JP2004002269A

JP2004002269A - Carcinogenesis-preventing agent

Info

Publication number: JP2004002269A
Application number: JP2002263943A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Akihisa; 秋久　俊博; Harukuni Tokuda; 徳田　春邦; Motohiko Ukiya; 浮谷　基彦; Hoyoku Nishino; 西野　輔翼; Masao Iizuka; 飯塚　正男
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2002-04-11
Filing date: 2002-09-10
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a carcinogenesis-preventing agent which has an excellent carcinogenesis-preventing effect and high safety. <P>SOLUTION: This carcinogenesis-preventing agent is characterized by containing at least one of a fatty acid and its methyl ester. The fatty acid is especially preferably docosahexaenoic acid or the like, and the fatty acid methyl ester is especially preferably a highly unsaturated fatty acid methyl ester such as methyl eicosapentaenoate, methyl docosapentaenoate, or methyl docosahexaenoate. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の発生を予防する発癌予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生活環境の悪化や食生活の変化などに伴って生活習慣病が大きな問題となってきており、そのなかでも癌は最も大きな問題となっている。癌の治療法は年々進歩しており、種々の方法や抗癌剤等が知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−３９９９８号公報
【特許文献２】
特開２０００−３００２１０号公報
【特許文献３】
特開２０００−３８３４７号公報
【非特許文献１】
古江尚著、「抗癌剤投与の実際−腫瘍別・抗腫瘍剤別投与法」、医薬ジャーナル社、２０００年４月１日
【非特許文献２】
大澤俊彦，大東肇，吉川敏一監修、「がん予防食品」、シーエムシー社、１９９８年１２月２６日
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、癌の発生を予防する効果を有する発癌予防剤については多くは知られておらず、しかも、十分な発癌予防効果を有するものはほとんどなかった。このようなことから、発癌予防効果に優れ、且つ副作用等のない安全性の高い発癌予防剤が求められていた。
そこで、本発明は、上記のような従来技術が有する問題点を解決し、発癌予防効果に優れ安全性が高い発癌予防剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は次のような構成からなる。すなわち、本発明の発癌予防剤は、脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとの少なくとも一方を含有することを特徴とする。
このような発癌予防剤は、種々の癌に対する発癌予防効果に優れ、且つ安全性が高い（副作用等がほとんどない）。
【０００６】
前記脂肪酸は不飽和脂肪酸であることが好ましい。また、不飽和脂肪酸は非共役不飽和脂肪酸であることが好ましい。
さらに、この不飽和脂肪酸は、炭素−炭素二重結合を３個以上有する高度不飽和脂肪酸であることがより好ましい。さらにまた、この高度不飽和脂肪酸は、オクタデカテトラエン酸，エイコサペンタエン酸，ドコサテトラエン酸，ドコサペンタエン酸，及びドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種であることがさらに好ましい。
【０００７】
また、これらの脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとは、魚油，魚肝油，及び海獣油の少なくとも１種を処理することにより製造されたものであることが好ましい。このような発癌予防剤は、脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとが安全な天然物である魚油，魚肝油，又は海獣油から製造されているので、安全性がより高い。
さらに、これらの脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとは、エプスタイン・バール・ウィルス活性化抑制効果を有することが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に係る発癌予防剤の実施の形態を詳細に説明する。なお、本実施形態は本発明の一例を示したものであって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
まず、魚肝油から種々の脂肪酸メチルエステル（飽和脂肪酸メチルエステル及び不飽和脂肪酸メチルエステル）を得る方法について説明する。ここでは、一例としてマンボウ肝油を原料とした場合について説明する。マンボウは世界中の温帯海域や熱帯海域に広く生息しており、しかも、他の魚油や魚肝油と比較してドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）が多く含まれているという特徴がある。
【０００９】
ただし、マンボウ肝油以外の魚油，魚肝油，海獣油からも脂肪酸メチルエステルを得ることができる。例えば、アイザメ肝油，スケトウダラ肝油，ウルメイワシ油，ギンダラ油，クロマグロ油，サケ油，サンマ油，ニシン油，マサバ油，竪琴アザラシ油等があげられる。
以下に、マンボウ肝油から脂肪酸メチルエステルを製造する操作手順を、図１のフロー図を参照しながら説明する。
【００１０】
▲１▼マンボウ肝油３．２ｇにＫＯＨのメタノール溶液（濃度は２ｍｏｌ／Ｌ）６５ｍＬを加え、１分間エステル交換反応を行って、脂肪酸メチルエステルを生成させた。
▲２▼そこに水を加えることにより反応を停止させ、ｎ−ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを抽出した。脂肪酸メチルエステルを含むｎ−ヘキサンを無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて脂肪酸メチルエステルを回収した。
【００１１】
▲３▼脂肪酸メチルエステル２．９ｇとメタノール４８ｍＬと撹拌子とを三角フラスコに入れ、ウォーターバスで約５０℃に保ちながらマグネチックスターラーで撹拌し溶解させた。
▲４▼加熱と撹拌を続けながら、尿素粉末９．６ｇを徐々に加えた。三角フラスコに栓をして５０℃で３０分間撹拌した後、三角フラスコをウォーターバスから取り出して室温になるまで放冷した。
【００１２】
▲５▼室温に冷却されると脂肪酸メチルエステルの尿素付加体の結晶が析出するので、これを残留した尿素とともに濾取し、漏斗上の結晶をｎ−ヘキサンで洗浄した。なお、濾液には脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体が含まれている。また、前記洗浄の際に生じた洗液は濾液に加えた。
▲６▼得られた結晶を別の三角フラスコに入れ、温水を加えて尿素付加体の分解と尿素の溶解とを行った。そして、室温になるまで放冷した（水等で冷却してもよい）。
【００１３】
▲７▼尿素付加体が分解されて生じた脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて回収した。
▲８▼前記▲５▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体を含んでいる濾液に対して、前記▲４▼〜▲６▼の工程を再度行った（使用した尿素粉末は５．６ｇ）。そして、得られた濾液（脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体を含む）をｎ−ヘキサンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて脂肪酸メチルエステルを回収した。
【００１４】
▲９▼前記▲７▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルを、オクタデシル基結合シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、各成分に単離した。また、前記▲８▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルについても、同様にして各成分に単離した。
このような操作により、図１の下部に記した種々の脂肪酸メチルエステルが得られた。
【００１５】
すなわち、尿素付加体画分からは、５種の飽和脂肪酸メチルエステルと５種の不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は１個）が単離された。具体的には、飽和脂肪酸メチルエステルとしては、ミリスチン酸メチルエステル（Ｃ_１４：０）、ペンタデカン酸メチルエステル（Ｃ_１５：０）、パルミチン酸メチルエステル（Ｃ_１６：０）、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ_１７：０）、ステアリン酸メチルエステル（Ｃ_１８：０）が得られ、不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、９−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ_１６：１，ｎ−７）、７−メチル−７−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ_１７：１）、オレイン酸メチルエステル（Ｃ_１８：１，ｎ−９）、９−エイコセン酸メチルエステル（Ｃ_２０：１，ｎ−１１）、１０−ドコセン酸メチルエステル（Ｃ_２２：１，ｎ−１１）が得られた。
【００１６】
また、尿素非付加体画分からは、２種の不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は２個）と６種の高度不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は３個以上）が単離された。具体的には、不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、リノール酸メチルエステル（Ｃ_１８：２，ｎ−６）、１１，１４−エイコサジエン酸メチルエステル（Ｃ_２０：２，ｎ−６）が得られ、高度不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、α−リノレン酸メチルエステル（Ｃ_１８：３，ｎ−３）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸メチルエステル（Ｃ_１８：４，ｎ−３）、アラキドン酸メチルエステル（Ｃ_２０：４，ｎ−６）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ_２０：５，ｎ−３）、ドコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ_２２：５，ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（Ｃ_２２：６，ｎ−３）が得られた。
【００１７】
次に、上記のようにして得られた脂肪酸メチルエステルをはじめとする種々の化合物について、その発癌予防効果を評価した。
評価した飽和脂肪酸メチルエステルは、カプリン酸メチルエステル（Ｃ_１０：０）、ラウリン酸メチルエステル（Ｃ_１２：０）、ミリスチン酸メチルエステル（Ｃ_１４：０）、ペンタデカン酸メチルエステル（Ｃ_１５：０）、パルミチン酸メチルエステル（Ｃ_１６：０）、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ_１７：０）、ステアリン酸メチルエステル（Ｃ_１８：０）の７種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００１８】
【化１】

