JP2004008132A

JP2004008132A - Transformed yeast, method for measuring polycyclic aromatic compound using the same yeast and kit for measuring the polycyclic aromatic compound

Info

Publication number: JP2004008132A
Application number: JP2002168074A
Authority: JP
Inventors: Koji Yagi; 八木　孝司; Akihide Ito; 伊藤　彰英
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Osaka Prefecture
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Osaka Prefecture
Priority date: 2002-06-10
Filing date: 2002-06-10
Publication date: 2004-01-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly measuring a polycyclic aromatic compound which exists in the environment, etc., in a simple operation by using a biochemical technique. <P>SOLUTION: An Ah receptor has a specific sequence derived from a mouse. A protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids are lost, substituted or added in the amino acid sequence and functions as the Ah receptor. A mouse Arnt protein has a specific amino acid sequence. A protein has an amino acid sequence in which one or several amino acids are lost, substituted or added in the amino acid sequence and functions as Arnt. The transformed yeast is obtained by inducing DNA encoding these proteins so as to enable expression into a chromosome. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイオキシン類に代表される多環芳香族化合物の測定に利用可能な形質転換酵母、この形質転換酵母を用いた多環芳香族化合物の測定方法、および多環芳香族化合物測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の検出や分析には、高価で大掛りな分析装置が必要であり、操作も煩雑である。また、機器分析では、被験物中に含まれる多種の多環芳香族化合物を分離して検出することは可能であるが、測定結果から環境中の総合的な毒性を判断することは難しい。
【０００３】
ところで、動物にダイオキシン類などの多環芳香族化合物を投与した場合に薬物代謝酵素の誘導を仲介する因子としてＡｈレセプター（アリルハイドロカーボンレセプター；ａｒｙｌ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の存在が知られている。また、Ａｈレセプターの補助因子としてＡｒｎｔ（ａｒｙｌ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）と呼ばれる核内移動因子も同定されている。ＡｈレセプターおよびＡｒｎｔは、多環芳香族化合物と複合体を形成してリガンド応答性の遺伝子発現に関与し、他の構造遺伝子の転写調節因子として機能するものである。
【０００４】
そして、特開２０００−３５４４９４号公報や特開２００１−７８７８２号公報では、ラットやハムスター由来のＡｈレセプター遺伝子を、レポーター遺伝子とともに細胞に導入し、得られた形質転換細胞を利用して化学物質などのレポーターアッセイを行う方法や、形質転換細胞を培養して得られるＡｈレセプターを利用してレセプターバインディングアッセイを行う方法が提案されている。しかし、上記公報の形質転換細胞は、宿主細胞として昆虫やヒト由来の培養細胞を用いる方法であるため、培養方法が煩雑で培養時間も長いことから、多環芳香族化合物の測定結果が出るまでに時間がかかるという問題がある。
【０００５】
一方、Ａｈレセプター遺伝子を導入して形質転換した微生物として、ヒト由来のＡｈレセプター遺伝子を導入したサッカロマイセス・シェレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用い、数種の多環芳香族化合物に対するリガンド応答性を調査した報告がなされている［Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１６０，　２９７−３０３（１９９９）］。しかし、この報告で使用されているヒト由来のＡｈレセプター遺伝子はリガンド応答性が低く、多環芳香族化合物の検出感度が低い。また、本発明者が行った試験結果によれば、ヒト由来のＡｈレセプター遺伝子を導入した形質転換酵母を用いる方法では、バックグラウンド値が高くなる傾向があるため、環境中に微量に含まれる多環芳香族化合物の測定に適したものとは言えない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境中などに存在する多環芳香族化合物を、生化学的な手法を用いて簡易な操作で迅速に測定する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、請求項１に記載の形質転換酵母の発明は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に発現可能に導入されていることを特徴とする。
【０００８】
この形質転換酵母は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子が導入されているため、後記実施例に示されるように、ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の測定において、検出感度が高い一方で、バックグラウンドを低くすることができる。また、この形質転換体の宿主細胞は酵母であるため、培養細胞に比べて取り扱いが容易であり、増殖も速く測定に長時間を要しない。さらに、使用する機器も簡易なもので済み、安価に多環芳香族化合物の分析が可能になる。
【０００９】
また、請求項２に記載の形質転換酵母の発明は、下記の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡと、下記の（ｃ）または（ｄ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡとが染色体内に発現可能に導入されたことを特徴とする。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｈレセプター。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｒｎｔ。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質。
この請求項２に記載された形質転換酵母についても、上記請求項１に記載の形質転換酵母と実質的に同様の作用効果が得られる。
【００１０】
また、請求項３に記載の形質転換酵母の発明は、請求項１または請求項２において、レポータープラスミドを細胞内に有しており、該レポータープラスミドは、ＡｈレセプターもしくはＡｈレセプターとして機能する蛋白質、ＡｒｎｔもしくはＡｒｎｔとして機能する蛋白質、および多環芳香族化合物から形成される複合体が結合可能な塩基配列と、レポーター遺伝子とを含むプラスミドであることを特徴とする。この形質転換酵母は、ＡｈレセプターもしくはＡｈレセプターとして機能する蛋白質、ＡｒｎｔもしくはＡｒｎｔとして機能する蛋白質および多環芳香族化合物からなる複合体（以下、単に「複合体」と記すことがある）が結合可能な塩基配列（以下、「複合体認識配列」と記すことがある）とレポーター遺伝子とを含むプラスミドを細胞内に有することにより、形質転換酵母内でレポーター遺伝子の発現までを行うことが可能になる。したがって、多環芳香族化合物の測定に際し、処理操作の簡素化と測定時間の短縮を図ることができる。
【００１１】
請求項４に記載の多環芳香族化合物の測定方法は、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の形質転換酵母を被験物に接触させることを特徴とする。この特徴によれば、多環芳香族化合物の測定において、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載した形質転換酵母の利点が如何なく発揮される。すなわち、測定における検出感度が高い一方で、バックグラウンドが低く、信頼性の高い測定結果が得られる。また、酵母を用いるため、培養細胞に比べて操作が容易であり、測定に長時間を必要としない。さらに、使用する機器も簡易なもので済み、安価に多環芳香族化合物の分析が可能になる。
また、複合体認識配列とレポーター遺伝子とを含むプラスミドを細胞内に有する形質転換酵母を使用する場合には、レポーター遺伝子の発現により生成する酵素等の活性を測定することにより、簡単に多環芳香族化合物を測定できるので、処理操作の簡素化と測定時間の短縮を図ることができる。
さらに、本測定方法は、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物の生体感受性に深く関与するＡｈレセプターの機能を利用する方法であるため、測定結果は機器分析と異なり毒性等量（ＴＥＱ）を反映しており、生体への影響を知る指標となり得る。したがって、環境中の多環芳香族化合物の検出や定量に利用する意義が極めて大きい測定方法である。
また、本測定方法は、リガンド応答性の遺伝子発現を利用するため、被験目的とする多環芳香族化合物への特異性が高い方法である。
【００１２】
請求項５に記載の多環芳香族化合物測定用キットの発明は、少なくとも、請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の形質転換酵母を含むことを特徴とする。この多環芳香族化合物測定用キットを用いることにより、多環芳香族化合物の高精度の測定を容易に行うことができる。
【００１３】
請求項６に記載の多環芳香族化合物測定用キットの発明は、請求項５において、さらに、前記形質転換酵母の培養用組成物と、前記形質転換酵母を溶菌可能な成分を含む緩衝液と、前記レポータープラスミドの活性を識別するための試薬と、を含むことを特徴とする。この多環芳香族化合物測定用キットは、多環芳香族化合物を測定するために必要な試薬等の要素を最適な組み合わせで具備したものであるため、このキットを用いることにより、吸光度計などの簡易な計測器を準備するだけでダイオキシン類等の多環芳香族化合物の高精度の測定が可能になる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に係る形質転換酵母は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子とマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子とが染色体内に発現可能に導入されたものである。ここでマウス由来のＡｈレセプター遺伝子やマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子の塩基配列は公知であり、一般的に利用可能なデータベースからも入手できる［例えば、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子ＮＭ０１３４４（ＮＣＢＩ）；例えば、マウス由来のＡｒｎｔ遺伝子Ｕ１０３２５（ＮＣＢＩ）など］。
【００１５】
