【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて、ヒトのＣ型肝炎の病態に極めて類似した、慢性肝炎、肝硬変、肝癌を誘発する病態モデル作製法とこれを用いた、ヒトＣ型肝炎、肝硬変および、肝癌の治療剤の開発、および治療方法確立のためのスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＣＶは持続感染して慢性肝炎から肝硬変を発症し、長期間を経て肝癌にいたることが知られている。ＨＣＶ感染の治療としてインターフェロンが使われているが、その効果は部分的であり、新たな治療法の開発が望まれている。しかし、ＨＣＶ感染症の良い実験動物モデルが無いために、発癌機構の解析と新たな治療剤および、治療法の開発の妨げとなっている。
【０００３】
ＨＣＶ感染症においてウイルス感染と慢性炎症の両者が肝発癌に深く関与していると考えられており、ＨＣＶ遺伝子産物を過剰発現させたトランスジェニックマウスが数種類作製された。しかしながら、ヒトの病態とは異なり、慢性肝炎、肝硬変といった病態を呈することがなかった（Ｔ Ｋａｗａｍｕｒａら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５ １０１４ １９９７、Ｋ Ｍｏｒｉｙａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ ４ １０６５ １９９８、Ｃ Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら Ｈｅｐａｔｏｌｇｙ ２５ ７１９１９９７など）。また、発癌に関しては起こらないか、発癌したとしてもかなりの低頻度であり（Ｋ Ｍｏｒｉｙａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ ４ １０６５ １９９８など）、また、用いた ＨＣＶ株の違いにより、トランスジェニック動物の病態に違いが認められた（例えば、Ｋ Ｍｏｒｉｙａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ ４ １０６５ １９９８ と Ｋ Ｍｏｒｉｙａら Ｎａｔ． Ｍｅｄ ４ １０６５ １９９８の比較）。従来技術では、Ｃ型肝炎由来の肝癌発症機序の解析および、肝癌治療剤の開発および、治療法確立のためのスクリーニングは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＨＣＶに起因する肝炎、発癌を極めてヒトの病態に類似した状態で再現する動物モデルおよび、Ｃ型肝炎および、肝癌の治療剤の開発および、治療方法確立のためのスクリーニング方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従来技術の問題点を解決すべく、本発明者らは、今まで動物に導入されたことのない ＨＣＶ ＴＨ株由来遺伝子（Ｗａｋｉｔａら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６５ １４２０５ １９９４）を用いたが、従来と同様に肝炎、肝硬変、肝癌などの発症は認められなかった。ＨＣＶ感染症においてウイルス感染と慢性炎症の両者が肝発癌に深く関与していると考えられている。したがって、ＨＣＶ遺伝子由来のタンパク質が胎児期から存在するため、免疫寛容が成立して肝炎が発症せず、癌化も起こらなかったものと考えられる。そこで、肝炎を慢性的に誘発することにより、肝癌を発症させることができる可能性を考えて検討を行った。こうすることにより、先に述べた、 ＨＣＶ遺伝子の存在と慢性肝炎をモデル動物で共存させることでヒトの病態に即したモデル動物になりうることを見出した。
【０００６】
そこで本発明者らは、ＨＣＶ感染と慢性肝障害による高頻度肝臓腫瘍発生動物モデルを作製し、Ｃ型肝炎および、肝癌の治療剤開発および、治療方法確立のためのスクリーニング系として有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、ＨＣＶのウイルスゲノム遺伝子由来のｃＤＮＡを組み込み、ＨＣＶのウイルスタンパク質を肝臓特異的に発現するトランスジェニック動物または、その子孫において、肝障害を誘発して慢性肝炎あるいは、肝硬変を誘発して、高頻度に肝癌を発症させることを特徴とするＣ型肝炎および、肝癌治療剤開発および、治療法確立のためのスクリーニング系を提供するものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） ＨＣＶ遺伝子の全部または一部を動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該遺伝子が発現された形質転換動物。
（２） ＨＣＶ遺伝子がＨＣＶ ＴＨ株である請求項１記載の形質転換動物。
（３） 動物の分化全能性を有する細胞がＥＳ細胞である（１）記載の形質転換動物。
（４） 動物の分化全能性を有する細胞が生殖系列の細胞である（１）記載の形質転換動物。
（５） 生殖系列の細胞が、受精卵である（４）記載の形質転換動物。
（６） ＨＣＶ ＴＨ株遺伝子の全部または一部が、組織特異発現をする発現プロモーター配列の制御下に導入されたものであることを特徴とする（１）記載の形質転換動物。
