JP2004000922A

JP2004000922A - Silica particle composition for extracting nucleic acid or protein

Info

Publication number: JP2004000922A
Application number: JP2003085208A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Kuroita; 黒板　　敏弘; Yoshikazu Ishida; 石田　　由和; Hidesuke Komatsubara; 小松原　　秀介; Fumikiyo Kawakami; 川上　　文清; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a silica particle composition highly dispersed in an aqueous solution and to provide a reagent capable of simply extracting a nucleic acid or a protein using the composition. <P>SOLUTION: This silica particle composition is prepared by suspending silica particles in at least 0.2 M salt solution containing a halide, acetate or thiocyanate of an alkali metal, an alkaline earth metal, or ammonia, and/or at least 25 (w/v)% solution of a monosaccharide, a polysaccharide, or a sugar alcohol. In a method for dispensing a silica particle solution, the silica particle composition is dispensed from a reagent vessel to a reaction vessel with a dispensing tool or dispensing equipment. There are also provided a reagent kit, for extracting a nucleic acid or a protein, containing the silica particle composition and a method for extracting a nucleic acid or a protein. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、水溶液中に安定に分散させ得るシリカ粒子組成物に関し、さらに詳しくは、比較的高濃度の塩溶液および／または高濃度の糖類溶液中に懸濁させたシリカ粒子組成物に関し、さらに、該組成物の試薬容器から反応容器となる試験管、マイクロチューブまたはプレート等への分注方法ならびに該組成物を含有する核酸またはタンパク質抽出用試薬キットおよび核酸またはタンパク質抽出法に関する。本発明の組成物は、例えばシリカ粒子への核酸の結合を利用して核酸を単離するような核酸抽出試薬を用いた自動核酸抽出装置にも応用し得る。
【０００２】
【従来の技術】
近年、分子生物学の分野において、生体試料よりデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などを分離して、これらを解析する研究が盛んに行われている。生体試料よりＤＮＡやＲＮＡを分離するにあたり、様々な方法が考案されてきたが、その中でもシリカなどの粒子表面に物理的または特異的にＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を結合（吸着）させる方法　（特開平　２−２８９５９６号公報など）が、その簡便さから盛んに使用されるようになりつつある。一方、シリカ粒子など比重の重い粒子は水溶液中では分散性が悪く、該粒子を試薬容器からマイクロチューブ等へ分注する操作は、特に煩雑とならざるをえない状況にある。
【０００３】
これらの操作を自動化するにあたり、磁性体粒子を磁力を用いて分離する方法が考案されている（特表平　４−５０１９５９号公報、特表平　５−５０４０９５号公報、特開平８−３２０２７号公報など）が、特にシリカと超常磁性金属酸化物などの複合体粒子を用いた場合、通常のシリカ粒子に比べて重く、分散性が低いため、分注操作はさらに煩雑なものにならざるを得ない。したがって、従来の技術、すなわち、水に懸濁された磁性シリカ粒子を試薬容器からマイクロチューブ等へ分注する場合、該粒子水溶液を激しく攪拌した後、粒子が分散している短時間に分注を完了しなければならない。また、そのようにして分注した溶液は濃度にムラができやすく、分注の順番により粒子の濃度が異なることが多いため、特に定量的な解析には向かないものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、比重の重いシリカ粒子を長時間、水溶液中に分散させておくことが、該粒子の試薬容器から反応容器への分注の簡便さ、また、分注精度の点からも強く望まれていた。特に、自動分注機を用いてシリカと超常磁性金属酸化物などの複合体粒子を反応容器となる試験管、マイクロチューブまたはプレート等へ分注するに当たっては最大の命題であった。すなわち、本発明の目的は、水溶液中に高度に分散させうるシリカ粒子組成物を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは比重の重いシリカ粒子を、水溶液中に分散させるにあたり、水溶液の組成およびその濃度に着目し、種々の検討を行った。その結果、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウムなどの塩および／またはサッカロース、ソルビトールなどの糖類を高濃度で含む溶液が、比重の重いシリカ粒子を比較的長い時間、分散状態にしておくことが可能であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明はシリカ粒子が、少なくとも０．２Ｍである無機塩または有機塩の塩溶液および／または少なくとも２５（ｗ／ｖ）％である単糖類、多糖類または糖アルコールである糖類溶液に懸濁されていることを特徴とする核酸またはタンパク質抽出用シリカ粒子組成物である。