【００１９】
【化２】

【００２０】
【化３】

【００２１】
【化４】

【００２２】
【化５】

【００２３】
【化６】

【００２４】
【化７】

【００２５】
また、評価した不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は１個又は２個）は、９−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ_１６：１，ｎ−７）、７−メチル−７−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ_１７：１）、オレイン酸メチルエステル（Ｃ_１８：１，ｎ−９）、９−エイコセン酸メチルエステル（Ｃ_２０：１，ｎ−１１）、１０−ドコセン酸メチルエステル（Ｃ_２２：１，ｎ−１１）、リノール酸メチルエステル（Ｃ_１８：２，ｎ−６）、１１，１４−エイコサジエン酸メチルエステル（Ｃ_２０：２，ｎ−６）の７種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００２６】
【化８】

【００２７】
【化９】

【００２８】
【化１０】

【００２９】
【化１１】

【００３０】
【化１２】

【００３１】
【化１３】

【００３２】
【化１４】

【００３３】
さらに、評価した高度不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は３個以上）は、α−リノレン酸メチルエステル（Ｃ_１８：３，ｎ−３）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸メチルエステル（Ｃ_１８：４，ｎ−３）、アラキドン酸メチルエステル（Ｃ_２０：４，ｎ−６）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ_２０：５，ｎ−３）、ドコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ_２２：５，ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（Ｃ_２２：６，ｎ−３）の６種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００３４】
【化１５】

【００３５】
【化１６】

【００３６】
【化１７】

【００３７】
【化１８】

【００３８】
【化１９】

【００３９】
【化２０】

【００４０】
さらに、評価した共役不飽和脂肪酸メチルエステルは、共役リノール酸（Ｃ_１８：２）及び共役リノレン酸（Ｃ_１８：３）の２種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００４１】
【化２１】

【００４２】
【化２２】

【００４３】
さらに、リファレンス化合物として、以下に示すような化学構造を有するオレアノール酸及びβ−カロチンの評価も行った。
【００４４】
【化２３】

【００４５】
【化２４】

【００４６】
発癌予防効果は、抗発癌プロモーター活性を評価することにより行った。そして、抗発癌プロモーター活性は、エプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）活性化抑制効果検定法を用いて評価した。ＥＢＶのゲノムを内蔵するバーキット・リンパ腫由来の培養細胞であるラジ（Ｒａｊｉ）株においてＥＢＶのゲノムの発現を阻害する化合物の多くが、マウス皮膚二段階発癌実験において抗発癌プロモーターとして作用するので、ＥＢＶ活性化抑制効果検定法は抗発癌プロモーター活性評価の１次スクリーニング法として有用である。
【００４７】
ＥＢＶのゲノムの発現を阻害する作用に着目したこの検定法は、発癌プロモーターであるテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）と抗発癌プロモーター活性発現に相乗的に作用するｎ−酪酸と被検物質とをラジ株培養系に加えて培養し、ＴＰＡにより活性化された細胞に由来する抗体を間接蛍光抗体法で検出する方法である。この方法は、迅速且つ定量性に優れ、微量活性成分の検出が可能である点で優れた方法である。
【００４８】
以下に、ＥＢＶ活性化抑制効果検定法の操作手順を、図２のフロー図を参照しながら詳細に説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０巻，３０９頁（１９８８））に準拠している。
▲１▼１×１０^６／ｍＬのラジ細胞に２０ｎｇ／ｍＬ（３２ｐｍｏｌ）の濃度のＴＰＡを加え、さらにｎ−酪酸を加えた。
【００４９】
▲２▼そこに、水，エタノール，又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被検物質（脂肪酸メチルエステル及びリファレンス化合物）を添加して、３７℃で４８時間培養した。
▲３▼培養終了後、上咽頭癌患者の血清を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００５０】
ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として、被検物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め、下記式により被検物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
（ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率）＝１００−（ＥＢＶ早期抗原の発現率）
各被検物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を表１及び表２に示す。なお、被検物質の濃度が１０００の欄の括弧内の数値は、ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高い方が正常細胞に対する悪影響が小さい、すなわち安全性が高いと言える。
【００５１】
【表１】