マウス由来のＡｈレセプター遺伝子の具体的な例としては、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡのほか、この配列番号３で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００１６】
また、マウス由来のＡｒｎｔ遺伝子の具体的な例としては、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡのほか、配列番号４で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡも用いることができる。
【００１７】
上記「配列番号３で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ」や、上記「配列番号４で表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡ」は、配列番号３マウス由来のＡｈレセプター遺伝子や配列番号４のマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子を元に、例えば部位特異的変位導入法などの方法で作成できる。
【００１８】
また、本発明の形質転換酵母は、下記の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡと、および下記の（ｃ）または（ｄ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡとが染色体内に発現可能に導入されたもの、としても特定され得る。
【００１９】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｈレセプター。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質。
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するマウスＡｒｎｔ。
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質。
【００２０】
ここで、上記（ｂ）の「配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｈレセプターとして機能する蛋白質」や上記（ｄ）の「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＡｒｎｔとして機能する蛋白質」についても、前記と同様にマウス由来のＡｈレセプター遺伝子やマウス由来のＡｒｎｔ遺伝子を元に、例えば、部位特異的変位導入法などの方法で作成できる。
【００２１】
本発明で形質転換に使用する酵母は、一般的に遺伝子組換え技術が適用できるものであれば特に制限なく利用できるが、もっとも技術の確立しているものとしては、サッカロマイセス・シェレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いることが好ましい。この他、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）や糸状酵母（Ｃａｎｄｉｄａ）等も遺伝子組換え技術が適用できるものであれば制限なく利用できる。
【００２２】
形質転換酵母の調製は、例えば以下のような手順で行うことができる。
マウスのＤＮＡ中のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子の作成は、上記配列番号３および配列番号４の塩基配列や、一般に利用可能なデータベース（前掲）の情報を元に、適切なプライマーを選定してＰＣＲ法を利用したり、化学合成などにより行うことができる。
【００２３】
ＰＣＲ法では、テンプレートとなるマウスのＤＮＡを元に、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列の一部など）をプライマーとしてＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子を合成することができる。ここでテンプレートとなるマウスのＤＮＡは、マウスの組織から、公知の遺伝子工学的手法により入手できる。例えば、マウスの肝臓などの組織由来のＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖のｃＤＮＡを合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドやファージなどのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このｃＤＮＡライブラリーから、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列の一部など）をプローブとして利用するハイブリダイゼーション法等によってテンプレートとなるＤＮＡを入手することができる。また、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の部分的な塩基配列を元にプライマーを作成し、上記ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によって直接Ａｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子を合成することもできる。
【００２４】
また、化学合成の場合は、公知のＡｈレセプター遺伝子やＡｒｎｔ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号３、配列番号４の塩基配列）から、ホスホアミダイト法など既知の方法に従い合成すればよい。
【００２５】
次に、得られた遺伝子を適切な制限酵素（例えば、Ｓａｌ　Ｉ、Ｈｐａ　Ｉ等）により処理し、同様に切断した酵母用シャトルベクター［例えば、ｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４等（以上、タカラ酒造製）、ｐｌ−ＲＥＤ１（東洋紡製）等］と修飾酵素［例えば、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡製）、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（タカラ酒造製）、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（以上、ＮＥＢ製）等］を用いてライゲーションする。ライゲーションの終わったＤＮＡを例えばエレクトロポーレーション法や、リン酸カルシウム法などにより化学的処理をした大腸菌の細胞等に形質転換し、適量まで増殖させた後、例えば溶菌、吸着抽出などにより目的のプラスミドを取り出す。
【００２６】
上記のような処理をしたシャトルベクターを例えばエレクトロポーレーション法や酢酸リチウム法などの化学的処理により、酵母に対し形質転換し、適切な選択培地等を用いて形質転換体を選抜する。
【００２７】
形質転換酵母は、Ａｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子が染色体内に導入されているため、リガンド（多環芳香族化合物）応答性の遺伝子発現に関与する転写調節因子としてのマウスＡｈレセプターやマウスＡｒｎｔを産生する。
【００２８】
すなわち、形質転換酵母が多環芳香族化合物に接触すると、ＡｈレセプターとＡｒｎｔとが、多環芳香族化合物と複合体を形成する。この複合体は、ＤＮＡ上のＸＲＥ（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）とよばれるエンハンサー領域などの複合体認識配列に結合し、その下流の構造遺伝子の発現を誘導する。
【００２９】
したがって、上記性質を利用し、複合体を直接公知の免疫学的測定法などにより測定したり、あるいは酵母細胞にリガンド応答性遺伝子発現により誘導され得るレポーター遺伝子を導入しておき、その発現産物を測定できるようにしておくことにより、多環芳香族化合物を測定することができる。特に、形質転換酵母として、リガンド応答性遺伝子発現によりレポーター遺伝子が誘導されるよう構築したプラスミド（レポータープラスミド）を形質転換酵母の細胞内に導入しておくことにより、多環芳香族化合物を容易に測定することができる。
【００３０】
レポータープラスミドの例としては、Ａｈレセプター、Ａｒｎｔおよび多環芳香族化合物から形成される複合体が結合可能な複合体認識配列と、適切なプロモーターにより発現可能な状態のレポーター遺伝子とを含むプラスミドを挙げることができる。レポーター遺伝子としては、レポーター遺伝子によりコードされる酵素などの測定を容易に行えるものが好ましく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子など既知のレポーター遺伝子を利用することができる。また、複合体認識配列としては、公知のＸＲＥ（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）などの塩基配列［上掲のＭｉｌｌｅｒ，　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１６０，　２９７−３０３（１９９９）参照］を、化学合成等の手法で作成したものが利用できる。本発明では、マウス由来のＡｈレセプターおよびＡｒｎｔを用いるため、ＸＲＥもマウス由来のものを用いることが好ましい。
【００３１】
形質転換体に導入するレポータープラスミドの構築は、例えば、市販の酵母用自立発現型ベクター［例えば、ｐＥＳＰ　ＶＥＣＴＯＲＳ（東洋紡製）、ｐＡＵＲ１１２（タカラ酒造製）等］に前記した複合体認識配列とレポーター遺伝子を適切な遺伝子組換え手法に従い導入することによって行うことができる。
【００３２】
このレポータープラスミドを形質転換酵母に対し、例えばエレクトロポーレーション法や酢酸リチウム法などの化学的処理により導入することで、レポータープラスミドを有する形質転換酵母を得ることができる。レポータープラスミドを導入した本発明形質転換酵母の例として、サッカロマイセス・シェレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＹＡ−０１０６株（ＩＦＯ　１１０２８）を挙げることができる。
【００３３】
以上のようにして得られた形質転換酵母は、通常の培養条件で継代培養できるほか、凍結乾燥して保存することも可能である。
【００３４】
本発明の多環芳香族化合物の測定方法は、上記形質転換酵母を被験物に接触させることにより行われる。ここで多環芳香族化合物としては、例えば、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β−ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ベンゾピレンおよびその誘導体、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレンなどを挙げることができる。被験物としては、特に制限はないが、例えばダイオキシン類による汚染が懸念される水、土壌、焼却灰などを挙げることができる。また、形質転換酵母を被験物に接触させる方法としては、例えば形質転換酵母、または形質転換酵母を含む培養液を試験物と混合することや、その混合状態を酵母の培養条件下で所定時間維持して多環芳香族化合物を形質転換酵母菌体に十分作用させることによって実施される。
【００３５】
本発明測定方法の一般的な実施方法の例を挙げれば、以下のとおりである。　まず、測定においては、形質転換酵母を前培養して菌の増殖を図り、十分な菌体量を確保することが好ましい。
前培養は、形質転換酵母として表１に示すようなアミノ酸、無機塩、ビタミン類、糖類等からなる培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、培養液５０μｌを分取し、表１に示す培地５０００μｌ中に加え、例えば３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって行う。形質転換酵母が凍結乾燥菌体である場合には、例えばＹＰＤ培地などの栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μｌ分取し、前記と同様に表１に示す培地５０００μｌに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって前培養を行う。
【００３６】
【表１】