【０００７】
また、本発明は分注器具または分注機器を用いて、上記シリカ粒子組成物を試薬容器から反応容器へ分注することを特徴とするシリカ粒子溶液を分注する方法である。
【０００８】
さらに、本発明は上記シリカ粒子組成物、吸着用試薬、洗浄用試薬および溶出用試薬を含有する核酸またはタンパク質抽出用試薬キットである。
【０００９】
本発明はタンパク質および核酸を含む細胞を上記シリカ粒子組成物および吸着用試薬と混合して、該細胞からタンパク質および核酸を取り出し、該シリカ粒子に核酸またはタンパク質を結合させて、残余の成分と分離させ、該シリカ粒子を洗浄した後、該シリカ粒子に結合した核酸またはタンパク質を溶出させることを特徴とする核酸またはタンパク質抽出法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、シリカ粒子とはシリカを含む粒子であって、例えば二酸化珪素結晶、他の珪素酸化物、例えば珪藻土、ガラス粉末、化学修飾シリカ、シリカと超常磁性金属酸化物などの複合体がある。
【００１１】
これらの成分より構成されるシリカ粒子は、水よりも比重が重く、一般に比重１．０〜１．８であり、水に懸濁すると沈降し、容器の底に固いペレットを形成する性質があり、長い間、水溶液中に懸濁状態にしておくことが一般的に困難なものである。特に、分子生物学の分野で用いられている核酸吸着などに使用されている粒子は、直径が約０．１〜１００μｍ程度のものが多く、それらの多くはこのような性質を有している。
【００１２】
本発明におけるシリカ粒子組成物は、このような性質を有するシリカ粒子を高度に水溶液中に分散させたものである。また、この技術は、ラテックス粒子、金属粒子および修飾金属粒子などのシリカ粒子以外の粒子に応用可能であることも容易に予想できる。
【００１３】
超常磁性金属酸化物としては、四三酸化鉄などが例示される。シリカと該超常磁性金属酸化物との複合体は、例えば、四三酸化鉄をテトラエトキシシランのアルコール溶液に添加し、超音波分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリカを沈着させる。このようにして得られた分散液に、ケイ酸ナトリウムを加え、有機溶媒および界面活性剤　（ソルビタンモノステアレートのトルエン溶液）を加えて乳化し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを形成させる。この乳濁液を硫酸アンモニウム水溶液に添加し、充分攪拌させる。その後、濾過分離、水洗、アルコール沈殿を行ない、乾燥させることにより、所望の球状シリカ粒子が得られる。
【００１４】
シリカと該超常磁性金属酸化物との複合体の一例としては、▲１▼超常磁性酸化鉄を含む磁性粒子であって、▲２▼その比表面積が１００〜８００ｍ^２／ｇであり、▲３▼上記酸化鉄がシリカで被覆されており、▲４▼さらに、微小シリカ粒子で構成される無機多孔性壁物質で複合されており、▲５▼上記酸化鉄の重量が１０〜６０ｗｔ％であり、▲６▼磁性シリカ粒子の表面積孔直径が０．１〜６０ｎｍであり、▲７▼磁性シリカ粒子の細孔容積が０．０１〜１．５ｍｌ／ｇであり、そして、▲８▼磁性シリカ粒子の粒子径が０．１〜１００、好ましくは０．５〜１５μｍである粒子が挙げられる。
【００１５】
このようなシリカと該超常磁性金属酸化物との複合体としては、鈴木油脂製の磁性シリカ粒子（粒径１〜１０μｍ、四三酸化鉄粒子３０％（ｗ／ｖ）含有、比表面積２８０ｍ^２／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ、細孔容積０．０２５ｍｌ／ｇ）が例示される。
【００１６】
本発明にて用いられる塩溶液とは、無機塩溶液または有機塩溶液であり、無機塩溶液としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、またはアンモニアのハロゲン化物またはチオシアン酸塩を含む溶液があり、例えば塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化リチウム、塩化マグネシウム、チオシアン酸ナトリウムの水溶液が包含される。有機塩溶液としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニアの酢酸塩を含む溶液があり、例えば酢酸ナトリウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウムの水溶液が包含される。これらを組み合わせて用いても良い。その濃度は少なくとも０．２Ｍ、好ましくは３〜１０Ｍの高濃度にて使用する。０．２Ｍ未満であると、シリカ粒子の分散性が低下し、分注精度が低下する。
【００１７】
上記溶液は他の成分、例えば緩衝液、キレート剤または界面活性剤などを含有していても良い。
【００１８】
本発明にて用いられる糖類溶液とは、単糖類、多糖類または糖アルコールの溶液であり、例えばグルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、サッカロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類およびソルビトール、マンニトール、ガラクチトールなどの糖アルコール類が含まれる。これらを組み合わせても良い。本発明では糖類の濃度が少なくとも２５（ｗ／ｖ）％、好ましくは５０〜６０（ｗ／ｖ）％である。２５（ｗ／ｖ）％未満であると、シリカ粒子の分散性が低下し、十分に分散されず満足いく分注精度を得ることが難しくなる傾向にある。上記溶液は他の成分、例えば防腐剤、緩衝液、キレート剤または界面活性剤などを含有しても良い。
【００１９】
シリカ粒子の水溶液中での分散性は、溶液中に溶解している物質の種類及び濃度が重要であり、その効果は、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化リチウム、塩化マグネシウムおよび酢酸アンモニウムなどの塩、またはサッカロース、ソルビトールなどの糖類に高い傾向が認められる。これら以外の塩類および糖類においても同様な効果が期待される。本発明では塩溶液に糖類が溶解されていてもよい。
