ２１を通過する際の照明光が中心抜け状態でも、標本２０の領域２０ｂの全面には、照明光が均一に照射される。
【００３５】
均一な照明光が照射された領域２０ｂ内では、蛍光物質が照明光によって励起され、自身の蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）に応じた光量の蛍光を発生する。この蛍光は、本実施形態では、上記した観察系（２１〜２８）の結像面２８ａに導かれる。結像面２８ａには標本２０の蛍光像が形成され、この蛍光像が接眼レンズ２８を介して観察される（蛍光観察）。
【００３６】
ここで、光源１１から射出される照明光は非常に強度が高いため、実際には、光源１１とダイクロイックミラー１８との間の任意の地点に、例えばＮＤフィルタを挿入し、標本２０の領域２０ｂにおける照明光の光量を適切にすることが好ましい。照明光の適切な光量とは、照明光の光量と蛍光の光量との比例関係が維持される範囲の光量である。
【００３７】
本実施形態の蛍光顕微鏡１０では、開口絞り１４に遮光部位１４ａを設けたため、遮光部位１４ａの面積分だけ、標本２０の領域２０ｂにおける照明光の光量が減少する。しかし、開口絞り１４の遮光部位１４ａによる光量の減少は、僅かであり、標本２０の領域２０ｂにおける照明光の光量を適切にするためには、上記のＮＤフィルタが必要である。
【００３８】
上記のような蛍光観察では、標本２０からの蛍光が微弱なため、迷光（特に照明光の漏れ光）をできるだけ遮断して、蛍光のみを効率良く観察視野内に導き、蛍光像のＳ／Ｎ比を向上させることが重要となる。Ｓ／Ｎ比が高いほど、コントラストの良い蛍光像を観察できるからである。
本実施形態の蛍光顕微鏡１０においても、基本的には、結像面２８ａと対物レンズ２１との間にダイクロイックミラー１８およびバリアフィルタ２２を配置し、照明光の漏れ光できるだけ遮断して、標本２０からの微弱な蛍光のみを効率良く観察視野内に導き、蛍光像のＳ／Ｎ比を向上させるようにしている。
【００３９】
しかし、照明光の漏れ光を遮断可能な光学素子の最終段であるバリアフィルタ２２は、漏れ光が斜め入射した場合、これを透過させてしまうことがある。そして、バリアフィルタ２２を透過した後の漏れ光は、当然、蛍光と共にそのまま観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる要因となる。
そこで、本実施形態においては、ダイクロイックミラー１８での反射を経て対物レンズ２１側に射出された照明光に注目し、この照明光のうち何らかの原因で標本２０に到達できなかった成分（漏れ光）が、バリアフィルタ２２に到達しないようにすることで、観察視野内に導かれる漏れ光を低減し、蛍光像のＳ／Ｎ比を向上させるようにした。
【００４０】
既に説明したように、ダイクロイックミラー１８から対物レンズ２１側に射出された照明光は、対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過して（開口絞り像３４）、対物レンズ２１の一方のレンズ面２１ｂのうち、リング状の周辺領域（明部３５ｂ）に入射する。このとき、多くの照明光は、レンズ面２１ｂを透過して他方のレンズ面２１ｃに向けて進行するが、残りの照明光Ｌａ（図３（ａ））は、レンズ面２１ｂで反射して漏れ光となってしまう。
【００４１】
また同様に、一方のレンズ面２１ｂからの照明光は、他方のレンズ面２１ｃのうち、リング状の周辺領域に入射する。そして、多くの照明光は、レンズ面２１ｃを透過して標本２０に向けて進行するが、残りの照明光は、上記の照明光Ｌａ（図３（ａ））と同様、レンズ面２１ｃで反射して漏れ光となってしまう。
このような漏れ光の発生方向は、照明光がレンズ面２１ｂ，２１ｃに入射する位置によっておよそ決まっている。本実施形態では、上記のように、レンズ面２１ｂ，２１ｃのうちリング状の周辺領域（明部３５ｂ参照）に照明光が入射し、周辺領域の各接平面は光軸２０ａに対して僅かに傾いているため、漏れ光の発生方向は、光軸２０ａに対して非平行となる。
【００４２】
ここで仮に、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂ，２１ｃのうち、光軸２０ａを含む円形状の中心領域（暗部３５ａ）にも、照明光が入射したとする。これは、開口絞り１４の遮光部位１４ａが取り除かれた構成の場合に相当し、対物レンズ２１に対する照明光の入射状態が図４（ａ），（ｂ）のようになる。このとき照明光の断面３６は、光軸２０ａを含む円形状である。
【００４３】
図４（ａ），（ｂ）の場合、レンズ面２１ｂ，２１ｃの周辺領域に入射した照明光の反射光Ｌａ（漏れ光）は、図３（ａ），（ｂ）の場合と同様、光軸２０ａに対して非平行となるが、レンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域に入射した照明光の反射光Ｌｂ（漏れ光）は、光軸２０ａに対して略平行となる。中心領域の各接平面は光軸２０ａに対して略垂直なためである。
【００４４】
そして、レンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域から発生した漏れ光は、光軸２０ａに略平行な方向に進行し、ダイクロイックミラー１８に到達する。ダイクロイックミラー１８は、漏れ光の波長域を僅かに透過する（５％程度）と共に、その透過光を散乱状態に変換してしまう。
したがって、レンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域から発生した漏れ光は、ダイクロイックミラー１８を透過した後、バリアフィルタ２２に斜め入射してしまうことになる。前述のように、バリアフィルタ２２に斜め入射した漏れ光は、蛍光と共にそのまま観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる要因となる。
【００４５】
しかし、本実施形態では、図３（ａ），（ｂ）のように、レンズ面２１ｂ，２１ｃのうちリング状の周辺領域（明部３５ｂ）のみに照明光を入射させるため、レンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域（暗部３５ａ）から漏れ光が発生することはない。つまり、光軸２０ａに対して略平行な漏れ光が発生することはない。
このため、図４（ａ），（ｂ）の場合のような事態、すなわち、光軸２０ａに対して略平行な漏れ光がダイクロイックミラー１８を透過して、バリアフィルタ２２に斜め入射し、蛍光と共にそのまま観察視野内に導かれるといった事態を確実に回避することができる。
【００４６】
本実施形態のように、レンズ面２１ｂ，２１ｃの周辺領域（明部３５ｂ）に照明光を入射させた場合、光軸２０ａに対して非平行な漏れ光は発生する。しかし、この漏れ光は、ダイクロイックミラー１８側に向けて進行するにつれて光軸２０ａから徐々に逸れていくため、ダイクロイックミラー１８やバリアフィルタ２２を透過して観察視野内に導かれること（つまり蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる要因となること）は殆どない。
【００４７】
したがって、本実施形態の蛍光顕微鏡１０によれば、ダイクロイックミラー１８から対物レンズ２１側に射出された照明光の一部が漏れ光となっても、この漏れ光が観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる事態を確実に回避できる。その結果、蛍光像のＳ／Ｎ比を確実に向上させることができ（像質改善）、コントラストの良い蛍光像を観察することが可能となる。
【００４８】
また、上記のような蛍光像の像質改善が、開口絞り１４の遮光部位１４ａのみで実現可能なため、構造が複雑化することはなく、安価に構成できる。
なお、上記した実施形態では、落射照明装置（１３〜１８）内の開口絞り１４に遮光部位１４ａを設けることにより、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域（暗部３５ａ）に照明光を入射させないようにしたが、本発明はこれに限定されない。例えば、観察系（２１〜２８）内の対物レンズ２１の瞳面２１ａに同様の遮光部位を設けてもよい。この場合、照明光の波長域を遮断すると共に、蛍光の波長域を透過するような材料で、遮光部位を構成することが好ましい。
【００４９】
また、ランプハウス（１１，２１）内の光源１１を、複数のＬＥＤ光源が２次元配列された構成とする場合、光軸１０ａを含む領域内のＬＥＤ光源を消灯させておくことで、同様の効果が得られる。なお、対物レンズ２１の瞳面２１ａに設けた遮光部位、および、ＬＥＤ光源の点灯／消灯を制御する回路は、本実施形態の開口絞り１４の遮光部位１４ａと共に、請求項の「減光手段」に対応する。
【００５０】
