JP2004000200A - Method for detecting microorganism - Google Patents

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JP2004000200A
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Yukiko Sugie
Naotaka Yamamoto
Masashige Yamanaka
山中 正重
山本 直香
杉江 由希子
Original Assignee
Menicon Co Ltd
株式会社メニコン
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting microorganisms contained in fluid promptly and sensitively. <P>SOLUTION: The method includes a process (1) for filtering the fluid by using a filter membrane, a process (2) in which the filter membrane is immersed in a liquid medium, and the microorganisms entrapped by the filter membrane are cultivated, a process (3) for concentrating the cultivated microorganisms, a process (4) for extracting the DNA of the cultivated microorganisms from the concentrated culture, a process (5) for performing PCR (polymerase chain reaction) by using the extracted DNA as a template, and a process (6) for detecting the obtained PCR product. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【0001】 [0001]
【発明の属する技術分野】 BACKGROUND OF THE INVENTION
本発明は、微生物の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting microorganisms.
【0002】 [0002]
【従来の技術】 BACKGROUND OF THE INVENTION
近年、組織工学の急速な進歩により、培養皮膚などの生細胞を利用した製品が開発されている。 In recent years, with the rapid advances in tissue engineering, products have been developed using living cells, such as cultured skin. そのような製品においては、構成する細胞の安全性はもちろんのこと、微生物の汚染がないという確証が要求される。 In such products, of course the safety of cells constituting, confirm that there is no contamination of the microorganisms is required. 培養皮膚などの生細胞を利用した製品は最終滅菌ができないため、製造工程において微生物が混入しないよう充分に注意を払う必要がある。 Since the products using living cells such as cultured skin can not terminal sterilization, it is necessary to pay enough attention to the microorganism is not mixed in the manufacturing process. また、最終製品の無菌性も保証することが必要となる場合がある。 Further, there are cases where sterility of the final product is also required to be guaranteed.
【0003】 [0003]
培養皮膚は、やけどを負った患者などから採取した少量の細胞を培養することによって製造され、細胞を採取した患者本人に移植される(自家培養皮膚移植)か、または他人に移植される(同種培養皮膚移植)。 Cultured skin is prepared by culturing a small amount of cells taken from such patients burned, they are implanted into the patient himself which cells were harvested (autologous cultured skin graft), or transplanted into another person (allogeneic cultured skin graft). このため、採取した細胞が真菌、細菌またはウイルスに感染していないことを確認する必要がある。 Therefore, it is necessary to collect cells to confirm that not infected with fungi, bacteria or viruses. とくに、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)などによる深在性(全身性)真菌症は、易感染患者が高率に罹患する感染症として医療上の問題となっている。 In particular, Candida albicans (Candida albicans) such as by profound (systemic) mycoses has a medical problem as infection compromised patients suffering a high rate. また、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)などによる緑濃菌症は、抵抗力の低下した宿主に日和見感染を起こし、皮膚の化膿、尿路感染、呼吸器感染、敗血症の原因となり、院内感染を起こしやすいという問題を有する。 In addition, Pseudomonas Erujinoza (Pseudomonas aeruginosa) Pseudomonas aeruginosa diseases caused by such as, reduced host resistance force to cause opportunistic infections, suppuration of the skin, urinary tract infection, respiratory tract infection, cause of sepsis, caused a nosocomial infection with the problem of cheap.
【0004】 [0004]
古くからの真菌の検出方法としては、臨床検体を、たとえばペトリ皿上で培養し、臨床検体に含まれる真菌を増殖させて、形成された真菌のコロニーを検出する方法が行なわれてきた。 Detection methods for the fungus from old, clinical specimens, for example, cultured on Petri dishes, grown fungal contained in the clinical specimen, a method of detecting the colonies of the fungus formed have been performed. しかしながら、とくに真菌は増殖が遅いため、コロニー形成まで長時間を要した。 However, particularly because fungi is slow growth, it took a long time until colonies formed. このため、培養皮膚を患者へ適用する前に検出結果が得られないという不具合が生じた。 Therefore, the detection result before applying the cultured skin to the patient inconvenience not be obtained occurs.
【0005】 [0005]
医療用具GMPにおける細菌・真菌否定試験としては、サンプルを濾過した濾過膜を7〜14日間培養し、培養液が濁っていないことを目視で確認するという方法が一般的に採用されている。 The bacteria, fungi negative test in medical devices GMP, samples were cultured for 7 to 14 days The filtered filtration membrane, the method that visually confirmed that no turbid culture solution is generally employed. しかしながら、この方法による培養皮膚の無菌試験の場合でもやはり、培養皮膚を患者へ適用する前に試験結果を得ることができない。 However, again, even if the sterility test of cultured skin by this method, it is impossible to obtain a test result before applying to the patient a cultured skin.
【0006】 [0006]
そのほか、真菌の抗原を免疫学的に検出する方法、真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法などがあるが、いずれも検出感度が低く、多くの時間を要する方法である。 In addition, a method of detecting an antigen of a fungus immunologically, there is a method of biochemically detectable cell components or metabolites of fungi, both low detection sensitivity is the method of time-consuming .
【0007】 [0007]
試験結果を得るまでに長時間を要するという問題を解決する方法として、真菌DNAを直接的に検出する方法が数多く公開されている。 As a method for solving the problem of taking a long time to obtain the test results, it is published a number of methods for directly detecting the fungal DNA. 具体的には、真菌の特定の遺伝子配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、PCRにより遺伝子を増幅して真菌を検出する方法である。 Specifically, a method using, for detecting the fungi by amplifying the gene by PCR specific gene sequences that hybridize to the oligonucleotide of the fungus as a primer. このような方法は、前述の方法よりも迅速に真菌を検出することができ、さらに、検出感度も向上した。 Such methods can be detected quickly fungi than the method described above, further, it was also improved detection sensitivity. とくに、特許文献1には、たとえば、カンジダ・アルビカンスの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、該遺伝子を増幅し、増幅産物を電気泳動法やドットブロットハイブリダイゼーション法などにより検出する方法が開示されている。 In particular, Patent Document 1, for example, by using a nucleic acid sequence that specifically hybridizes to an oligonucleotide of 18SrRNA gene Candida albicans as primers to amplify the gene, electrophoresis an amplified product or dot blot method for detecting the like hybridization method is disclosed. この方法により、従来、数日から数週間要した真菌の検出を1日以内に終わらせることが可能となった。 In this way, conventionally, it becomes possible to finish the detection of fungal taken days or weeks within a day. しかしながら、特許文献1に開示されている方法では従来のPCR法を適用しており、1〜2ml程度のサンプルしか利用することができない。 However, in the method disclosed in Patent Document 1 has been applied conventional PCR method, you can only use a sample of about 1 to 2 ml. 該方法を培養上清が数百ミリリットルに達する組織または組織等価物の浸漬液などの液体に適用する場合には、得られた培養上清のごく一部を使用することになる。 When applying the method to a liquid, such as immersion liquid tissue or tissue equivalent culture supernatant reaches hundreds milliliters, will use a small portion of the resulting culture supernatant. したがって、微生物の検出感度が不充分であるだけでなく、試験結果の信頼性の低下などの不具合も生じる。 Therefore, not only is insufficient detection sensitivity of microorganisms, also occur inconveniences such as lowering of the reliability of the test results.
【0008】 [0008]
PCRを用いるそのほかの真菌検出方法についても、検出感度は充分ではない。 For even other fungal detection method using PCR, the detection sensitivity is not sufficient. また、培養皮膚などの組織等価物の浸漬液をサンプルとした真菌の検出方法については、まったく開示されていなかった。 As for the method of detecting the fungus, and sample immersion liquid tissue equivalent, such as cultured skin it was not at all disclosed.
【0009】 [0009]
さらに、細菌の迅速検出法としては、培地の炭素原として14 Cで標識したブドウ糖を用い、代謝により産生されるCO を検出する方法も知られている(非特許文献1)。 Further, as the rapid detection of bacteria, using the glucose labeled with 14 C as a carbon source of the medium, it is also known a method of detecting the CO 2 produced by metabolism (Non-Patent Document 1). しかしながら、該方法では真菌と細菌を区別して検出することができないという問題点があった。 However, the method has a problem that can not be detected by distinguishing the fungi and bacteria. また、生細胞を含有する製品(たとえば組織等価物)に関しては、生細胞自体がCO を産生するため、該方法を適用することができない。 With regard to products containing living cells (e.g. tissue equivalent), since the living cells themselves produce CO 2, it is impossible to apply the method.
【0010】 [0010]
したがって、組織または組織等価物、とくに培養皮膚において有用な、真菌および細菌などを含む微生物の検出方法が望まれていた。 Accordingly, tissue or tissue equivalent, a particularly useful in cultured skin, has been desired method for detecting microorganisms, including fungi and bacteria.
【0011】 [0011]
管理環境中の空気中の微生物の検出方法としては、エアーサンプラーを用いて一定量の空気を吸引し、空気中の微生物を寒天培地に衝突させ、そののち該寒天培地を培養し、生育したコロニー数を測定する方法が知られている(非特許文献2および3)。 Colony Detection methods of microorganisms in the air management in the environment, sucks a certain amount of air using an air sampler, the microorganisms in the air is impinging on agar medium, and cultured Thereafter agar medium, grown method of measuring the number is known (non-Patent documents 2 and 3). しかしながら、目視でコロニーが確認できるようになるには、増殖速度が速い菌体でも少なくとも2日、増殖速度が遅い菌体においては4日以上の培養が必要である。 However, the colonies will be able to visually confirm, at least 2 days even growth rates at a fast bacteria, in the growth rate is slow cells are required more than four days in culture. また、酵母様真菌および細菌のコロニーの形は円状であることから、コロニーの形から両者を識別することは困難であり、菌の同定を行なう場合には、菌体からDNAを抽出するなど、さらに時間を要するといった問題があった。 Further, since the shape of colonies of yeast-like fungi and bacteria are circular, identifying both the shape of the colonies is difficult, in the case of the identification of bacteria, such as extracting DNA from bacterial cells , there has been a problem such further time-consuming. そのほかにも、たとえば、一定量の空気を吸引する毎に寒天培地を交換する必要があるため、大量の寒天培地が必要となる点、寒天培地での培養期間は日本薬局方により5日以上と定められているため、寒天培地を培養するための場所が数日に渡って必要になる点、または菌体の検出を1日でも早く確認するために、培養期間中コロニーの有無を観察しなければならず、サンプルが多い場合はもちろん、寒天培地の観察に手間がかかるといった点などが問題となっている。 Besides that, the example, it is necessary to replace the agar medium each time to suck a certain amount of air, that is required a large amount of agar medium, culture period in agar or 5 days by Japanese Pharmacopoeia because it is determined, that the location for culturing agar is needed for several days, or the detection of bacteria in order to confirm quickly even 1 day, be observed whether the culture period colonies Banara not a, if the sample is large, of course, such as time-consuming, such as a point on the observation of the agar media has become a problem.
【0012】 [0012]
【特許文献1】 [Patent Document 1]
特開平8−89254号公報【非特許文献1】 JP-A-8-89254 [Non-Patent Document 1]
社団法人日本空気清浄協会編、「クリーンルーム環境の施工と維持管理」、第1版、(株)オーム社、2000年7月20日、p. Japan Air Cleaning Association, ed., "Construction and maintenance of clean room environment", first edition, (Ltd.) Ohm, Inc., July 20, 2000, p. 65〜75 65 to 75
【非特許文献2】 Non-Patent Document 2]
日本薬局方解説書編集委員会編、「第14改正 日本薬局方解説書」、東京廣川書店、平成13年6月27日、p. Japanese Pharmacopoeia Reference edited by the Editorial Committee, "the 14 Japanese Pharmacopoeia Reference", Tokyo Hirokawa Publishing Company, 2001 June 27, p. F−140〜162 F-140~162
【非特許文献3】 Non-Patent Document 3]
佐藤健二ら編、「滅菌済み医療用具GMP・バリデーション入門講座」、財団法人 医療機器センター、平成14年2月21日、p. Kenji Sato et al., Eds., "Sterile medical devices GMP · validation introductory course", Foundation Medical Equipment Center, February 21, 2002, p. 87〜107 87-107
【0013】 [0013]
【発明が解決しようとする課題】 [Problems that the Invention is to Solve
前記従来技術の問題点に鑑み、本発明は、迅速かつ高感度に微生物を検出する方法を提供することを目的とする。 In view of the problems of the prior art, the present invention aims to provide a method for detecting microorganisms in rapid and sensitive. とくに、本発明は、組織または組織等価物の浸漬液などの液体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。 In particular, the present invention aims to provide a method of detecting a rapid and sensitive microorganisms contained in a liquid, such as immersion liquid tissue or tissue equivalent. さらに本発明は、気体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することも目的とする。 The present invention also aims to provide a method for detecting a rapid and sensitive microorganisms contained in the gas. すなわち、本発明は流体に含まれる微生物を迅速かつ高感度に検出する方法を提供することを目的とする。 That is, the present invention aims to provide a method of detecting a rapid and sensitive microorganisms contained in the fluid.
【0014】 [0014]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
微生物を迅速かつ高感度に検出する方法について研究を重ねた結果、組織または組織等価物の浸漬液などの液体の濾過膜による濾過、該濾過膜を用いる前培養およびPCRを組み合わせることにより、液体に含まれる微生物が迅速かつ高感度に検出されることを見出した。 Result of extensive studies on how to detect the rapid and sensitive microorganisms, filtration through a filtration membrane of a liquid, such as immersion liquid tissue or tissue equivalent, by combining the pre-culture and PCR using the filtration membrane, the liquid microorganisms contained has been found to be detected rapidly and with high sensitivity. さらに、液体だけでなく気体に含まれる微生物をも迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成するに至った。 Furthermore, it found that detecting the rapid and sensitive also microorganisms contained in the gas well fluid, and have completed the present invention.
【0015】 [0015]
すなわち本発明は、微生物の検出方法であって、 That is, the present invention is a method for detecting microorganisms,
(1)濾過膜を用いて流体を濾過する工程、 (1) a step of filtering a fluid with a filtration membrane,
(2)濾過膜を液体培地に浸漬し、該濾過膜に捕捉された微生物を培養する工程、 (2) a filtration membrane was immersed in a liquid medium, a microorganism that is trapped in the filtration membrane process,
(3)培養物を濃縮する工程、 (3) a step of concentrating the culture,
(4)濃縮培養物から微生物のDNAを抽出する工程、 (4) extracting the DNA of microorganisms from the concentrated culture,
(5)抽出したDNAを鋳型としてPCRを実施する工程、および(6)得られたPCR産物を検出する工程を含む微生物の検出方法に関する。 (5) step of the extracted DNA to PCR performed as a template, and (6) a method for detecting microorganisms comprising the step of detecting a resultant PCR product.
【0016】 [0016]
【発明の実施の形態】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
以下に本発明をより詳細に説明する。 The invention is explained in more detail below.
【0017】 [0017]
本明細書において、「濾過」とは、液体または気体を濾過膜などの多孔質の物質に通すことを意味する。 As used herein, "filtering" means the passage of liquid or gas into a porous substance such as filter membranes.
【0018】 [0018]
本明細書における用語「流体」は、液体または気体を意味する。 The term "fluid" herein means a liquid or gas.
【0019】 [0019]
本明細書における用語「液体」は、微生物を含む可能性のある液体を意味し、たとえば、組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The term "liquid" in this specification means a liquid that may contain microorganisms, for example, immersion liquid tissue or tissue equivalent, but such immersion fluid or blood organs include, limited to not.
【0020】 [0020]
本明細書における用語「組織」は、生体から摘出された各種組織を意味する。 The term "tissue" as used herein, refers to excised various tissues from a living body. 組織の例としては、たとえば、皮膚、角膜、軟骨、脂肪組織、筋肉、血管、神経、羊膜、胎盤またはリンパ節などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Examples of tissue, for example, skin, cornea, cartilage, adipose tissue, muscle, blood vessels, nerves, amnion, although such placenta or lymph nodes include, but are not limited thereto.
【0021】 [0021]
本明細書における用語「組織等価物」は、生きた細胞を含有する構造物、または生きた細胞が生体適合性材料に組み込まれた構造物として定義される。 The term "tissue equivalent" herein is defined as a structure containing the living cells or living cells has been incorporated into the biocompatible material structures. 組織等価物の例としては、たとえば、生細胞と生体高分子または生細胞のみからなる培養皮膚、培養角膜、培養軟骨、培養骨、培養腎臓、培養肝臓、培養網膜、培養神経、培養心臓または培養内耳などがあり、生きた細胞を含有する構造物である限りこれらに限定されるものではない。 Examples of tissue equivalents, for example, cultured skin comprising only live cells and biopolymer or living cells, cultured corneal culture cartilage, cultured bone, cultured kidney, cultured liver, cultured retinal, cultured neurons, cultured cardiac or cultured It includes the inner ear, but is not as long as a structure containing the living cells limitation.