【００５２】
【表２】

【００５３】
表１及び表２から分かるように、脂肪酸メチルエステルにはＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が認められた。そして、不飽和度が高くなるにしたがって該効果が高くなる傾向があり、特に、高度不飽和脂肪酸メチルエステルであるエイコサペンタエン酸メチルエステル，ドコサペンタエン酸メチルエステル，及びドコサヘキサエン酸メチルエステルは、１０００倍モル濃度においてＴＰＡによる早期抗原の発現を完全に阻害した。
【００５４】
なお、飽和脂肪酸メチルエステルにおいては、カプリン酸メチルエステルとラウリン酸メチルエステルを除いては、分子量が小さくなるにしたがってＥＢＶ早期抗原の発現阻害率が高くなるという傾向が見られた。また、共役不飽和脂肪酸メチルエステル（表２に記載の共役リノール酸及び共役リノレン酸）と非共役不飽和脂肪酸メチルエステル（表１に記載のリノール酸及び表２に記載のα−リノレン酸）とを比較すると、２つの異性体のうち非共役不飽和脂肪酸メチルエステルの方がＥＢＶ早期抗原の発現阻害率が若干高かった。
【００５５】
また、脂肪酸メチルエステルをＴＰＡに対して１０００倍モル濃度使用しても、ラジ細胞の生存率は６０％又は７０％であった。脂肪酸メチルエステルを使用しないコントロールにおいても生存率は８０％程度であることから、脂肪酸メチルエステルは正常細胞に対する悪影響が小さいと言える。
次に、ドコサヘキサエン酸メチルエステルの発癌予防効果を評価するために行ったマウス皮膚二段階発癌実験について説明する。
【００５６】
試験群として６週齢のＩＣＲ雌性マウスを１５匹用意し、各マウスの背部皮膚に３９０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度の７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を塗布して、イニシエーションを行った。そして、その１週間後から２０週間にわたって、週２回の割合で同一部位に被検物質であるドコサヘキサエン酸メチルエステル（濃度は８５ｎｍｏｌ／Ｌ）とＴＰＡ（濃度は１．７ｎｍｏｌ／Ｌ）を塗布した。なお、ＴＰＡは、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布してから６０分後に塗布した。
【００５７】
対照群として前述と同種のマウスを１５匹用意し、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布しないことを除いては前述と同様に、ＤＭＢＡの塗布とＴＰＡの塗布とを行った。
両群のマウスについて、腫瘍が発生したマウスの数と形成した腫瘍数とを調べた。そして、各群における腫瘍発生率（腫瘍が発生したマウスの率）とマウス１匹当りの平均腫瘍個数とを算出した。その結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】

【００５９】
対照群においては１０週間後には全てのマウスに腫瘍の発生が認められ、２０週間後には１匹当たり約９個の腫瘍が認められた。それに対して、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布した試験群は、対照群と比較して腫瘍の発生が明らかに遅延しており、２０週間後でも腫瘍数は約５個で、対照群の約５０％の数であった。このことから、ドコサヘキサエン酸メチルエステルの塗布により、腫瘍の発生が約５０％に抑制されることが分かる。
【００６０】
このように、脂肪酸メチルエステル、特に高度不飽和脂肪酸メチルエステルは発癌予防効果に優れ且つ安全性が高いので、発癌予防剤として好適に使用可能である。また、マンボウ肝油のような高度不飽和脂肪酸類を含む油脂類は、発癌予防の観点から、機能性食品として期待できる。
なお、本実施形態においては脂肪酸メチルエステルについて説明したが、同様の脂肪酸の他のエステル（例えば、プロピルエステル，ブチルエステル等）も発癌予防効果を有している。よって、これらの脂肪酸エステルも発癌予防剤として使用可能である。
【００６１】
次に、脂肪酸の発癌予防効果ついて説明する。脂肪酸の種類は特に限定されるものではなく、前述した全ての脂肪酸メチルエステルの遊離脂肪酸が発癌予防効果を有している。
一例として、ドコサヘキサエン酸の発癌予防効果の評価結果を表４に示す。なお、発癌予防効果の評価方法は、前述の脂肪酸メチルエステルの場合と同様に、抗発癌プロモーター活性を評価することにより行った。また、表４中の数値は表１，２と同様にＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を示し、被検物質の濃度が１０００の欄の括弧内の数値はラジ細胞の生存率（％）を示す。
【００６２】
【表４】