【００２０】
該シリカ粒子を試薬容器から反応容器となるマイクロチューブ等へ自動分注する分野では、一般的には懸濁したシリカ粒子を約５分間以内に分注する操作が主体となるため、少なくとも５分間以内での粒子の分散性が重要となる。本発明のシリカ粒子組成物を用いた場合、シリカ粒子を水に懸濁した場合に比べ、５分間以内での粒子の分散性は飛躍的に向上し、分注の精度が上昇することが明らかとなり、この方法を応用した自動分注システムの構築も可能である。また、本発明のシリカ粒子組成物を用いると、５分間以後の粒子の分散性も蒸留水に懸濁した場合に比べ、飛躍的に向上していることも確認されており、沈殿した粒子の再懸濁も容易になるものと思われる。
【００２１】
長期保存における溶液の腐敗という面から考えると、シリカ粒子の懸濁には、塩類の溶液が好ましい。一方、糖類溶液を用いる場合は、防腐剤を添加することが好ましい。また、塩溶液としては、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウムなどの塩溶液が好ましい。また、塩結晶の析出などのことも考えると、特に塩化リチウムが最も結晶が生じにくく、優れている。
【００２２】
本発明を実施するに当たり、上記無機塩または有機塩の塩溶液および／または単糖類、多糖類または糖アルコールの糖類溶液を核酸吸着等の反応系に持ち込むことによって、該反応系が阻害されないように、溶液の種類を選択することが好ましい。特に、核酸等をシリカ粒子に吸着させるような場合、反応系に持ち込んだイオンの種類や濃度により、その選択性や許容力などに影響が及ばないような溶液を選択する必要がある。
【００２３】
本発明によるシリカ粒子組成物は、比重の重いシリカなどの粒子を比較的長時間にわたって、水溶液中に分散状態に保つことができ、粒子の試薬容器から反応容器となる試験管、マイクロチューブおよびプレート等への分注（特に自動分注機）を用いた分注を容易にする。本発明のシリカ粒子組成物は、シリカ粒子への核酸の吸着を利用した核酸の抽出装置などへ使用される。また、シリカ粒子を利用した様々な用途、例えば化粧材料、塗料、接着などの分野への応用も可能である。
【００２４】
本発明の一実施態様としては、シリカと超常時性金属酸化物などとの複合粒子（磁性シリカ粒子：直径１〜１０μｍ）を約０．５〜５Ｍの塩化ナトリウムまたは塩化リチウムに懸濁した組成物がある。該組成物を使用することにより、安定した粒子懸濁液の供給および磁性シリカ粒子の自動分注が可能となるため、核酸の自動抽出機などに応用可能である。
【００２５】
また、本発明はシリカ粒子組成物を分注器具または分注機器を用いて、試薬容器から反応容器となる試験管、マイクロチューブまたはプレート等へ分注する。分注器具としては、メスピペット、マイクロピペッターおよびシリンジなどが考えられる。分注機器としては、シリンダーを用いたピペットタイプの分注機およびポンプを用いた加圧式分注機などが考えれられる。また、分注方法としては、懸濁された溶液をシリンダーを介してチップ内に吸入し分注する方法および管を通してポンプ等の圧力を利用してノズルより押し出し分注する方法などが考えられる。
【００２６】
さらに、本発明の核酸またはタンパク質抽出用試薬キットは上記シリカ粒子組成物、さらに核酸またはタンパク質を容易に吸着させるための吸着用試薬、粒子に吸着した非特異的成分を洗浄する洗浄用試薬および粒子表面から核酸またはタンパク質を溶出するための溶出用試薬を含む。吸着用試薬としては、例えば、グアニジン塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素またはこれらの混合物などのカオトロピック試薬などが例示される。また、吸着用試薬は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝剤、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）などのキレート剤および／またはエタノールなどの有機溶媒を含有していてもよい。洗浄用試薬は上記トロピックス物質またはエタノールなどの有機溶媒を含有していてもよい。洗浄用試薬は、上記緩衝剤および／またはキレート剤を含有していてもよい。粒子表面から核酸またはタンパク質を溶出する溶出用試薬には、低塩濃度緩衝液、水などを使用する。吸着液、洗浄液および溶出液の成分は、上記以外に用途によって様々な組成を選択することができる。
【００２７】
また、核酸またはタンパク質を抽出するには、該試薬キットに含まれる試薬を定められた順序で混合、分離および加温等の操作を行う必要がある。例えば、タンパク質および核酸を含む細胞を上記シリカ粒子組成物および核酸またはタンパク質吸着用試薬と混合して、該細胞からタンパク質および核酸を取り出し、該シリカ粒子にタンパク質または核酸を結合させて、残余の成分と分離させ、該シリカ粒子を洗浄した後、該シリカ粒子に結合した核酸またはタンパク質を溶出させることにより、核酸またはタンパク質を抽出する。抽出された核酸は、公知の核酸増幅法を用いて増幅した後、公知の検出法にて検出することができる。本発明の核酸またはタンパク質抽出法は、研究用または臨床診断用の核酸またはタンパク質の調製に適用できる。
【００２８】
以下に、本発明を実施例より、具体的に説明する。
【実施例】
実施例１粒子沈降試験（１）磁性シリカ粒子懸濁液の調製磁性シリカ粒子（粒径１〜１０μｍ、四三酸化鉄粒子３０％（ｗ／ｖ）含有、比表面積２８０ｍ^２／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ、細孔容積０．０２５ｍｌ／ｇ：鈴木油脂製）０．４ｇを下記表１に示される化合物を含む溶液１ｍｌを入れたマイクロチューブの中にて懸濁してシリカ粒子懸濁液を調製した。以下の試薬の調製に用いた試薬は、ナカライテスク社製のものを使用し、水は蒸留水を用いた。
【００２９】
（２）沈降試験（１）にて調製した、磁性シリカ粒子懸濁液それぞれを収容するマイクロチューブを転倒混和して完全に懸濁し、１ｍｌシリンジ（テルモ社製：ＳＳ−０１Ｔ）にて１ｍｌの目盛りまで吸引した。その後、シリンジを試験管立てに固定し、５分後に溶液と磁性シリカ粒子との界面を高さ、すなわち、粒子が何ｍｌのラインまで沈降したかを測定した。測定は２度行い、平均した界面の高さを０分の界面の高さで割ったものを分散率とした。その結果を下記表１に示す。
【００３０】
【表１】