（７） 組織特異的発現をするプロモーター配列が、肝臓特異的に発現するプロモーターであること特徴とする（６）記載の形質転換動物。
（８） 組織特異的発現をするプロモーター配列が、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーター配列であること特徴とする（６）記載の形質転換動物。
（９） ＨＣＶ株遺伝子の全部または一部が、ＨＣＶ ＴＨ株のコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（６）から（８）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１０） 形質転換動物が齧歯類動物であることを特徴とする（１）から（９）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１１） 齧歯類動物がマウスであることを特徴とする（１０）記載の形質転換動物。
（１２） 慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を施した（１）から（１１）のいずれかに記載の形質転換動物。
（１３） 慢性肝炎、肝硬変または肝癌を誘発する処置を薬物投与、外科的手術若しくは免疫学的手法により行なうことを特徴とする（１２）記載の形質転換動物。
（１４） 薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする（１３）記載の形質転換動物。
（１５） （１０）乃至（１４）のいずれかに記載の形質転換動物を用いたヒトＣ型肝炎、肝硬変、および、肝癌の治療剤の開発および、治療方法確立のためのスクリーニング方法。
（１６） ＨＣＶ遺伝子の全部または一部を肝臓特異的に発現するプロモーターの制御下に、動物の分化全能性を有する細胞に導入し、該細胞を仮親中で個体発生させることを含む形質転換動物の作出方法。
（１７） 肝臓特異的発現をするプロモーターが、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーターであること特徴とする（１６）記載の形質転換動物の作出方法。
（１８） ＨＣＶ遺伝子の全部または一部が、ＨＣＶのコアタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１６）記載の形質転換動物の作出方法。
（１９） （１）から（１１）のいずれかのに記載の形質転換動物に、薬物投与、外科的手術または免疫学的手法を用いて慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発させることを特徴とする病態モデル動物の作出方法。
（２０） 薬物が慢性肝炎、肝硬変あるいは肝癌を誘発するものである、（１９）記載の病態モデル動物の作出方法。
（２１） 薬物が四塩化炭素、ジエチルニトロサミン、ジメチルニトロサミン、コンカナバリンＡ、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｕｎｅｓ）、抗Ｆａｓ抗体であることを特徴とする（２０）記載の病態モデル動物の作出方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明のモデル動物の作出
次に本発明のモデル動物の作出方法について説明する。組織特異的に発現するプロモーターの下流にＨＣＶ遺伝子の全部または一部を導入して発現ベクターを作製する。ＨＣＶ由来遺伝子としては、ＨＣＶ ＴＨ株遺伝子が例示されるがこれに限定されない。動物に導入されたときに該動物がＣ型慢性肝炎、肝硬変または肝癌病態を呈する遺伝子ならばいずれの遺伝子でもよい。組織特異的に発現するプロモーターとしては、肝臓特異的に発現するプロモーターが望ましいが、これには限定されない。肝臓特異的に発現するプロモーターとして例えば、ヒト血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）遺伝子プロモーター（Ｚｈａｏ Ｘ．ら Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１１ ７３６ １９９２）が挙げられる。このようにして、前記プロモーターとＨＣＶ遺伝子を導入して作製した発現ベクターを、分化全能性を有する細胞に導入し、導入後仮親に移植する。分化全能性を有する細胞としては、受精卵、初期胚の他、多分化能を有するＥＳ細胞等の培養細胞が挙げられる。また、導入する対象とする動物の種類は、トランスジェニック動物の作出技術が確立されている動物で有れば特に制限されない。好ましくはマウス、ラット、ハムスターなどの齧歯類であり、それらの中でも特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが好ましいが、技術的には全ての動物種を対象とすることが可能である。実施例ではマウスを用いているが、これに限定されることなく、ラット、ウサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどでもよい。例えばＰｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４， １９８０の方法等に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞および生殖細胞染色体中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって本発明のモデル動物を作出することができる。個体へと発生させる全能性細胞は、目的のタンパク質の発現の程度が好ましい全能性細胞を選択しておくことが望ましい。