【００６３】
表４から分かるように、ドコサヘキサエン酸はドコサヘキサエン酸メチルエステルよりも、ＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が優れていた。また、ドコサヘキサエン酸及びドコサヘキサエン酸メチルエステルは、比較のため試験したドコサヘキサエン酸エチルエステルよりもＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が優れていた。ラジ細胞の生存率については前記３者は同程度であり、正常細胞に対する悪影響は小さかった。
このように、遊離の脂肪酸についても脂肪酸メチルエステルと同様に発癌予防効果に優れ且つ安全性が高いので、発癌予防剤として好適に使用可能である。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の発癌予防剤は、発癌予防効果が優れていることに加えて、副作用等がほとんどなく安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】マンボウ肝油から脂肪酸メチルエステルを製造する操作手順を示すフロー図である。
【図２】ＥＢＶ活性化抑制効果検定法の操作手順を示すフロー図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a carcinogenesis preventive agent for preventing the occurrence of cancer.
[0002]
[Prior art]
In recent years, lifestyle-related diseases have become a major problem with the deterioration of the living environment and changes in eating habits, and among them, cancer has become the biggest problem. Cancer treatment methods have been progressing year by year, and various methods and anticancer agents are known.
[0003]
[Patent Document 1]
JP 2001-39998 A [Patent Document 2]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-300210 [Patent Document 3]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-38347 [Non-Patent Document 1]
Hisashi Furue, "Actual Administration of Anticancer Drugs-Tumor and Antitumor Drug Administration", Pharmaceutical Journal, April 1, 2000 [Non-Patent Document 2]
Supervised by Toshihiko Osawa, Hajime Ohto and Shunichi Yoshikawa, "Cancer Preventive Food", CMC, December 26, 1998 [0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, many cancer preventive agents having an effect of preventing the occurrence of cancer have not been known, and none of them have a sufficient cancer preventive effect. For these reasons, there has been a demand for a highly safe carcinogen preventive agent that has an excellent cancer preventive effect and has no side effects.
Therefore, an object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art and provide a highly safe cancer prevention agent having an excellent cancer prevention effect.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention has the following configuration. That is, the cancer prevention agent of the present invention is characterized by containing at least one of a fatty acid and a methyl ester of the fatty acid.
Such a carcinogenesis preventive agent is excellent in carcinogenesis prevention effect against various cancers and has high safety (has almost no side effects).
[0006]
Preferably, the fatty acids are unsaturated fatty acids. Further, the unsaturated fatty acid is preferably a non-conjugated unsaturated fatty acid.
Further, the unsaturated fatty acid is more preferably a highly unsaturated fatty acid having three or more carbon-carbon double bonds. Still more preferably, the polyunsaturated fatty acid is at least one of octadecatetraenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosatetraenoic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid.
[0007]
Further, it is preferable that these fatty acids and methyl esters of the fatty acids are produced by treating at least one of fish oil, fish liver oil, and sea animal oil. Such a carcinogenesis preventive is more safe because fatty acids and methyl esters of the fatty acids are produced from fish oil, fish liver oil, or sea animal oil, which are safe natural products.
Further, it is preferable that these fatty acids and methyl esters of the fatty acids have an effect of suppressing Epstein-Barr virus activation.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the cancer prevention agent according to the present invention will be described in detail. Note that the present embodiment is an example of the present invention, and the present invention is not limited to the present embodiment.
First, a method for obtaining various fatty acid methyl esters (saturated fatty acid methyl ester and unsaturated fatty acid methyl ester) from fish liver oil will be described. Here, a case where sunfish liver oil is used as a raw material will be described as an example. Sunfish are widely inhabited in temperate and tropical seas around the world, and are characterized by containing more docosapentaenoic acid (DPA) than other fish oils and fish liver oils.
[0009]
However, fatty acid methyl esters can also be obtained from fish oil other than sunfish liver oil, fish liver oil, and sea animal oil. Examples include liver shark oil, walleye pollock liver oil, black sardine oil, ginkgo biloba oil, bluefin tuna oil, salmon oil, saury oil, herring oil, masaba oil, lyre seal oil and the like.
Hereinafter, an operation procedure for producing a fatty acid methyl ester from sunfish liver oil will be described with reference to the flowchart of FIG.