さらに、上記した実施形態では、遮光部位１４ａが設けられた落射照明装置（１３〜１８）を蛍光顕微鏡１０に組み込む例で説明したが、落射照明装置（１３〜１８）は、蛍光顕微鏡だけでなく、他の蛍光測定装置に組み込むこともできる。また、上記した実施形態では、開口絞り１４の遮光部位１４ａなどによって、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂ，２１ｃの中心領域（暗部３５ａ）における照明光の光強度を略零に低減する例（完全遮光）を説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、遮光部位１４ａの代わりに、ＮＤフィルタと同様の光学特性（照明光の光強度を低減させる光学特性）の部位を設けても良い。対物レンズ２１の瞳面２１ａに減光手段を設ける場合も同じである。
【００５１】
さらに、上記した実施形態では、開口絞り１４の遮光部位１４ａの径が固定となっているが、遮光部位１４ａの径を調節可能とすることが好ましい。対物レンズ２１の倍率を変更すると、対物レンズ２１のレンズ面２１ｂ，２１ｃの曲率が変わるため、これに応じて遮光部位１４ａの径も調整することが好ましい。
遮光部位１４ａの径が異なる複数の開口絞りを予め用意しておき、対物レンズの倍率変更に応じて切り換えて挿入してもよい。遮光部位１４ａの径だけでなく形状を変えても良い（例えば角形）。対物レンズ２１の瞳面２１ａに減光手段を設ける場合も同じである。
【００５２】
また、上記した実施形態では、光源１１，コレクタレンズ１２，レンズ１３によって開口絞り１４の位置に光源像１１ａを形成したが、このような光源手段（１１〜１３）に代えて、光ガイドを用いることもできる。光ガイドを用いる場合、その出射端面を開口絞り１４の近傍に配置することが好ましい。また、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどを用いてもよい。
【００５３】
さらに、上記した実施形態では、開口絞り１４，視野絞り１５の順に配置する例を説明したが、開口絞り１４と視野絞り１５の位置関係は逆でもよい。
また、上記した実施形態では、接眼レンズ２８によって結像面２８ａの蛍光像を目視で観察する例を説明したが、結像面２８ａにカメラの撮像面を配置し、カメラによって撮影された蛍光像を標本２０の蛍光画像として取り込み、観察してもよい。
【００５４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、光源から対物レンズ側に射出された照明光の一部が漏れ光となって観察視野内に導かれ、蛍光像のＳ／Ｎ比を低下させる事態を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光顕微鏡１０の全体構成図である。
【図２】蛍光顕微鏡１０の全体構成図である。
【図３】開口絞り１４の遮光部位１４ａによって光軸２０ａに略平行な漏れ光を遮断できることを説明する光路図である。
【図４】遮光部位１４ａが無い場合の漏れ光を説明する光路図である。
【符号の説明】
１０　蛍光顕微鏡
１１　光源
１２　コレクタレンズ
１３　レンズ
１４　開口絞り
１４ａ　遮光部位
１５　視野絞り
１６　レンズ
１７　励起フィルタ
１８　ダイクロイックミラー
１９　ステージ
２０　標本
２１　対物レンズ
２２　バリアフィルタ
２３　結像レンズ
２４〜２７　プリズム
２８　接眼レンズ[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescence microscope used for fluorescence observation of a specimen labeled with a fluorescent substance, and an epi-illumination device and an epi-illumination method for fluorescence observation for illuminating a specimen labeled with a fluorescent substance.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, fluorescence observation of a specimen labeled with a fluorescent substance has been performed using a fluorescence microscope or the like. The fluorescence observation of a specimen is a method in which a fluorescent substance in a specimen is excited by illumination light from a light source, fluorescence is generated from the fluorescent substance, and an image (fluorescent image) of the specimen is observed based on the fluorescence. Excitation of the fluorescent substance by the illumination light, that is, illumination of the specimen, is performed using an objective lens (epi-illumination).
[0003]
In such fluorescence observation, since the fluorescence from the specimen is weak, stray light (especially, leakage light of illumination light) is blocked as much as possible, and only the fluorescence is efficiently guided into the observation visual field, and the fluorescence (signal) and the stray light are reduced. It is important to improve the ratio (S / N ratio) to (noise). This is because the higher the S / N ratio, the more a fluorescent image with good contrast can be observed. Basically, a dichroic mirror and a barrier filter are arranged between the fluorescent image forming surface and the objective lens so as to block leakage of illumination light and improve the S / N ratio of the fluorescent image. .
[0004]
The dichroic mirror reflects illumination light and transmits fluorescence. The barrier filter absorbs illumination light and transmits fluorescence. The barrier filter is arranged on the fluorescent image forming surface side with respect to the dichroic mirror. That is, the last stage of the optical element that can block the leakage light of the illumination light is the barrier filter.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Incidentally, the leakage light of the illumination light travels in various directions, and may enter the barrier filter obliquely. Then, depending on the angle at which the light enters, the light passes through the barrier filter. Naturally, the leaked light after passing through the barrier filter is guided into the observation field as it is together with the fluorescent light, and becomes a factor for lowering the S / N ratio of the fluorescent image.