【００３１】
表１から明らかなように、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウムなどの塩溶液またはサッカロース、ソルビトールなどの糖類の溶液に、高い粒子分散効果が認められた。これら溶液においては、蒸留水懸濁液が５分後に７０％まで界面が下降したのに対して、９０％以上の界面が保たれていた。この傾向は、これら溶液濃度が濃いほど顕著であり、５Ｍの塩化ナトリウム溶液、ヨウ化ナトリウム溶液、塩化リチウム溶液、塩化アンモニウム溶液および２Ｍの塩化マグネシウム溶液においては、０．９５以上の分散率が得られる
ことが分かった。
【００３２】
塩の濃度については塩化リチウムにおいては、０．２Ｍ以上にて顕著であり、０．２Ｍにおいても、明らかに比重の高い２Ｍの塩化カリウム溶液よりも分散性が高いことがわかった。また、糖類溶液の濃度についてはサッカロースにおいて、２５％（ｗ／ｖ）以上の濃度において顕著であった。これらのことから、粒子の分散性を高める効果は、溶液中に溶解している物質の種類およびその濃度に大きく左右されることが明らかとなった。
【００３３】
また、５分より後の粒子の分散率を５Ｍの塩化リチウム溶液、蒸留水について比較したところ、３０分後においても顕著な差がみられ、蒸留水懸濁液においては分散率が０．４以下であったのに対し、５Ｍ塩化リチウム懸濁液においては０．６以上であった（図１）。
【００３４】
実施例２分注試験（１）粒子懸濁液の調製実施例１と同様な方法に従い、磁性シリカ粒子懸濁液（５Ｍ塩化リチウム溶液、蒸留水）を２ｍｌ調製した。
【００３５】
２．５ｍｌ容量のコンビチップ（エッペンドルフ社製）を装着した連続分注ピペット（エッペンドルフ社製）に（１）にて、既に調製してある５Ｍ塩化リチウムおよび蒸留水の磁性シリカ粒子懸濁液を１．２ｍｌ吸引し、あらかじめ秤量したマイクロチューブに５０μｌづつ、５秒毎に１９本連続分注を行った。分注する際、分注機は床面に対して垂直になるように行った。分注終了後、分注量がほぼ正確であることを確認し、分注されたマイクロチューブを秤量し、あらかじめ秤量しておいた値を差し引いて分注された粒子溶液の重量を算出した。
【００３６】
その結果を図２に示す。図２から明らかなように、５Ｍ塩化リチウムに懸濁した磁性シリカ粒子を分注したものは、蒸留水に懸濁したものに比べ、安定した数値が得られることが分かった。塩化リチウム懸濁液と蒸留水懸濁液の分注重量のＣＶ（％）（標準偏差／平均値×１００）はそれぞれ０．９４％及び、３．２６％であった。このばらつきは、分注された懸濁液中に含まれる磁性粒子の濃度に起因していると推察される。
【００３７】
蒸留水懸濁液を連続分注した場合、最初から１３番目までの分注において、その分注された液の重量が徐々に増加し、１３番目以降、徐々に減少する傾向がみられた。この現象は、実施例１の結果からも容易に予測可能であり、時間を経るに従って、粒子懸濁液に濃度勾配が生じていたことが予想される。よって、本発明の方法を用いることにより、均一なシリカ懸濁液を連続的に分注することが可能になることが示された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、比重の重いシリカ粒子を水溶液中に分散させておくことが容易に可能となる。また、本発明のシリカ粒子組成物は、自動分注器を利用した核酸抽出装置などに応用可能である。この方法を核酸またはタンパク質の精製に応用することにより、従来法に比べ、再現性のある確実な抽出結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】磁性シリカ粒子懸濁液の分散率と放置時間との関係を示す図である。
【図２】磁性シリカ粒子懸濁液を連続分注した時の、分注重量の変化を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a silica particle composition that can be stably dispersed in an aqueous solution, and more particularly to a silica particle composition suspended in a relatively high concentration of a salt solution and / or a high concentration of a saccharide solution. The present invention also relates to a method for dispensing the composition from a reagent container to a test tube, microtube or plate serving as a reaction container, a nucleic acid or protein extraction reagent kit and a nucleic acid or protein extraction method containing the composition. The composition of the present invention can be applied to, for example, an automatic nucleic acid extraction device using a nucleic acid extraction reagent for isolating a nucleic acid by utilizing the binding of the nucleic acid to silica particles.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, in the field of molecular biology, research for separating deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), and the like from biological samples and analyzing them has been actively conducted. Various methods have been devised for separating DNA and RNA from biological samples. Among them, a method of physically or specifically binding (adsorbing) a nucleic acid such as DNA or RNA to a particle surface such as silica (particularly). Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-289596) has been widely used because of its simplicity. On the other hand, particles having a high specific gravity such as silica particles have poor dispersibility in an aqueous solution, and the operation of dispensing the particles from a reagent container to a microtube or the like has to be particularly complicated.
[0003]
In order to automate these operations, a method of separating magnetic particles using magnetic force has been devised (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-501959, Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-504095, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-32027). However, when complex particles such as silica and superparamagnetic metal oxides are used, the dispensing operation has to be more complicated because the particles are heavier and have lower dispersibility than ordinary silica particles. Absent. Therefore, in the conventional technique, that is, when dispensing magnetic silica particles suspended in water from a reagent container to a microtube or the like, the aqueous solution of the particles is vigorously stirred and then dispensed in a short time during which the particles are dispersed. Must be completed. In addition, the solution thus dispensed tends to have uneven concentration, and the concentration of particles often differs depending on the order of dispensing, so that it is not particularly suitable for quantitative analysis.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, it is strongly desired to disperse silica particles having a high specific gravity in an aqueous solution for a long time in view of the simplicity of dispensing the particles from a reagent container to a reaction container and also from the viewpoint of dispensing accuracy. Was. In particular, it was the greatest proposition in dispensing composite particles such as silica and superparamagnetic metal oxide into a test tube, a microtube, or a plate serving as a reaction vessel using an automatic dispenser. That is, an object of the present invention is to provide a silica particle composition that can be highly dispersed in an aqueous solution.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have paid attention to the composition and concentration of an aqueous solution in dispersing silica particles having a high specific gravity in an aqueous solution, and have conducted various studies. As a result, a solution containing salts such as sodium chloride, sodium iodide, lithium chloride and ammonium acetate and / or saccharides such as saccharose and sorbitol at a high concentration makes the silica particles having a high specific gravity dispersed in a relatively long time. And found that the present invention was completed.
[0006]
That is, the present invention provides that the silica particles are suspended in a salt solution of an inorganic salt or an organic salt of at least 0.2 M and / or a saccharide solution of a monosaccharide, polysaccharide or sugar alcohol having at least 25 (w / v)%. It is a silica particle composition for nucleic acid or protein extraction characterized by being turbid.
[0007]
Further, the present invention is a method for dispensing a silica particle solution, wherein the silica particle composition is dispensed from a reagent container to a reaction container using a dispensing device or a dispensing device.
[0008]
Further, the present invention is a nucleic acid or protein extraction reagent kit containing the above silica particle composition, adsorption reagent, washing reagent and elution reagent.
[0009]