【００１０】
導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）として、交配によりＨＣＶ遺伝子を染色体の一部に安定的に発現可能に組み込んだトランスジェニック動物を効率よく作出することができる。そして、トランスジェニック動物は病態モデル動物として使用することができる
作出したトランスジェニック動物の肝臓に炎症および障害を発生させることにより、このトランスジェニック動物の肝臓に慢性肝炎、肝硬変、腫瘍を発生させる。炎症および、肝障害をおこす方法は、薬物を用いる方法、外科手術的手法を用いた方法、免疫学的手法を用いた方法があるが、これに限定されない。
【００１１】
薬物を用いる方法としては、四塩化炭素０．３−２ ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、ジエチルニトロサミン１−２０ ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、ジメチルニトロサミン１−２０ ｍｇ／ｍｌを定期的に経口あるいは、腹腔内投与、コンカナバリンＡ ０．１ｍｇ／ｂｏｄｙを定期的に静脈投与、リポポリサッカロイド、プロピオニバクター アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｕｎｅｓ） １−１０ｍｇ／ｂｏｄｙを静脈投与して７日後にリポポリサッカロイド１−１０μｇ／ｂｏｄｙを静脈投与することを定期的に行なうことＤ−ガラクトミン１−１０ｍｇ／ｂｏｄｙを静脈投与して数日後にリポポリサッカロイド１０−３０μｇ／ｋｇを静脈内あるいは腹腔内投与することを定期的に行なうこと、抗Ｆａｓ抗体（クローンＪｏ２）などを１−５０ｍｇ／ｂｏｄｙでなどを静脈内あるいは腹腔内投与するなどがあるが、これに限定されない。
外科手術的手法を用いる方法としては、肝切除などがあるが、これに限定されない。
免疫学的手法を用いる方法としては、養子免疫、抗原を用いた免疫、ＤＮＡを
用いた免疫方法などがあるが、これに限定されない。
【００１２】
２．本発明の病態モデル動物の使用
本発明の病態モデル動物を、Ｃ型肝炎、肝硬変および肝癌の治療剤のスクリーニング又は治療法の開発のために用いることができる。
本発明の病態モデル動物に被験物質を投与し、Ｃ型肝炎、肝硬変および肝癌が治癒するかあるいは退行するかを指標に被験物質が治療剤として使用し得るかどうか判断できる。また、病態モデル動物中のＨＣＶ関連遺伝子の発現量を測定し、被験物質を投与しない場合のＨＣＶ関連遺伝子の発現量と比較することにより、ＨＣＶ関連遺伝子の発現量を減少させる物質、すなわちＨＣＶに関連する疾患の治療剤をスクリーニングすることが可能である。
【００１３】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
〔実施例１〕
（１） トランスジェニックマウスの作製
発現ベクターの構築のため、ＳＡＰプロモーターの下流にＨＣＶ ＴＨ株のコア領域遺伝子ｃＤＮＡの５７３塩基対長を挿入した（図１）。ＨＣＶ ＴＨ株のコア領域遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を図２に示す（それぞれ、配列番号１および配列番号２）。この発現ベクターを精製してマウスの受精卵にマイクロインジェクションした。生まれたマウスの体細胞遺伝子への、トランスジーンの組み込みを以下の方法でスクリーニングした。マウスの耳介切片をプロテネースＫ溶液中で５５度１時間加熱した。得られたＤＮＡ溶液をＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは２９４Ｓ−２０（５’−ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号３）と６０４Ｒ−１８（５’−ＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡ−３’）（配列番号４）である。得られたＰＣＲ産物を電気泳動して、目的の大きさ（３１１ｂｐ）のＤＮＡの有無によりトランスジーンの組み込みを判定した。３匹の陽性マウスを同定した。この３匹をＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４と命名した。
【００１４】
（２） 組み込み遺伝子の確認