[0010]
{Circle around (1)} To 3.2 g of sunfish liver oil, 65 mL of a methanol solution of KOH (concentration: 2 mol / L) was added, and a transesterification reaction was carried out for 1 minute to produce a fatty acid methyl ester.
(2) The reaction was stopped by adding water thereto, and the fatty acid methyl ester was extracted with n-hexane. After drying the n-hexane containing the fatty acid methyl ester with anhydrous sodium sulfate, the fatty acid methyl ester was recovered using a rotary evaporator.
[0011]
{Circle around (3)} 2.9 g of fatty acid methyl ester, 48 mL of methanol, and a stirrer were placed in an Erlenmeyer flask, and stirred and dissolved with a magnetic stirrer while maintaining the temperature at about 50 ° C. in a water bath.
(4) While continuing heating and stirring, 9.6 g of urea powder was gradually added. After stoppering the Erlenmeyer flask and stirring at 50 ° C. for 30 minutes, the Erlenmeyer flask was taken out of the water bath and allowed to cool to room temperature.
[0012]
{Circle over (5)} When cooled to room temperature, crystals of a urea adduct of a fatty acid methyl ester precipitate. The crystals were collected by filtration together with the remaining urea, and the crystals on the funnel were washed with n-hexane. The filtrate contains non-urea adducts of fatty acid methyl esters. The washing liquid generated during the washing was added to the filtrate.
{Circle around (6)} The obtained crystals were placed in another Erlenmeyer flask, and hot water was added to decompose the urea adduct and dissolve urea. Then, it was allowed to cool to room temperature (may be cooled with water or the like).
[0013]
{Circle around (7)} The fatty acid methyl ester produced by the decomposition of the urea adduct was extracted with n-hexane, dried over anhydrous sodium sulfate, and recovered using a rotary evaporator.
(8) The filtrate containing the non-urea adduct of fatty acid methyl ester obtained in the step (5) was subjected to the steps (4) to (6) again (the urea powder used was 5.6 g). Then, the obtained filtrate (including urea non-adduct of fatty acid methyl ester) was extracted with n-hexane, dried over anhydrous sodium sulfate, and then fatty acid methyl ester was recovered using a rotary evaporator.
[0014]
(9) The fatty acid methyl ester obtained in the step (7) was isolated into each component by high performance liquid chromatography (HPLC) using an octadecyl group-bonded silica gel column (ODS column). In addition, the fatty acid methyl ester obtained in the step (8) was isolated into each component in the same manner.
By such an operation, various fatty acid methyl esters shown in the lower part of FIG. 1 were obtained.
[0015]
That is, five types of saturated fatty acid methyl esters and five types of unsaturated fatty acid methyl esters (the number of carbon-carbon double bonds was one) were isolated from the urea adduct fraction. Specifically, examples of the saturated fatty acid methyl ester include myristic acid methyl ester (C14 _{: 0} ), pentadecanoic acid methyl ester (C15 _{: 0} ), palmitic acid methyl ester (C16 _{: 0} ), and heptadecanoic acid methyl ester (C16 _{: 0} ). C _{17: 0} ) and stearic acid methyl ester (C _{18: 0} ) are obtained. As unsaturated fatty acid methyl esters, 9-hexadecenoic acid methyl ester (C _{16: 1} , n-7), 7-methyl-7 -Methyl hexadecenoate (C17 _{: 1} ), methyl oleate ( _{C18: 1} , n-9), methyl 9-eicosenoate (C20 _{: 1} , n-11), methyl 10-docosenoate (C22 _{: 1} , n-11) was obtained.
[0016]
From the urea non-adduct fraction, two types of unsaturated fatty acid methyl esters (the number of carbon-carbon double bonds is two) and six types of highly unsaturated fatty acid methyl esters (the number of carbon-carbon double bonds) 3 or more) were isolated. Specifically, as the unsaturated fatty acid methyl ester, linoleic acid methyl ester (C _{18: 2} , n-6) and 11,14-eicosadienoic acid methyl ester (C _{20: 2} , n-6) are obtained, Examples of the highly unsaturated fatty acid methyl ester include α-linolenic acid methyl ester (C _{18: 3} , n-3) and 6,9,12,15-octadecatetraenoic acid methyl ester (C _{18: 4} , n-3). ), Arachidonic acid methyl ester (C _{20: 4} , n-6), eicosapentaenoic acid methyl ester (C _{20: 5} , n-3), docosapentaenoic acid methyl ester (C _{22: 5} , n-3), Docosahexaenoic acid methyl ester (C22 _{: 6} , n-3) was obtained.
[0017]
Next, various compounds including the fatty acid methyl ester obtained as described above were evaluated for their carcinogenic preventive effects.