【００３７】
前培養により菌が十分に増殖したら、レポーター遺伝子のプロモーターの特性にあった培地（例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼである場合は、炭素源としてガラクトースを使用したものなど）中に、被験物と前培養液を適当な割合で混合し、２８〜３０℃程度の温度条件で所定時間（例えば１８時間程度）培養して多環芳香族化合物を菌体に対し十分作用させる。被験物が固体の場合には、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の菌体に対して毒性を示さない溶媒を用い、被験物を溶解し、あるいは被験物中の多環芳香族化合物を抽出してから混合することが好ましい。
【００３８】
被験物と形質転換酵母との接触を十分に行った後、公知の手法により形質転換酵母菌体を溶菌させる。
すなわち、例えば表２に示すＺ緩衝液（溶菌剤として、界面活性剤のサルコシルを添加）などにより菌体を溶菌させる。
【００３９】
【表２】

【００４０】
次に、上記溶菌液を適量採取し、複合体の結合により活性化したレポータープラスミドの酵素活性等を適切な手段により測定する。例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼをコードする場合であれば、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、常法により吸光度を測定する。この測定において、予め既知の濃度の多環芳香族化合物を測定し、検量線を作成しておくことにより、被験物中の多環芳香族化合物を測定することが可能になる。なお、前記検量線は被験物の測定と同時に作成することが望ましい。また、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物を適宜希釈することが重要である。
【００４１】
上記の本発明測定方法を簡単に実施するため、前記形質転換酵母を含む多環芳香族化合物の測定用キットを作成しておくこともできる。この測定用キットには、例えば、凍結乾燥形質転換酵母に加え、形質転換酵母の培養用組成物（液状または粉末状培地）、形質転換酵母を溶菌可能な成分を含む緩衝液、レポータープラスミドの活性を識別する試薬、濃度既知の試料に基づき作成した検量線データなどの構成要素を含めることができる。キットに含める上記各構成要素は、それぞれ前記した内容に準じて調製することができる。なお、ポリスチレンに吸着しやすいメチルコラントレン等が被験物である場合は、試験操作にはガラス製の容器、器具を用いることが好ましい。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例および比較例等を挙げ本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら制約を受けるものではない。
【００４３】
実施例１
＜Ａｒｎｔ遺伝子の作成＞
Ａｒｎｔ遺伝子は、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲ法により作成した。
Ｃ５７ＢＬマウス肺細胞より、ＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡＲＴ−ＰＣＲ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（東洋紡製）により全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ）を抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）　Ｑｕｉｋ　ｍＲＮＡ（東洋紡製）を用いてｍ−ＲＮＡの精製を行った。これにより得られたｍ−ＲＮＡをＲｅｖｅｒ　ＴｒａＡｃｅ−α（東洋紡製）により逆転写反応させることでｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことでＲＴ−ＰＣＲ法を行った。この時のＰＣＲ反応では、プライマーとして配列番号５の塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号６の塩基配列のリバースプライマーを用いた。
【００４４】
ＰＣＲ法に使用する反応液は以下の組成のものを用いた。
反応液：５μｌＫＯＤ＋用緩衝液、５μｌ　２ｍＭｄＮＴＰ、
２μｌ　２５ｍＭＭｇＣｌ_２、１．５μｌ　プライマー、
２μｌ　テンプレート、１μｌ　ＫＯＤ＋ポリメラーゼ（東洋紡製）
【００４５】
また、ＰＣＲ法における温度条件は、▲１▼９４℃で熱変性、▲２▼５３℃で３０秒のアニーリング、▲３▼６８℃で７分の伸長を１サイクルとし、▲１▼〜▲３▼を３０サイクル繰り返して反応を行った。
【００４６】
＜Ａｈレセプター遺伝子の作成＞
Ａｈレセプター遺伝子も、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲ法により作成した。
Ｃ５７ＢＬマウス肺細胞より、ＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡＲＴ−ＰＣＲ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（東洋紡製）により全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡ）を抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）　Ｑｕｉｋ　ｍＲＮＡ（東洋紡製）を用いてｍ−ＲＮＡの精製を行った。これにより得られたｍ−ＲＮＡをＲｅｖｅｒ　ＴｒａＡｃｅ−α（東洋紡製）により逆転写反応させることでｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことでＲＴ−ＰＣＲ法を行った。この時のＰＣＲ反応では、プライマーとして配列番号７の塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号８の塩基配列のリバースプライマーを用いた。
【００４７】
ＰＣＲ法に使用する反応液は以下の組成のものを用いた。
反応液：５μｌＫＯＤ＋用緩衝液、５μｌ　２ｍＭｄＮＴＰ、
２μｌ　２５ｍＭＭｇＣｌ_２、１．５μｌ　プライマー、
２μｌ　テンプレート、１μｌ　ＫＯＤ＋ポリメラーゼ（東洋紡製）
【００４８】
また、ＰＣＲ法における温度条件は、▲１▼９４℃で熱変性、▲２▼５３℃で３０秒のアニーリング、▲３▼６８℃で７分の伸長を１サイクルとし、▲１▼〜▲３▼を３０サイクル繰り返して反応を行った。
【００４９】
＜プロモーターとのライゲーション＞
Ｇａｌ　１，１０プロモーター領域を有するプラスミド（ＹＥｐ１８１　Ｇａｌ　１，１０；ＧｅｎＢａｎｋ，ｐＢＭ２７２）をＢａｍＨ　ＩおよびＳａｌ　Ｉで処理し、同じくＢａｍＨ　ＩおよびＳａｌＩで処理したＡｒｎｔ遺伝子をＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。得られた反応物をＳｍａ　ＩおよびＥｃｏＲ　Ｉで処理した後、Ｓｍａ　ＩおよびＭｆｅ　Ｉで処理したＡｈレセプター遺伝子をＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。
【００５０】
＜シャトルベクターの作成＞
得られたプロモーターと上記遺伝子のライゲーション産物をＳａｌ　ＩおよびＨｐａ　Ｉを用いて処理し、Ｓａｌ　ＩおよびＳｍａ　Ｉで処理したシャトルベクターｐＡＵＲ１０１
（タカラ酒造製）にＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡製）を用い、１６℃でライゲーションした。
【００５１】
＜形質転換＞
上記の作成されたシャトルベクターをサッカロマイセス・シェレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＭＹＡ−１５１）に酢酸リチウム法によって形質転換した。
【００５２】
＜レポータープラスミドの導入＞
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＲＷ９５−３［Ｗｏｌｆ　ｅｔａｌ．；　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２０，　５６８−５７３　（１９９６）］のＢａｍＨ　ＩとＸｍａ　Ｉの切断部位に、マウス由来のＸＲＥ配列を含む配列番号９の塩基配列をライゲーションした。このプラスミドを酢酸リチウム法により前記形質転換サッカロマイセス・シェレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３株に導入し本発明形質転換酵母とした。
【００５３】
比較例１
実施例１のマウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子に替え、ヒト由来のＡｈレセプター遺伝子［配列番号１０；ＸＭ　００４９８８（ＮＣＢＩ）］およびヒト由来のＡｒｎｔ遺伝子［配列番号１１；ＮＭ　００１６６８（ＮＣＢＩ）］を用いる以外は実施例１に準じて比較形質転換酵母を作成した。
【００５４】
試験例１
β−ガラクトシダーゼ活性の調査：
実施例１で得た本発明形質転換酵母のコロニーをＹＰＤ培地に接種し、３０℃で６００ｎｍの吸光度が２になるまで培養した。その後、培養液５０μｌを表１に示される培地５０００μｌに対して加え、３０℃で１２時間振とう培養し、前培養により菌の増殖を図った。培養液は菌体の濃度を６００ｎｍの吸光度が１になるように調製した。
【００５５】
次に９６穴のウェルプレートに、多環芳香族化合物としてナフトフラボン、メチルコラントレン、ベンゾピレンを所定濃度となるようにＤＭＳＯに溶かしたものをそれぞれ１μｌずつ入れ、さらに前掲表１の培地の炭素源としてガラクトースを使用したもの２００μｌ、および前述の培養液を５μｌ入れ、３０℃で１８時間培養した。
【００５６】
培養の終わったプレートから別の新しいプレートに対し、各１０μｌを分注し、Ｚ緩衝液（前掲表２）１４０μｌ、および４ｍｇ／ｌの濃度のＯＮＰＧを５０μｌ入れ、３７℃で１時間培養した。培養後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定し、下式に基づきβ―ガラクトシダーゼ活性を算出した。
【００５７】
【数１】