[0006]
Therefore, in recent years, a measure has been proposed to reduce the leakage light reaching the barrier filter, thereby reducing the leakage light guided into the observation visual field, and improving the S / N ratio of the fluorescent image. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-221953 focuses on components (leakage light) transmitted through the dichroic mirror without being reflected by the dichroic mirror from among the illumination light incident on the dichroic mirror from the light source side, and this leakage light does not reach the barrier filter. It is devised as follows.
[0007]
However, in the above-mentioned measures, it was not possible to avoid a situation where the following leaked light reaches the barrier filter (that is, a situation where it is guided into the observation visual field). The leakage light is incident on the dichroic mirror from the light source side, and the illumination light reflected by the dichroic mirror (illumination light emitted to the objective lens side) is reflected on the surface of the objective lens. Is the illumination light that could not reach the specimen.
[0008]
An object of the present invention is to provide a fluorescence microscope capable of avoiding a situation in which a part of illumination light emitted from a light source toward an objective lens is leaked and guided into an observation visual field, thereby lowering the S / N ratio of a fluorescent image. Another object of the present invention is to provide an epi-illumination device and an epi-illumination method for fluorescence observation.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
2. The fluorescence microscope according to claim 1, further comprising an objective lens, an imaging unit for forming a fluorescent image of the specimen labeled with a fluorescent substance, an epi-illumination unit for illuminating the specimen, and an incident light on the objective lens. And a dimming means for reducing the light intensity of the illumination light near the optical axis of the objective lens.
[0010]
According to a second aspect of the present invention, in the fluorescence microscope according to the first aspect, an optical system for defining a reference plane conjugate to a pupil plane of the objective lens is provided, and the dimming unit includes an optical axis of the optical system. An aperture stop disposed above and near the reference plane, wherein the aperture stop has an area smaller than a diameter when the illumination light is incident on the aperture stop and includes an optical axis of the optical system. And a part for reducing the light intensity of the illumination light.
[0011]
According to a third aspect of the present invention, in the fluorescence microscope according to the second aspect, the portion of the aperture stop is a light shielding portion that reduces the light intensity of the illumination light to substantially zero.
According to a fourth aspect of the present invention, there is provided an epi-illumination apparatus for fluorescence observation which illuminates a specimen labeled with a fluorescent substance by emitting illumination light toward an objective lens, wherein the illumination light is conjugated to a pupil plane of the objective lens. An optical system that defines a reference plane, comprising an aperture stop arranged on the optical axis of the optical system and near the reference plane, wherein the aperture stop has a region near the optical axis of the illumination light. A portion for reducing the light intensity of the illumination light is provided.