The evaluated saturated fatty acid methyl esters were capric acid methyl ester (C _{10: 0} ), lauric acid methyl ester (C _{12: 0} ), myristic acid methyl ester (C _{14: 0} ), and pentadecanoic acid methyl ester (C _{15: 0).} ), Palmitic acid methyl ester (C _{16: 0} ), heptadecanoic acid methyl ester (C _{17: 0} ), and stearic acid methyl ester (C _{18: 0} ), and their chemical structural formulas are as shown below. is there.
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The evaluated unsaturated fatty acid methyl esters (the number of carbon-carbon double bonds is one or two) are 9-hexadecenoic acid methyl ester (C _{16: 1} , n-7), 7-methyl-7- Methyl hexadecenoate (C _{17: 1} ), methyl oleate (C _{18: 1} , n-9), methyl 9-eicosenoate (C _{20: 1} , n-11), methyl 10-docosenoate ( C22 _{: 1} , n-11), linoleic acid methyl ester ( _{C18: 2} , n-6), and 11,14-eicosadienoic acid methyl ester (C20 _{: 2} , n-6). The chemical structural formula is as shown below.
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[0033]
Furthermore, the evaluated highly unsaturated fatty acid methyl esters (the number of carbon-carbon double bonds is 3 or more) were α-linolenic acid methyl esters (C _{18: 3} , n-3), 6, 9, 12, 15 -Octadecatetraenoic acid methyl ester ( _{C18: 4} , n-3), arachidonic acid methyl ester (C20 _{: 4} , n-6), eicosapentaenoic acid methyl ester (C20 _{: 5} , n-3), There are six types of docosapentaenoic acid methyl ester (C22 _{: 5} , n-3) and docosahexaenoic acid methyl ester (C22 _{: 6} , n-3), and their chemical structural formulas are as shown below.
[0034]
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[0040]
Further, the evaluated conjugated unsaturated fatty acid methyl esters are two kinds of conjugated linoleic acid (C _{18: 2} ) and conjugated linolenic acid (C _{18: 3} ), and their chemical structural formulas are as shown below.
[0041]
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[0042]
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[0043]
Furthermore, oleanolic acid and β-carotene having the following chemical structures were also evaluated as reference compounds.
[0044]
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[0046]
The effect of preventing carcinogenesis was evaluated by evaluating the antitumor promoter activity. The antitumor promoter activity was evaluated using an Epstein-Barr virus (EBV) activation inhibitory effect assay. Many of the compounds that inhibit the expression of the EBV genome in Raji strains, which are cultured cells derived from Burkitt's lymphoma that harbor the EBV genome, act as anti-cancer promoters in mouse skin two-stage carcinogenesis experiments, The EBV activation inhibitory effect assay is useful as a primary screening method for evaluating antitumor promoter activity.
[0047]
Focusing on the effect of inhibiting the expression of the EBV genome, this assay is based on tetradecanoylphorbol acetate (TPA), a tumor promoter, n-butyric acid, which acts synergistically on the expression of antitumor promoter activity, and a test substance. Is added to a Raji strain culture system and cultured, and an antibody derived from cells activated by TPA is detected by an indirect fluorescent antibody method. This method is excellent in that it is quick and excellent in quantification, and is capable of detecting a trace amount of active ingredient.
[0048]
Hereinafter, the operation procedure of the EBV activation suppression effect assay method will be described in detail with reference to the flowchart of FIG. This procedure is based on the method of Tokuda et al. (Cancer Letters, vol. 40, p. 309 (1988)).
{Circle around (1)} TPA at a concentration of 20 ng / mL (32 pmol) was added to 1 × 10 ⁶ / mL raji cells, and n-butyric acid was further added.
[0049]
{Circle around (2)} A predetermined amount of a test substance (fatty acid methyl ester and reference compound) dissolved in water, ethanol, or dimethyl sulfoxide was added thereto, and the cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours.
(3) After the completion of the culture, the expression of the EBV early antigen was detected by the indirect fluorescent antibody method using the serum of a nasopharyngeal carcinoma patient.
[0050]
The expression rate of the EBV early antigen in the group to which the test substance was added was determined assuming that the expression rate of the EBV early antigen in the group to which only TPA was added (control) was 100%. (%) Was calculated.
(EBV early antigen expression inhibition rate) = 100− (EBV early antigen expression rate)
Tables 1 and 2 show the EBV early antigen expression inhibition rate (%) of each test substance. The values in parentheses in the column where the concentration of the test substance is 1000 indicate the survival rate (%) of the radio cells. The higher the value, the smaller the adverse effect on normal cells, ie, the higher the safety.
[0051]
[Table 1]