【0022】 [0022]
前記培養皮膚には、培養表皮、培養真皮および複合培養皮膚などが含まれる。 Wherein the cultured skin, cultured epidermal, and the like cultured dermis and composite cultured skin. 培養表皮とは、たとえば、ケラチノサイトなどの哺乳動物の表皮から得た表皮細胞を培養し増殖させることにより製造する表皮細胞シート、またはコラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および/またはポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に表皮細胞を組み込んだ構造物である。 The cultured epidermal, for example, epidermal cell sheet for producing by culturing epidermal cells obtained from mammalian epidermal such as keratinocyte proliferation or collagen, chitin, chitosan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, laminin, polylactic acid, polyglycolic acid, fibrin, biopolymer materials such as gelatin, and / or polyurethane, polystyrene, structures incorporating epidermal cells synthetic polymer material cell adhesive with good non-biodegradable, such as polyacrylates. 培養真皮とは、たとえば、哺乳類の真皮から得た線維芽細胞を培養し増殖させ、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および/または合成高分子であるポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に組み込んだ培養真皮シートである。 The culture dermis, for example, culturing the fibroblasts obtained from mammalian dermal grown, collagen, chitin, chitosan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, laminin, polylactic acid, polyglycolic acid, fibrin, biological height such as gelatin polyurethane is a molecular material, and / or synthetic polymers, polystyrene, cultured dermal sheet incorporating the cell adhesiveness good nonbiodegradable synthetic polymer materials such as polyacrylates. 複合培養皮膚とは、前記培養真皮状の構造物にさらに表皮細胞を組み込んだ生体の皮膚に近い構造物である。 The composite cultured skin is a close structure to the skin of more biological incorporating epidermal cells in the culture dermis-like structure.
【0023】 [0023]
前記培養角膜とは、たとえば、哺乳類の角膜から得られた角膜上皮細胞、実質細胞および/または内皮細胞を培養し増殖させることにより製造したシート状の構造物、またはコラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、フィブリン、ゼラチンなどの生体高分子材料、および/または合成高分子であるポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性の良い非生分解性の合成高分子材料に哺乳類の角膜から得た角膜上皮細胞、実質細胞および/または内皮細胞などを組み込んだ構造物である。 Wherein the culture cornea, for example, corneal epithelial cells obtained from mammalian cornea, sheet-like structure was prepared by culturing parenchymal cells and / or endothelial cell proliferation or collagen, chitin, chitosan, chondroitin sulfate , hyaluronic acid, laminin, polylactic acid, polyglycolic acid, fibrin, biopolymer materials such as gelatin, and / or polyurethane is a synthetic polymer, polystyrene, cell adhesion good non-biodegradable synthetic, such as polyacrylates corneal epithelial cells from mammalian cornea in a polymer material, a structure incorporating such parenchymal cells and / or endothelial cells.
【0024】 [0024]
前記培養軟骨とは、周知の方法により製造される、細胞または細胞が基材に組み込まれた構造物からなる人工軟骨である。 Wherein the culture cartilage, are prepared by methods well known, an artificial cartilage cells or cell consists of a structure built in the substrate. 培養軟骨としては、たとえば、キトサン、コラーゲンおよび/またはリン酸カルシウムなどの生体適合性材料からなる三次元構造の担体に、軟骨細胞および/または間葉系幹細胞などを組み込むことにより製造された構造物を挙げることができる。 The culture cartilage, for example, include chitosan, collagen and / or carriers of the three-dimensional structure of a biocompatible material such as calcium phosphate, the structure manufactured by incorporating the like chondrocytes and / or mesenchymal stem cells be able to.
【0025】 [0025]
本明細書における用語「組織または組織等価物の浸漬液」は、(i)患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関(たとえばメーカー)へ輸送される際に使用された液体、(ii)前記組織等価物の製造工程で使用された液体、または(iii)製造された組織等価物を保存するために使用された液体などを含む。 Liquid term "immersion liquid tissue or tissue equivalents" in the present specification, which is used when it is transported to (i) tissue or tissue equivalent supply engine after obtaining a tissue specimen from a patient (e.g., the manufacturer) , including liquid that is used to store (ii) the tissue equivalent liquid was used in the manufacturing process or, (iii) producing tissue equivalent.
【0026】 [0026]
「患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関へ輸送される際に使用された液体」は、採取した組織片を目的地に輸送する間、該組織片を浸漬した液体である限りとくに限定されるものではない。 "Liquid used when it is transported from the harvesting of tissue pieces from the patient to the tissue or tissue equivalent supply authority" during transport to the destination a collected tissue piece, a liquid obtained by immersing the tissue pieces the present invention is not limited as long as there especially. 「患者から組織片を採取してから組織または組織等価物供給機関へ輸送される際に使用された液体」としては、たとえば、哺乳動物から採取した皮膚を保存する際に用いた液体または皮膚を緩衝液でリンスした後に回収される液体などが含まれる。 As "liquid used when it is transported from the harvesting of tissue pieces from the patient to the tissue or tissue equivalent supply authority", for example, a liquid or skin which was used to store the skin taken from a mammal such as a liquid that is recovered after rinsing with buffer contains.
【0027】 [0027]
「組織等価物の製造工程で使用された液体」は、組織等価物の製造中に組織等価物に対して添加され回収される液体であるかぎり、とくに限定されるものではない。 "Liquid used in the manufacturing process of tissue equivalents", unless added to the tissue equivalent in the manufacture of the tissue equivalent is a liquid to be recovered, but the invention is not particularly limited. 「組織等価物の製造工程で使用された液体」は、たとえば、哺乳動物から採取した細胞を緩衝液でリンスした後に回収される液体である。 "Liquid used in the manufacturing process of tissue equivalents", for example, a liquid that is recovered after rinsing the cells collected from the mammal with buffer. さらに、組織等価物を構成する細胞を培養した後に得られる培養上清、細胞を分散させるためのトリプシン処理を実施した後に回収される液体および組織等価物の培養培地を交換する際に回収される液体などもまた、組織等価物の製造工程で使用された液体に含まれる。 Furthermore, recovered when replacing the culture medium of liquid and tissue equivalents are recovered after culture supernatant obtained after culturing the cells constituting the tissue equivalent, the trypsinized to disperse cells was performed liquid like, it is also included in the liquid used in the manufacturing process of the tissue equivalent.
【0028】 [0028]
「製造された組織等価物の保存のために使用された液体」は、完成から実際に適用されるまでの間に組織等価物に添加された後に回収される液体であるかぎり、とくに限定されない。 "Liquid used for storage of the produced tissue equivalents", as long as the liquid to be recovered after being added to the tissue equivalent until is actually applied from the finished, not particularly limited.
【0029】 [0029]
「組織または組織等価物の浸漬液」に使用し得るものの具体例としては、ダルベッコ改変イーグル基本培地(DMEM)、リン酸緩衝液、リンガー液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハンクス液、ロック液、イーグルの最小必須培養液、ハム(Ham)の合成培養液F12、Green培養液、レイボビッツ(Leibovitz)のL−15培養液、ならびに無血清培養液MCDB153、MCDE151、MCDE104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105およびMCDB110などが挙げられる。 Specific examples of that used in the "dip tissue or tissue equivalents", Dulbecco's modified Eagle's essential medium (DMEM), phosphate buffer, Ringer's solution, Ringer - Lock solution, Tyrode's solution, Earle solution, Hanks liquid, lock solution, minimum essential medium Eagle, synthetic culture medium F12, Green culture of ham (ham), L-15 culture medium of Leibovitz (Leibovitz), as well as the serum-free culture medium MCDB153, MCDE151, MCDE104, MCDB131, MCDB402, MCDB201, MCDB302, such as MCDB105 and MCDB110 and the like. また、組織等価物を製造後に凍結保存する場合には、前記の培養液または緩衝液に凍結保護剤を添加した凍結保存液を使用することができる。 Further, in the case of cryopreserved tissue equivalent after manufacture may be used cryopreservation solution added with cryoprotectant in culture medium or buffer of the. 凍結保護剤としてはグリセロール、ジメチルスルフォキシド(DMSO)、プロピレングリコール、エチレングリコール、蔗糖、カルボキシメチルセルロース塩、カルボキシメチルセルロース(CMC)および二糖類(トレハロース等)などを挙げることができ、これらの中から1種類以上選択して前記の培養液または緩衝液に添加することができる。 Glycerol as the cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol, ethylene glycol, sucrose, carboxymethylcellulose salts, carboxymethylcellulose (CMC) and disaccharides (trehalose) and the like can be illustrated, from these You may select one or more added to the culture medium or buffer of the.
【0030】 [0030]
本明細書における用語「臓器」は、生体から摘出された各種臓器を意味する。 The term "organ" as used herein, refers to a variety of organs excised from a living body. 臓器の例としては、たとえば、肝臓、すい臓、腎臓または心臓などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Examples of organs, for example, liver, pancreas, although such kidney or heart include, but are not limited thereto.
【0031】 [0031]
本明細書における用語「臓器の浸漬液」は、臓器移植などの際、摘出された臓器を病院間で輸送する場合に一時的に臓器を浸漬、保存するために使用された液体などを含む。 The term "immersion liquid organ" as used herein, upon organ transplantation and the like, temporarily immersing the organ when transporting isolated organ between hospitals, including liquid that is used to store.
【0032】 [0032]
「臓器の浸漬液」に使用し得るものの具体例としては、DMEM、リン酸緩衝液、リンガー液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハンクス液、ロック液、イーグルの最小必須培養液、ハムの合成培養液F12、Green培養液、レイボビッツのL−15培養液、ならびに無血清培養液MCDB153、MCDE151、MCDE104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105およびMCDB110などが挙げられる。 Specific examples of that used in the "immersion liquid organ" is, DMEM, phosphate buffer, Ringer's solution, Ringer - Lock solution, Tyrode's solution, Earle solution, Hank's solution, the lock solution, minimum essential medium Eagle synthetic culture F12, Green culture ham, L-15 culture Leibovitz, and serum-free medium MCDB153, MCDE151, MCDE104, MCDB131, MCDB402, MCDB201, MCDB302, such as MCDB105 and MCDB110 and the like. また、前記の培養液または緩衝液に凍結保護剤を添加した凍結保存液を使用することもできる。 It is also possible to use a cryopreservation solution added with cryoprotectant in culture medium or buffer of the. 凍結保護剤としてはグリセロール、DMSO、プロピレングリコール、エチレングリコール、蔗糖、カルボキシメチルセルロース塩、CMCおよび二糖類(トレハロース等)などを挙げることができ、これらの中から1種類以上選択して前記の培養液または緩衝液に添加することができる。 Glycerol as the cryoprotectant, DMSO, propylene glycol, ethylene glycol, sucrose, carboxymethylcellulose salts, CMC and disaccharides (trehalose) and the like can be illustrated, wherein the culture broth was selected from these one or more or it may be added to the buffer.
【0033】 [0033]
さらに、細胞を除去していない採取された血液そのもの、および血液から細胞を除去した液体成分なども、本発明の微生物の検出方法を用いて微生物汚染を検出することができる。 Furthermore, blood itself collected not removing the cells, and also including a liquid component obtained by removing the cells from the blood, it can detect microbial contamination using the method for detecting microorganisms of the present invention. 血液から細胞を除去した液体成分としては、血清または血漿などが挙げられる。 The liquid component obtained by removing cells from blood, such as serum or plasma and the like. 血清は、たとえば、乾燥注射器を用いて採取した血液を放置し、血球といくつかの血液凝固因子(フィブリノーゲンまたはプロトロンビンなど)を含む血餅を血液から取り除くことによって得られる。 Serum, for example, leaving the blood collected using a dry syringe, obtained by removal of a blood clot containing blood cells and some blood coagulation factors (such as fibrinogen or prothrombin) from the blood. 血漿は、たとえば、採取された血液に血液凝固阻止剤を添加し、該血液を遠心することにより沈殿した血球を血液から取り除くことによって得られる。 Plasma is, for example, the addition of anticoagulant to the collected blood is obtained by removing the blood cells were precipitated by centrifugation the blood from the blood.
【0034】 [0034]
本明細書における用語「気体」は、微生物を含む可能性のある気体を意味し、たとえば、少なくとも酸素を含む空気が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The term "gas" herein is meant a gas that may contain microorganisms, for example, including but air containing at least oxygen, but is not limited thereto.
【0035】 [0035]
本明細書における用語「微生物」は、たとえば、組織もしくは組織等価物の使用前および使用中、または臓器を摘出する際においてその汚染の原因となる真菌および/または細菌などを含む。 The term "microorganism" as used herein includes, for example, tissue or in use prior to and use of tissue equivalents, or the like fungi and / or bacteria that cause contamination in time to remove the organ.
【0036】 [0036]
真菌としては、たとえば、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウモシスチス属、マラセジア属またはデバリオマイセス属などに属する真菌が含まれる。 The fungus, for example, Candida, Hansenula, Saccharomyces, include Trichosporon, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, blasting Kluyveromyces, Coccidioides spp, Nyuumoshisuchisu genus fungi belonging to such Malassezia or Debaryomyces genus . さらに具体的に、そのような真菌には、たとえば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)またはニュウモシスチス・カリニ(Pneumocistis carinii)が含まれる。 More specifically, such a fungus, for example, Candida albicans, Candida Rushitanie (Candida lusitaniae), Candida Kuruzei (Candida krusei), Candida glabrata (Candida glabrata), Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans ), include Aspergillus fumigatus (Aspergillus fumigatus) or Nyuumoshisuchisu carinii (Pneumocistis carinii) is.
【0037】 [0037]
細菌としては、たとえば、バチルス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、エシェリキア属またはスタフィロコッカス属などに属する細菌が含まれる。 Bacterial, for example, Bacillus, Streptococcus, Pseudomonas, include bacteria belonging to such Escherichia genus or Staphylococcus. さらに具体的に、そのような細菌には、たとえば、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)、ストレプトコッカス・パイオジェン(Streptococcus pyogenes)、サルモネラ・チフムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)またはスタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)およびシュードモナス・エルジノーザが含まれ More specifically, such a bacteria, e.g., Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptococcus Paiojen (Streptococcus pyogenes), Salmonella Chifumuriumu (Salmonella typhimurium), Salmonella Bongori (Salmonella bongori), Salmonella Enteriti disk (Salmonella enteritidis), Escherichia coli (Escherichia coli) or Staphylococcus Epidamidisu (Staphylococcus epidermidis), is included Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and Pseudomonas Erujinoza .
【0038】 [0038]
本発明の検出方法では、検出結果の信頼性を高めるために、濾過対象が液体の場合には、液体全体をサンプルとして用いる。 In the detection method of the present invention, in order to increase the reliability of the detection result, if the filtration target is a liquid, using a total liquid as a sample. 対象の液体をすべて濾過膜を用いて濾過することにより、該液体に含まれる微生物を捕捉する。 By filtering with all filtration membranes liquid of interest, capturing the microorganisms contained in the liquid. 濾過対象が気体である場合には、濾過膜をエアサンプラーに適用し、エアーサンプラーによって気体を吸引することにより、該気体に含まれる微生物を捕捉する。 If filtration target is a gas, applying a filter membrane to the air sampler, by sucking gas by an air sampler, capturing the microorganisms contained in the gas.
【0039】 [0039]
本明細書において「エアサンプラー」とは、空気中の微生物を濾過膜に衝突させることによって微生物を捕捉し得る装置である限り、とくに限定されるものではない。 The "air sampler" herein, as long as the apparatus capable of capturing the microorganisms by impinging the microorganisms in the air filter membrane, but is not particularly limited. たとえば、寒天培地を微生物が衝突するようにセットされたエアーサンプラーなどを使用することができる。 For example, it is possible to use the agar medium such as the set air sampler as microorganisms collide. 寒天培地がセットされたエアーサンプラーを使用する場合には、該寒天培地に濾過膜を載せ、エアーサンプラーによって気体を吸引することにより、該気体に含まれる微生物を捕捉することができる。 When using air sampler agar is set, placing the filtration membrane in agar medium, by sucking the gas through air sampler can capture microorganisms contained in the gas. なお、寒天培地に濾過膜を載せると、濾過膜は湿った状態になる。 Note that when placing the filter membrane on an agar medium, the filtration membranes become wet. 乾燥状態の濾過膜を使用した場合、静電気の影響により微生物を濾過膜上に定量的に捕集できない可能性があるため、湿った状態の濾過膜を使用することが好ましい。 When using the filter membrane in a dry state, because there may not be quantitatively collected microorganisms on the filter membrane due to the influence of static electricity, it is preferable to use a filtration membrane wet.
【0040】 [0040]
本発明において、濾過に使用する濾過膜としては、濾過膜の孔径が0.2μm〜0.45μmであることが好ましい。 In the present invention, the filtration membrane used for filtration, it is preferable pore size of the filtration membrane is 0.2Myuemu~0.45Myuemu. 濾過膜の孔径が0.2μm未満の場合には、目的とする微生物以外の細胞屑などが濾過膜に残存し、濾過膜が目詰まりをおこす傾向がある。 When the pore size of the filtration membrane is less than 0.2μm is to remain in the filtration membrane such as cell debris other than microorganisms of interest, the filtration membrane tends to cause clogging. 濾過膜の孔径が0.45μmより大きい場合には、目的とする微生物が濾過膜を通過してしまう傾向がある。 When the pore size of the filtration membrane is larger than 0.45μm tend microorganism of interest will pass through the filtration membrane. 濾過膜の目詰まりを防ぐために、さらに孔径の大きい濾過膜(たとえば、孔径8μm)を重ねてもよい。 To prevent clogging of the filtration membranes, larger filtration membranes having a pore size (e.g., pore size 8 [mu] m) may be repeated. また、液体に細胞の残骸が多く含まれるなど、目詰まりをおこす可能性がある液体を濾過対象とする場合には、液体を分割し、それぞれを別の濾過膜で濾過することが好ましい。 Further, such a liquid cellular debris is abundant in the case where a liquid that can cause clogging and be filtered, the liquid was divided, it is preferred to filter the respectively different filtration membranes. 1つのサンプルを複数の濾過膜で濾過した場合、下記の培養工程においてそれら複数の濾過膜をまとめてもよいし、濾過工程以降はそれぞれ単独に本発明の方法を適用してもよい。 If filtration of the one sample in a plurality of filtration membranes, may be collectively plurality of filtration membrane in the step of culturing the following method may be applied to the present invention, each subsequent filtration step alone.