【００５８】
各試験区分（ナフトフラボン、メチルコラントレン、ベンゾピレン）における各濃度でのβ―ガラクトシダーゼ活性を図１に示した。
【００５９】
試験例２
バックグラウンド値の測定：
実施例１で得た本発明形質転換酵母および比較例１で得た比較形質転換酵母を用い、多環芳香族化合物を含まないブランク試料（ＤＭＳＯのみを含む試料）を用い、試験例１に準じた方法で４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図２に示した。図２から見て取れるようにヒト由来のＡｈレセプター遺伝子、Ａｒｎｔ遺伝子で形質転換された比較形質転換酵母は、マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子で形質転換された本発明形質転換酵母に比べてバックグラウンドが高いことが示された。
【００６０】
したがって、本発明形質転換酵母を用いる測定では、低濃度の領域における測定値の信頼性が高く、被験物を溶解した溶媒の影響が少ないため、正確な測定が可能となる。
【００６１】
【発明の効果】
マウス由来のＡｈレセプター遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子が導入されている本発明の形質転換酵母を、ダイオキシン類をはじめとする多環芳香族化合物の測定に用いることにより、高い検出感度で、バックグラウンドが低く信頼性の高い測定結果が得られる。したがって、本発明形質転換酵母は、環境浄化、廃棄物処理、安全性評価などの分野で有用である。また、酵母形質転換を用いることにより、培養細胞に比べて操作が容易であり、測定時間を短縮することができる。さらに、使用する機器も簡易なもので済み、安価に多環芳香族化合物の分析が可能になる。特に、複合体認識配列とレポーター遺伝子とを含むプラスミドを細胞内に有する形質転換酵母を使用する場合には、形質転換酵母内でレポーター遺伝子の発現までを行うことが可能になり、処理操作を簡素化と測定時間の短縮を図ることができる。さらに、本発明の測定方法は、ダイオキシン類等の多環芳香族化合物の生体感受性に深く関与するＡｈレセプターを利用する方法であるため、測定結果は機器分析に比べて毒性等量を反映しており、環境中の多環芳香族化合物の測定に利用する意義が大きい。また、本測定方法は、リガンド応答性の遺伝子発現を利用するため、被験目的とする多環芳香族化合物への特異性が高い。
【００６２】
また、本発明の多環芳香族化合物測定用キットを用いることにより、多環芳香族化合物の高精度の測定を容易に実施することができる。
【００６３】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ナフトフラボン、メチルコラントレン、ベンゾピレンの各濃度でのβ―ガラクトシダーゼ活性を示すグラフ図面。
【図２】本発明形質転換酵母と比較形質転換酵母におけるβ−ガラクトシダーゼ活性測定時のバックグラウンド値を示すグラフ図面。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a transformed yeast which can be used for measuring a polycyclic aromatic compound represented by dioxins, a method for measuring a polycyclic aromatic compound using the transformed yeast, and a kit for measuring a polycyclic aromatic compound. About.
[0002]
[Prior art]
For the detection and analysis of polycyclic aromatic compounds such as dioxins, an expensive and large-scale analyzer is required, and the operation is complicated. Further, in instrumental analysis, it is possible to separate and detect various kinds of polycyclic aromatic compounds contained in a test object, but it is difficult to judge the overall toxicity in the environment from the measurement results.
[0003]
By the way, it is known that an Ah receptor (aryl hydrocarbon receptor) is known as a factor mediating the induction of a drug metabolizing enzyme when a polycyclic aromatic compound such as dioxins is administered to an animal. A nuclear transfer factor called Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) has also been identified as a cofactor for the Ah receptor. Ah receptor and Arnt form complexes with polycyclic aromatic compounds, participate in ligand-responsive gene expression, and function as transcriptional regulators of other structural genes.
[0004]
In JP-A-2000-354494 and JP-A-2001-78782, a rat or hamster-derived Ah receptor gene is introduced into a cell together with a reporter gene, and a chemical substance or the like is obtained by using the obtained transformed cell. And a method for performing a receptor binding assay using an Ah receptor obtained by culturing transformed cells. However, the transformed cells disclosed in the above publication are methods in which cultured cells derived from insects or humans are used as host cells, and the culturing method is complicated and the culturing time is long. There is a problem that it takes time.
[0005]
On the other hand, as a microorganism transformed by introducing an Ah receptor gene, Saccharomyces cerevisiae introduced with a human-derived Ah receptor gene was used to report ligand responsiveness to several kinds of polycyclic aromatic compounds. [Miller, Toxicology and Applied Pharmacology 160, 297-303 (1999)]. However, the human-derived Ah receptor gene used in this report has low ligand responsiveness and low detection sensitivity for polycyclic aromatic compounds. Further, according to the test results performed by the present inventors, the background value tends to be higher in the method using the transformed yeast into which the human-derived Ah receptor gene has been introduced. It cannot be said that it is suitable for the measurement of ring aromatic compounds.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for quickly measuring a polycyclic aromatic compound existing in an environment or the like by a simple operation using a biochemical technique.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problem, the invention of the transformed yeast according to claim 1 is characterized in that a mouse-derived Ah receptor gene and a mouse-derived Arnt gene are introduced into a chromosome so that they can be expressed.
[0008]
Since this transformed yeast has introduced the mouse-derived Ah receptor gene and Arnt gene, the detection sensitivity is high in the measurement of polycyclic aromatic compounds including dioxins, as shown in the Examples below. On the other hand, the background can be lowered. In addition, since the host cell of this transformant is yeast, it is easier to handle than a cultured cell, and it grows quickly and does not require a long time for measurement. Furthermore, the equipment to be used is simple, and the analysis of polycyclic aromatic compounds can be performed at low cost.
[0009]
Further, the invention of the transformed yeast according to claim 2 comprises a DNA encoding the protein shown in the following (a) or (b) and a DNA encoding the protein shown in the following (c) or (d): Has been introduced so that it can be expressed in the chromosome.
(A) A mouse Ah receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which functions as an Ah receptor.
(C) Mouse Arnt having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(D) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which functions as an Ant.
The transformed yeast according to the second aspect has substantially the same effect as the transformed yeast according to the first aspect.
[0010]
Further, the invention of the transformed yeast according to claim 3 has the reporter plasmid according to claim 1 or 2, wherein the reporter plasmid is an Ah receptor or a protein that functions as an Ah receptor. It is characterized by being a plasmid containing Arnt or a protein capable of functioning as Arnt, and a base sequence capable of binding to a complex formed from the polycyclic aromatic compound, and a reporter gene. The transformed yeast is capable of binding to an Ah receptor or a complex comprising an Ah receptor or a protein functioning as an Ah receptor, Arnt or a protein functioning as an Ant and a polycyclic aromatic compound (hereinafter sometimes simply referred to as a “complex”). By having a plasmid containing a unique base sequence (hereinafter sometimes referred to as "complex recognition sequence") and a reporter gene in a cell, it is possible to perform the expression up to the reporter gene in transformed yeast . Therefore, in the measurement of the polycyclic aromatic compound, the processing operation can be simplified and the measurement time can be shortened.
[0011]