[0012]
According to a fifth aspect of the present invention, in the epi-illumination device for fluorescence observation according to the fourth aspect, the part of the aperture stop is a light-shielding part that reduces the light intensity of the illumination light to substantially zero.
According to a sixth aspect of the present invention, in the epi-illumination method for fluorescence observation for illuminating a specimen labeled with a fluorescent substance, the illumination light is emitted toward the objective lens side, and the illumination light is incident on the objective lens. Of these, the light intensity near the optical axis of the objective lens is reduced.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
This embodiment corresponds to claims 1 to 6. Here, as shown in FIGS. 1A and 2, an example of an epi-illumination device (13 to 18) incorporated in a fluorescence microscope 10 used for fluorescence observation of a specimen 20 and illuminating the specimen 20 will be described. .
[0014]
The fluorescent microscope 10 includes a lamp house (37) having a light source (11) and a collector lens (12), an observation system (21 to 28), in addition to an epi-illumination device (13 to 18) for fluorescence observation. Is provided. First, the observation target specimen 20 will be described, and then the observation system (21 to 28), the lamp house (37), and the epi-illumination device (13 to 18) of the fluorescence microscope 10 will be described in order.
[0015]
The specimen 20 is a biological specimen (DNA, protein, or the like) labeled with at least one kind of fluorescent substance, and is mounted on the stage 19. Then, when illuminated by the light source (11) in the lamp house (37) and the epi-illumination devices (13 to 18), the fluorescent substance in the specimen 20 is excited to generate fluorescence. The direction in which the fluorescence is generated is all directions regardless of the illumination direction.
[0016]
As shown in FIG. 2, the observation system (21 to 28) of the fluorescence microscope 10 includes, in order from the specimen 20 side along the optical axis 20a, an infinity-based objective lens 21, a barrier filter 22, and a second objective lens. In this configuration, an imaging lens 23 functioning as a lens, prisms 24-27, and an eyepiece 28 are arranged.
The barrier filter 22 has a spectral characteristic that selectively transmits the wavelength range of the fluorescence generated from the sample 20 and absorbs the wavelength range of the illumination light for the sample 20 (the wavelength range in which the fluorescent substance in the sample 20 can be excited). It is a wavelength selection filter. As the barrier filter 22, for example, an interference filter or a dye filter is used.
[0017]
In addition, the dichroic mirror 18 of the epi-illumination device (13 to 18) is arranged in front of the barrier filter 22. The dichroic mirror 18 has a spectral characteristic of reflecting the wavelength range of the illumination light with respect to the sample 20 and transmitting the wavelength range of the fluorescence generated from the sample 20.
When observing the fluorescence of the specimen 20, the fluorescence generated from the specimen 20 passes through the objective lens 21, the dichroic mirror 18, the barrier filter 22, the imaging lens 23, and the prisms 24 to 27, and forms an imaging surface in front of the eyepiece lens 28. The light enters the lens 28a and is condensed by the action of the objective lens 21 and the imaging lens 23.
[0018]
At this time, a fluorescent image of the specimen 20 based on the fluorescent light is formed on the imaging surface 28a. The fluorescent image on the imaging surface 28a is observed when the observer looks into the eyepiece 28. The objective lens 21 and the imaging lens 23 correspond to “imaging means” in the claims.
As shown in FIGS. 1A and 2, the lamp house (37) and the epi-illumination device (13 to 18) of the fluorescent microscope 10 sequentially include a light source 11, a collector lens 12, and an optical axis 10a. A configuration in which a lens 13, an aperture stop 14 (shown only in FIG. 1A), a field stop 15 (shown only in FIG. 2), a lens 16, an excitation filter 17, and a dichroic mirror 18 are arranged. Has become.
[0019]
Further, the lamp house (37) and the epi-illumination device (13-18) are arranged such that the optical axis 10a is substantially orthogonal to the optical axis 20a of the observation system (21-28) and the observation system (21-28). ) Is incorporated between the objective lens 21 and the barrier filter 22. At this time, the dichroic mirror 18 of the epi-illumination device (13 to 18) is arranged on the optical axis 20a.
[0020]
At the time of fluorescence observation of the specimen 20, the illumination light from the light source 11 roughly passes through the collector lens 12, the lens 13, the aperture stop 14 (FIG. 1A), the field stop 15 (FIG. 2), the lens 16, and the excitation filter 17. After transmitting, the light is reflected by the dichroic mirror 18 and guided on the optical axis 20a of the observation system (21 to 28). Then, after passing through the objective lens 21, the sample 20 is irradiated. As described above, the epi-illumination devices (13 to 18) are configured to illuminate the sample 20 using the objective lens 21.
[0021]
Further, in the epi-illumination device (13 to 18) of the present embodiment, a reference plane conjugate to the pupil plane 21a (illustrated only in FIG. 1A) of the objective lens 21 is defined by the lens 16, and the vicinity of this reference plane is defined. An aperture stop 14 is arranged on the optical axis 10a. The pupil plane 21a of the objective lens 21 is also called an entrance pupil plane or a rear focal plane. The lens 16 corresponds to an “optical system” in the claims. The epi-illumination devices (13 to 18) correspond to “epi-illumination means”.