【0041】 [0041]
組織または組織等価物の浸漬液などの液体は、微生物の増殖を予防するために抗生物質を含む場合がある。 Liquid, such as immersion liquid tissue or tissue equivalent may include an antibiotic to prevent the growth of microorganisms. そのような場合には、浸漬液を濾過した後の濾過膜に抗生物質が吸着され、続く培養工程に悪影響を与える。 In such cases, the antibiotic is adsorbed by the membrane filter after filtration of the immersion liquid, adversely affect the subsequent incubation step. したがって、本発明の微生物の検出方法においては、組織または組織等価物の浸漬液などの液体を濾過した後、濾過膜をリンスすることが好ましい。 Accordingly, in the method for detecting microorganisms of the present invention, after filtration of the liquid, such as immersion liquid tissue or tissue equivalent, it is preferable to rinse the filtration membrane. 濾過膜をリンスすることにより、濾過膜に吸着した抗生物質を洗い流すことができ、続く培養工程における微生物の増殖が阻害されないため、より確実に微生物を検出することができる。 By rinsing the filter membrane can be washed away antibiotic adsorbed on filtration membranes, because the growth of microorganisms is not inhibited in the subsequent culturing step, it is possible to detect the microorganism more reliably. そのような濾過膜のリンスには、たとえばレシチン、ポリソルベート希釈液(LP希釈液)、ブドウ糖・ペプトン液体培地(GP液体培地)、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト液体培地(SCD液体培地)、チオグリコール酸培地(TG培地)、サブロー・ブドウ糖培地、ブドウ糖・ペプトン培地(GP培地)、リン酸緩衝液(pH7.2)、リン酸緩衝食塩水液(pH7.2)、ペプトン・食塩緩衝液(pH7.0)、ならびに前記培地にまたは前記緩衝液にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地または緩衝液などを使用することができる。 The rinsing of such filtration membrane, such as lecithin, polysorbates diluent (LP diluent), glucose-peptone liquid medium (GP liquid culture medium), soybean casein digest broth (SCD liquid medium), thioglycollate medium (TG medium), Sabouraud dextrose medium, glucose-peptone medium (GP medium), phosphate buffer (pH 7.2), phosphate-buffered saline solution (pH 7.2), peptone saline buffer (pH 7.0 ), and the like can be used the medium or the buffer solution was added lecithin or polysorbate in a medium or buffer. 真菌を検出対象とする場合の濾過膜のリンスには、GP液体培地、SCD液体培地、ポテト・デキストロース液体培地、サブロー・デキストロース液体培地、またはこれらの培地にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地などを使用することが好ましい。 The rinsing of the filtration membranes in the case of a detection target fungi, using GP liquid culture medium, SCD liquid medium, potato dextrose liquid medium, Sabouraud Dextrose broth or medium and supplemented with lecithin or polysorbate these media, it is preferable to. 細菌を検出対象とする場合の濾過膜のリンスには、SCD液体培地、TG培地、プレインハートインフュージョン液体培地、ニュートリエント液体培地、またはこれらの培地にレシチンもしくはポリソルベートを添加した培地などを使用することが好ましい。 Rinsing of the filtration membranes in the case of bacteria and detection subject using SCD liquid medium, TG medium, plain heart infusion broth, nutrient broth or medium and supplemented with lecithin or polysorbate these media, it is preferable.
【0042】 [0042]
本発明の微生物の検出方法において、濾過膜に捕捉された微生物は一定時間培養される。 In the detection method of the microorganism of the present invention, the microorganisms trapped in the filtration membrane is fixed incubation time. 濾過膜に捕捉された微生物を培養することにより、流体に含まれる数個の微生物の検出が可能となる。 By culturing trapped the filter membrane microorganism, it is possible to detect several microorganisms contained in the fluid.
【0043】 [0043]
前記培養で使用する培養培地は、少なくとも組織等価物を生体材料として使用する際に問題となる真菌および/または細菌が増殖する培地であればとくに限定されず、当業者により適宜選択され得る。 Culture medium used in the culture is not limited particularly as long as the medium fungi and / or bacteria in question when using at least the tissue equivalent as biomaterials proliferate may be suitably selected by those skilled in the art. たとえば、真菌および細菌を検出対象とする場合は、SCD培地またはGP培地などの培地を用いることができる。 For example, if the detection target fungi and bacteria can be used as the medium, such as SCD medium or GP medium. 真菌のみを検出対象とする場合はGP液体培地、SCD液体培地、サブロー・ブドウ糖液体培地、ポテト・デキストロース液体培地またはサブロー・デキストロース液体培地を用いることが好ましい。 GP liquid culture medium when it is only detected fungi, SCD liquid medium, Sabouraud dextrose liquid culture medium, it is preferable to use a potato dextrose liquid medium or Sabouraud dextrose broth. 細菌のみを検出対象とする場合はSCD液体培地、TG液体培地、プレインハートインフュージョン液体培地またはニュートリエント液体培地を用いることが好ましい。 SCD liquid medium when the bacteria only detected, TG liquid medium, it is preferable to use a plain heart infusion broth or nutrient broth.
【0044】 [0044]
本発明の微生物の検出方法において、培養方法は振とう培養または撹拌培養であることが好ましい。 In the detection method of the microorganism of the present invention, it is preferred that the culture method is shaking culture or spinner culture.
【0045】 [0045]
本発明の微生物の検出方法において、微生物の培養時間は5時間から24時間が好ましく、12時間から24時間がより好ましい。 In the detection method of the microorganism of the present invention, the cultivation time of the microorganism is preferably 24 hours 5 hours, more preferably 12 to 24 hours. 細菌のみを検出対象とする場合は、培養時間を5時間から24時間とすることが好ましい。 If the bacteria only detected, it is preferable that the 24 hours incubation time from 5 hours. 真菌を検出の対象とする場合は、培養時間を8時間から24時間とすることが好ましい。 If the object of detecting the fungus, it is preferable that the 24 hours incubation time 8 h. 細菌の場合で5時間未満、真菌の場合で8時間未満の培養では、検出に充分な程度に微生物が増殖していない傾向がある。 In the case of a bacterial less than 5 hours, the culture of less than 8 hours in the case of fungi tend to microorganism to a degree sufficient to detect not proliferate. 培養時間が24時間を超える場合には、24時間の培養と比較して検出感度が変わらない傾向がある。 When the culture time exceeds 24 hours, there is a tendency that does not change the detection sensitivity as compared to the 24 hours of culture.
【0046】 [0046]
本発明の微生物の検出方法において、微生物の培養温度は、たとえば20〜37℃とすることができる。 In the detection method of the microorganism of the present invention, the culture temperature of microorganisms, for example, can be 20 to 37 ° C.. また、細菌においては培養温度を30〜35℃とすることが好ましく、真菌においては培養温度を20〜25℃とするのが好ましい。 Further, preferably to 30 to 35 ° C. The culture temperature in bacteria, preferably in the 20-25 ° C. The culturing temperature is in fungi. しかしながら、培養温度はこれらに限定されるものではなく、検出対象の微生物に最適な培養温度は当業者により適宜設定され得る。 However, the culture temperature is not limited to these, the optimal culture temperature microorganisms to be detected may appropriately be set by a person skilled in the art.
【0047】 [0047]
微生物の培養速度はそれぞれ異なり、真菌は細菌と比べて増殖速度が遅い傾向にある。 Culture rate of the microorganisms are different each, the fungus is on the slow trend growth rate compared with the bacteria. したがって、培養物の一部を使用するのみでは、検出感度が充分とはいえない場合がある。 Accordingly, only use part of the culture, there is a case where the detection sensitivity can not be said to be sufficient. したがって培養終了後は、増殖した微生物すべてを回収してつぎの工程で使用することが好ましいため、培養物を遠心などにより濃縮する。 Thus after the culture, all grown microorganisms were collected for it is preferably used in the next step, concentrating the culture by centrifugal. 遠心により上清を除去し、沈殿した培養物からDNAを抽出する。 By centrifugation to remove the supernatant, DNA is extracted from the precipitated culture. DNAの抽出法としては、たとえばトリトンX−100、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤を用いるDNA抽出法など、あらゆる常法を適用することができる。 The extraction of DNA, eg Triton X-100, such as DNA extraction method using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS), can be applied to any conventional method. 抽出したDNAは、フェノール処理やクロロホルム処理を行ない、ついでエタノール沈殿法またはイソプロパノール沈殿法を実施することにより精製してもよい。 Extracted DNA performs a phenol treatment and chloroform treatment and then may be purified by performing the ethanol precipitation or isopropanol precipitation.
【0048】 [0048]
本発明の微生物の検出方法におけるPCRには、通常のPCR法を適用することができ、鋳型として前述の工程を経て抽出されたDNAを、かつ目的の微生物のDNA配列を検出し得るプライマーを用いる限り、とくに限定されない。 The PCR in the detection method of the microorganism of the present invention can be applied to conventional PCR method, the above-mentioned the DNA was extracted by the steps as a template, and using primers capable of detecting DNA sequence of interest microorganisms As long as not particularly limited.
【0049】 [0049]
PCRは、二本鎖DNAの一本鎖への変性、一本鎖DNAとプライマーとのアニーリングおよびDNAポリメラーゼによる相補性DNAの合成というサイクルの繰り返しである。 PCR is modified to a single strand of double-stranded DNA, a repeat of the cycle of the synthesis of the complementary DNA by annealing and DNA polymerase with single-stranded DNA and primers. アニーリング温度は、通常、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)以下に設定する。 The annealing temperature is typically set below the melting temperature of the oligonucleotides used as primers (Tm). Tmを求める式は当業者に公知であり、たとえば以下の式によりTmを算出することができる(細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」▲3▼本当に増えるPCR、13〜43頁、1996年、(株)秀潤社発行)。 The formula for the Tm are well known to those of ordinary skill in the art, for example, it is possible to calculate the Tm by the following equation (Cell Technology separate volume "Bio Experiment Illustrated Ray Ted" ▲ 3 ▼ really increase PCR, pp. 13-43, 1996, (Ltd.) Shujunsha issue).
【0050】 [0050]
Tm(℃)=4×(%GC)+2×(%AT)−2n Tm (℃) = 4 × (% GC) + 2 × (% AT) -2n
(%GC):オリゴヌクレオチド中のGC含量(%) (% GC): GC content in the oligonucleotide (%)
(%AT):オリゴヌクレオチド中のAT含量(%) (% AT): AT content in the oligonucleotide (%)
n:オリゴヌクレオチドの長さ【0051】 n: the length of the oligonucleotide [0051]
本発明の微生物の検出方法において、PCRは、たとえば真菌と細菌とに分けて実施することができる。 In the detection method of the microorganism of the present invention, PCR, for example it can be carried out separately on the fungi and bacteria. あるいは、1つのPCR用反応液中に2組以上のプライマー、たとえば目的の真菌に対するプライマーと目的の細菌に対するプライマーを同時に使用して、PCRを実施してもよい。 Alternatively, two or more sets of primers in the reaction mixture for one PCR, for example, using primers to the primer and the target bacteria against fungi of objects simultaneously, PCR may be performed.
【0052】 [0052]
前記PCRに用いるプライマーの配列は、たとえば、真菌または細菌において保存されており、かつ特異的な遺伝子またはその一部を増幅し得る配列を選択して設計する。 The sequences of the primers used for the PCR, for example, are stored in the fungal or bacterial, and specific gene or select a sequence capable of amplifying a part of the design. 真菌または細菌において保存され、かつ特異的な遺伝子としては、rRNA遺伝子が好ましい。 It is conserved in fungi or bacteria, and as a specific gene, rRNA genes are preferred. プライマーとして最も適当な配列は、一般的に入手可能なデータベース(たとえば、DDBJ(DNA Data Bank of Japan)またはRDP(Ribosomal Database Project))に基づく調査により適宜選択することができる。 The most appropriate sequence as a primer, generally available databases (e.g., DDBJ (DNA Data Bank of Japan) or RDP (Ribosomal Database Project)) can be appropriately selected by survey-based. なお、rRNAを増幅するプライマーとしては、以下の各組み合わせが知られている。 As the primers to amplify the rRNA, it is known the combination of the following.
【0053】 [0053]
真菌を検出し得るプライマーは、18S rRNA遺伝子またはその一部の配列に基づいて設計することが好ましい。 Primers capable of detecting the fungus is preferably designed based on the 18S rRNA gene or a part of the sequence. そのようなプライマーの組み合わせとしては、5'−ACTTTCGATGGTAGGATAG−3'(配列番号1)からなるプライマーと5'−TGATCGTCTTCGATCCCCTA−3'(配列番号2)からなるプライマーとの組み合わせ、および配列番号2と5'−CTGAGAAACGGCTACCACAT−3'(配列番号3)との組み合わせが知られており(K. Makimura, et al. (1994), J. Med. Microbiol., 40, 358−364)、本発明の検出方法に使用することができる。 The combination of such primers, 5'-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3 a combination of a primer consisting of '(SEQ ID NO: 1) primer 5'-TGATCGTCTTCGATCCCCTA-3 consisting of' (SEQ ID NO: 2), and SEQ ID NO: 2 and 5 '-CTGAGAAACGGCTACCACAT-3' (SEQ ID NO: 3) is known combination of (K. Makimura, et al. (1994), J. Med. Microbiol., 40, 358-364), the detection method of the present invention it can be used for. これらのプライマーにより、カンジダ属、サッカロマイセス属、アスペルギルス属およびハンセヌラ属などの臨床的に重要な感染症を引き起こす真菌を含む25種78菌株の18S rRNAを増幅することができる。 These primers, Candida, Saccharomyces, can be used to amplify 18S rRNA of 25 or 78 strains containing fungal clinically cause important infectious diseases such as Aspergillus and Hansenula. それぞれ配列番号1および配列番号2に示す塩基配列からなる二種類のプライマーをPCRに用いた場合、そのPCR産物は約687bpである。 When using two kinds of primers having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to PCR, the PCR product is about 687bp. それぞれ配列番号2および配列番号3に示す塩基配列からなる二種類のプライマーをPCRに用いた場合には、そのPCR産物は約600bpである。 In the case of using two kinds of primers having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 in PCR, the PCR product is about 600 bp.
【0054】 [0054]
細菌を検出し得るプライマーとしては、5'−GTGCCAGCAGCCGCGGTA−3'(配列番号4)からなるプライマー(Tsuguo Sasaki, et al.(1996), PDA Journal of Pharmaceutical Sciences & Technology, 51, 242−247)と5'−ACGTCATCCCCACCTTCCTC−3'(配列番号5)からなるプライマー(Kui Chen, et al.(1989), FEMS Microbiology Letters, 57, 19−24)との組み合わせ、および配列番号4からなるプライマーと5'−AGGCCCGGGAACGTATTCAC−3'(配列番号6)からなるプライマー(前掲Kui Chen, et al.)との組み合わ The primers capable of detecting bacteria, 5'-GTGCCAGCAGCCGCGGTA-3 '(SEQ ID NO: 4) Primer (Tsuguo Sasaki, et al. (1996), PDA Journal of Pharmaceutical Sciences & Technology, 51, 242-247) and 5'-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 5) consisting of a primer (Kui Chen, et al. (1989), FEMS Microbiology Letters, 57, 19-24) and primer consisting combinations, and SEQ ID NO: 4 with 5' -AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3 'made of (SEQ ID NO: 6) primers (supra Kui Chen, et al.) Awa combination with が知られており、本発明の検出方法に使用することができる。 It is known and can be used in the detection method of the present invention. これらのプライマー配列は、少なくともバチルス・ズブチルス、ストレプトコッカス・パイオジェン、シュードモナス・エルジノーザ、サルモネラ・チフムリウム、サルモネラ・ボンゴリ、エシェリキア・コリおよびストレプトコッカス・エピダーミディスの間で100%一致しており、約677bpまたは約876bpの16S rRNA遺伝子断片を増幅することができる。 These primer sequences are at least Bacillus subtilis, Streptococcus Paiojen, Pseudomonas Erujinoza, Salmonella Chifumuriumu, Salmonella Bongori has 100% identity between the E. coli and Streptococcus Epidamidisu, about 677bp or about 876bp it is possible to amplify the 16S rRNA gene fragment. このほか、細菌検出用のフォワードプライマーとしては5'−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3'(配列番号7)(P.A. Eden et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 324(1991); W. G. Weisburg et al., J. Bacteriol., 173, 697(1991);および D. A. Relman et al., Mol. Microbiol., 6, 1801(1992))、5'−TCAAAKGAATTGACGGGGGC−3'(配列番号8)(KはdTまたはdGを示す。D. A. Relman et al., N. Engl. J. Med., 327, 293(1992);および D. A. Relman et al., N. Engl. J. M In addition, the forward primer for bacteria detection 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 7) (P.A Eden et al, Int J. Syst Bacteriol 41, 324 (1991);..... W. . G. Weisburg et al, J. Bacteriol, 173, 697 (1991);.... and D. A. Relman et al, Mol Microbiol, 6, 1801 (1992)), 5'-TCAAAKGAATTGACGGGGGC-3 '( SEQ ID NO: 8) (K denotes a dT or dG .D A. Relman et al, N. Engl J. Med, 327, 293 (1992....);. and D. A. Relman et al, N. Engl. J. M d., 323, 1573(1990))、5'−GAGGAAGGTGGGGATGACGT−3'(配列番号9)(前掲D. A. Relman et al., N. Engl. J. Med., 323, 1573(1990);およびK. Chen et al., FEMS Microbiol. Lett. 48, 19(1989))などが知られており、細菌検出用のリバースプライマーとしては5'−GGACTACCAGGGTATCTAAT−3'(配列番号10)(前掲D. A. Relman et al., N. Engl. J. Med., 327, 293(1992);およびK. H. Wilson et al, J. Clin. Microbiol. 28, 1942(1990))5'−GGTTACCTTGTTACG . D, 323, 1573 (1990)), 5'-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3 '(... SEQ ID NO: 9) (supra D. A. Relman et al, N. Engl J. Med, 323, 1573 (1990); and K. Chen et al., FEMS Microbiol. Lett. 48, 19 (1989)), etc. are known as the reverse primer for bacteria detection 5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3 '(SEQ ID NO: 10) (supra D ... A. Relman et al, N. Engl J. Med, 327, 293 (1992);... and K. H. Wilson et al, J. Clin Microbiol 28, 1942 (1990)) 5'-GGTTACCTTGTTACG CTT−3'(配列番号11)(前掲P.A. Eden et al.,; 前掲W. G. Weisburg et al.;および前掲D. A. Relman etal., Mol. Microbiol., 6, 1801(1992))などが知られている。 CTT-3 '(SEQ ID NO: 11) (supra P.A. Eden et al,;.... Supra W. G. Weisburg et al .; and supra D. A. Relman etal, Mol Microbiol, 6, 1801 ( 1992)) and the like are known.