組み込まれたＨＣＶ遺伝子をさらに詳しく確認するためにサザンブロット解析をおこなった。ＰＣＲで陽性だった３種類のマウスの肝臓からゲノムＤＮＡを抽出し、アガロースゲルに電気泳動した。泳動終了後、ナイロン膜にＤＮＡを転写した。ＨＣＶ ｃＤＮＡをプローブに用いて、トランスジーンを検出した（図３）。ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４の組み込みコピー数を約１６、２５、８コピーと推定できた。ＰＣＲおよびサザンブロット解析により、ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４にはインジェクションしたトランスジーンが体細胞遺伝子に組み込まれていることが確認された。
【００１５】
（３） ＨＣＶタンパク質の発現の確認
発現ベクターの構築に用いたＳＡＰプロモーターは肝臓特異的に発現することが知られている。（ｒｅｆ）ＳＣ１１、ＳＣ１２、ＳＣ１４の肝臓のライセートを作製してアクリルアミドゲルに電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗コアモノクローナル抗体でコアタンパク質を検出した（図４）。トランスジェニックマウスの肝臓に目的の大きさのコアタンパク質の発現を確認した。さらに、マウスの各種臓器から同様にライセートを作製して、コアタンパク質はトランスジェニックマウスの肝臓特異的に発現していることを確認した。
【００１６】
（４） トランスジェニックマウスの自然経過での肝腫瘍発生
トランスジェニックマウスとコントロールマウスを１８ヶ月から２４ヶ月齢まで飼育して肝臓における腫瘍発生を観察した。表１に示すようにトランスジェニックマウスにおいてわずかに腫瘍が発生した。
【００１７】
【表１】
【００１８】
（５） 四塩化炭素による肝炎の誘発
１０％または２０％の四塩化炭素溶液を１ ｍｌ／ｋｇの量でトランスジェニックマウスおよびコントロールマウスに週１回または２回投与して誘導される肝炎の程度を観察した。繰り返し投与に対して肝炎を繰り返して発生した。血清中のＡＬＴ値を測定した。図５に示すようにトランスジェニックマウスとコントロールマウスで肝炎の程度に差は見られなかった。
【００１９】
（６） 四塩化炭素による肝炎によるトランスジェニックマウスの肝腫瘍発生
図６に示すスケジュールにしたがって、当初４週間週２回２０％四塩化炭素を投与し、その後３６週間にわたる週１回の投与の後にマウスを開腹して腫瘍の発生を観察した。表２に示すように投与開始後３２週では腫瘍は認めなかった。投与開始後４０週でトランスジェニックマウス９匹中５匹に腫瘍が発生した（図７）。またコントロールマウス５匹では腫瘍発生は認められなかった。
【００２０】
【表２】
【００２１】
【発明の効果】
本発明において、ＨＣＶトランスジェニックマウスに繰り返し肝炎を誘導することにより高頻度に肝臓に腫瘍を発生させる病態モデルを作製できた。したがって、この病態モデルは、Ｃ型肝炎および、Ｃ型由来肝癌治療剤開発および、治療法確立のためのスクリーニング法として有用である。
【００２２】
【配列表】
【００２３】
【配列表フリーテキスト】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトのＳＡＰプロモーターとＨＣＶコア領域遺伝子を連結させた導入用遺伝子断片を示した図である。
【図２】導入したＨＣＶコア領域遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示した図である。
【図３】トランスジェニックマウスの耳介切片から抽出したＤＮＡのサザンブロットの結果を示す写真である。
【図４】トランスジェニックマウスの肝臓から抽出したタンパク質と抗ＨＣＶコア抗体とのウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図５】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を投与した時の、マウス血中トランスアミラーゼの変動を示す図である。
【図６】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を長期投与した時のスケジュールを示す図である。
【図７】トランスジェニックマウスに四塩化炭素を長期投与終了後の肝臓組織の病理写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention uses a transgenic animal into which a hepatitis C virus (HCV) gene has been introduced, and provides a method for producing a pathological model that induces chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma, which is very similar to the pathology of human hepatitis C. The development of a therapeutic agent for human hepatitis C, cirrhosis and liver cancer, and a screening method for establishing a therapeutic method.