[0052]
[Table 2]

[0053]
As can be seen from Tables 1 and 2, fatty acid methyl ester was found to have an effect of inhibiting the expression of EBV early antigen. The effect tends to increase as the degree of unsaturation increases. Particularly, methyl ester of eicosapentaenoic acid, methyl ester of docosapentaenoic acid, and methyl ester of docosahexaenoic acid, which are highly unsaturated fatty acid methyl esters, are 1000 At twice the molar concentration, TPA completely inhibited early antigen expression.
[0054]
In the case of the saturated fatty acid methyl ester, except for the capric acid methyl ester and the lauric acid methyl ester, there was a tendency that the expression inhibition rate of the EBV early antigen increased as the molecular weight became smaller. Further, a conjugated unsaturated fatty acid methyl ester (conjugated linoleic acid and conjugated linolenic acid shown in Table 2) and a non-conjugated unsaturated fatty acid methyl ester (linoleic acid shown in Table 1 and α-linolenic acid shown in Table 2) In comparison, the non-conjugated unsaturated fatty acid methyl ester of the two isomers had a slightly higher EBV early antigen expression inhibition rate.
[0055]
Even when the fatty acid methyl ester was used at a 1000-fold molar concentration with respect to TPA, the survival rate of the radio cells was 60% or 70%. Since the survival rate is about 80% even in the control using no fatty acid methyl ester, it can be said that the fatty acid methyl ester has a small adverse effect on normal cells.
Next, a two-stage mouse skin carcinogenesis experiment performed to evaluate the preventive effect of docosahexaenoic acid methyl ester on carcinogenesis will be described.
[0056]
As a test group, 15 6-week-old ICR female mice were prepared, and 390 nmol / L of 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) was applied to the back skin of each mouse, and initiation was performed. . One week after that, for 20 weeks, the same site was coated with docosahexaenoic acid methyl ester (concentration: 85 nmol / L) and TPA (concentration: 1.7 nmol / L) twice a week for 20 weeks. . TPA was applied 60 minutes after the application of docosahexaenoic acid methyl ester.
[0057]
As a control group, 15 mice of the same kind as above were prepared, and DMBA and TPA were applied in the same manner as described above, except that docosahexaenoic acid methyl ester was not applied.
For both groups of mice, the number of mice that developed tumors and the number of tumors that formed were examined. Then, the tumor incidence rate (rate of mice in which tumors occurred) in each group and the average number of tumors per mouse were calculated. Table 3 shows the results.
[0058]
[Table 3]