【0055】 [0055]
細菌の前記プライマー配列と、細菌の16S rRNA遺伝子に相当するヒトの18S rRNA遺伝子配列との相同性は60%以下と低く、適切なPCRの条件を選択すればヒトの18S rRNA遺伝子断片が増幅されることはない。 Said primer sequences of bacterial homology with human 18S rRNA gene sequence corresponding to the 16S rRNA gene of bacteria is as low as 60% or less, 18S rRNA gene fragment of human is amplified by selecting the appropriate PCR conditions Rukoto is not. また、真菌の前記プライマーを用いた場合においても、適切なPCRの条件を選択すればヒトの18S rRNAの遺伝子断片が増幅されることはない。 Further, even in the case of using the primer fungal gene fragment of human 18S rRNA it will not be amplified by selecting the appropriate PCR conditions. PCRの条件は当業者により適宜設定され得る。 PCR conditions may be appropriately set by those skilled in the art.
【0056】 [0056]
本発明の微生物の検出方法において、PCRにより増幅されたDNA断片(PCR産物)は、当分野において一般的に実施されている方法により、検出することができる。 In the detection method of the microorganism of the present invention, the amplified DNA fragments by PCR (PCR product), by the method commonly practiced in the art, can be detected. PCR産物の検出法としては、たとえば、アガロースゲルなどを用いる電気泳動、PCR産物に対する標識プローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ、またはPCR−ELISA法などの本分野における公知の検出法を適用することができる。 The detection method of PCR products, for example, can be applied electrophoresis and the like agarose gel, hybridization assays using labeled probes for PCR product, or known in the art, such as PCR-ELISA method detection method. PCRで増幅されたDNA断片(PCR産物)の塩基配列をDNAシーケンサーで解析することにより、菌種の同定も可能であると考えられる。 By PCR with the amplified DNA fragment The nucleotide sequence of the (PCR product) analyzed by DNA sequencer, considered and identification of bacterial species are possible.
【0057】 [0057]
ハイブリダイゼーションアッセイの場合には、PCR産物またはその一部の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドと検出可能な標識とからなる標識プローブを使用する。 In the case of hybridization assays using labeled probe comprising a detectable label and an oligonucleotide complementary to the sequence of PCR product or a portion thereof. 標識としては、当分野において通常使用されるあらゆる標識を利用することができ、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼもしくはベータ−D−ガラクトシダーゼなどの酵素類、蛍光色素またはラジオアイソトープを使用することができる。 The labeling, typically can be utilized any label used in the art, for example, may be used alkaline phosphatase, an enzyme such as peroxidase or beta -D- galactosidase, fluorescent dyes or radioisotope. アルカリホスファターゼなどの酵素類を標識として使用する場合には、PCR産物と標識プローブとをハイブリダイゼーションさせ、酵素とその基質(発色物質、蛍光物質または発光物質など)とを反応させ、ついで基質の発色、蛍光または発光などを検出することにより、PCR産物を検出することができる。 When using enzymes such as alkaline phosphatase as the label, the PCR product and the labeled probe is hybridized, the enzyme and its substrate (chromogenic material, such as a fluorescent substance or a luminescent substance) is reacted, followed chromogenic substrate , by detecting a fluorescent or luminescent, it is possible to detect the PCR products.
【0058】 [0058]
PCR−ELISA法の場合、たとえば、PCR増幅の際にジゴキシゲニン(DIG)で標識した塩基を取り込ませ、ついでDIGに対する抗体を用いるELISAを行なうことにより、PCR産物を検出することができる。 For PCR-ELISA method, for example, in PCR amplification with digoxigenin (DIG) was incorporated labeled bases, followed by performing ELISA using antibodies against DIG, it is possible to detect the PCR products.
【0059】 [0059]
以上のようにしてPCR産物が検出された場合は、組織、組織等価物、臓器、血液または気体などが微生物に汚染されていることを意味する。 If the PCR product was detected as described above, tissue, tissue equivalent, an organ, such as blood or gas means that it is contaminated with microorganisms.
【0060】 [0060]
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, the present invention is not limited to these examples.
【0061】 [0061]
【実施例】 【Example】
以下に記載したGP液体培地、LP希釈液およびSCD液体培地などの試薬ならびに試験管、マイクロチューブ、ピンセットなどの器具はすべて、事前にオートクレーブ滅菌(121℃、20分間)した。 GP liquid culture medium as described below, the reagents and test tubes, such as LP diluent and SCD liquid medium, microtube, all instruments such as forceps, previously autoclaved (121 ° C., 20 minutes). ジャンボコニカルチューブは、日本ベクトン・ディッキンソン(株)製、カタログ番号FALCON2075を用いた。 Jumbo conical tubes, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., was using the catalog number FALCON2075. 酢酸カリウムに関しては、実施例1において、フルカ(Fluka)社製、カタログ番号60035、実施例2〜4において、和光純薬工業(株)製、カタログ番号166−03545を用いた。 With respect to potassium acetate, in Example 1, Fluka (Fluka) Co., Catalog No. 60035, in Examples 2-4, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., was used Catalog No. 166-03545. イソプロパノールおよびエタノールは、それぞれ、和光純薬工業(株)製、カタログ番号166−04836、および和光純薬工業(株)製、カタログ番号057−00456を用いた。 Isopropanol and ethanol, respectively, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Catalog No. 166-04836, and manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., was used Catalog No. 057-00456. TE(pH8.0)に関しては、実施例1において、ニッポンジーン(株)製、カタログ番号316−90025、実施例2〜4において、ニッポンジーン(株)製、カタログ番号00579Jを用いた。 For the TE (pH 8.0), in Example 1, Nippon Gene Co., Catalog No. 316-90025, in Examples 2-4, was used Nippon Gene Co., catalog number 00579J. 濾過膜に関しては、実施例1において、孔径0.2μmの濾過膜(ザルトリウス(株)製、カタログ番号13107−47−ACN)、実施例2〜4において、孔径0.2μmの濾過膜(ポール(株)製、カタログ番号4803)、実施例5において、孔径0.45μmの濾過膜(ザルトリウス(株)製、カタログ番号13106−47−ACN)、実施例6において、孔径0.45μmの濾過膜(ザルトリウス(株)製、カタログ番号13106−47−ACN)および孔径0.2μmの濾過膜(ポール(株)製、カタログ番号4803)、実施例7において孔径0.22μmの濾過膜(ミリポア(株)製、カタログ番号ATSMTTD60)を用いた。 For the filtration membrane, in Example 1, filtration membrane having a pore diameter of 0.2 [mu] m (Sartorius Ltd., Cat. No. 13107-47-ACN), in Examples 2-4, the filtration membrane having a pore diameter of 0.2 [mu] m (pole ( Ltd.), the catalog number 4803), example 5, pore size 0.45μm filter membrane (Sartorius Ltd., Cat. No. 13106-47-ACN), in example 6, pore size 0.45μm filter membrane ( Sartorius Ltd., Cat. No. 13106-47-ACN) and pore diameter 0.2μm membrane filter (pole Co., catalog number 4803), pore size 0.22μm filter membrane in example 7 (Millipore Corp. Ltd., catalog number ATSMTTD60) was used. フィルターホルダーおよびマニホールドは、アドバンテック東洋(株)製、カタログ番号KGS−47TFおよびアドバンテック東洋(株)製、型番KM−3を用いた。 Filter holder and manifold, Advantech Toyo Co., Ltd., catalog number KGS-47TF and Advantech Toyo Co., Ltd., a model number KM-3 was used. ディスポループ(ガンマー滅菌済み)は、アズワン製、カタログ番号GI−0457−05を用いた。 Disposable loop (gamma sterilized) was used As One Co., Ltd., Catalog No. GI-0457-05. ミリフレックス(正式名:ツインヘッドMilliflex センサーII吸引濾過)およびアダプター(正式名:MFPP アダプター改良型)は、それぞれ、ミリポア(株)製、カタログ番号MXPS20015、およびポール(株)製、カタログ番号Y−0705−2を用いた。 Milliflex (official name: Twin head Milliflex sensor II suction filtration) and adapter (official name: MFPP adapter modified), respectively, Millipore Corp., Catalog No. MXPS20015, and Paul Ltd., Catalog No. Y- 0705-2 was used. エアーサンプラーとして、M Air Tミリポアテスター(ミリポア(株)製、カタログ番号ATAS PLR01)を用い、微細孔サンプリングプレートは、ミリポア(株)製、カタログ番号ATAH EAD01を用いた。 As air sampler, M Air T Millipore tester (Millipore Corp., Catalog No. ATAS PLR01) with micropores sampling plate used was Millipore Co., catalog number ATAH EAD01. PCRサーマルサイクラーMPは、宝酒造(株)製、型名TP3000を用い、ポラロイドカメラは、フナコシ(株)製、型番DS−300(M)を用いた。 PCR thermal cycler MP is, Takara Shuzo Co., Ltd., using a type name TP3000, Polaroid camera was used Funakoshi Co., Ltd., model number DS-300 a (M). SYBR Greenに関しては、実施例1および5において、SYBR GreenI(×10000)(宝酒造(株)製、コード番号F0513)、実施例2〜4および6において、SYBR Green(BMA社製、カタログ番号50513)を用いた。 For the SYBR Green, in Examples 1 and 5, SYBR GreenI (× 10000) (Takara Shuzo Co., Ltd., code number F0513), in Examples 2-4 and 6, SYBR Green (BMA, Inc., Catalog No. 50513) It was used.
【0062】 [0062]
実施例1 Example 1
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(A) 試験管1本に、GP液体培地(ブドウ糖、ペプトン液体培地(粉末)(日本製薬(株)製、カタログ番号397−00225)28.5g/超純水1l)10mlを分注した。 To one (A) test tube was dispensed GP liquid culture medium (glucose, peptone broth (powder) (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 397-00225) 28.5g / ultrapure water 1l) and 10ml min. つぎに、該GP液体培地にカンジダ・アルビカンス(財団法人発酵研究所における受託番号IFO 1594菌株)のコロニー1個を接種し、ピペッティングにより菌体を充分に分散させた。 Next, inoculated with one colony of Candida albicans to the GP liquid culture medium (Accession No. IFO 1594 strain in Institute for Fermentation), was thoroughly disperse the cells by pipetting. この菌液を、室温(約25)℃で18時間培養した。 This bacterial solution was incubated for 18 hours at room temperature (about 25) ° C..
【0063】 [0063]
(B) 試験管10本に、GP液体培地を9mlずつ分注した。 (B) to 10 test tubes, it was dispensed GP liquid culture medium by 9 ml. GP液体培地を分注した試験管の1本に、マイクロピペットを用いて前記(A)で調製した菌液1mlを添加して混合し、10倍希釈液を調製した。 In one tube that dispensed GP liquid culture medium min, added and mixed bacterial solution 1ml prepared in the (A) using a micropipette to prepare 10-fold dilutions. チップを交換し、以後同様にして、10 10倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the chip, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 10 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例1においては、10 〜10 10倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in Example 1, it was used 10 6 to 10 10-fold diluted bacterial solution.
【0064】 [0064]
(C) 容量225mlのジャンボコニカルチューブ6本それぞれに、ウシ胎児血清(JRHバイオサイエンシーズ社(JRH Biosciences, Inc.)製)を3%含有するGreen培地(Green+3%FBS)150mlを入れ、さらに、ストレプトマイシン、ペニシリンおよびアンホテリシンBからなる抗生物質(ライフテックオリエンタル(株)製、カタログ番号15240−096、最終濃度:ストレプトマイシン 100μg/ml、ペニシリン 100単位/ml、アンホテリシンB 0.25μg/ml)1.5mlを各チューブに添加し、混合した。 Jumbo conical tube six each (C) volume 225 ml, fetal bovine serum (JRH Biosciences (JRH Biosciences, Inc.) Ltd.) 3% Put Green Medium (Green + 3% FBS) 150 ml containing further streptomycin, penicillin and antibiotics consisting amphotericin B (Life Technologies Oriental Co., catalog number 15240-096, final concentration: streptomycin 100 [mu] g / ml, penicillin 100 units / ml, amphotericin B 0.25 [mu] g / ml) 1.5 ml It was added to each tube and mixed. ついで、前記(B)で調製した10 〜10 10倍希釈菌液をそれぞれ1.0mlずつ添加し、混合した。 Then, the 10 6 to 10 10-fold diluted bacterial solution prepared in (B) was added in 1.0ml each, were mixed. なお、希釈菌液のかわりにGP液体培地1.0mlを添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, a material obtained by adding GP liquid culture medium 1.0ml instead of diluting bacterial solution, as a negative control.
【0065】 [0065]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
孔径0.2μmの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。 The filtration membrane having a pore size of 0.2μm was set in a filter holder and then set the filter holder to the manifold. つぎに、50mlピペットを用いて前記(C)で調製したサンプル50mlをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。 Next, put the using 50ml pipette samples 50ml prepared in (C) in funnel, and all suction filtration. 吸引濾過をさらに2回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。 Suction filtration was repeated two more times, was filtered off with suction all of the sample.
【0066】 [0066]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
LP希釈液(LP希釈液「ダイゴ」(日本製薬(株)製、カタログ番号397−00281)2本/超純水2l、最終濃度:ポリペプトン 1g/l、レシチン 0.7g/l、ポリソルベート80 20g/l、pH7.0〜7.4)50mlをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。 LP diluent (LP diluent "Daigo" (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 397-00281) 2 / ultrapure water 2l, final concentration: polypeptone 1g / l, lecithin 0.7g / l, polysorbate 80 20g It was added /l,pH7.0~7.4)50ml the funnel, followed by suction filtration and rinse the inner wall of the funnel. 同様のリンスをさらに2回繰り返した。 It was repeated two more times the same rinse.
【0067】 [0067]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、30mlのGP液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温(25℃)で一晩(15〜20時間)、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtered to 50ml centrifuge tube film containing the GP liquid culture medium 30 ml, and then overnight at room temperature (25 ° C.) (15 to 20 hours), carried out by shaking culture did.
【0068】 [0068]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
一晩培養した後、ピンセットによりGP液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After overnight culture was aseptically removed filtration membrane from GP liquid culture medium by tweezers. GP液体培地を遠心し(2000g、10分間)、上清を静かに除去した。 GP liquid culture medium was centrifuged (2000 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(15000g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ° C. (15000 g, 10 minutes), it was gently remove the supernatant.
【0069】 [0069]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
各マイクロチューブに溶解液(100mM トリス・HCl(pH7.5)、30mM EDTA・2Na、0.5%(重量/容量)SDS)を100μlずつ添加し、菌体を懸濁した。 Lysate to each microtube (100 mM Tris · HCl (pH7.5), 30mM EDTA · 2Na, 0.5% (w / v) SDS) was added to each 100 [mu] l, the cells were suspended. ボルテックスミキサーにより菌体を5秒間撹拌し、ついで、100℃で15分間インキュベーションした。 The cells were stirred for 5 seconds by a vortex mixer, then incubated for 15 minutes at 100 ° C.. 各マイクロチューブに2.5Mの酢酸カリウム溶液100μlを添加、混合したのち、氷上で60分間インキュベーションした。 Added potassium acetate solution 100μl of 2.5M to each microtube, were mixed and incubated on ice for 60 minutes. 各マイクロチューブを4℃で遠心し(12000rpm、5分間)、上清を新しいマイクロチューブに移した。 Centrifuge each microtube at 4 ° C. (12000 rpm, 5 minutes), the supernatant was transferred to a new microtube. 上清と同量のイソプロパノールを添加し、DNAの沈殿物を得た。 Isopropanol was added supernatant and the same amount, to obtain a precipitate of DNA. 各マイクロチューブを遠心し(15000rpm、10分間)、静かに上清を除去した。 Each microtube was centrifuged (15000 rpm, 10 minutes) and gently remove the supernatant. ついで、99%エタノール0.5mlを添加し、混合したのち、4℃で遠心して(15000rpm、10分間)上清を除去した。 Then added 99% ethanol 0.5 ml, were mixed, to remove centrifuged to (15000 rpm, 10 minutes) the supernatant at 4 ° C.. 沈殿物に70%エタノール0.5mlを添加し、混合したのち、さらに4℃で遠心して(15000rpm、10分間)上清を除去した。 The precipitate was added 70% ethanol 0.5 ml, were mixed, to further remove centrifugation (15000 rpm, 10 minutes) the supernatant at 4 ° C.. 沈殿物をペーパータオル上で軽く乾燥させたのち、50μlのTE(pH8.0)を添加し、DNAを溶解した。 After the precipitate was dried briefly on paper towels, then added TE (pH 8.0) of 50 [mu] l, it was dissolved DNA.