The present invention comprises mixing cells containing proteins and nucleic acids with the above silica particle composition and the reagent for adsorption, removing proteins and nucleic acids from the cells, binding nucleic acids or proteins to the silica particles, and separating the remaining components. And washing the silica particles, and then eluting the nucleic acids or proteins bound to the silica particles.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, silica particles are particles containing silica, for example, silicon dioxide crystals, other silicon oxides such as diatomaceous earth, glass powder, chemically modified silica, and composites of silica and superparamagnetic metal oxide. .
[0011]
Silica particles composed of these components have a specific gravity higher than that of water and generally have a specific gravity of 1.0 to 1.8, and have the property of sedimenting when suspended in water to form hard pellets at the bottom of the container. It is generally difficult to keep them suspended in an aqueous solution for a long time. In particular, particles used for nucleic acid adsorption and the like used in the field of molecular biology often have a diameter of about 0.1 to 100 μm, and many of them have such properties. .
[0012]
The silica particle composition according to the present invention is obtained by highly dispersing silica particles having such properties in an aqueous solution. In addition, it can be easily expected that this technique can be applied to particles other than silica particles such as latex particles, metal particles, and modified metal particles.
[0013]
Examples of the superparamagnetic metal oxide include triiron tetroxide. The composite of silica and the superparamagnetic metal oxide is prepared by, for example, adding iron trioxide to an alcohol solution of tetraethoxysilane and depositing silica on the surface of the iron trioxide while dispersing ultrasonically. Sodium silicate is added to the dispersion thus obtained, and an organic solvent and a surfactant (a solution of sorbitan monostearate in toluene) are added to emulsify to form a W / O emulsion. This emulsion is added to an aqueous solution of ammonium sulfate and thoroughly stirred. Thereafter, filtration separation, washing with water, alcohol precipitation and drying are performed to obtain desired spherical silica particles.
[0014]
Examples of composites of silica and the superparamagnetic metal oxide include: (1) magnetic particles containing superparamagnetic iron oxide, (2) having a specific surface area of 100 to 800 m ² / g, and (3) ▼ The above iron oxide is coated with silica, 4) It is further composited with an inorganic porous wall material composed of fine silica particles, 5) The weight of the above iron oxide is 10 to 60 wt%. (6) the surface area pore diameter of the magnetic silica particles is 0.1 to 60 nm, (7) the pore volume of the magnetic silica particles is 0.01 to 1.5 ml / g, and (8) the magnetic silica particles. Particles having a particle size of 0.1 to 100, preferably 0.5 to 15 μm are exemplified.
[0015]
Examples of such a complex of silica and the superparamagnetic metal oxide include magnetic silica particles (particle size: 1 to 10 μm, iron tetroxide particles 30% (w / v), specific surface area: 280 m ²⁾ / G, surface pore diameter 2-6 nm, pore volume 0.025 ml / g).
[0016]
The salt solution used in the present invention is an inorganic salt solution or an organic salt solution.As the inorganic salt solution, there is a solution containing a halide or thiocyanate of an alkali metal, an alkaline earth metal, or ammonia, For example, aqueous solutions of sodium chloride, sodium iodide, lithium chloride, lithium iodide, magnesium chloride, and sodium thiocyanate are included. The organic salt solution includes a solution containing an acetate of an alkali metal, an alkaline earth metal, or ammonia, and includes, for example, an aqueous solution of sodium acetate, lithium acetate, and magnesium acetate. These may be used in combination. The concentration is used at a high concentration of at least 0.2M, preferably 3 to 10M. If it is less than 0.2 M, the dispersibility of the silica particles is reduced, and the dispensing accuracy is reduced.
[0017]
The solution may contain other components such as a buffer, a chelating agent or a surfactant.
[0018]
The saccharide solution used in the present invention is a solution of a monosaccharide, a polysaccharide or a sugar alcohol. Sugar alcohols such as lactitol are included. These may be combined. In the present invention, the concentration of the saccharide is at least 25 (w / v)%, preferably 50 to 60 (w / v)%. If the content is less than 25 (w / v)%, the dispersibility of the silica particles is reduced, and the silica particles are not sufficiently dispersed, and it tends to be difficult to obtain satisfactory dispensing accuracy. The solution may contain other components, such as preservatives, buffers, chelating agents or surfactants.
[0019]
The dispersibility of the silica particles in an aqueous solution is important depending on the type and concentration of the substance dissolved in the solution, and the effects are as follows: sodium chloride, sodium iodide, lithium chloride, lithium iodide, magnesium chloride and acetic acid. Salts such as ammonium and sugars such as saccharose and sorbitol tend to have a high tendency. Similar effects are expected for salts and saccharides other than these. In the present invention, the saccharide may be dissolved in the salt solution.
[0020]
In the field of automatically dispensing the silica particles from a reagent container to a microtube or the like serving as a reaction container, generally, the operation of dispensing the suspended silica particles within about 5 minutes is mainly performed, and therefore, at least 5 minutes The dispersibility of the particles within is important. When the silica particle composition of the present invention is used, it is clear that the dispersibility of the particles within 5 minutes is dramatically improved and the accuracy of dispensing is increased as compared with the case where the silica particles are suspended in water. Thus, an automatic dispensing system using this method can be constructed. In addition, it was also confirmed that the use of the silica particle composition of the present invention significantly improved the dispersibility of the particles after 5 minutes as compared with the case where the particles were suspended in distilled water. Resuspension would also be easier.
[0021]