[0002]
[Prior art]
It is known that HCV is persistently infected, develops cirrhosis from chronic hepatitis, and leads to liver cancer over a long period of time. Interferon has been used as a treatment for HCV infection, but its effect is partial, and development of a new treatment is desired. However, the lack of a good experimental animal model for HCV infection has hindered the analysis of the carcinogenesis mechanism and the development of new therapeutic agents and therapies.
[0003]
In HCV infection, both viral infection and chronic inflammation are thought to be deeply involved in hepatocarcinogenesis, and several transgenic mice overexpressing HCV gene products have been produced. However, unlike human pathologies, they did not exhibit pathologies such as chronic hepatitis and cirrhosis (T Kawamura et al. Hepatology 25 1014 1997, K Moriya et al. Nat. Med 4 1065 1998, C Pasquinelli et al. Hepatology 1925). In addition, carcinogenesis does not occur, or if carcinogenesis occurs, the frequency is quite low (K Moriya et al., Nat. Med 4 1065 1998, etc.), and the pathology of transgenic animals differs depending on the HCV strain used. (Eg, a comparison of K Moriya et al. Nat. Med 4 1065 1998 with K Moriya et al. Nat. Med 4 1065 1998). In the prior art, it was difficult to analyze the pathogenesis of hepatitis C-derived liver cancer, to develop a therapeutic agent for liver cancer, and to screen for the establishment of a therapeutic method.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to develop an animal model that reproduces HCV-induced hepatitis and carcinogenesis in a state very similar to human pathology, and a therapeutic agent for hepatitis C and liver cancer, and to establish a therapeutic method. It is to provide a screening method.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the problems of the prior art, the present inventors used a HCV TH strain-derived gene (Wakita et al., J Biol Chem. 265 14205 1994), which has never been introduced into animals. No onset of hepatitis, cirrhosis or liver cancer was observed. It is believed that both viral infection and chronic inflammation are deeply involved in hepatocarcinogenesis in HCV infection. Therefore, it is considered that since the protein derived from the HCV gene is present from the fetal stage, immune tolerance was established, hepatitis did not develop, and canceration did not occur. Therefore, the present inventors examined the possibility that hepatitis could be developed by chronically inducing hepatitis. By doing so, it has been found that the coexistence of the HCV gene and chronic hepatitis in a model animal as described above can result in a model animal suited to human pathology.
[0006]
Therefore, the present inventors have prepared an animal model for the occurrence of high-frequency liver tumors due to HCV infection and chronic liver damage, and are useful as a screening system for the development of therapeutic agents for hepatitis C and liver cancer and the establishment of therapeutic methods. And completed the present invention.
[0007]
That is, in a transgenic animal or its progeny that incorporates a cDNA derived from the HCV viral genomic gene and specifically expresses the HCV viral protein in the liver, chronic hepatitis or cirrhosis is induced by inducing liver injury in a transgenic animal or a progeny thereof. It is intended to provide a screening system for developing a therapeutic agent for hepatitis C and liver cancer characterized by causing liver cancer frequently, and establishing a therapeutic method.