[0022]
The light source 11 is a high-intensity light source such as a mercury lamp, for example, and emits illumination light such as ultraviolet light or visible light (illumination light including a wavelength range appropriate for exciting the fluorescent substance of the specimen 20) from the lamp core to the objective lens 21. It is emitted toward the collector lens 12 on the side. FIG. 1A shows an optical path of illumination light emitted from one point on the optical axis 10 a of the illumination light from the light source 11. FIG. 2 shows the optical path of the illumination light emitted along the optical axis 10a.
[0023]
The collector lens 12 and the lens 13 collect the illumination light from the light source 11 and, as shown in FIGS. 1A and 1B, in the vicinity of the aperture stop 14 (a reference conjugate with the pupil plane 21 a of the objective lens 21). The light source image 11a is formed in the vicinity of the surface). The illumination light is a parallel light flux between the collector lens 12 and the lens 13.
As shown in FIG. 1B, the aperture stop 14 is provided with a circular light-shielding portion 14a whose center is aligned with the optical axis 10a. The light shielding portion 14a is smaller than a cross section (that is, the light source image 11a) when the illumination light from the lens 13 enters the aperture stop 14. It is preferable that the diameter of the light shielding portion 14a be determined according to the magnification of the objective lens 21.
[0024]
The aperture stop 14 is also provided with portions 14b and 14c for supporting the light shielding portion 14a. The part 14b is rod-shaped. The part 14c is ring-shaped. The diameter of the part 14c is larger than the diameter of the light shielding part 14a. The light-shielding portion 14a is supported near the center of the ring-shaped portion 14c via a rod-shaped portion 14b.
Therefore, a substantially ring-shaped opening 14d is secured between the light shielding portion 14a and the ring-shaped portion 14c. The opening 14d is a transparent portion for passing illumination light incident on the aperture stop 14. As described above, the aperture stop 14 of the present embodiment is configured such that the circular light-shielding portion 14a and the ring-shaped opening 14d are arranged substantially concentrically.
[0025]
In the cross section of the illumination light incident on the aperture stop 14 (that is, the light source image 11a), in a region including the optical axis 10a (a region overlapping with the light shielding portion 14a), the light intensity of the illumination light is reduced to substantially zero, and Does not pass toward the field stop 15 (FIG. 2). In other areas (areas overlapping with the opening 14d), the light passes toward the subsequent field stop 15 (FIG. 2) without reducing the light intensity of the illumination light.
[0026]
The aperture stop 14 as described above can be easily obtained, for example, by applying a black matte coating to a plate member formed by press working. Instead of the matte coating, a light-shielding film such as an anti-reflection film or an absorption film may be applied. Also, cloth such as velvet may be stretched.
The illumination light transmitted through the aperture 14d of the aperture stop 14 enters the lens 16 via the field stop 15 (FIG. 2). The field stop 15 is arranged on a plane conjugate to both the specimen 20 and the imaging plane 28 a in front of the eyepiece 28. The illumination area of the specimen 20 is defined by the field stop 15.
[0027]
As described above, the lens 16 is an optical system that defines a reference plane conjugate to the pupil plane 21a of the objective lens 21 (FIG. 1). For this reason, the illumination light from the aperture 14 d of the aperture stop 14 arranged near the reference plane is focused on the pupil plane 21 a of the objective lens 21 by the action of the lens 16.
However, the illumination light transmitted through the lens 16 is not guided on the optical axis 20a of the observation system (21 to 28), that is, while traveling on the optical axis 10a of the epi-illumination device (13 to 18). , Through the excitation filter 17. The excitation filter 17 is a filter having a spectral characteristic that transmits an appropriate wavelength range to excite the fluorescent substance in the sample 20.
[0028]
Therefore, the illumination light transmitted through the excitation filter 17 becomes illumination light in a wavelength range capable of exciting the fluorescent substance in the sample 20 and enters the dichroic mirror 18, and is emitted toward the objective lens 21 by reflection therefrom. Is done. Then, illumination light in a wavelength range that can excite the fluorescent substance is focused on the pupil plane 21 a of the objective lens 21.
At this time, an image of the aperture stop 14 (hereinafter, referred to as “aperture stop image 34”) is formed on the pupil plane 21a of the objective lens 21. Further, as shown in FIG. 3A, the aperture stop image 34 includes a circular dark portion 34a and a ring-shaped bright portion 34b.
[0029]
FIG. 3A is a diagram in which the excitation filter 17 and the dichroic mirror 18 in FIG. 1A are omitted, and the optical axis 10a and the optical axis 20a are aligned on the same straight line. As can be seen from FIG. 3A, the dark portion 34a and the bright portion 34b of the aperture stop image 34 correspond to the light-shielding portion 14a and the opening 14d of the aperture stop 14, respectively. It is preferable to determine the diameter of the light shielding portion 14a of the aperture stop 14 so that the diameter of the dark portion 34a of the aperture stop image 34 is, for example, about 30% of the pupil diameter of the objective lens 21.
[0030]
As described above, in the present embodiment, since the aperture stop image 34 is formed on the pupil plane 21a of the objective lens 21, a circular central area (dark part 34a) including the optical axis 20a of the pupil plane 21a is illuminated. The light does not reach, and the illumination light reaches only the surrounding ring-shaped peripheral region (the bright portion 34b). Illumination light L indicated by a solid line in FIG. ₁ Exists, but the illumination light L indicated by the broken line ₂ Is non-existent.