【0070】 [0070]
<PCR> <PCR>
反応混合液50μlを0.2mlのPCRチューブに調製し、氷上で保持した。 The reaction mixture was 50μl prepared PCR tubes 0.2 ml, and kept on ice. 反応混合液の組成は、5μlの(10×)PCR緩衝液(Taqポリメラーゼの付属品)、4μlのdNTP混合液(Taqポリメラーゼの付属品)、プライマー各0.3μM、2.5μlの鋳型DNA、0.25μlのTaqポリメラーゼ(5U/μl)(宝酒造(株)製、カタログ番号R001A)および超純水である。 The composition of the reaction mixture, 5 [mu] l of (10 ×) PCR buffer (Taq polymerase accessory) (accessory Taq polymerase) 4 [mu] l of dNTP mix, primers each 0.3 [mu] M, 2.5 [mu] l of template DNA, 0.25μl of Taq polymerase (5U / μl) (Takara Shuzo Co., Ltd., catalog No. R001A) is and ultra-pure water. プライマーとしては、配列番号1および配列番号2に示す配列を有する2種のプライマーを用いた。 The primers were used two primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. また、鋳型DNAとしては、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>において調製されたカンジダ・アルビカンス IFO 1594菌株のDNAを用いた。 As the template DNA, using DNA of Candida albicans IFO 1594 strain which has been prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 1. なお、本実施例で用いたdNTP混合液は、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPを各2.5mM含有する溶液である。 Incidentally, dNTPs mixture used in this example are dATP, dTTP, dCTP, and dGTP a solution containing each 2.5 mM.
【0071】 [0071]
PCRサーマルサイクラーMPに各PCRチューブをセットし、つぎのプログラムでPCRを実施した。 Set each PCR tube PCR thermal cycler MP, PCR was carried out in the following program. 本実施例において、PCRは、95℃で5分間インキュベーションし、ついで95℃で45秒間、55℃で1分間および72℃で2分間を1サイクルとしてこれを30サイクル行ない、さらに72℃で10分間インキュベーションすることで実施した。 In this embodiment, PCR is incubated for 5 minutes at 95 ° C., then 45 seconds at 95 ° C., 30 cycles no line this as one cycle for 2 minutes at 1 minute and 72 ° C. at 55 ° C., further 72 ° C. for 10 minutes It was carried out by incubation. アニーリング温度は、前述の式により算出したプライマーの融解温度を参考にして設定した。 The annealing temperature was set by reference to the melting temperature of the primers was calculated by the above equation.
【0072】 [0072]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
泳動バッファー(1×TAE)を、つぎのようにして調製した。 The electrophoresis buffer (1 × TAE), was prepared as follows. 9.6gのトリス・HCl(pH8.0)、1.48gのEDTAおよび2.28mlの酢酸を超純水1900mlに溶解した。 9.6g of Tris · HCl (pH8.0), was dissolved acetic acid EDTA and 2.28ml of 1.48g of ultrapure water 1900 ml. 1NのNaOHで溶液をpH8.1に調整したのち、さらに超純水を加えて2000mlとした。 After the solution was adjusted to pH8.1 with 1N NaOH, and the 2000ml further adding ultrapure water.
【0073】 [0073]
前記PCR産物50μlに10μlのローディングバッファー(ブロモフェノールブルー0.25%(重量/容量)、グリセロール25%(容量/容量)、超純水)を加えて混合した。 Loading buffer 10μl to the PCR product 50 [mu] l (bromophenol blue 0.25% (w / v) glycerol 25% (volume / volume), ultrapure water) were added and mixed. ついで、これらのサンプル20μlをアガロースゲル(アガロースS(ニッポンジーン(株)製、カタログ番号312−01193)1.2g/1×TAE 100ml)にローディングし、100Vで25分間、電気泳動を実施した。 Then, these samples 20μl agarose gel (agarose S (Nippon Gene Co., Ltd., Catalog No. 312-01193) 1.2g / 1 × TAE 100ml) was then loaded on 25 minutes at 100 V, electrophoresis was performed.
【0074】 [0074]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR GreenI(×10000)を10μl加え、染色液を調製した。 It was added 10μl of SYBR GreenI (× 10000) in 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0075】 [0075]
PCR産物の染色の結果、10 倍希釈菌液および10 倍希釈菌液からカンジダ・アルビカンス IFO 1594菌株のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, DNA of Candida albicans IFO 1594 strain was detected from 106-fold diluted bacterial solution and 10 7-fold dilutions bacterial liquid. 以下の試験例に記載のように、10 倍希釈菌液中の生菌数は1個であった。 As described in the following Test Example, 10 7 fold viable cell count of diluted bacterial solution was one.
【0076】 [0076]
試験例1 Test Example 1
実施例1の菌液の調製(B)において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。 The viable cell count of the diluted bacterial solution which had been prepared in the preparation of bacterial solution of Example 1 (B), was measured by the following pour method. すなわち、前記10 〜10 10倍希釈菌液1mlを直径90mmシャーレに分注した(n=2)。 That was dispensed the 10 5 -10 10-fold diluted bacterial solution 1ml diameter 90mm petri dish (n = 2). 各シャーレに、オートクレーブ後45℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地(サブロー・ブドウ糖寒天培地(粉末)(日本製薬(株)製、カタログ番号390−01011)32.5g/超純水500ml)を15mlずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。 In each dish, Sabouraud dextrose agar medium has been held to 45 ℃ after autoclaving (Sabouraud dextrose agar medium (powder) (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 390-01011) 32.5g / ultra-pure water 500ml) the by aliquoted 15ml min, stirring gently, and allowed to stand until the agar solidifies. 寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して25℃のインキュベータ内で培養した。 After the agar solidified, and cultured in an incubator at 25 ° C. with inverted each dish. 培養から4日後および5日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 After 4 days, and 5 days of culture, the number of colonies formed was counted visually.
【0077】 [0077]
測定の結果、10 倍希釈菌液に含まれるカンジダ・アルビカンス IFO 1594菌株は1個であった。 As a result of the measurement, Candida albicans IFO 1594 strain contained in 10 7-fold diluted bacterial solution was one.
【0078】 [0078]
実施例2 Example 2
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(A) カンジダ・アルビカンス IFO 1594菌株のコロニー1個を採取し、サブロー・ブドウ糖寒天培地(試験例1と同様に作製)に塗抹し、30℃で24時間培養した。 One colony (A) Candida albicans IFO 1594 strain were collected, spread on Sabouraud dextrose agar medium (in the same manner as in Test Example 1 Preparation), for 24 hours at 30 ° C..
【0079】 [0079]
(B) 試験管10本に、GP液体培地を9mlずつ分注した。 (B) to 10 test tubes, it was dispensed GP liquid culture medium by 9 ml. GP液体培地を分注した試験管の1本に、前記(A)で培養したコロニーをディスポループ2ループ分を接種し、10mlピペットで菌を懸濁して10倍希釈液を調製した。 In one tube that dispensed GP liquid culture medium min, the colonies were cultured in (A) was inoculated with disposable loop 2 loop component, to prepare a 10-fold dilutions were suspended bacteria in 10ml pipette. 得られた菌液1mlを、GP液体培地を分注した試験管の1本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、10 倍希釈液を調製した。 The resulting bacterial solution 1 ml, was added and mixed using a micropipette to one test tube dispensed GP liquid culture min, to prepare a 10 two-fold dilutions. チップを交換し、以後同様にして、10 倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the chip, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 8 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例2においては10 〜10 倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in the embodiment 2 was used 105 to 8-fold diluted bacterial solution.
【0080】 [0080]
(C) 容量225mlのジャンボコニカルチューブ1本に、180mlのGP培地を入れ、さらに、50mg/mlのゲンタマイシン(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15750−060)および250μg/mlのアンホテリシンB(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15290―018)をそれぞれ900μlを添加し、混合した。 Jumbo conical tube one (C) volume 225 ml, put GP medium 180 ml, further, 50 mg / ml gentamicin (Invitrogen Corp., Catalog No. 15750-060) and 250 [mu] g / ml of amphotericin B (Invitrogen ( Ltd.), catalog No. 15290-018) was added to 900μl each and mixed.
【0081】 [0081]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径0.2μmの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。 Set the adapter Milliflex, then set the funnel fitted with a filter membrane having a pore size of 0.2μm to the adapter. つぎに、25mlピペットを用いて前記(C)で調製したGP液体培地30mlおよび(B)で調製した10 倍希釈菌液1.0mlをそれぞれファネルに入れて混合し、吸引濾過した。 Next, the 10 5 dilution bacterial liquid 1.0ml prepared in GP liquid culture medium 30ml and prepared in (C) (B) were mixed and put into the funnel each with 25ml pipette and suction filtered. 10 〜10 倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。 For even 10 6 to 10 8 fold diluted bacterial solution was subjected to the same procedure as. なお、希釈菌液のかわりにGP液体培地を1.0ml添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, what the GP liquid culture medium instead of the dilution cell suspension was added 1.0 ml, served as a negative control.
【0082】 [0082]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
LP希釈液(実施例1と同様に作製)50mlをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。 LP dilution (as produced in Example 1) 50 ml was added to the funnel and then by suction filtration and rinse the inner wall of the funnel. 同様のリンスをさらに2回繰り返した。 It was repeated two more times the same rinse.
【0083】 [0083]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、25mlのGP液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温(25℃)で20時間、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtration membrane 50ml centrifuge tube containing the GP liquid culture medium 25 ml, and then 20 hours at room temperature (25 ° C.), it was carried out by shaking culture.
【0084】 [0084]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
培養後、ピンセットによりGP液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After the culture was aseptically removed filtration membrane from GP liquid culture medium by tweezers. GP液体培地を遠心し(1310g、10分間)、上清を静かに除去した。 GP liquid culture medium was centrifuged (1310 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(16100g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ℃ (16100g, 10 min), and gently remove the supernatant.
【0085】 [0085]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
PCR用の鋳型の調製は、実施例1の<菌体の回収>において回収された菌体の代わりに、実施例2の<菌体の回収>において回収された菌体を使用するほかは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>と同様に行なった。 Preparation of template for PCR, instead of the cells recovered in <recovery of cells> of Example 1, except to use the bacteria recovered in <recovery of cells> of Example 2, It was carried out in the same manner as <preparation of template for PCR> of example 1.
【0086】 [0086]
<PCR> <PCR>
PCRは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAの代わりに、実施例2の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAを使用するほかは、実施例1の<PCR>と同様の条件で行なった。 PCR, instead of the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 1, except to use the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> Example 2, implemented It was carried out under the same conditions as <PCR> example 1.
【0087】 [0087]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
アガロース電気泳動は、実施例1の<PCR>において増幅されたPCR産物の代わりに、実施例2の<PCR>において増幅されたPCR産物を使用するほかは、実施例1の<アガロース電気泳動>と同様に行なった。 Agarose electrophoresis, instead of the amplified PCR product in <PCR> of Example 1, except using PCR products amplified in <PCR> of Example 2, Example 1 <agarose electrophoresis> It was carried out in the same manner as.
【0088】 [0088]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR Greenを10μl加え、染色液を調製した。 It was added 10μl of SYBR Green to 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0089】 [0089]
PCR産物の染色の結果、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液からカンジダ・アルビカンス IFO 1594菌株のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, 105-fold, DNA of Candida albicans IFO 1594 strain was detected in 10 6 fold and 107-fold dilutions bacterial liquid.
【0090】 [0090]
試験例2 Test Example 2
実施例2の菌液の調製(B)において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。 The viable cell count of the diluted bacterial solution which had been prepared in the preparation of bacterial solution of Example 2 (B), was measured by the following pour method. すなわち、前記10 〜10 倍希釈菌液1mlを直径90mmシャーレに分注した(10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液に関してはn=2、10 倍希釈菌液に関してはn=4)。 That is, the 10 5 10 8-fold diluted bacterial solution 1ml was dispensed into diameter 90mm petri dish (10 5 times, with respect to n = 2,10 7-fold diluted bacterial solution with respect to 106-fold and 108-fold diluted bacterial solution n = 4). 各シャーレに、オートクレーブ後50℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地(実施例1と同様に作製)を14mlずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。 Each dish, Sabouraud dextrose agar which had been held at 50 ° C. after autoclaving (similar produced as in Example 1) and dispensed at 14ml min, stirring gently, and allowed to stand until the agar solidifies. 寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して25℃のインキュベータ内で培養した。 After the agar solidified, and cultured in an incubator at 25 ° C. with inverted each dish. 培養から4日後および5日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 After 4 days, and 5 days of culture, the number of colonies formed was counted visually.
【0091】 [0091]
測定の結果、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、111個、9.5個および2.5個であった。 As a result of the measurement, 10 5 fold, 10 6 fold and 107-fold the number of viable cells contained in the diluted bacterial solution, respectively: 111, it was 9.5 pieces and 2.5.
【0092】 [0092]
実施例3 Example 3
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(A) サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)における受託番号ATCC 9763菌株)のコロニー1個を採取し、サブロー・ブドウ糖寒天培地(試験例1と同様に作製)に塗抹し、32℃で24時間培養した。 (A) Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) one colony was taken (American Type Culture Collection (American Type Culture Collection) accession number ATCC 9763 strain in), (prepared in the same manner as in Test Example 1) Sabouraud dextrose agar spread on, for 24 hours at 32 ° C..
【0093】 [0093]
(B) 試験管10本に、GP液体培地を9mlずつ分注した。 (B) to 10 test tubes, it was dispensed GP liquid culture medium by 9 ml. GP液体培地を分注した試験管の1本に、前記(A)で培養したコロニーをディスポループ2ループ分を接種し、10mlピペットで菌を懸濁して10倍希釈液を調製した。 In one tube that dispensed GP liquid culture medium min, the colonies were cultured in (A) was inoculated with disposable loop 2 loop component, to prepare a 10-fold dilutions were suspended bacteria in 10ml pipette. 得られた菌液1mlを、GP液体培地を分注した試験管の1本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、10 倍希釈液を調製した。 The resulting bacterial solution 1 ml, was added and mixed using a micropipette to one test tube dispensed GP liquid culture min, to prepare a 10 two-fold dilutions. チップを交換し、以後同様にして、10 倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the chip, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 8 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例3においては10 〜10 倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in the third embodiment using the 10 4 to 10 8 fold dilution bacterial liquid.
【0094】 [0094]
(C) 容量225mlのジャンボコニカルチューブ1本に、180mlのGP培地を入れ、さらに、50mg/mlのゲンタマイシン(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15750−060)および250μg/mlのアンホテリシンB(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15290―018)をそれぞれ900μlを添加し、混合した。 Jumbo conical tube one (C) volume 225 ml, put GP medium 180 ml, further, 50 mg / ml gentamicin (Invitrogen Corp., Catalog No. 15750-060) and 250 [mu] g / ml of amphotericin B (Invitrogen ( Ltd.), catalog No. 15290-018) was added to 900μl each and mixed.
【0095】 [0095]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径0.2μmの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。 Set the adapter Milliflex, then set the funnel fitted with a filter membrane having a pore size of 0.2μm to the adapter. つぎに、25mlピペットを用いて前記(C)で調製したGP液体培地30mlおよび(B)で調製した10 倍希釈菌液1.0mlをそれぞれファネルに入れて混合し、すべて吸引濾過した。 Then mixed putting the ten 4-fold dilutions bacterial liquid 1.0ml prepared in GP liquid culture medium 30ml and prepared in (C) (B), each funnel with 25ml pipette and all suction filtration. 10 〜10 倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。 For even 10 5 to 10 8 fold diluted bacterial solution was subjected to the same procedure as. なお、希釈菌液のかわりにGP液体培地を1.0ml添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, what the GP liquid culture medium instead of the dilution cell suspension was added 1.0 ml, served as a negative control.
【0096】 [0096]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
ポリソルベート加洗浄液「ダイゴ」(日本製薬(株)製、カタログ番号395−01561)約100mlをデカンテーションでファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。 Polysorbates pressurized cleaning liquid "Daigo" (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 395-01561) was added to approximately 100ml to funnel by decantation, followed by suction filtration and rinse the inner wall of the funnel. 同様の操作をさらに2回繰り返し、合計300mlの洗浄液で濾過膜をリンスした。 Repeat two more times the same operation to rinse the filtration membrane with a washing liquid of a total 300 ml.