[0008]
That is, the present invention is as follows.
(1) A transformed animal in which all or part of the HCV gene has been introduced into cells having totipotency of the animal, and the gene has been expressed.
(2) The transgenic animal according to claim 1, wherein the HCV gene is an HCV TH strain.
(3) The transformed animal according to (1), wherein the cells having totipotency of the animal are ES cells.
(4) The transgenic animal according to (1), wherein the cells having totipotency of the animal are germline cells.
(5) The transformed animal according to (4), wherein the germline cells are fertilized eggs.
(6) The transgenic animal according to (1), wherein the whole or a part of the HCV TH strain gene is introduced under the control of an expression promoter sequence for tissue-specific expression.
(7) The transgenic animal according to (6), wherein the promoter sequence for tissue-specific expression is a promoter for liver-specific expression.
(8) The transgenic animal according to (6), wherein the promoter sequence for tissue-specific expression is a human serum amyloid P component (SAP) gene promoter sequence.
(9) The transgenic animal according to any one of (6) to (8), wherein all or part of the HCV strain gene is a gene encoding a core protein of the HCV TH strain.
(10) The transgenic animal according to any one of (1) to (9), wherein the transgenic animal is a rodent.
(11) The transgenic animal according to (10), wherein the rodent is a mouse.
(12) The transgenic animal according to any one of (1) to (11), which has been treated to induce chronic hepatitis, cirrhosis or liver cancer.
(13) The transgenic animal according to (12), wherein the treatment for inducing chronic hepatitis, cirrhosis or liver cancer is performed by drug administration, surgical operation or immunological technique.
(14) The transgenic animal according to (13), wherein the drug is carbon tetrachloride, diethylnitrosamine, dimethylnitrosamine, concanavalin A, lipopolysaccharide, propionibacterium acune, or anti-Fas antibody. .
(15) A screening method for developing a therapeutic agent for human hepatitis C, cirrhosis, and liver cancer using the transgenic animal according to any of (10) to (14) and establishing a therapeutic method.
(16) A transgenic animal comprising introducing into a cell having totipotency of an animal under the control of a promoter that specifically or entirely expresses the HCV gene in the liver, and causing the cell to undergo ontogenesis in a foster parent. How to create.
(17) The method for producing a transgenic animal according to (16), wherein the promoter that causes liver-specific expression is a human serum amyloid P component (SAP) gene promoter.
(18) The method for producing a transformed animal according to (16), wherein all or a part of the HCV gene is a gene encoding a core protein of HCV.
(19) A transgenic animal according to any one of (1) to (11), wherein chronic hepatitis, cirrhosis or liver cancer is induced by drug administration, surgical operation or immunological technique. How to create a disease model animal.
(20) The method according to (19), wherein the drug induces chronic hepatitis, cirrhosis or liver cancer.
(21) The disease model animal according to (20), wherein the drug is carbon tetrachloride, diethylnitrosamine, dimethylnitrosamine, concanavalin A, lipopolysaccharide, propionibacterium acunes, or anti-Fas antibody. How to create.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Production of Model Animal of the Present Invention Next, the method of producing the model animal of the present invention will be described. An expression vector is prepared by introducing the whole or a part of the HCV gene downstream of a tissue-specific promoter. Examples of HCV-derived genes include, but are not limited to, HCV TH strain genes. Any gene may be used so long as the animal exhibits a chronic hepatitis C, cirrhosis or liver cancer condition when introduced into the animal. A promoter that is expressed in a tissue-specific manner is preferably a promoter that is expressed in a liver-specific manner, but is not limited thereto. Examples of the liver-specific promoter include a human serum amyloid P component (SAP) gene promoter (Zhao X. et al., J. Biochem. (Tokyo) 111 736 1992). In this way, the expression vector prepared by introducing the promoter and the HCV gene is introduced into cells having totipotency and transplanted into a foster parent after the introduction. Examples of cells having totipotency include fertilized eggs, early embryos, and cultured cells such as pluripotent ES cells. The type of animal to be introduced is not particularly limited as long as it is an animal for which transgenic animal production technology has been established. Preferred are rodents such as mice, rats, and hamsters. Among them, mice in which a large number of inbred strains have been created, and in which fertilized egg culture, in vitro fertilization, and other techniques are preferred, mice are preferred. It is possible to target all animal species. Although a mouse is used in the embodiment, the present invention is not limited to this, and a rat, rabbit, pig, medaka, zebrafish, or the like may be used. For example, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980, etc., to introduce the transgene into mammalian totipotent cells, develop the cells into individuals, and integrate the transgene into somatic cells and germ cell chromosomes. The model animal of the present invention can be produced by selecting individuals. As totipotent cells to be generated in an individual, it is desirable to select totipotent cells having a preferable degree of expression of a target protein.