The method for measuring a polycyclic aromatic compound according to a fourth aspect is characterized in that the transformed yeast according to any one of the first to third aspects is brought into contact with a test substance. According to this feature, the advantage of the transformed yeast according to any one of claims 1 to 3 is exerted in the measurement of the polycyclic aromatic compound. That is, while the detection sensitivity in the measurement is high, the background is low and a highly reliable measurement result is obtained. In addition, since yeast is used, the operation is easier than that of cultured cells, and the measurement does not require a long time. Furthermore, the equipment to be used is simple, and the analysis of polycyclic aromatic compounds can be performed at low cost.
When a transformed yeast having a plasmid containing a complex recognition sequence and a reporter gene in a cell is used, the activity of an enzyme or the like generated by the expression of the reporter gene can be measured to easily obtain a polycyclic aromatic ring. Since the group compound can be measured, the processing operation can be simplified and the measurement time can be shortened.
Furthermore, since this measurement method uses the function of the Ah receptor that is deeply involved in the biosensitivity of polycyclic aromatic compounds such as dioxins, the measurement results reflect toxicity equivalents (TEQ) unlike instrumental analysis. It can be an index to know the effect on the living body. Therefore, it is a measurement method that is extremely significant for use in detecting and quantifying polycyclic aromatic compounds in the environment.
In addition, this measurement method uses a ligand-responsive gene expression, and therefore has a high specificity to a target polycyclic aromatic compound.
[0012]
The invention of the kit for measuring a polycyclic aromatic compound according to claim 5 is characterized by including at least the transformed yeast according to any one of claims 1 to 3. By using this polycyclic aromatic compound measurement kit, highly accurate measurement of the polycyclic aromatic compound can be easily performed.
[0013]
The invention of the kit for measuring a polycyclic aromatic compound according to claim 6 is the invention according to claim 5, further comprising a composition for culturing the transformed yeast, and a buffer containing a component capable of lysing the transformed yeast. And a reagent for identifying the activity of the reporter plasmid. Since the polycyclic aromatic compound measurement kit is provided with an optimal combination of components such as reagents necessary for measuring the polycyclic aromatic compound, by using this kit, By simply preparing a simple measuring instrument, highly accurate measurement of polycyclic aromatic compounds such as dioxins becomes possible.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The transformed yeast according to the present invention is one in which a mouse-derived Ah receptor gene and a mouse-derived Arnt gene have been introduced into a chromosome so that they can be expressed. Here, the nucleotide sequences of the mouse-derived Ah receptor gene and the mouse-derived Arnt gene are known and can be obtained from publicly available databases [for example, mouse-derived Ah receptor gene NM01344 (NCBI); Arnt gene U10325 (NCBI) and the like].
[0015]
Specific examples of the mouse-derived Ah receptor gene include, in addition to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, one or several nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Examples of such DNA include a DNA having a lost, substituted or added sequence and encoding a protein that functions as an Ah receptor.
[0016]
Specific examples of the mouse-derived Arnt gene include, in addition to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, one or several nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4. DNA encoding a protein having a lost, substituted or added sequence and functioning as an Ant can also be used.
[0017]
The "DNA encoding a protein having a sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and which functions as an Ah receptor"; In the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, a DNA having a sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added, and encoding a protein that functions as Arnt ”is derived from SEQ ID NO: 3 mouse Can be prepared based on the Ah receptor gene and the mouse-derived Arnt gene of SEQ ID NO: 4 by a method such as site-specific displacement introduction method.
[0018]
In the transformed yeast of the present invention, the DNA encoding the protein shown in the following (a) or (b) and the DNA encoding the protein shown in the following (c) or (d) are contained in the chromosome. It can also be specified as one that has been introduced so that it can be expressed.
[0019]
(A) A mouse Ah receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which functions as an Ah receptor.
(C) Mouse Arnt having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(D) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which functions as an Ant.
[0020]
Here, the “(b)“ protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which functions as an Ah receptor ”” And (d) "a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which functions as an Arnt" In the same manner as described above, it can be prepared based on a mouse-derived Ah receptor gene or a mouse-derived Arnt gene, for example, by a method such as site-specific displacement introduction method.
[0021]
The yeast used for transformation in the present invention can be used without particular limitation as long as it is generally applicable to genetic recombination technology, but the most established technology is Saccharomyces cerevisiae. It is preferable to use In addition, fission yeast (Schizaccharomyces), filamentous yeast (Candida), and the like can be used without limitation as long as the gene recombination technique can be applied.
[0022]
Preparation of the transformed yeast can be performed, for example, by the following procedure.
The Ah receptor gene and the Arnt gene in the DNA of the mouse are prepared by selecting appropriate primers based on the base sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and information of commonly available databases (supra) by PCR. It can be carried out by utilizing a method or by chemical synthesis.
[0023]