[0031]
After the aperture stop image 34 is formed, the illumination light passes through the pupil plane 21a of the objective lens 21 and is incident on one lens surface 21b of the objective lens 21. At this time, the cross section 35 of the illumination light (FIG. 3B) includes a circular dark portion 35a and a ring-shaped bright portion 35b.
[0032]
That is, in the lens surface 21b of the objective lens 21, the illumination light does not reach the circular central region (dark portion 35a) including the optical axis 20a, and only the ring-shaped peripheral region (bright portion 35b) around it. Illumination light arrives. This is because the illumination light did not reach the central region (dark portion 34a) of the pupil plane 21a of the objective lens 21.
In this way, most of the illumination light that has reached the ring-shaped peripheral region (bright portion 35b) of the lens surface 21b of the objective lens 21 passes through the lens surface 21b as it is and enters the other lens surface 21c. At this time, the cross section of the illumination light includes a circular dark portion and a ring-shaped bright portion, as in the cross section 35 (FIG. 3B).
[0033]
That is, in the lens surface 21c of the objective lens 21, the illumination light does not reach the circular central region including the optical axis 20a, but reaches only the ring-shaped peripheral region around it. This is also because the illumination light did not reach the central region (dark portion 34a) of the pupil plane 21a of the objective lens 21.
Most of the illumination light that has reached the peripheral region of the lens surface 21c of the objective lens 21 passes through the lens surface 21c as it is and reaches the region 20b of the specimen 20. Here, the illumination light emitted from each point of the bright portion 34b of the aperture stop image 34 formed on the pupil plane 21a of the objective lens 21 becomes a parallel light flux after passing through the objective lens 21, and becomes the same area 20b of the specimen 20a. Is irradiated.
[0034]
As described above, in the fluorescence microscope 10 of the present embodiment, the lamp core of the light source 11, the aperture stop 14, and the pupil plane 21a of the objective lens 21 are conjugate (FIG. 1A), and the sample 20 and the field stop 15 And the imaging plane 28a are conjugate (FIG. 2), so that Koehler illumination is realized. For this reason, even when the illumination light passing through the objective lens 21 is out of center, the entire surface of the region 20b of the sample 20 is uniformly irradiated with the illumination light.
[0035]
In the region 20b irradiated with the uniform illumination light, the fluorescent substance is excited by the illumination light, and generates a fluorescent light of an amount corresponding to its own fluorescence generation efficiency (ratio of the amount of the fluorescent light to the amount of the fluorescent light). In the present embodiment, this fluorescence is guided to the imaging surface 28a of the above-described observation system (21 to 28). A fluorescent image of the specimen 20 is formed on the imaging surface 28a, and this fluorescent image is observed through the eyepiece 28 (fluorescent observation).
[0036]
Here, since the illumination light emitted from the light source 11 has a very high intensity, in practice, for example, an ND filter is inserted at an arbitrary point between the light source 11 and the dichroic mirror 18 so that the area 20b It is preferable to make the light amount of the illumination light at the time appropriate. The appropriate amount of illumination light is an amount of light in a range in which a proportional relationship between the amount of illumination light and the amount of fluorescence is maintained.
[0037]
In the fluorescence microscope 10 of the present embodiment, since the light-shielding portion 14a is provided in the aperture stop 14, the amount of illumination light in the region 20b of the specimen 20 is reduced by the area of the light-shielding portion 14a. However, the decrease in the amount of light due to the light-shielding portion 14a of the aperture stop 14 is slight, and the above-described ND filter is necessary in order to appropriately set the amount of illumination light in the region 20b of the sample 20.
[0038]
In the fluorescence observation as described above, since the fluorescence from the specimen 20 is weak, stray light (especially leakage light of illumination light) is blocked as much as possible, and only the fluorescence is efficiently guided into the observation visual field, and the S / N of the fluorescence image is reduced. It is important to improve the ratio. This is because the higher the S / N ratio, the more a fluorescent image with good contrast can be observed.
In the fluorescence microscope 10 of the present embodiment as well, basically, the dichroic mirror 18 and the barrier filter 22 are arranged between the imaging surface 28a and the objective lens 21 so as to block leakage of illumination light as much as possible. Only the weak fluorescent light from the light source is efficiently guided into the observation visual field to improve the S / N ratio of the fluorescent image.
[0039]
However, the barrier filter 22, which is the last stage of the optical element capable of blocking the leakage light of the illumination light, may transmit the leakage light when obliquely incident. The leaked light after passing through the barrier filter 22 is naturally guided into the observation field of view together with the fluorescent light, and becomes a factor for lowering the S / N ratio of the fluorescent image.
Therefore, in the present embodiment, attention is paid to the illumination light emitted to the objective lens 21 side after being reflected by the dichroic mirror 18, and a component (leakage light) of the illumination light that could not reach the sample 20 for some reason. However, by preventing the light from reaching the barrier filter 22, leakage light guided into the observation visual field is reduced, and the S / N ratio of the fluorescent image is improved.