Considering the spoilage of the solution during long-term storage, a salt solution is preferable for suspending the silica particles. On the other hand, when a saccharide solution is used, it is preferable to add a preservative. As the salt solution, a salt solution such as sodium chloride, lithium chloride, and magnesium chloride is preferable. In consideration of the precipitation of salt crystals, lithium chloride is particularly excellent since it hardly generates crystals.
[0022]
In carrying out the present invention, a salt solution of the above-mentioned inorganic salt or organic salt and / or a saccharide solution of a monosaccharide, a polysaccharide or a sugar alcohol are brought into a reaction system such as nucleic acid adsorption so that the reaction system is not hindered. Preferably, the type of solution is selected. In particular, when a nucleic acid or the like is adsorbed on silica particles, it is necessary to select a solution that does not affect the selectivity and the tolerance of the ion depending on the type and concentration of ions brought into the reaction system.
[0023]
The silica particle composition according to the present invention can maintain particles such as silica having a high specific gravity in an aqueous solution for a relatively long period of time, and can be used as a test container, a microtube, and a plate, which can be used as a reaction container from a reagent container for particles. And the like (particularly automatic dispensers). The silica particle composition of the present invention is used for an apparatus for extracting nucleic acids utilizing adsorption of nucleic acids to silica particles. In addition, various uses using the silica particles, for example, applications to fields such as cosmetic materials, paints, and adhesives are also possible.
[0024]
In one embodiment of the present invention, a composition in which composite particles (magnetic silica particles: diameter of 1 to 10 μm) of silica and a superconstant metal oxide are suspended in about 0.5 to 5 M sodium chloride or lithium chloride. There are things. The use of the composition enables stable supply of a particle suspension and automatic dispensing of magnetic silica particles, and is therefore applicable to an automatic nucleic acid extractor and the like.
[0025]
Further, in the present invention, a silica particle composition is dispensed from a reagent container to a test tube, a microtube, a plate, or the like serving as a reaction container, using a dispensing device or a dispensing device. As the dispensing device, a mespipet, a micropipettor, a syringe, and the like can be considered. Examples of the dispensing device include a pipette type dispenser using a cylinder and a pressurized dispenser using a pump. As a dispensing method, a method in which the suspended solution is sucked into the chip via a cylinder and dispensed, and a method in which the suspended solution is pushed out from a nozzle using a pressure of a pump or the like through a pipe and dispensed, can be considered.
[0026]
Furthermore, the nucleic acid or protein extraction reagent kit of the present invention comprises the silica particle composition, an adsorption reagent for easily adsorbing nucleic acids or proteins, a washing reagent and particles for washing nonspecific components adsorbed on the particles. Includes an elution reagent for eluting nucleic acids or proteins from the surface. Examples of the adsorption reagent include chaotropic reagents such as guanidine salt, sodium iodide, potassium iodide, sodium (iso) thiocyanate, urea, and mixtures thereof. Further, the adsorption reagent may contain a buffer such as an acetate buffer, a citrate buffer, and a Tris buffer, a chelating agent such as sodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), and / or an organic solvent such as ethanol. . The washing reagent may contain the above-mentioned tropics substance or an organic solvent such as ethanol. The washing reagent may contain the above buffer and / or chelating agent. As the elution reagent for eluting the nucleic acid or protein from the particle surface, a low salt buffer, water or the like is used. As the components of the adsorbing solution, the washing solution and the eluate, various compositions other than those described above can be selected depending on the application.
[0027]
Further, in order to extract nucleic acids or proteins, it is necessary to perform operations such as mixing, separating, and heating the reagents contained in the reagent kit in a predetermined order. For example, a cell containing a protein and a nucleic acid is mixed with the above silica particle composition and a nucleic acid or a reagent for adsorbing a protein, the protein and the nucleic acid are removed from the cell, and the protein or the nucleic acid is bound to the silica particle, and the remaining components are removed. After washing the silica particles, nucleic acids or proteins bound to the silica particles are eluted to extract nucleic acids or proteins. The extracted nucleic acid can be amplified by a known nucleic acid amplification method and then detected by a known detection method. The nucleic acid or protein extraction method of the present invention can be applied to the preparation of a nucleic acid or protein for research or clinical diagnosis.
[0028]
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples.
【Example】
Example 1 Particle Sedimentation Test (1) Preparation of Magnetic Silica Particle Suspension Magnetic silica particles (particle size: 1 to 10 μm, iron trioxide particles containing 30% (w / v), specific surface area: 280 m ² / g, fine surface 0.4 g of a pore diameter of 2 to 6 nm and a pore volume of 0.025 ml / g (manufactured by Suzuki Yushi) is suspended in a microtube containing 1 ml of a solution containing a compound shown in Table 1 below to suspend silica particles. A liquid was prepared. The reagents used in the preparation of the following reagents were those manufactured by Nacalai Tesque, Inc., and distilled water was used as the water.
[0029]
(2) The microtubes containing each of the magnetic silica particle suspensions prepared in the sedimentation test (1) were inverted to mix and completely suspended, and 1 ml of a 1 ml syringe (manufactured by Terumo: SS-01T) was used. Aspirated to the scale. Then, the syringe was fixed to a test tube stand, and after 5 minutes, the height of the interface between the solution and the magnetic silica particles, that is, how many ml of the particles settled was measured. The measurement was performed twice, and the value obtained by dividing the average interface height by the interface height at 0 minutes was defined as the dispersion ratio. The results are shown in Table 1 below.
[0030]
[Table 1]