[0010]
Transgenic animals in which the HCV gene has been stably integrated into a portion of the chromosome by crossing can be efficiently produced by using the individual in which the presence of the introduced gene is confirmed as the first generation (Founder). The transgenic animal produces chronic hepatitis, cirrhosis, and tumor in the liver of the transgenic animal by causing inflammation and damage in the liver of the created transgenic animal that can be used as a disease model animal. Methods for causing inflammation and liver damage include, but are not limited to, a method using a drug, a method using a surgical technique, and a method using an immunological technique.
[0011]
As a method using a drug, carbon tetrachloride 0.3-2 mg / ml is orally or intraperitoneally administered, diethylnitrosamine 1-20 mg / ml is orally or intraperitoneally administered, dimethylnitrosamine Oral or intraperitoneal administration of 1-20 mg / ml periodically, intravenous administration of concanavalin A 0.1 mg / body periodically, lipopolysaccharide, Propionibacterium acnes (Propionibacterium acnes) 1-10 mg / body. Seven days after intravenous administration, lipopolysaccharide 1-10 μg / body is periodically administered intravenously D-galactamine 1-10 mg / body Ten days after intravenous administration, lipopolysaccharide 10-30 μg / Kg administered intravenously or intraperitoneally on a regular basis Nau it, and the like anti-Fas antibody (clone Jo2) at 1-50 mg / body, but there is such administered intravenously or intraperitoneally, but are not limited thereto.
Methods using surgical techniques include, but are not limited to, hepatectomy.
Examples of the method using an immunological technique include, but are not limited to, adoptive immunization, immunization using an antigen, and immunization using DNA.
[0012]
2. Use of the pathological model animal of the present invention The pathological model animal of the present invention can be used for screening a therapeutic agent for hepatitis C, cirrhosis and liver cancer or for developing a therapeutic method.
The test substance is administered to the pathological model animal of the present invention, and it can be determined whether the test substance can be used as a therapeutic agent based on whether hepatitis C, cirrhosis and liver cancer are cured or regressed. Further, by measuring the expression level of the HCV-related gene in the disease state model animal and comparing it with the expression level of the HCV-related gene when the test substance is not administered, a substance that reduces the expression level of the HCV-related gene, that is, HCV It is possible to screen for therapeutic agents for related diseases.
[0013]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples.
[Example 1]
(1) Preparation of Transgenic Mouse To construct an expression vector, 573 base pairs of the core gene cDNA of HCV TH strain was inserted downstream of the SAP promoter (FIG. 1). The nucleotide sequence and the predicted amino acid sequence of the cDNA of the core region gene of the HCV TH strain are shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively). This expression vector was purified and microinjected into mouse fertilized eggs. The transgene was incorporated into the somatic genes of the born mice by the following method. Mouse pinna sections were heated in a Proteinase K solution at 55 ° C. for 1 hour. The obtained DNA solution was used for a PCR reaction. The primers used for the PCR reaction are 294S-20 (5'-TGATAGGGTGCTGCGAGTG-3 ') (SEQ ID NO: 3) and 604R-18 (5'-TTGCCATAGAGGGCCAA-3') (SEQ ID NO: 4). The resulting PCR product was subjected to electrophoresis, and the incorporation of the transgene was determined based on the presence or absence of the target size (311 bp) DNA. Three positive mice were identified. These three animals were named SC11, SC12 and SC14.