[0059]
In the control group, tumor development was observed in all mice after 10 weeks, and about 20 tumors were observed per mouse after 20 weeks. On the other hand, in the test group to which docosahexaenoic acid methyl ester was applied, the onset of tumor was clearly delayed as compared with the control group. Even after 20 weeks, the number of tumors was about 5 and about 50% of the control group. Was the number. This indicates that the application of docosahexaenoic acid methyl ester suppresses the occurrence of tumor to about 50%.
[0060]
As described above, fatty acid methyl esters, particularly highly unsaturated fatty acid methyl esters, are excellent in cancer prevention effect and high in safety, and therefore can be suitably used as a cancer prevention agent. In addition, fats and oils containing highly unsaturated fatty acids such as sunfish liver oil can be expected as functional foods from the viewpoint of cancer prevention.
Although the fatty acid methyl ester has been described in the present embodiment, other esters of the same fatty acid (for example, propyl ester, butyl ester, etc.) also have a carcinogenesis preventing effect. Therefore, these fatty acid esters can also be used as cancer prevention agents.
[0061]
Next, the carcinogenic prevention effect of fatty acids will be described. The type of fatty acid is not particularly limited, and free fatty acids of all the above-mentioned fatty acid methyl esters have a carcinogenesis preventing effect.
As an example, Table 4 shows the evaluation results of the carcinogenesis prevention effect of docosahexaenoic acid. In addition, the evaluation method of the cancer prevention effect was performed by evaluating the anti-cancer promoter activity similarly to the case of the above-mentioned fatty acid methyl ester. The numerical values in Table 4 indicate the expression inhibition rate (%) of the EBV early antigen as in Tables 1 and 2, and the numerical values in parentheses in the column where the test substance concentration is 1000 indicate the survival rate (%) of the radio cells. ).
[0062]
[Table 4]

[0063]
As can be seen from Table 4, docosahexaenoic acid was superior to docosahexaenoic acid methyl ester in the effect of inhibiting the expression of the EBV early antigen. In addition, docosahexaenoic acid and methyl docosahexaenoate were superior to docosahexaenoic acid ethyl ester tested for comparison in inhibiting EBV early antigen expression. Regarding the survival rate of the Raji cells, the three groups were comparable, and the adverse effect on normal cells was small.
As described above, free fatty acids are excellent in carcinogenesis prevention effect and high in safety similarly to fatty acid methyl esters, and thus can be suitably used as carcinogenesis prevention agents.
[0064]
【The invention's effect】
As described above, the anti-cancer agent of the present invention is excellent in the anti-cancer effect and has high safety with almost no side effects.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flowchart showing an operation procedure for producing a fatty acid methyl ester from sunfish liver oil.
FIG. 2 is a flowchart showing an operation procedure of an EBV activation suppression effect assay method.

Claims

An anticancer agent comprising at least one of a fatty acid and a methyl ester of the fatty acid.

The said fatty acid is an unsaturated fatty acid, The cancer prevention agent of Claim 1 characterized by the above-mentioned.

The cancer prevention agent according to claim 2, wherein the unsaturated fatty acid is a non-conjugated unsaturated fatty acid.

The carcinogenesis preventive agent according to claim 2 or 3, wherein the unsaturated fatty acid is a polyunsaturated fatty acid having three or more carbon-carbon double bonds.

The carcinogenesis according to claim 4, wherein the polyunsaturated fatty acid is at least one of octadecatetraenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosatetraenoic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. Prophylactic agent.

The cancer prevention agent according to any one of claims 1 to 5, wherein the fatty acid and a methyl ester of the fatty acid are produced by treating at least one of fish oil, fish liver oil, and sea animal oil.

The agent for preventing carcinogenesis according to any one of claims 1 to 6, which has an effect of suppressing Epstein-Barr virus activation.