In the PCR method, a partial nucleotide sequence of a known Ah receptor gene or Arnt gene (for example, a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or the like) is used as a primer on the basis of mouse DNA serving as a template. Receptor genes and Arnt genes can be synthesized. Here, mouse DNA serving as a template can be obtained from mouse tissues by a known genetic engineering technique. For example, RNA derived from tissues such as mouse liver is extracted, and single-stranded cDNA is synthesized using the obtained RNA as a template. Next, a double-stranded cDNA is synthesized using the single-stranded cDNA as a template, and the obtained double-stranded cDNA is inserted into a vector such as a plasmid or a phage to prepare a cDNA library. From this cDNA library, a template can be obtained by hybridization using a known partial sequence of the Ah receptor gene or the Ant gene (for example, a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) as a probe. DNA can be obtained. Alternatively, a primer can be prepared based on a partial base sequence of a known Ah receptor gene or Arnt gene, and the Ah receptor gene or Arnt gene can be directly synthesized from the above cDNA library by PCR.
[0024]
In the case of chemical synthesis, it may be synthesized from a known nucleotide sequence of the Ah receptor gene or Arnt gene (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) according to a known method such as a phosphoramidite method.
[0025]
Next, the obtained gene is treated with an appropriate restriction enzyme (eg, Sal I, Hpa I, etc.), and similarly cut yeast shuttle vector [eg, pAUR101, pAUR224, etc. (all, manufactured by Takara Shuzo), pl -RED1 (manufactured by Toyobo) or the like and a modification enzyme [eg, Ligation High (manufactured by Toyobo), T4 DNA Ligase (manufactured by Takara Shuzo), T4 DNA Ligase, DNA Ligase (manufactured by NEB), etc.]. The ligated DNA is transformed into, for example, Escherichia coli cells chemically treated by the electroporation method, the calcium phosphate method, or the like, grown to an appropriate amount, and then the target plasmid is extracted by, for example, lysis, adsorption extraction, or the like. .
[0026]
The shuttle vector treated as described above is transformed into yeast by a chemical treatment such as an electroporation method or a lithium acetate method, and a transformant is selected using an appropriate selection medium or the like.
[0027]
Since the Ah receptor gene and the Arnt gene have been introduced into the chromosome, the transformed yeast produces the mouse Ah receptor and mouse Arnt as transcription regulators involved in ligand (polycyclic aromatic compound) -responsive gene expression. I do.
[0028]
That is, when the transformed yeast comes into contact with the polycyclic aromatic compound, the Ah receptor and Arnt form a complex with the polycyclic aromatic compound. This complex binds to a complex recognition sequence such as an enhancer region called XRE (Xenobiotic Response Element) on DNA, and induces the expression of a structural gene downstream thereof.
[0029]
Therefore, utilizing the above properties, the complex can be directly measured by a known immunoassay or the like, or a reporter gene that can be induced by the expression of a ligand-responsive gene is introduced into yeast cells, and the expression product thereof is prepared. By making the measurement possible, the polycyclic aromatic compound can be measured. In particular, by introducing a plasmid (reporter plasmid) constructed such that a reporter gene is induced by ligand-responsive gene expression as a transformed yeast into cells of the transformed yeast, polycyclic aromatic compounds can be easily converted. Can be measured.
[0030]
Examples of reporter plasmids include a plasmid containing a complex recognition sequence capable of binding to a complex formed from Ah receptor, Arnt and a polycyclic aromatic compound, and a reporter gene that can be expressed by an appropriate promoter. be able to. As the reporter gene, those capable of easily measuring an enzyme or the like encoded by the reporter gene are preferable. For example, a known reporter gene such as a luciferase gene or a β-galactosidase gene can be used. In addition, as the complex recognition sequence, a base sequence such as a known XRE (Xenobiotic Response Element) [see Miller, Toxicology and Applied Pharmacology 160, 297-303 (1999), supra] is prepared by a technique such as chemical synthesis. Can be used. In the present invention, since a mouse-derived Ah receptor and Arnt are used, it is preferable to use a mouse-derived XRE as well.
[0031]
The construction of the reporter plasmid to be introduced into the transformant is performed, for example, by using the above-described complex recognition sequence and reporter gene in a commercially available self-sustained expression vector for yeast [eg, pESP VECTORS (Toyobo), pAUR112 (Takara Shuzo), etc.]. Can be carried out according to an appropriate gene recombination technique.
[0032]
By introducing this reporter plasmid into the transformed yeast by, for example, a chemical treatment such as an electroporation method or a lithium acetate method, a transformed yeast having the reporter plasmid can be obtained. An example of the transformed yeast of the present invention into which a reporter plasmid has been introduced is Saccharomyces cerevisiae strain YA-0106 (IFO 11028).
[0033]
The transformed yeast obtained as described above can be subcultured under ordinary culture conditions, or can be freeze-dried and stored.
[0034]
The method for measuring a polycyclic aromatic compound of the present invention is performed by bringing the above transformed yeast into contact with a test substance. Here, examples of the polycyclic aromatic compound include dioxins, polychlorinated dibenzofurans (PCDF), polychlorinated biphenyls (PCB), β-naphthoflavones, 3-methylcholanthrene, benzopyrene and derivatives thereof, benzimidazole, dibenzoanthra Sene, pentachlorophenol, dicohol, octachlorostyrene and the like can be mentioned. The test substance is not particularly limited, and examples thereof include water, soil, incinerated ash, and the like, which are likely to be contaminated by dioxins. In addition, as a method of contacting the transformed yeast with the test substance, for example, the transformed yeast, or a culture solution containing the transformed yeast is mixed with the test article, or the mixed state is maintained for a predetermined time under yeast culture conditions Then, the polycyclic aromatic compound is allowed to sufficiently act on the transformed yeast cells.
[0035]
An example of a general method for carrying out the measurement method of the present invention is as follows. First, in the measurement, it is preferable that the transformed yeast be pre-cultured so as to proliferate the bacteria and ensure a sufficient amount of cells.
In the case of using pre-cultured yeast that has been continuously cultured in a medium comprising amino acids, inorganic salts, vitamins, saccharides, etc. as shown in Table 1, 50 μl of the culture solution is collected. Then, it is added to 5000 μl of the medium shown in Table 1 and shake-cultured at, for example, 30 ° C. for about 12 to 24 hours. When the transformed yeast is a freeze-dried cell, for example, a nutrient medium such as a YPD medium is added, and 50 μl of a culture solution cultured at 30 ° C. for 24 hours is taken out. In addition, preculture is performed by shaking culture at 30 ° C. for about 12 to 24 hours.
[0036]
[Table 1]