[0014]
(2) Confirmation of integrated gene Southern blot analysis was performed to confirm the integrated HCV gene in more detail. Genomic DNA was extracted from the livers of three types of mice that were positive by PCR, and electrophoresed on an agarose gel. After the electrophoresis, the DNA was transferred to a nylon membrane. The transgene was detected using HCV cDNA as a probe (FIG. 3). The number of incorporated copies of SC11, SC12 and SC14 was estimated to be about 16, 25 and 8 copies. PCR and Southern blot analysis confirmed that the injected transgene was incorporated into somatic cell genes in SC11, SC12, and SC14.
[0015]
(3) Confirmation of HCV protein expression It is known that the SAP promoter used in the construction of the expression vector is specifically expressed in the liver. (Ref) SC11, SC12, and SC14 liver lysates were prepared, electrophoresed on an acrylamide gel, transferred to a PVDF membrane, and core proteins were detected with an anti-core monoclonal antibody (FIG. 4). Expression of the core protein of the desired size was confirmed in the liver of the transgenic mouse. Furthermore, lysates were similarly prepared from various mouse organs, and it was confirmed that the core protein was specifically expressed in the liver of the transgenic mouse.
[0016]
(4) Liver Tumor Development in the Natural History of Transgenic Mice Transgenic mice and control mice were bred from 18 to 24 months of age to observe tumor development in the liver. As shown in Table 1, the tumor slightly developed in the transgenic mouse.
[0017]
[Table 1]
[0018]
(5) Induction of hepatitis by carbon tetrachloride Extent of hepatitis induced by administration of a 10% or 20% carbon tetrachloride solution to transgenic mice and control mice at a volume of 1 ml / kg once or twice a week Was observed. Hepatitis occurred repeatedly with repeated administration. The ALT value in the serum was measured. As shown in FIG. 5, there was no difference in the degree of hepatitis between the transgenic mouse and the control mouse.
[0019]
(6) Liver tumor development in transgenic mice due to hepatitis due to carbon tetrachloride According to the schedule shown in FIG. 6, 20% carbon tetrachloride was initially administered twice a week for 4 weeks, and then once a week for 36 weeks. The mice were opened for observation of tumor development. As shown in Table 2, no tumor was observed 32 weeks after the start of administration. At 40 weeks after the start of administration, tumors occurred in 5 out of 9 transgenic mice (FIG. 7). No tumor was observed in 5 control mice.
[0020]
[Table 2]
[0021]
【The invention's effect】
In the present invention, a pathological model in which tumors are frequently generated in the liver by repeatedly inducing hepatitis in HCV transgenic mice was produced. Therefore, this pathological model is useful as a screening method for developing therapeutic agents for hepatitis C and hepatitis C-derived liver cancer and establishing therapeutic methods.
[0022]
[Sequence list]
[0023]
[Sequence List Free Text]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a gene fragment for introduction in which a human SAP promoter and a HCV core region gene are linked.
FIG. 2 is a diagram showing a DNA sequence and an amino acid sequence of an introduced HCV core region gene.
FIG. 3 is a photograph showing the results of a Southern blot of DNA extracted from auricular sections of transgenic mice.
FIG. 4 is a photograph showing the results of Western blot of a protein extracted from the liver of a transgenic mouse and an anti-HCV core antibody.
FIG. 5 is a graph showing changes in mouse blood transamylase when carbon tetrachloride was administered to transgenic mice.
FIG. 6 is a diagram showing a schedule when long-term administration of carbon tetrachloride to transgenic mice.
FIG. 7 is a pathological photograph of liver tissue after long-term administration of carbon tetrachloride to transgenic mice.