【0097】 [0097]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、30mlのGP液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで室温(25℃)で20時間、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtration membrane 50ml centrifuge tube containing the GP liquid culture medium 30 ml, and then 20 hours at room temperature (25 ° C.), it was carried out by shaking culture.
【0098】 [0098]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
培養後、ピンセットによりGP液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After the culture was aseptically removed filtration membrane from GP liquid culture medium by tweezers. GP液体培地を遠心し(2000g、10分間)、上清を静かに除去した。 GP liquid culture medium was centrifuged (2000 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(15000g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ° C. (15000 g, 10 minutes), it was gently remove the supernatant.
【0099】 [0099]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
PCR用の鋳型の調製は、実施例1の<菌体の回収>において回収された菌体の代わりに、実施例3の<菌体の回収>において回収された菌体を使用するほかは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>と同様に行なった。 Preparation of template for PCR, instead of the cells recovered in <recovery of cells> of Example 1, except to use the bacteria recovered in <recovery of cells> of Example 3, It was carried out in the same manner as <preparation of template for PCR> of example 1.
【0100】 [0100]
<PCR> <PCR>
PCRは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAの代わりに、実施例3の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAを使用するほかは、実施例1の<PCR>と同様の条件で行なった。 PCR, instead of the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 1, except to use the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> Example 3, performed It was carried out under the same conditions as <PCR> example 1.
【0101】 [0101]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
アガロース電気泳動は、実施例1の<PCR>において増幅されたPCR産物の代わりに、実施例3の<PCR>において増幅されたPCR産物を使用するほかは、実施例1の<アガロース電気泳動>と同様に行なった。 Agarose electrophoresis, instead of the amplified PCR product in <PCR> of Example 1, except using PCR products amplified in <PCR> of Example 3, of Example 1 <agarose electrophoresis> It was carried out in the same manner as.
【0102】 [0102]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR Greenを10μl加え、染色液を調製した。 It was added 10μl of SYBR Green to 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0103】 [0103]
PCR産物の染色の結果、10 倍、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液からサッカロマイセス・セレビシエ ATCC 9763菌株のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, 104-fold, 105-fold, DNA of Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 strain was detected in 10 6 fold and 107-fold dilutions bacterial liquid. 10 倍希釈菌液からはサッカロマイセス・セレビシエ ATCC 9763菌株のDNAは検出されなかった。 From 10 8 dilution bacterial suspension DNA of Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 strain was detected.
【0104】 [0104]
試験例3 Test Example 3
実施例3の菌液の調製(B)において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。 The viable cell count of the diluted bacterial solution which had been prepared in the preparation of bacterial suspension in the Example 3 (B), was measured by the following pour method. すなわち、前記10 〜10 倍希釈菌液1mlを直径90mmシャーレに分注した(n=3)。 That was dispensed the 10 4 to 10 8 fold diluted bacterial solution 1ml diameter 90mm petri dish (n = 3). 各シャーレに、オートクレーブ後50℃に保持していたサブロー・ブドウ糖寒天培地(実施例1と同様に作製)を14mlずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。 Each dish, Sabouraud dextrose agar which had been held at 50 ° C. after autoclaving (similar produced as in Example 1) and dispensed at 14ml min, stirring gently, and allowed to stand until the agar solidifies. 寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して32.5℃のインキュベータ内で培養した。 After the agar solidified, and cultured in an incubator at 32.5 ° C. with inverted each dish. 培養から4日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 Four days after the culture, the number of colonies formed was counted visually.
【0105】 [0105]
測定の結果、10 倍、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、100個以上、42.3個、2.3個および0.3個であった。 As a result of the measurement, 10 4 fold, 10 5 fold, 10 6 fold and 107-fold the number of viable cells contained in the diluted bacterial solution, respectively, 100 or more, 42.3 or 2.3 units and 0.3 units Met. 10 倍希釈菌液に関しては、コロニーは検出されなかった。 For the 10 8-fold diluted bacterial solution, colonies were detected.
【0106】 [0106]
実施例4 Example 4
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(A) 試験管1本に、GP液体培地(実施例1と同様に作製)10mlを分注した。 To one (A) tube, (prepared as in Example 1) GP liquid culture medium was dispensed 10ml min. つぎに、該GP液体培地にアスペルギルス・フミガタス(財団法人発酵研究所における受託番号IFO 33022菌株)の胞子および菌子をディスポループ1ループ分を接種し、GP液体培地に懸濁した。 Next, inoculated with one loop component disposable loops spores and mycelium of Aspergillus fumigatus in the GP liquid culture medium (accession number IFO 33,022 strains in the Institute for Fermentation), were suspended in GP liquid culture medium. この菌液を、25℃で20時間培養した。 This bacterial solution was incubated for 20 hours at 25 ° C..
【0107】 [0107]
(B) 試験管5本に、GP液体培地を9mlずつ分注した。 (B) in 5 test tubes were dispensed GP liquid culture medium by 9 ml. GP液体培地を分注した試験管の1本に、5mlピペットを用いて前記(A)で調製した菌液1mlを添加して混合し、10倍希釈液を調製した。 In one tube that dispensed GP liquid culture medium min, added and mixed bacterial solution 1ml prepared in the (A) using a 5ml pipette, to prepare 10-fold dilutions. ピペットを交換し、以後同様にして、10 倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the pipette, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 3 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例4においては前記(A)で調製した菌液(原液)〜10 倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in the embodiment 4 was used bacterial suspension (stock) to 10 3 fold dilutions bacterial solution prepared in the above (A).
【0108】 [0108]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
ミリフレックスにアダプターをセットし、ついで孔径0.2μmの濾過膜を装着したファネルをアダプターにセットした。 Set the adapter Milliflex, then set the funnel fitted with a filter membrane having a pore size of 0.2μm to the adapter. つぎに、25mlピペットを用いてGP液体培地30mlおよび(B)で調製した菌液(原液)1.0mlをそれぞれファネルに入れて混合し、すべて吸引濾過した。 Then mixed respectively placed in funnel GP bacterial solution prepared in liquid medium 30ml and (B) a (stock solution) 1.0 ml using a 25ml pipette and all suction filtration. 10 〜10 倍希釈菌液についても、同様に操作を行なった。 For even 10 1 to 10 3 fold dilutions cell solution was subjected to the same procedure as. なお、希釈菌液のかわりにGP液体培地を1.0ml添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, what the GP liquid culture medium instead of the dilution cell suspension was added 1.0 ml, served as a negative control.
【0109】 [0109]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
実施例4においては抗生物質を使用しなかったので、ファネルの内壁をリンスしなかった。 Since in Example 4 was not used antibiotics, it did not rinse the inner wall of the funnel.
【0110】 [0110]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、30mlのGP液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで27℃で20時間、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtration membrane 50ml centrifuge tube containing the GP liquid culture medium 30 ml, and then 20 hours at 27 ° C., it was carried out by shaking culture.
【0111】 [0111]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
培養後、ピンセットによりGP液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After the culture was aseptically removed filtration membrane from GP liquid culture medium by tweezers. GP液体培地を遠心し(1310g、10分間)、上清を静かに除去した。 GP liquid culture medium was centrifuged (1310 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(16100g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ℃ (16100g, 10 min), and gently remove the supernatant.
【0112】 [0112]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
PCR用の鋳型の調製は、実施例1の<菌体の回収>において回収された菌体の代わりに、実施例4の<菌体の回収>において回収された菌体を使用するほかは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>と同様に行なった。 Preparation of template for PCR, instead of the cells recovered in <recovery of cells> of Example 1, except to use the bacteria recovered in <recovery of cells> of Example 4, It was carried out in the same manner as <preparation of template for PCR> of example 1.
【0113】 [0113]
<PCR> <PCR>
PCRは、実施例1の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAの代わりに、実施例4の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAを使用するほかは、実施例1の<PCR>と同様の条件で行なった。 PCR, instead of the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 1, except to use the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> Example 4, performed It was carried out under the same conditions as <PCR> example 1.
【0114】 [0114]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
アガロース電気泳動は、実施例1の<PCR>において増幅されたPCR産物の代わりに、実施例4の<PCR>において増幅されたPCR産物を使用するほかは、実施例1の<アガロース電気泳動>と同様に行なった。 Agarose electrophoresis, instead of the amplified PCR product in <PCR> of Example 1, except using PCR products amplified in <PCR> Example 4, Example 1 <agarose electrophoresis> It was carried out in the same manner as.
【0115】 [0115]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR Greenを10μl加え、染色液を調製した。 It was added 10μl of SYBR Green to 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0116】 [0116]
PCR産物の染色の結果、1倍、10倍、10 倍および10 倍希釈菌液からアスペルギルス・フミガタス IFO 33022菌株のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, 1-fold, 10-fold, 10 2-fold and 10 3 times dilutions bacterial suspension of Aspergillus fumigatus IFO 33,022 strains DNA was detected.
【0117】 [0117]
試験例4 Test Example 4
アスペルギルス・フミガタス IFO 33022菌株は菌糸をもち胞子を形成するカビであるため、菌体の希釈菌液の検出感度をコロニー数(cfu)で示すことができない。 Aspergillus fumigatus IFO thirty-three thousand and twenty-two strain because it is a fungus that forms spores have hyphae, can not show the detection sensitivity of the dilution bacterial liquid of bacterial colony count (cfu). そこで、アスペルギルス・フミガタス IFO 33022菌株の希釈菌液の検出感度をコロニー数(cfu)で示すのではなく、DNA量で表示した。 Therefore, the detection sensitivity of the dilution bacterial suspension of Aspergillus fumigatus IFO thirty-three thousand and twenty-two strain rather than indicated by colony counts (cfu), viewed in the amount of DNA. すなわち、1倍、10倍、10 倍および10 倍希釈菌液のPCR用鋳型(DNA)を抽出し(実施例1と同様)この鋳型8μlをマイクロチューブに入れ、TE72μlと混合して10倍希釈した。 That is, 1-fold, 10-fold, 10 to extract the 2-fold and 10 threefold dilutions bacterial solution for PCR template (DNA) (as in Example 1) placed in the mold 8μl microtubes, mixed with TE72myueru 10 fold diluted. TEを対象として、この鋳型の260nmの吸光度をUV可視分光光度計(ベックマンコールター製、型番DU640)を用いて測定した。 As target TE, the 260nm absorbance of the template with UV-visible spectrophotometer (Beckman Coulter, model number DU640) was used for the measurement. DNA量を求める式は当業者に公知であり、例えば以下の式によりDNA量を算出することができる(細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」▲1▼分子生物学の基礎、61〜62頁、1995年、(株)秀潤社発行)。 The formula for the amount of DNA are known to those skilled in the art, for example, the following equation makes it possible to calculate the amount of DNA (Cell Engineering Supplement "Bio Experiment Illustrated Ted" ▲ 1 ▼ molecular biology basics, pp 61-62 , 1995, (Ltd.) Shujunsha issue).
【0118】 [0118]
2本鎖DNA(μg/μl)=(260nm吸光度)×0.05×希釈倍率【0119】 Double-stranded DNA (μg / μl) = (260nm absorbance) × 0.05 × dilution factor [0119]
260nmの吸光度の測定の結果、1倍、10倍、10 倍および10 倍希釈菌液に含まれるアスペルギルス・フミガタス IFO 33022菌株のDNA量はそれぞれ0.9μg、0.67μg、68.3ngおよび4.25ngであった。 Results of the measurement of absorbance at 260nm, 1-fold, 10-fold, 10 double and 10 triple each DNA of Aspergillus fumigatus IFO thirty-three thousand and twenty-two strain contained in diluted bacterial solution 0.9μg, 0.67μg, 68.3ng and was 4.25ng. このことから、アスペルギルス・フミガタス IFO 33022菌株のDNA量が4.25ngあれば、同様の方法で検出できることが明らかとなった。 Therefore, if the amount of DNA of Aspergillus fumigatus IFO 33 022 strains 4.25Ng, revealed that detectable by the same method.
【0120】 [0120]
実施例5 Example 5
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(D) 試験管1本に、SCD液体培地(ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト粉末培地(日本製薬(株)製、カタログ番号396−00991)8.5g/超純水500ml)10mlを分注した。 (D) to one test tube was dispensed SCD liquid medium (Soybean Casein Digest powdered medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 396-00991) 8.5g / ultrapure water 500ml) and 10ml min. つぎに、該SCD液体培地にバチルス・ズブチルス(財団法人発酵研究所における受託番号IFO 3134)のコロニー1個を接種し、ピペッティングにより菌体を充分に分散させた。 Next, inoculated with one colony of Bacillus subtilis in the SCD broth (accession number IFO 3134 in Institute for Fermentation), it was thoroughly disperse the cells by pipetting.
【0121】 [0121]
(E) 試験管10本に、SCD液体培地を9mlずつ分注した。 (E) to 10 test tubes, it was dispensed SCD liquid medium by 9 ml. SCD液体培地を分注した試験管の1本に、マイクロピペットを用いて前記(D)で調製した菌液1mlを添加して混合し、10倍希釈液を調製した。 In one tube that dispensed SCD liquid medium min, added and mixed bacterial solution 1ml prepared in the (D) using a micropipette to prepare 10-fold dilutions. チップを交換し、以後同様にして、10 倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the chip, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 8 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例5においては、10 〜10 倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in Example 5, using 10 5 to 10 8 fold diluted bacterial solution.
【0122】 [0122]
(F) 容量225mlのジャンボコニカルチューブ8本それぞれに、150mlのGreen+3%FBSを入れ、さらに、ゲンタマイシン(インビトロジェン(株)製のカタログ番号15750−060)およびアンホテリシンB(商品名「ファンギゾン」、インビトロジェン(株)製、カタログ番号15290−018)をそれぞれ50μg/ml、0.25μg/mlの濃度になるように添加した。 Jumbo conical tube eight each of the (F) capacity 225ml, put the Green + 3% FBS of 150ml, further, gentamicin (Invitrogen Co., Ltd., catalog number 15750-060) and amphotericin B (trade name "Fungizone", Invitrogen ( Ltd.), catalog No. 15290-018), respectively 50 [mu] g / ml, was added to a concentration of 0.25 [mu] g / ml. ついで、前記(E)で調製した10 〜10 倍希釈菌液をそれぞれ1.0mlずつ添加し、混合した。 Then, the 10 5 10 8-fold diluted bacterial solution prepared in (E) was added portionwise 1.0ml each, were mixed. なお、希釈菌液のかわりにSCD液体培地1.0mlを添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, a material obtained by adding SCD liquid medium 1.0ml instead of diluting bacterial solution, as a negative control.
【0123】 [0123]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
孔径0.45μmの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。 The filtration membrane having a pore diameter of 0.45μm is set to a filter holder and then set the filter holder to the manifold. つぎに、50mlピペットを用いて前記(F)で調製したサンプル50mlをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。 Next, put the using 50ml pipette samples 50ml prepared in (F) to the funnel, and all suction filtration. 吸引濾過をさらに2回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。 Suction filtration was repeated two more times, was filtered off with suction all of the sample.
【0124】 [0124]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
LP希釈液(実施例1と同様に作製)50mlをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。 LP dilution (as produced in Example 1) 50 ml was added to the funnel and then by suction filtration and rinse the inner wall of the funnel. 同様のリンスをさらに2回繰り返した。 It was repeated two more times the same rinse.
【0125】 [0125]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、30mlのSCD液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで35℃で一晩(12〜18時間)、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtration membrane 50ml centrifuge tube containing the SCD broth 30 ml, then overnight at 35 ° C. (12 to 18 hours) were carried out by shaking culture.
【0126】 [0126]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
一晩培養した後、ピンセットによりSCD液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After overnight culture was aseptically removed filtration membrane from SCD liquid medium by tweezers. SCD液体培地を遠心し(2000g、10分間)、上清を静かに除去した。 SCD broth was centrifuged (2000 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(15000g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ° C. (15000 g, 10 minutes), it was gently remove the supernatant.
【0127】 [0127]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
各マイクロチューブの懸濁液0.5mlを、1.5mlエッペンドルフチューブに移し、4℃で遠心した(15000g、10分間)。 The suspension 0.5ml of each microtube were transferred to 1.5ml eppendorf tubes and centrifuged at 4 ° C. (15000 g, 10 minutes). 遠心後、上清を除去し、沈殿をトリトンX−100を含むTE(10mM トリス・HCl(pH8.0)、1mM EDTA、1.0%(重量/容量)トリトンX−100)50μlに懸濁した。 After centrifugation, the supernatant was removed, TE containing Triton X-100 to precipitate (10 mM Tris · HCl (pH8.0), 1mM EDTA, 1.0% (w / v) Triton X-100) suspended in 50μl did. ついで、各サンプルを100℃で20分間処理し、氷上に静置した。 Then, each sample was treated with 100 ° C. 20 minutes, allowed to stand on ice.
【0128】 [0128]
<PCR> <PCR>
反応混合液50μlを0.2mlのPCRチューブに調製し、氷上で保持した。 The reaction mixture was 50μl prepared PCR tubes 0.2 ml, and kept on ice. プライマーとしては、配列番号4および配列番号5に示す配列を有する2種のプライマーを用いた。 The primers were used two primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. また、鋳型DNAとしては、実施例5の<PCR用の鋳型の調製>において調製されたバチルス・ズブチルス IFO 3134のDNAを用いた。 As the template DNA, using DNA of Bacillus subtilis IFO 3134 prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 5. 反応混合液の組成は、プライマー各0.5μMおよび2.0μlの鋳型DNAを用いたほかは実施例1の反応混合液と同様の組成である。 The composition of the reaction mixture, except using the template DNA primers each 0.5μM and 2.0μl the same composition as the reaction mixture of Example 1.