[0040]
As described above, the illumination light emitted from the dichroic mirror 18 to the objective lens 21 side passes through the pupil surface 21a of the objective lens 21 (aperture stop image 34), and passes through one lens surface 21b of the objective lens 21. Of these, the light enters the ring-shaped peripheral region (the bright portion 35b). At this time, most of the illumination light passes through the lens surface 21b and travels toward the other lens surface 21c, but the remaining illumination light La (FIG. 3A) is reflected by the lens surface 21b and leaks. It becomes light.
[0041]
Similarly, the illumination light from one lens surface 21b enters the ring-shaped peripheral region of the other lens surface 21c. Most of the illuminating light passes through the lens surface 21c and travels toward the sample 20, but the remaining illuminating light is reflected by the lens surface 21c as in the case of the illuminating light La (FIG. 3A). And leak light.
The direction in which such leakage light is generated is approximately determined by the position where the illumination light enters the lens surfaces 21b and 21c. In the present embodiment, as described above, the illumination light is incident on the ring-shaped peripheral region (see the bright portion 35b) of the lens surfaces 21b and 21c, and each tangent plane of the peripheral region is slightly with respect to the optical axis 20a. Due to the inclination, the direction in which the leakage light is generated is non-parallel to the optical axis 20a.
[0042]
Here, it is assumed that the illumination light is also incident on the circular center region (dark portion 35a) including the optical axis 20a of the lens surfaces 21b and 21c of the objective lens 21. This corresponds to the case where the light-shielding portion 14a of the aperture stop 14 is removed, and the state of incidence of the illumination light on the objective lens 21 is as shown in FIGS. At this time, the cross section 36 of the illumination light has a circular shape including the optical axis 20a.
[0043]
In the case of FIGS. 4A and 4B, the reflected light La (leakage light) of the illumination light that has entered the peripheral area of the lens surfaces 21b and 21c is light as in the case of FIGS. 3A and 3B. Although not parallel to the axis 20a, the reflected light Lb (leakage light) of the illumination light incident on the central region of the lens surfaces 21b and 21c is substantially parallel to the optical axis 20a. This is because each tangent plane of the central region is substantially perpendicular to the optical axis 20a.
[0044]
Then, the leaked light generated from the central regions of the lens surfaces 21b and 21c travels in a direction substantially parallel to the optical axis 20a and reaches the dichroic mirror 18. The dichroic mirror 18 slightly transmits the wavelength range of the leaked light (about 5%) and converts the transmitted light into a scattered state.
Therefore, the leakage light generated from the central regions of the lens surfaces 21b and 21c is transmitted through the dichroic mirror 18 and then obliquely enters the barrier filter 22. As described above, the leaked light obliquely incident on the barrier filter 22 is directly guided into the observation visual field together with the fluorescent light, and causes a reduction in the S / N ratio of the fluorescent image.
[0045]
However, in the present embodiment, as shown in FIGS. 3A and 3B, since the illumination light is incident only on the ring-shaped peripheral region (bright portion 35b) of the lens surfaces 21b and 21c, No light leaks from the central region (dark portion 35a) of 21c. That is, leak light substantially parallel to the optical axis 20a does not occur.
For this reason, the situation as in the case of FIGS. 4A and 4B, that is, leaked light substantially parallel to the optical axis 20a passes through the dichroic mirror 18 and obliquely enters the barrier filter 22 to generate fluorescent light. At the same time, it is possible to reliably avoid a situation where the user is guided into the observation visual field as it is.
[0046]
As in the present embodiment, when the illumination light enters the peripheral area (bright portion 35b) of the lens surfaces 21b and 21c, non-parallel leakage light is generated with respect to the optical axis 20a. However, since this leaked light gradually deviates from the optical axis 20a as it progresses toward the dichroic mirror 18 side, it passes through the dichroic mirror 18 and the barrier filter 22 and is guided into the observation visual field (that is, the fluorescence image). Is a factor that lowers the S / N ratio).
[0047]
Therefore, according to the fluorescence microscope 10 of the present embodiment, even if part of the illumination light emitted from the dichroic mirror 18 toward the objective lens 21 becomes leakage light, the leakage light is guided into the observation visual field, and A situation that lowers the S / N ratio of the image can be reliably avoided. As a result, the S / N ratio of the fluorescent image can be reliably improved (improved image quality), and a fluorescent image with good contrast can be observed.
[0048]
Further, since the image quality improvement of the fluorescent image as described above can be realized only by the light shielding portion 14a of the aperture stop 14, the structure is not complicated and the structure can be formed at a low cost.
In the above-described embodiment, the illumination light is applied to the central region (dark portion 35a) of the lens surfaces 21b and 21c of the objective lens 21 by providing the light blocking portion 14a in the aperture stop 14 in the epi-illumination device (13 to 18). Although the light was not made incident, the present invention is not limited to this. For example, a similar light shielding portion may be provided on the pupil plane 21a of the objective lens 21 in the observation system (21 to 28). In this case, it is preferable that the light-shielding portion is made of a material that blocks the wavelength range of the illumination light and transmits the wavelength range of the fluorescent light.