[0031]
As is clear from Table 1, a high particle dispersing effect was observed in a salt solution such as sodium chloride, sodium iodide, lithium chloride, ammonium chloride, and magnesium chloride or a saccharide solution such as saccharose and sorbitol. In these solutions, the interface of the distilled water suspension was lowered to 70% after 5 minutes, while the interface was maintained at 90% or more. This tendency is more remarkable as the concentration of these solutions is higher. In a 5 M sodium chloride solution, a sodium iodide solution, a lithium chloride solution, an ammonium chloride solution and a 2 M magnesium chloride solution, a dispersion rate of 0.95 or more is obtained. I knew it could be done.
[0032]
The concentration of the salt was remarkable at 0.2 M or more in lithium chloride, and it was found that even at 0.2 M, the dispersibility was higher than that of a 2 M potassium chloride solution having a clearly higher specific gravity. The concentration of the saccharide solution was remarkable in saccharose at a concentration of 25% (w / v) or more. From these facts, it has been clarified that the effect of enhancing the dispersibility of the particles largely depends on the type and concentration of the substance dissolved in the solution.
[0033]
Further, when the dispersion ratio of the particles after 5 minutes was compared with that of 5M lithium chloride solution and distilled water, a remarkable difference was observed even after 30 minutes. On the other hand, it was 0.6 or more in the 5M lithium chloride suspension (FIG. 1).
[0034]
Example 2 Dispensing test (1) Preparation of particle suspension According to the same method as in Example 1, 2 ml of a magnetic silica particle suspension (5M lithium chloride solution, distilled water) was prepared.
[0035]
A suspension of magnetic silica particles of 5M lithium chloride and distilled water, which had already been prepared, was added to a continuous pipetting pipette (manufactured by Eppendorf) equipped with a combichip (manufactured by Eppendorf) having a capacity of 2.5 ml in (1) in (1). 1.2 ml was aspirated, and 19 tubes were continuously dispensed every 50 seconds into 50 μl microtubes weighed in advance. When dispensing, the dispenser was set to be perpendicular to the floor. After the end of the dispensing, it was confirmed that the dispensed amount was almost accurate, the dispensed microtube was weighed, and the value of the previously weighed was subtracted to calculate the weight of the dispensed particle solution.
[0036]
The result is shown in FIG. 2. As is clear from FIG. 2, it was found that those obtained by dispensing magnetic silica particles suspended in 5M lithium chloride gave more stable numerical values than those suspended in distilled water. The CV (%) (standard deviation / average value × 100) of the dispensed weights of the lithium chloride suspension and the distilled water suspension was 0.94% and 3.26%, respectively. This variation is presumed to be due to the concentration of the magnetic particles contained in the dispensed suspension.
[0037]
When the distilled water suspension was continuously dispensed, the weight of the dispensed liquid gradually increased in the first to thirteenth dispensations, and gradually decreased after the thirteenth dispensation. This phenomenon can be easily predicted from the results of Example 1, and it is expected that a concentration gradient was generated in the particle suspension over time. Therefore, it was shown that the use of the method of the present invention makes it possible to dispense a uniform silica suspension continuously.
[0038]
【The invention's effect】
According to the present invention, silica particles having a high specific gravity can be easily dispersed in an aqueous solution. Further, the silica particle composition of the present invention can be applied to a nucleic acid extraction device using an automatic dispenser. By applying this method to nucleic acid or protein purification, reproducible and reliable extraction results can be obtained compared to conventional methods.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a relationship between a dispersion ratio of a magnetic silica particle suspension and a standing time.
FIG. 2 is a diagram showing a change in dispensed weight when a magnetic silica particle suspension is continuously dispensed.