【0129】 [0129]
PCRサーマルサイクラーMPに各PCRチューブをセットし、つぎのプログラムでPCRを実施した。 Set each PCR tube PCR thermal cycler MP, PCR was carried out in the following program. 本実施例において、PCRは、94℃で2分間インキュベーションし、ついで94℃で1分間、61℃で1分間および72℃で1分間を1サイクルとしてこれを30サイクル行ない、さらに72℃で1分間インキュベーションすることで実施した。 In this embodiment, PCR is incubated for 2 minutes at 94 ° C., then 1 min at 94 ° C., 30 cycles no line this as 1 cycle 1 min 1 min and 72 ° C. at 61 ° C., a further 1 minute at 72 ° C. It was carried out by incubation. アニーリング温度は、前述の式により算出したプライマーの融解温度を参考にして設定した。 The annealing temperature was set by reference to the melting temperature of the primers was calculated by the above equation.
【0130】 [0130]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
前記PCR産物50μlに10μlのローディングバッファーを加えて混合した。 It was added and mixed loading buffer 10μl to the PCR product 50 [mu] l. ついで、これらのサンプル15μlをアガロースゲル(アガロースS 2.9g/1×TAE 100ml)にローディングし、100Vで30分間、電気泳動を実施した。 Then, these samples 15μl loaded onto agarose gel (agarose S 2.9g / 1 × TAE 100ml), 30 minutes at 100 V, electrophoresis was performed.
【0131】 [0131]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR GreenI(×10000)を10μl加えて混合し、染色液を調製した。 To 1 × TAE of 100ml were mixed with 10μl of SYBR GreenI (× 10000), was prepared staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0132】 [0132]
PCR産物の染色の結果、10 〜10 倍希釈菌液すべてからバチルス・ズブチルス IFO 3134のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, 105 to 108 times the DNA of Bacillus subtilis IFO 3134 from a dilute cell suspension all were detected. 以下の試験例5に記載のように、10 倍、10 倍、および10 倍希釈菌液に含まれるバチルス・ズブチルスは、それぞれ30個、4個および0.5個であった。 As described in the following Test Example 5, 10 6 fold, 10 7 fold, and Bacillus subtilis contained in 10 8-fold diluted bacterial solution, 30 respectively, were four and 0.5 units.
【0133】 [0133]
試験例5 Test Example 5
実施例5の菌液の調製(E)において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。 The viable cell count of the diluted bacterial solution which had been prepared in the preparation of bacterial suspension (E) of Example 5 was measured by the following pour method. すなわち、前記10 〜10 倍希釈菌液1mlを直径90mmシャーレに分注した(n=2)。 That was dispensed the 105 to 8-fold diluted bacterial solution 1ml diameter 90mm petri dish (n = 2). 各シャーレに、オートクレーブ後45℃に保持していたSCD寒天培地(SCD寒天培地(日本製薬(株)製、カタログ番号396−00991)8.0g/超純水200ml)を15mlずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。 In each dish, SCD agar medium has been held to 45 ℃ after autoclaving (SCD agar medium (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 396-00991) 8.0g / ultra-pure water 200ml) to be dispensed at 15ml minute It was stirred gently, and allowed to stand until the agar solidifies. 寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して35℃のインキュベータ内で培養した。 After the agar solidified, and cultured in an incubator at 35 ° C. with inverted each dish. 培養から4日後および5日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 After 4 days, and 5 days of culture, the number of colonies formed was counted visually.
【0134】 [0134]
測定の結果、10 倍、10 倍、10 倍、および10 倍希釈菌液に含まれるバチルス・ズブチルス IFO 3134は、それぞれ200個、30個、4個および0.5個であった。 As a result of the measurement, 10 5 fold, 10 6 fold, 10 7 fold, and Bacillus subtilis IFO 3134 contained in 10 8-fold diluted bacterial solution, 200 respectively, 30, was four and 0.5 units .
【0135】 [0135]
実施例6 Example 6
<菌液の調製> <Preparation of the bacterial solution>
(D) シュードモナス・エルジノーザ(財団法人発酵研究所における受託番号IFO 13275菌株)のコロニー1個を採取し、SCD寒天培地(試験例5と同様に作製)に塗抹し、32.5℃で24時間培養した。 (D) Pseudomonas Erujinoza taken one colony (accession number IFO 13275 strain in Institute for Fermentation), spread on SCD agar medium (in the same manner as in Test Example 5 Preparation), 24 hours at 32.5 ° C. and cultured.
【0136】 [0136]
(E) 試験管11本に、SCD液体培地(実施例5と同様に作製)を9mlずつ分注した。 To eleven (E) tube, (prepared as in Example 5) SCD liquid medium was aliquoted 9ml min. SCD液体培地を分注した試験管の1本に、前記(D)で培養したコロニーをディスポループ2ループ分を接種し、10mlピペットで菌を懸濁した。 In one tube that dispensed SCD liquid medium min, the inoculated with 2 loops min disposable loop colonies cultured in (D), the cells were suspended in 10ml pipette. 得られた菌液1mlを、SCD液体培地を分注した試験管の1本にマイクロピペットを用いて添加して混合し、10倍希釈液を調製した。 The resulting bacterial solution 1 ml, was added and mixed using a micropipette to one test tube dispensed SCD liquid medium min, to prepare a 10-fold dilution. チップを交換し、以後同様にして、10 10倍希釈菌液を得るまで希釈を繰り返した。 Replace the chip, thereafter in the same manner, was repeated diluted to obtain a 10 10 fold dilutions bacterial liquid. 以下、実施例6においては、10 〜10 10倍希釈菌液を使用した。 Hereinafter, in Example 6, using 10 6 to 10 10-fold diluted bacterial solution.
【0137】 [0137]
(F) 容量225mlのジャンボコニカルチューブ6本それぞれに、150mlのSCD液体培地を入れ、さらに、50mg/mlのゲンタマイシン(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15750−060)および250μg/mlのアンホテリシンB(インビトロジェン(株)製、カタログ番号15290―018)をそれぞれ150μlを添加し、混合した。 Jumbo conical tube six each (F) volume 225 ml, put SCD liquid medium 150 ml, further, 50 mg / ml gentamicin (Invitrogen Corp., Catalog No. 15750-060) and 250 [mu] g / ml of amphotericin B ( Invitrogen Corp., catalog No. 15290-018) was added to 150μl each and mixed. ついで、前記(E)で調製した10 〜10 10倍希釈菌液をそれぞれ1.0mlずつ添加し、混合した。 Then, the 10 6 to 10 10-fold diluted bacterial solution prepared in (E) was added portionwise 1.0ml each, were mixed. なお、希釈菌液のかわりにSCD液体培地1.0mlを添加したものを、ネガティブコントロールとした。 Incidentally, a material obtained by adding SCD liquid medium 1.0ml instead of diluting bacterial solution, as a negative control.
【0138】 [0138]
<菌液の濾過> <Filtration of bacterial solution>
孔径0.45μmの濾過膜をフィルターホルダーにセットし、ついでフィルターホルダーをマニホールドにセットした。 The filtration membrane having a pore diameter of 0.45μm is set to a filter holder and then set the filter holder to the manifold. つぎに、50mlピペットを用いて前記(F)で調製したサンプル50mlをファネルに入れ、すべて吸引濾過した。 Next, put the using 50ml pipette samples 50ml prepared in (F) to the funnel, and all suction filtration. 吸引濾過をさらに2回繰り返し、サンプルのすべてを吸引濾過した。 Suction filtration was repeated two more times, was filtered off with suction all of the sample.
【0139】 [0139]
<濾過膜のリンス> <Rinse of the filtration membrane>
LP希釈液(実施例1と同様に作製)50mlをファネルに添加し、ついで吸引濾過することにより、ファネルの内壁をリンスした。 LP dilution (as produced in Example 1) 50 ml was added to the funnel and then by suction filtration and rinse the inner wall of the funnel. 同様のリンスをさらに2回繰り返した。 It was repeated two more times the same rinse.
【0140】 [0140]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、ピンセットで濾過膜を取りだし、30mlのSCD液体培地を入れた50ml遠沈管に濾過膜を浸漬し、ついで35℃で19時間、振とう培養を実施した。 After suction filtration, taken out filtration membrane with forceps, immersed filtered to 50ml centrifuge tube film containing the SCD broth 30 ml, then 19 hours at 35 ° C., it was carried out by shaking culture.
【0141】 [0141]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
培養後、ピンセットによりSCD液体培地から濾過膜を無菌的に除去した。 After the culture was aseptically removed filtration membrane from SCD liquid medium by tweezers. SCD液体培地を遠心し(1310g、10分間)、上清を静かに除去した。 SCD broth was centrifuged (1310 g, 10 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(16100g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ℃ (16100g, 10 min), and gently remove the supernatant.
【0142】 [0142]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
PCR用の鋳型の調製は、実施例5の<菌体の回収>において回収された菌体の代わりに、実施例6の<菌体の回収>において回収された菌体を使用するほかは、実施例5の<PCR用の鋳型の調製>と同様に行なった。 Preparation of template for PCR, instead of the cells recovered in <recovery of cells> of Example 5, except to use the cells recovered in <recovery of cells> of Example 6, It was carried out in the same manner as <preparation of template for PCR> of example 5.
【0143】 [0143]
<PCR> <PCR>
PCRは、実施例5の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAの代わりに、実施例6の<PCR用の鋳型の調製>において調製された鋳型DNAを使用するほかは、実施例5の<PCR>と同様に行なった。 PCR, instead of the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 5, except to use the template DNA prepared in <Preparation of template for PCR> Example 6, carried out example was carried out in the same manner as <PCR> 5.
【0144】 [0144]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
アガロース電気泳動は、実施例5の<PCR>において増幅されたPCR産物の代わりに、実施例6の<PCR>において増幅されたPCR産物を使用するほかは、実施例5の<アガロース電気泳動>と同様に行なった。 Agarose electrophoresis, instead of the amplified PCR product in <PCR> of Example 5, except using PCR products amplified in <PCR> Example 6 <agarose electrophoresis> Example 5 It was carried out in the same manner as.
【0145】 [0145]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR Greenを10μl加えて混合し、染色液を調製した。 It was mixed with 10μl of SYBR Green to 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0146】 [0146]
PCR産物の染色の結果、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液からシュードモナス・エルジノーザIFO 13275菌株のDNAが検出された。 Results of staining of PCR products, 106-fold, DNA of Pseudomonas Erujinoza IFO 13275 strain was detected from 107-fold and 108-fold diluted bacterial solution. 10 倍および10 10倍希釈菌液からはシュードモナス・エルジノーザIFO 13275菌株のDNAは検出されなかった。 From 10 9 times and 10 10-fold diluted bacterial solution DNA of Pseudomonas Erujinoza IFO 13275 strain was not detected.
【0147】 [0147]
試験例6 Test Example 6
実施例6の菌液の調製(E)において調製した希釈菌液中の生菌数を、以下の混釈法により測定した。 The viable cell count in the diluted bacterial solution prepared in the preparation of bacterial suspension (E) of Example 6 was measured by the following pour method. すなわち、前記10 〜10 10倍希釈菌液1mlを直径90mmシャーレに分注した(n=3)。 That was dispensed the 10 6 to 10 10-fold diluted bacterial solution 1ml diameter 90mm petri dish (n = 3). 各シャーレに、オートクレーブ後50℃に保持していたSCD寒天培地(試験例5と同様に作製)を15mlずつ分注して、穏かに撹拌し、寒天が固化するまで静置した。 Each dish, SCD agar medium after retained in 50 ° C. autoclave (in the same manner as in Test Example 5 Preparation) and dispensed at 15ml min, stirring gently, and allowed to stand until the agar solidifies. 寒天が固化したのち、各シャーレを倒置して35℃のインキュベータ内で培養した。 After the agar solidified, and cultured in an incubator at 35 ° C. with inverted each dish. 培養から3日後および5日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 3 days and 5 days after culturing, the number of colonies formed was counted visually.
【0148】 [0148]
測定の結果、10 倍、10 倍および10 倍希釈菌液に含まれる生菌数は、それぞれ、100個以上、34個および2.7個であった。 As a result of the measurement, 10 6 times, the number of viable bacteria contained in 107-fold and 108-fold diluted bacterial solution, respectively, 100 or more, was 34 pieces, and 2.7. 10 倍および10 10倍希釈菌液に関しては、コロニーは検出されなかった。 For the 109-fold and 10 10-fold dilutions bacterial suspension, colonies were detected. なお、同様の実験を4回繰り返し行なったが、いずれも生菌数が1〜数個でも検出が可能であった。 Although it repeated performed 4 times the same experiment, both the number of viable bacteria was possible to detect even a few 1.
【0149】 [0149]
さらに、0.45μmの孔径の濾過膜の代わりに孔径0.2μmの濾過膜を用いて同様の実験を行なった場合も、シュードモナス・エルジノーザ IFO 13275菌株のDNAは検出された。 Further, even when subjected to similar experiments using a filter membrane having a pore size of 0.2μm instead of the filtration membrane of pore size of 0.45 [mu] m, DNA of Pseudomonas Erujinoza IFO 13275 strain was detected.
【0150】 [0150]
実施例1〜3、5および6ならびに試験例1〜3、5および6の結果より、濾過前の生菌数が1〜数個の場合でも、菌体の存在を検出できることが分かった。 From the results of Examples 1 to 3 and 5 and 6 and Test Examples 1 to 3 and 5 and 6, even when the viable count of several 1 before filtration, it was found that can detect the presence of bacteria. また、実施例1〜3、5および6の結果より、培地に抗生物質が含まれている場合でも、濾過前に1〜数個の菌体が存在すれば、菌体の存在を検出できること、および、実施例4の結果より、抗生物質が含まれていない場合でも、数個の菌体が存在すれば、菌体の存在を検出できることが分かった。 Further, from the results of Examples 1 to 3 and 5 and 6, even if it contains an antibiotic to the medium, if there are several cells 1 prior to filtration, it can detect the presence of cells, and, from the results of example 4, even if it does not contain antibiotics, if there are several cells, it has been found that can detect the presence of bacteria. このことは、組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液に少数の菌体が存在すれば、抗生物質が含まれているか否かにかかわらず、菌体の存在を検出できることを意味する。 This immersion liquid tissue or tissue equivalent, if there are a small number of bacteria in the immersion fluid or blood organs, regardless of whether or not contain antibiotics, to be able to detect the presence of bacteria means.
【0151】 [0151]
濾過膜の孔径に関しては、実施例6の結果より、孔径0.2μmおよび孔径0.45μmの濾過膜のどちらの濾過膜を使用しても、細菌の存在を検出できることが分かった。 For the pore size of the membrane, from the results of Example 6, using either a filtration membrane having a pore size of 0.2μm and a pore size 0.45μm filter membrane, it was found to detect the presence of bacteria. また、一般的に真菌は細菌よりもサイズが大きいことから、実施例6の結果は孔径0.45μmの濾過膜を使用した場合でも、真菌の存在を検出できることを意味する。 Also, generally fungi since larger size than bacteria, the results of Example 6, even when using a filtration membrane having a pore diameter of 0.45 [mu] m, which means that it is possible to detect the presence of fungi.
【0152】 [0152]
実施例7 Example 7
<気体の濾過> <Filtration of gas>
M Air TミリポアテスターにM Air TカセットTSA培地充填済み(以下、TSA培地をSCD寒天培地と称する)をセットし、ついでSCD寒天培地の蓋を開け、ピンセットを用いてSCD寒天培地上に滅菌した孔径0.22μmの濾過膜を載せた。 M Air T Millipore tester M Air T cassette TSA medium filled (hereinafter, the TSA medium called SCD agar medium) set and then open the lid of the SCD agar medium was sterilized on SCD agar using tweezers It was placed on the pore size of 0.22μm of the filtration membrane. ついでM Air Tミリポアテスターに微細孔サンプリングプレートをセットし、蓋をした。 Then set the micropores sampling plate M Air T Millipore tester and capped. つぎに、微生物を含むと思われる非清浄区域(メニコンBIOセンター、2階機械室)における空気200リットルを、M Air Tミリポアテスターを用いて吸引した。 Next, unclean area (Menicon BIO Center, 2F machine room) suspected of containing a microorganism 200 liters air in and pulled with M Air T Millipore tester. なお、濾過膜は直径70mmのサイズに切断し、高圧蒸気滅菌(121℃、20分)したものを使用した。 Incidentally, the filtration membrane was cut to the size of the diameter of 70 mm, the high-pressure steam sterilization (121 ° C., 20 minutes) was used after.
【0153】 [0153]
<濾過膜に捕捉された菌体の培養> <Culture of bacteria trapped in the filtration membrane>
吸引濾過後、微細孔サンプリングプレートを外し、ピンセットで濾過膜を取りだし、50mlのSCD液体培地(日本製薬(株)製、カタログ番号396−00991)8.5g/蒸留水500ml)を入れたγ線滅菌済みのコンテナ(アシスト(株)製、カタログ番号75.9922.414S)に濾過膜を浸漬し、ついで30℃で22時間、振とう培養を実施した。 After suction filtration, microporous sampling plate to remove, taken out filtration membrane with forceps, (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., Catalog No. 396-00991) SCD liquid medium 50 ml 8.5 g / distilled water 500ml) and γ-rays placed (manufactured by assist Co., catalog No. 75.9922.414S) sterile container was immersed in a filtration membrane, and then 22 hours at 30 ° C., it was carried out by shaking culture. なお、コンテナにSCD液体培地50mlを入れたものを、ネガティブコントロールとし、30℃で22時間、振とう培養を実施した。 Incidentally, those containing the SCD broth 50ml in a container, a negative control, 22 hours at 30 ° C., was carried out by shaking culture.