[0037]
When the bacteria are sufficiently grown by the preculture, the test substance is placed in a medium suitable for the promoter of the reporter gene (for example, when the reporter gene is β-galactosidase, galactose is used as a carbon source). The preculture liquid is mixed at an appropriate ratio, and cultured at a temperature of about 28 to 30 ° C. for a predetermined time (for example, about 18 hours) to allow the polycyclic aromatic compound to sufficiently act on the cells. When the test substance is a solid, the test substance is dissolved or a polycyclic aromatic compound in the test substance is extracted by using a solvent having no toxicity to the cells such as dimethylsulfoxide (DMSO). Is preferably mixed.
[0038]
After sufficient contact between the test substance and the transformed yeast, the transformed yeast cells are lysed by a known method.
That is, the cells are lysed with, for example, a Z buffer shown in Table 2 (a sarcosyl surfactant is added as a lysing agent).
[0039]
[Table 2]

[0040]
Next, an appropriate amount of the lysate is collected, and the enzyme activity and the like of the reporter plasmid activated by the binding of the complex are measured by an appropriate means. For example, if the reporter gene encodes β-galactosidase, a color reagent such as ONPG (orthonitrophenylgalactopyranoside) is allowed to act, and the absorbance is measured by a conventional method. In this measurement, a polycyclic aromatic compound having a known concentration is measured in advance, and a calibration curve is prepared, whereby the polycyclic aromatic compound in the test object can be measured. It is desirable that the calibration curve is created at the same time as the measurement of the test substance. In the measurement, it is important to appropriately dilute the test substance so as to fall within the range of the dose-effect relationship.
[0041]
In order to easily carry out the above-described measurement method of the present invention, a kit for measuring a polycyclic aromatic compound containing the above-mentioned transformed yeast can be prepared. The measurement kit includes, for example, a lyophilized transformed yeast, a composition for culturing the transformed yeast (a liquid or powdered medium), a buffer containing a component capable of lysing the transformed yeast, and the activity of the reporter plasmid. Components such as a reagent for identifying a sample and calibration curve data created based on a sample with a known concentration can be included. Each of the above components contained in the kit can be prepared according to the contents described above. When methylcholanthrene or the like which is easily adsorbed to polystyrene is the test substance, it is preferable to use a glass container or device for the test operation.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited by these.
[0043]
Example 1
<Creation of Arnt gene>
The Arnt gene was created by the RT-PCR method described below.
Total RNA (Total-RNA) was extracted from C57BL mouse lung cells by Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit (Toyobo), and m-RNA was purified using Poly (A) Quik mRNA (Toyobo). The m-RNA thus obtained was subjected to a reverse transcription reaction using Reverse TraAce-α (manufactured by Toyobo) to synthesize cDNA, and PCR was performed using this cDNA as a template to perform an RT-PCR method. In the PCR reaction at this time, a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 were used as primers.
[0044]
The reaction solution used in the PCR method had the following composition.
Reaction solution: 5 μl KOD + buffer, 5 μl 2 mM dNTP,
2 μl 25 mM MgCl ₂ , 1.5 μl primer,
2 μl template, 1 μl KOD + polymerase (Toyobo)
[0045]
The temperature conditions in the PCR method were as follows: (1) heat denaturation at 94 ° C., (2) annealing at 53 ° C. for 30 seconds, and (3) elongation at 68 ° C. for 7 minutes. The reaction was performed by repeating ▼ for 30 cycles.
[0046]
<Creation of Ah receptor gene>
The Ah receptor gene was also prepared by the RT-PCR method described below.
Total RNA (Total-RNA) was extracted from C57BL mouse lung cells by Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit (Toyobo), and m-RNA was purified using Poly (A) Quik mRNA (Toyobo). The m-RNA thus obtained was subjected to a reverse transcription reaction using Reverse TraAce-α (manufactured by Toyobo) to synthesize cDNA, and PCR was performed using this cDNA as a template to perform an RT-PCR method. In the PCR reaction at this time, a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 were used as primers.
[0047]
The reaction solution used in the PCR method had the following composition.
Reaction solution: 5 μl KOD + buffer, 5 μl 2 mM dNTP,
2 μl 25 mM MgCl ₂ , 1.5 μl primer,
2 μl template, 1 μl KOD + polymerase (Toyobo)
[0048]
The temperature conditions in the PCR method were as follows: (1) heat denaturation at 94 ° C., (2) annealing at 53 ° C. for 30 seconds, and (3) elongation at 68 ° C. for 7 minutes. The reaction was performed by repeating ▼ for 30 cycles.
[0049]
<Ligation with promoter>
A plasmid having a Gal 1,10 promoter region (YEp181 Gal 1,10; GenBank, pBM272) was treated with BamH I and Sal I, and an Arnt gene similarly treated with BamH I and SalI was used using Ligation High (manufactured by Toyobo). Ligation was performed at 16 ° C. The obtained reaction product was treated with Sma I and EcoRI, and then the Ah receptor gene treated with Sma I and Mfe I was ligated at 16 ° C. using Ligation High (manufactured by Toyobo).
[0050]
<Creating a shuttle vector>
The resulting ligation product of the promoter and the above gene was treated with Sal I and Hpa I, and shuttle vector pAUR101 treated with Sal I and Sma I.
Ligation High (manufactured by Toyobo) was used for ligation (manufactured by Takara Shuzo) at 16 ° C.
[0051]
<Transformation>
The shuttle vector thus prepared was transformed into Saccharomyces cerevisiae strain W303 (ATCC No. MYA-151) by the lithium acetate method.
[0052]
<Introduction of reporter plasmid>
Plasmid pRW95-3 containing the gene encoding β-galactosidase [Wolf et al. Biotechniques 20, 568-573 (1996)], and the base sequence of SEQ ID NO: 9 containing the mouse-derived XRE sequence was ligated to the cleavage sites of BamHI and XmaI. This plasmid was introduced into the transformed Saccharomyces cerevisiae W303 strain by a lithium acetate method to obtain a transformed yeast of the present invention.
[0053]
Comparative Example 1
The human-derived Ah receptor gene [SEQ ID NO: 10; XM004988 (NCBI)] and the human-derived Ant gene [SEQ ID NO: 11; NM 001668 (NCBI)] in place of the mouse-derived Ah receptor gene and Arnt gene of Example 1. A comparative transformed yeast was prepared in the same manner as in Example 1 except that
[0054]
Test example 1
Investigation of β-galactosidase activity:
A colony of the transformed yeast of the present invention obtained in Example 1 was inoculated into a YPD medium and cultured at 30 ° C. until the absorbance at 600 nm became 2. Thereafter, 50 µl of the culture solution was added to 5000 µl of the medium shown in Table 1, followed by shaking and culturing at 30 ° C for 12 hours, and the bacteria were grown by preculture. The culture solution was prepared such that the concentration of the cells was 1 at an absorbance of 600 nm.
[0055]
Next, in a 96-well plate, 1 μl each of naphthoflavone, methylcholanthrene, and benzopyrene dissolved in DMSO so as to have a predetermined concentration as polycyclic aromatic compounds was added, and the carbon source of the medium shown in Table 1 above was further added. 200 μl using galactose and 5 μl of the above-mentioned culture solution were added thereto, and cultured at 30 ° C. for 18 hours.
[0056]
From the plate after the culture, 10 μl of each was dispensed to another new plate, 140 μl of Z buffer (Table 2 above) and 50 μl of 4 mg / l ONPG were added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 1 hour. After the culture, the absorbance at 415 nm was measured, and the β-galactosidase activity was calculated based on the following equation.
[0057]
(Equation 1)