Claims

That the silica particles are suspended in a salt solution of at least 0.2 M of an inorganic or organic salt and / or a saccharide solution of at least 25 (w / v)% of a monosaccharide, polysaccharide or sugar alcohol. A silica particle composition for nucleic acid or protein extraction, characterized by:

The silica particle composition according to claim 1, wherein the silica particles are silicon dioxide crystals, silicon oxide other than silicon dioxide crystals, diatomaceous earth, glass powder, chemically modified silica, or a composite of silica and superparamagnetic metal oxide.

The silica particle composition according to claim 1, wherein the specific gravity of the silica particles is 1.0 to 1.8.

The silica particle composition according to claim 1, wherein the inorganic salt or organic salt solution is a solution containing a halide, acetate or thiocyanate of an alkali metal, an alkaline earth metal or ammonia.

The silica particles according to claim 1, wherein the inorganic salt or organic salt solution is a salt solution selected from the group consisting of sodium chloride, sodium iodide, lithium chloride, lithium iodide, magnesium chloride, ammonium acetate and sodium thiocyanate. Composition.

The silica particle composition according to claim 1, wherein the saccharide solution is a saccharide solution selected from the group consisting of glucose, saccharose, sorbitol, and mannitol.

Silicon dioxide crystal having a specific gravity of 1.0 to 1.8 and a particle size of 0.1 to 100 μm, silicon oxide other than silicon dioxide crystal, diatomaceous earth, glass powder, chemically modified silica or silica and superparamagnetic metal A solution in which the silica particles, which are complexed with the oxide, comprise at least 0.2 M of a halide, acetate or thiocyanate of an alkali metal, alkaline earth metal or ammonia and / or at least 25 (w / v) % Of a silica particle composition for nucleic acid or protein extraction, which is suspended in a saccharide solution of a monosaccharide, a polysaccharide or a sugar alcohol having a concentration of 0.1%.

A method for dispensing a silica particle solution, comprising dispensing the silica particle composition according to any one of claims 1 to 7 from a reagent container to a reaction container using a dispensing device or a dispensing device. .

A nucleic acid or protein extraction reagent kit comprising the silica particle composition according to any one of claims 1 to 7, an adsorption reagent, a washing reagent, and an elution reagent.

10. The nucleic acid or protein extraction reagent kit according to claim 9, wherein the adsorption reagent contains a chaotropic reagent, a buffer, and if necessary, an organic solvent.

A cell containing a protein and a nucleic acid is mixed with the silica particle composition and the reagent for adsorption according to any one of claims 1 to 7, to remove the protein and the nucleic acid from the cell, and to bind the nucleic acid or the protein to the silica particle. And separating the remaining components, washing the silica particles, and then eluting the nucleic acids or proteins bound to the silica particles.