【0154】 [0154]
<菌体の回収> <Recovery of bacteria>
培養後、培養物をそれぞれ50ml遠沈管に移し、ついで遠心し(3000g、15分間)、上清を静かに除去した。 After culturing, the culture was transferred to 50ml centrifuge tube, respectively, and then centrifuged (3000 g, 15 min), and gently remove the supernatant. 沈殿を1.0mlのPBS(−)に懸濁し、懸濁液をマイクロチューブに移した。 The precipitate 1.0ml of PBS (-) was suspended in, the suspension transferred to a micro tube. マイクロチューブを4℃で遠心し(15000g、10分間)、上清を静かに除去した。 Centrifuge the microtube at 4 ° C. (15000 g, 10 minutes), it was gently remove the supernatant.
【0155】 [0155]
<PCR用の鋳型の調製> <Preparation of a template for PCR>
各マイクロチューブにトリトンX−100を含むTE(実施例5と同様に作製)を100μlずつ添加し、菌体を懸濁した。 The TE (similarly prepared as in Example 5) containing Triton X-100 to each microtube was added in 100 [mu] l, the cells were suspended. ついで、各サンプルを100℃で20分間処理し、氷上に静置した。 Then, each sample was treated with 100 ° C. 20 minutes, allowed to stand on ice.
【0156】 [0156]
<PCR> <PCR>
反応混合液50μlを0.2mlのPCRチューブに調製し、氷上で保持した。 The reaction mixture was 50μl prepared PCR tubes 0.2 ml, and kept on ice. プライマーとしては、配列番号4および配列番号5に示す配列を有する2種のプライマーを用いた。 The primers were used two primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. また、鋳型DNAとしては、実施例7の<PCR用の鋳型の調製>において調製されたDNAを用いた。 As the template DNA, using DNA prepared in <Preparation of template for PCR> of Example 7. 反応混合液の組成は、0.5μMの配列番号4に示す配列を有するプライマー、1μMの配列番号5に示す配列を有するプライマー、0.5μlのTaqポリメラーゼ(5U/μl)および2.0μlの鋳型DNAを用いたほかは実施例1の反応混合液と同様の組成である。 Composition of the reaction mixture, a primer with the sequence shown in SEQ ID NO: 4 of 0.5 [mu] M, primer with the sequence shown in SEQ ID NO: 5 of 1 [mu] M, 0.5 [mu] l of Taq polymerase (5U / μl) and 2.0μl of the template but using DNA has the same composition as the reaction mixture of example 1.
【0157】 [0157]
PCRサーマルサイクラーMPに各PCRチューブをセットし、実施例5の<PCR>と同様のプログラムでPCRを実施した。 Set each PCR tube PCR thermal cycler MP, was PCR performed in the same program as the <PCR> of Example 5.
【0158】 [0158]
<アガロース電気泳動> <Agarose gel electrophoresis>
アガロース電気泳動は、実施例5の<PCR>において増幅されたPCR産物の代わりに、実施例7の<PCR>において増幅されたPCR産物を使用するほかは、実施例5の<アガロース電気泳動>と同様に行なった。 Agarose electrophoresis, instead of the amplified PCR product in <PCR> of Example 5, except using PCR products amplified in <PCR> of Example 7, <agarose electrophoresis> Example 5 It was carried out in the same manner as.
【0159】 [0159]
<PCR産物の染色> <Staining of the PCR product>
100mlの1×TAEにSYBR Greenを10μl加えて混合し、染色液を調製した。 It was mixed with 10μl of SYBR Green to 1 × TAE of 100 ml, to prepare a staining solution. 電気泳動後のアガロースゲルを染色液に浸漬し、暗所で2時間静置させた。 Immersing the agarose gel after electrophoresis to stain, it was 2 hours left in the dark. ついで、アガロースゲルにUV(λ=254nm)を照射し、ポラロイドカメラを用いて写真を撮影した。 Then irradiated with UV (λ = 254nm) in agarose gel, it was photographed using a Polaroid camera.
【0160】 [0160]
PCR産物の染色の結果、メンブレンを入れて培養した培地から680bp付近にバンドが検出された。 Results of staining of PCR products, a band was detected around 680bp from the medium cultured put the membrane. なお、ネガティブコントロールからはバンドは検出されなかった。 It should be noted, was not detected in the band from the negative control. 680bp付近にバンドが検出されたことから、配列番号4および配列番号5に示す配列を有する2種のプライマーによって検出される細菌であることが推測された。 Since around 680bp band was detected, it was speculated that the bacterium is detected by the two primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
【0161】 [0161]
比較例1 Comparative Example 1
M Air TミリポアテスターにM Air TカセットTSA培地充填済み(以下、TSA培地をSCD寒天培地と称する)をセットし、ついでSCD寒天培地の蓋を開けたのち、微細孔サンプリングプレートをセットし、蓋をした。 M Air T Millipore tester M Air T cassette TSA medium filled (hereinafter, the TSA medium called SCD agar medium) set and then after opening the lid of the SCD agar medium, sets the micropores sampling plate, lid Did. つぎに、実施例7と同様、微生物を含むと思われる非清浄区域(メニコンBIOセンター、2階機械室)における空気200リットルを、M Air Tミリポアテスターを用いて吸引した。 Then, as in Example 7, unclean area (Menicon BIO Center, 2F machine room) suspected of containing a microorganism 200 liters air in and pulled with M Air T Millipore tester. なお、空気の吸引は、実施例7とほぼ同時に行なった。 Incidentally, the suction of air was carried out at approximately the same time as in Example 7. 微細孔サンプリングプレートを外し、寒天培地に蓋をし、27℃のインキュベータ内で培養した。 Remove the micropores sampling plate, a lid on the agar medium, and cultured in an incubator at 27 ° C.. 培養から1日後、2日後、3日後、4日後および7日後に、形成されたコロニー数を目視で計測した。 One day after the culture, after two days, after three days, after and 7 days after 4 days, the number of colonies formed was counted visually.
【0162】 [0162]
測定の結果、1日後、2日後、3日後、4日後および7日後に検出されたコロニー数は、それぞれ、0個、4個、6個、8個および8個であった。 As a result of the measurement, after one day, after two days, after 3 days, 4 days and 7 days the number of colonies detected after, respectively, 0, 4, 6, 8 or and eight. したがって、比較例1の方法では、菌体の捕捉から微生物を検出するまでに少なくとも2日以上必要であることが分かる。 Thus, the method of Comparative Example 1, it can be seen until detecting microorganisms from the capture of the cells is required at least two days.
【0163】 [0163]
一方、実施例7の方法を用いれば、菌体を午後に採取した場合、次の日の午後には検査結果を得ることができる(約30時間)。 On the other hand, using the method of Example 7, when taken the cells in the afternoon, in the afternoon of the next day can be obtained test results (about 30 hours). また、実施例7の方法を用いると、菌体は濾過膜上に捕捉されるため、濾過対象の気体が大量である場合でも、エアーサンプラーに設置する寒天培地を一定量の気体を吸引する毎に交換することなく、濾過膜を交換することによって、1枚の寒天培地だけで微生物の検出が可能である。 Also, when using the method of Example 7, each cell is to be captured on the filter membrane, even when the gas filtration target is a large amount, for sucking a predetermined amount of gas the agar medium installed in air sampler without replacing the, by exchanging filtration membrane, it is possible to detect the microorganisms with only one agar. さらに、PCRで増幅されたDNA断片(PCR産物)の塩基配列をDNAシーケンサーで解析することにより、菌種の同定も可能である。 Furthermore, by analyzing the nucleotide sequence of PCR with the amplified DNA fragment (PCR product) in DNA Sequencer, identification of bacterial species it is possible.
【0164】 [0164]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
本発明の微生物の検出方法を用いれば、流体における微生物の存在の有無を確認することができ、たとえば、組織または組織等価物の浸漬液における微生物の存在の有無を、培養皮膚などの移植前に確認することができる。 By using the method for detecting microorganisms of the present invention, it is possible to confirm the presence or absence of microorganisms in the fluid, e.g., the presence or absence of microorganisms in the immersion liquid tissues or tissue equivalent, prior to implantation, such as cultured skin it can be confirmed. 従来の方法では約1mlのサンプルを使用しており、その検出感度は菌体100個/ml以上であったが、本発明の方法を用いれば、約150mlのサンプルを処理することができ、そのサンプルに含まれる微生物1個を検出することが可能である。 In the conventional method and using a sample of about 1 ml, the detection sensitivity is was cells 100 cells / ml or more, using the method of the present invention, it is possible to process samples of about 150 ml, the it is possible to detect one microorganism in the sample. また、これまでの細菌・真菌の検出は、サンプルを濾過した濾過膜を7〜14日間培養し、培養液が濁っていないことを目視で確認する方法と、浸漬液の一部をサンプルとするPCR法であった。 Moreover, so far the detection of bacteria, fungi, the samples were cultured for 7 to 14 days The filtered filtration membrane, a method of visually confirmed that no turbid culture, the portion of the immersion liquid and the sample It was PCR method. 前者においては、7〜14日間という長い期間が必要という問題があった。 In the former, there is a problem that requires a long period of 7-14 days. 後者においては、期間は1〜2日間と短いが1〜2ml程度のサンプルしか利用することができないために、数百ミリリットルに達する組織または組織等価物の浸漬液に適用する場合には、得られた培養上清のごく一部を使用することになり、微生物の検出感度が不充分であるだけでなく、試験結果の信頼性の低下という問題があった。 In the latter, the time period for but a short for 1-2 days can not be utilized only samples of about 1 to 2 ml, when applied to immersion liquid tissue or tissue equivalent reach hundreds milliliters, obtained and it will use a small portion of the culture supernatant, not only insufficient sensitivity of microorganisms, there is a problem that reduction in the reliability of test results. しかしながら、本発明の微生物の検出方法は、組織または組織等価物の浸漬液などの液体を午後に採取した場合、次の日の午後には検査結果を得ることができるため(約24時間)、非常に優れている。 However, the detection method of the microorganism of the present invention, when the liquid such as the immersion liquid of the tissue or tissue equivalent was taken in the afternoon, for the afternoon of the next day can be obtained test results (about 24 hours), It is very good.
【0165】 [0165]
さらに、本発明の微生物の検出方法は、気体にも適用することができる。 Furthermore, the detection method of the microorganism of the present invention can be applied to the gas. 従来の方法では、濾過対象の気体が大量である場合、エアーサンプラーに設置する寒天培地を一定量の気体を吸引する毎に交換する必要があるため、大量の寒天培地が必要となり、大量の使用済みの寒天培地を処理しなければならないという問題点があった。 In the conventional method, when the gas filtration target is mass, it is necessary to replace the agar medium installed in air sampler each time to suck a certain amount of gas, requires a large amount of agar, use of large amounts already there is a problem that be must process the agar medium. しかしながら、本発明の微生物の検出方法を用いると、廃棄物の量を減らすことができる。 However, using the detection method of the microorganism of the present invention, it is possible to reduce the amount of waste.
【0166】 [0166]
本発明の微生物の検出方法を用いると、使用するプライマーの種類により、微生物の検出結果が得られるだけでなく検出された微生物が真菌であるか細菌であるかを識別することができる。 With the method for detecting microorganisms of the present invention, may be the type of primers used, microorganisms microbial detection result is detected not only obtained to identify whether the bacteria is a fungus. また、PCRで増幅されたDNA断片(PCR産物)の塩基配列をDNAシーケンサーで解析することにより、流体の採取から短時間で菌種の同定をすることも可能である。 Further, by analyzing the nucleotide sequence of PCR with the amplified DNA fragment (PCR product) in DNA sequencer, it is possible to make the identification of bacterial species in a short time from the collection of the fluid. さらに、菌種に特異的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用すれば、菌種の同定を同時に行なうことも可能である。 Furthermore, using the oligonucleotide of specific sequence hybridize to the species as a primer, it is also possible to carry out the identification of bacterial species simultaneously.
【0167】 [0167]
【配列表フリーテキスト】 Sequence Listing Free Text
配列番号1:真菌の18SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番号2:真菌の18SリボソームRNA遺伝子の検出用リバースプライマー配列番号3:真菌の18SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番号4:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番号5:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用リバースプライマー配列番号6:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用リバースプライマー配列番号7:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番号8:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番号9:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用フォワードプライマー配列番 SEQ ID NO: 1: detecting forward primer SEQ ID NO: 2 of the 18S ribosomal RNA gene of the fungus: detecting reverse primer SEQ ID NO: 3 of the 18S ribosomal RNA gene of the fungus: forward primer SEQ ID NO: 4 for the detection of 18S ribosomal RNA gene of fungi: bacteria the 16S ribosomal RNA gene of the detection forward primer SEQ ID NO: 5: bacterial 16S ribosomal RNA gene of the detection reverse primers SEQ ID NO: 6: bacterial 16S ribosomal RNA gene of the detection reverse primers SEQ ID NO: 7: bacterial 16S ribosomal RNA gene of the detection forward primer SEQ ID NO: 8: bacterial 16S ribosomal RNA gene of the detection forward primer SEQ ID NO: 9: detecting a forward primer sequence numbered 16S ribosomal RNA gene of bacteria 10:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用リバースプライマー配列番号11:細菌の16SリボソームRNA遺伝子の検出用リバースプライマー【0168】 10: bacterial 16S ribosomal RNA gene of detection for the reverse primer SEQ ID NO: 11: detection for reverse primer [0168] of the 16S ribosomal RNA gene of bacteria
【配列表】 [Sequence Listing]

Claims (12)

  1. 微生物の検出方法であって、 There is provided a method of detecting a microorganism,
    (1)濾過膜を用いて流体を濾過する工程、 (1) a step of filtering a fluid with a filtration membrane,
    (2)濾過膜を液体培地に浸漬し、該濾過膜に捕捉された微生物を培養する工程、 (2) a filtration membrane was immersed in a liquid medium, a microorganism that is trapped in the filtration membrane process,
    (3)培養物を濃縮する工程、 (3) a step of concentrating the culture,
    (4)濃縮培養物から微生物のDNAを抽出する工程、 (4) extracting the DNA of microorganisms from the concentrated culture,
    (5)抽出したDNAを鋳型としてPCRを実施する工程、および(6)得られたPCR産物を検出する工程を含む微生物の検出方法。 (5) step of the extracted DNA to PCR performed as a template, and (6) method for detecting a microorganism comprising the step of detecting a resultant PCR product.
  2. 前記工程(1)ののち、得られた濾過膜をリンスする工程を含む請求項1記載の方法。 After the step (1), The method of claim 1 further comprising the step of rinsing the resulting filtration membrane.
  3. 前記工程(2)における培養時間が、5時間から24時間である請求項1または2記載の方法。 The incubation time in step (2) is, according to claim 1 or 2 wherein from 5 hours is 24 hours.
  4. 前記微生物が真菌または細菌である請求項1、2または3記載の方法。 Claim 1, 2 or 3 the method described wherein the microorganism is a fungus or bacterium.
  5. 前記濾過膜の孔径が0.2〜0.45μmである請求項1、2、3または4記載の方法。 The method of claim 1, 2, 3 or 4, wherein the pore size of the filtration membrane is 0.2~0.45Myuemu.
  6. 前記工程(5)におけるPCRが、それぞれ配列番号1および配列番号2に示される塩基配列からなる2種類のプライマーを用いて実施される請求項1、2、3、4または5記載の方法。 The PCR in step (5) according to claim 1, 2, 3, 4 or 5 method described is carried out using two types of primers consisting of the nucleotide sequence, respectively shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  7. 前記工程(5)におけるPCRが、それぞれ配列番号4および配列番号5に示される塩基配列からなる2種類のプライマー、またはそれぞれ配列番号4および配列番号6に示される塩基配列からなる2種類のプライマーを用いて実施される請求項1、2、3、4または5記載の方法。 PCR in the step (5), the two primers or two primers having the nucleotide sequence of each shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 claim 1, 2, 3, 4 or 5 method described is carried out with.
  8. 前記工程(6)における検出が、アガロースゲルを用いる電気泳動またはハイブリダイゼーションアッセイにより実施される請求項1、2、3、4、5、6または7記載の方法。 The detection in step (6), according to claim 1,2,3,4,5,6 or 7 The method described is carried out by electrophoresis or hybridization assays using agarose gel.
  9. 前記流体が気体または液体である請求項1、2、3、4、5、6、7または8記載の方法。 Claim 7 or 8 method wherein the fluid is a gas or liquid.
  10. 前記液体が組織もしくは組織等価物の浸漬液、臓器の浸漬液または血液である請求項9記載の方法。 Immersion liquid method of claim 9, wherein the immersion fluid or blood organs of the liquid tissue or tissue equivalent.
  11. 前記組織等価物が培養皮膚または培養角膜である請求項10記載の方法。 The method of claim 10, wherein the tissue equivalent is cultured skin or cultured cornea.
  12. 前記培養皮膚が培養表皮、培養真皮または複合培養皮膚である請求項11記載の方法。 The cultured skin is cultured epidermal method of claim 11 wherein the culture dermis or composite cultured skin.
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