[0049]
Further, when the light source 11 in the lamp house (11, 21) has a configuration in which a plurality of LED light sources are two-dimensionally arranged, the LED light source in the region including the optical axis 10a is turned off, so that the same applies. The effect is obtained. The light-shielding portion provided on the pupil plane 21a of the objective lens 21 and the circuit for controlling the turning on / off of the LED light source are provided together with the light-shielding portion 14a of the aperture stop 14 of the present embodiment, as a "dimming means". Corresponding to
[0050]
Further, in the above-described embodiment, an example has been described in which the epi-illumination devices (13 to 18) provided with the light shielding portions 14a are incorporated in the fluorescence microscope 10, but the epi-illumination devices (13 to 18) are not limited to the fluorescence microscope. , Can be incorporated in other fluorescence measurement devices. In the above-described embodiment, the light intensity of the illumination light in the central region (dark portion 35a) of the lens surfaces 21b and 21c of the objective lens 21 is reduced to substantially zero by the light shielding portion 14a of the aperture stop 14 (complete light shielding). ), But the present invention is not limited to this. For example, a part having the same optical characteristics as the ND filter (optical characteristics for reducing the light intensity of illumination light) may be provided instead of the light shielding part 14a. The same applies to the case where the dimming means is provided on the pupil plane 21a of the objective lens 21.
[0051]
Further, in the above-described embodiment, the diameter of the light shielding portion 14a of the aperture stop 14 is fixed, but it is preferable that the diameter of the light shielding portion 14a can be adjusted. When the magnification of the objective lens 21 is changed, the curvatures of the lens surfaces 21b and 21c of the objective lens 21 change. Therefore, it is preferable to adjust the diameter of the light shielding portion 14a accordingly.
A plurality of aperture stops having different diameters of the light shielding portion 14a may be prepared in advance, and may be switched and inserted according to a change in magnification of the objective lens. The shape as well as the diameter of the light shielding portion 14a may be changed (for example, a square shape). The same applies to the case where the dimming means is provided on the pupil plane 21a of the objective lens 21.
[0052]
Further, in the above embodiment, the light source image 11a is formed at the position of the aperture stop 14 by the light source 11, the collector lens 12, and the lens 13, but a light guide is used instead of such light source means (11 to 13). You can also. In the case where a light guide is used, it is preferable to arrange the exit end face near the aperture stop 14. Further, a small semiconductor laser, a light emitting diode, or the like may be used.
[0053]
Further, in the above-described embodiment, an example has been described in which the aperture stop 14 and the field stop 15 are arranged in this order, but the positional relationship between the aperture stop 14 and the field stop 15 may be reversed.
Further, in the above-described embodiment, an example in which the fluorescent image on the imaging surface 28a is visually observed by the eyepiece lens 28 has been described. However, the imaging surface of the camera is disposed on the imaging surface 28a, and the fluorescent image May be captured as a fluorescence image of the specimen 20 and observed.
[0054]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a part of the illumination light emitted from the light source toward the objective lens becomes leakage light and is guided into the observation visual field, thereby lowering the S / N ratio of the fluorescent image. Can be avoided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an overall configuration diagram of a fluorescence microscope 10.
FIG. 2 is an overall configuration diagram of the fluorescence microscope 10.
FIG. 3 is an optical path diagram illustrating that leakage light substantially parallel to the optical axis 20a can be blocked by a light shielding portion 14a of the aperture stop 14.
FIG. 4 is an optical path diagram illustrating light leakage when there is no light-shielding portion 14a.
[Explanation of symbols]
10 Fluorescence microscope
11 Light source
12 Collector lens
13 lenses
14 Aperture stop
14a Shading area
15 Field stop
16 lenses
17 Excitation filter
18 dichroic mirror
19 stages
20 specimens
21 Objective lens
22 Barrier filter
23 Imaging lens
24-27 prism
28 Eyepiece

Claims

Imaging means having an objective lens and forming a fluorescent image of a specimen labeled with a fluorescent substance,
Epi-illumination means for illuminating the specimen,
A fluorescence microscope, comprising: a dimming unit that reduces light intensity near an optical axis of the objective lens among illumination light incident on the objective lens.

The fluorescence microscope according to claim 1,
An optical system that defines a reference plane conjugate to a pupil plane of the objective lens,
The dimming unit includes an aperture stop disposed on the optical axis of the optical system and near the reference plane,
The aperture stop is provided with a portion that reduces the light intensity of the illumination light in a region smaller than a diameter of the illumination light when entering the aperture stop and including an optical axis of the optical system. A fluorescence microscope, characterized in that:

The fluorescence microscope according to claim 2,
The fluorescence microscope according to claim 1, wherein the portion of the aperture stop is a light shielding portion that reduces the light intensity of the illumination light to substantially zero.

In an epi-illumination device for fluorescence observation that illuminates a specimen labeled with a fluorescent substance by emitting illumination light toward an objective lens,
An optical system that defines a reference plane conjugate to a pupil plane of the objective lens;
An aperture stop disposed on the optical axis of the optical system and near the reference plane,
An epi-illumination device for fluorescence observation, wherein the aperture stop is provided with a portion for reducing the light intensity of the illumination light in a region near the optical axis of the illumination light.

The epi-illumination device for fluorescence observation according to claim 4,
The epi-illumination device for fluorescence observation, wherein the portion of the aperture stop is a light-shielding portion that reduces the light intensity of the illumination light to substantially zero.

In an epi-illumination method for fluorescence observation that illuminates a specimen labeled with a fluorescent substance,
The illumination light is emitted toward the objective lens,
An epi-illumination method for fluorescence observation, characterized in that of the illumination light incident on the objective lens, a light intensity near an optical axis of the objective lens is reduced.