[0058]
FIG. 1 shows the β-galactosidase activity at each concentration in each test category (naphthoflavon, methylcholanthrene, benzopyrene).
[0059]
Test example 2
Measurement of background value:
Using the transformed yeast of the present invention obtained in Example 1 and the comparative transformed yeast obtained in Comparative Example 1, a blank sample containing no polycyclic aromatic compound (a sample containing only DMSO) was used. The absorbance at 415 nm was measured by the above method. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the comparative transformed yeast transformed with the human-derived Ah receptor gene and the Arnt gene has a background compared to the transformed yeast of the present invention transformed with the mouse-derived Ah receptor gene and the Arnt gene. Was shown to be high.
[0060]
Therefore, in the measurement using the transformed yeast of the present invention, the measurement value in a low concentration region is highly reliable, and the influence of the solvent in which the test substance is dissolved is small, so that accurate measurement is possible.
[0061]
【The invention's effect】
By using the transformed yeast of the present invention, into which a mouse-derived Ah receptor gene and Arnt gene have been introduced, for the measurement of polycyclic aromatic compounds such as dioxins, the detection sensitivity is high, the background is low and the reliability is low. Highly reliable measurement results can be obtained. Therefore, the transformed yeast of the present invention is useful in fields such as environmental purification, waste disposal, and safety evaluation. In addition, by using yeast transformation, the operation is easier than in the case of cultured cells, and the measurement time can be reduced. Furthermore, the equipment to be used is simple, and the analysis of polycyclic aromatic compounds can be performed at low cost. In particular, when a transformed yeast having a plasmid containing a complex recognition sequence and a reporter gene in a cell is used, the expression of the reporter gene can be performed in the transformed yeast, and the processing operation can be simplified. And the measurement time can be shortened. Furthermore, since the measurement method of the present invention uses an Ah receptor that is deeply involved in the biosensitivity of polycyclic aromatic compounds such as dioxins, the measurement results reflect toxic equivalents as compared with instrumental analysis. Therefore, it is of great significance to use it for measuring polycyclic aromatic compounds in the environment. In addition, since the present measurement method utilizes ligand-responsive gene expression, it has high specificity for the target polycyclic aromatic compound.
[0062]
In addition, by using the polycyclic aromatic compound measurement kit of the present invention, highly accurate measurement of the polycyclic aromatic compound can be easily performed.
[0063]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 5
Oligonucleotide primers designed for PCR.
SEQ ID NO: 6
Oligonucleotide primers designed for PCR.
SEQ ID NO: 7
Oligonucleotide primers designed for PCR.
SEQ ID NO: 8
Oligonucleotide primers designed for PCR.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing β-galactosidase activity at each concentration of naphthoflavones, methylcholanthrene, and benzopyrene.
FIG. 2 is a graph showing background values of β-galactosidase activity in the transformed yeast of the present invention and a comparative transformed yeast.

Claims

A transformed yeast into which a mouse-derived Ah receptor gene and a mouse-derived Arnt gene have been introduced so that they can be expressed in chromosomes.

A transformed yeast into which a DNA encoding the protein shown in the following (a) or (b) and a DNA encoding the protein shown in the following (c) or (d) have been introduced so as to be expressed in a chromosome.
(A) A mouse Ah receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which functions as an Ah receptor.
(C) Mouse Arnt having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(D) a protein which has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and which functions as an Ant.

Claim 1 or Claim 2, wherein the reporter plasmid is contained in the cell,
The reporter plasmid is a plasmid containing an Ah receptor or a protein that functions as an Ah receptor, Arnt or a protein that functions as an Ant, and a base sequence capable of binding to a complex formed from a polycyclic aromatic compound, and a reporter gene. A transformed yeast, characterized in that:

A method for measuring a polycyclic aromatic compound, comprising contacting the transformed yeast according to any one of claims 1 to 3 with a test substance.

A kit for measuring a polycyclic aromatic compound, comprising at least the transformed yeast according to any one of claims 1 to 3.

The polycyclic aromatic composition according to claim 5, further comprising a composition for culturing the transformed yeast, a buffer containing a component capable of lysing the transformed yeast, and a reagent for identifying the activity of the reporter plasmid. Kit for measuring aromatic compounds.