JP2004000082A

JP2004000082A - Process for preparing d-tagatose

Info

Publication number: JP2004000082A
Application number: JP2002160220A
Authority: JP
Inventors: Kazutoshi Yoshihara; 吉原　一年; Takahiro Hirotsu; 廣津　孝弘; Takeshi Ikumori; 何森　健
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2022-05-31
Also published as: JP3840538B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biological process for efficiently and inexpensively preparing highly pure D-tagatose. <P>SOLUTION: A microorganism belonging to Rhizopus spp. which converts D-psicose to D-tagatose but does not digest D-psicose is cultured in the presence of D-psicose. Then, D-tagatose is obtained from a culture broth. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いてＤ‐プシコースからＤ‐タガトースを効率よく製造するための新規な方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、自然界ではわずかしか生成されない希少糖類、例えばＤ‐プシコース、Ｄ‐タガトース、Ｄ‐アロース、Ｄ‐タリトール、Ｄ‐アリトールなどが機能性素材又は天然活性物質として注目を浴びるようになってきている。そして、これらのうち、Ｄ‐プシコースやＤ‐タガトースなどの一部のものは、化学的に合成され［「カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．）」，第７０巻，第２０９ページ（１９７９）］、市販されている。
しかしながら、これまで知られている化学的な合成法は煩雑であり、非常に生産効率が低く、しかも高純度の製品を得ることが困難なため、大量生産には不適当でコスト高になるのを免れない。
【０００３】
他方、化学的な合成法に代る製造方法として、バイオテクノロジーを利用する方法、例えば、Ｄ‐タガトース‐３‐エピメラーゼを固定化したバイオリアクターを用い、Ｄ‐フルクトースを原料としてＤ‐プシコースを製造する方法が提案され［「ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．）」，第９０巻，第４５３ページ（２０００）］実用化段階に入っている。このようなバイオテクノロジーを利用した生物学的な方法は、酵素特有の高い基質特異性により高純度の目的物を得ることができるので有利であり、種々の希少糖類の製造にも応用されている。
【０００４】
ところで、これまでＤ‐タガトースの生物学的な方法については、例えばアースロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌体を用いる方法［「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，第４８巻，第１０５５ページ（１９８４）］や、酢酸菌の菌体を用いる方法［「プロセスバイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，第３６巻、第９７１ページ（２００１）］、これらの微生物が生産する酵素すなわちＬ‐アラビノースイソメラーゼを固定化したバイオリアクターを用いる方法［「バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，第２３巻，第１８５ページ（２００１）及び「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，第４６巻，第１０５５ページ（１９８４）］などが提案されているが、まだ十分満足できる生産効率で得ることはできなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、高純度のＤ‐タガトースを効率よく安価に製造しうる生物的な方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｄ‐タガトースを得るための生物学的な方法について種々研究を重ねた結果、リゾプス属に属する微生物の中に、Ｄ‐プシコースを消化することなく、これをＤ‐タガトースに効率よく転換する微生物が存在すること、及びこれをＤ‐プシコースの存在下で培養すれば高純度のＤ‐タガトースが生産されることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｄ‐プシコースをＤ‐タガトースに転化する能力を有し、かつＤ‐プシコースを消化しないリゾプス属に属する微生物を、Ｄ‐プシコースの存在下において培養したのち、培養液中よりＤ‐タガトースを収得することを特徴とするＤ‐タガトースの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法において用いる、Ｄ‐プシコースをＤ‐タガトースに転化する能力を有し、かつＤ‐プシコースを消化しないリゾプス属に属する微生物は、接合菌類接合菌亜門（Ｚｙｇｏｍｉｃｏｔｉｎａ）、ケカビ目クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属するもので、例えばリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アセトイヌス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｃｅｔｏｉｎｕｓ）、リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）などがある。
本発明方法においては、これらの菌株のみでなく、その変異株も用いることができる。
【０００９】
本発明方法においては、まずリゾプス属微生物の胞子を発芽可能な炭素源例えばＤ‐グルコース、窒素源、無機塩などを含有する培地を用いて培養する。この培地としては、微酸性ないし中性の液体培地を用いるのが好ましい。そして、２０〜３５℃において、１〜２日間通気撹拌などの好気的条件下で培養し、胞子を発芽させ菌体としたのちＤ‐プシコースを無菌的に培養系に添加する。Ｄ‐プシコースの添加濃度は５〜１２ｇ／リットルにするのが好ましい。このようにして、Ｄ‐プシコースの追加後に培養をさらに２〜１３日間継続することによって添加されたＤ‐プシコースが効率的にＤ‐タガトースに転化される。
【００１０】
本発明方法においては、また糸状菌の培養に使用される一般的な培地で培養した菌体そのものを用いて行うこともできる。例えば、麦芽エキス培地あるいはポテトデキストロース培地などで２０〜３５℃にて３〜７日間培養して得られた菌体に、ｐＨ４〜７のリン酸緩衝液又は酢酸緩衝液などに溶解したＤ‐プシコース溶液を添加して２０〜３５℃で１〜５日間撹拌インキュベートすることによってＤ‐タガトースを得ることができる。この際のＤ‐プシコース溶液の濃度としては、８〜５０ｇ／リットルの範囲が好ましい。
【００１１】
このようにして得られたＤ‐タガトースは、例えば活性炭処理法による脱色、各種の陽イオン及び陰イオン交換樹脂による脱塩処理法などで精製し、濃縮してシラップとして収得することができる。所望ならば、これを種々のイオン交換体を用いる液体クロマトグラフィー、例えばダウケミカル社製の商品名ダウエックス５０Ｗ−Ｘ２などによるカラムクロマトグラフィー、日立製作所製の商品名ＧＬ−６１１カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーなどによりさらに精製したのち、濃縮、結晶化し高純度の製品とすることができる。
【００１２】
本発明方法によると、Ｄ‐タガトースは原料のＤ‐プシコースに対し約２５ｗ／ｗ％以上の高収率で得られるので、工業的製造法として好適であり、これにより医薬品工業あるいは食品工業をはじめとする各種産業における原料もしくは中間体としてＤ‐タガトースを大量かつ安価に供給することができる。
【００１３】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００１４】
実施例１
まず、グルコース２ｇ／リットル、硫酸アンモニウム２ｇ／リットル、リン酸二カリウム１ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．５ｇ／リットル、ＫＣｌ０．５ｇ／リットル、硫酸第二鉄１０ｍｇ／リットルよりなる培地を１Ｍ−ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整し、その５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この培地にリゾプス・オリザエＹＰＦ−６１Ａ株［アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）登録番号ＭＹＡ−２４８３］の胞子を１０^４／ｍｌになるよう接種し、３０℃で１日間培養した。そののち、発芽した菌体を含む培養系にＤ‐プシコースを１２ｇ／リットルになるよう無菌的に添加し、同一の条件下で培養を８日間継続した。
【００１５】
培養後、培養液から菌体をろ去し、ろ液を常法に従い活性炭で処理して脱色した。次いで陽イオン交換樹脂［三菱化学製、商品名「ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）」］及び陰イオン交換樹脂［オルガノ社製、商品名「アンバーライトＩＲＡ−４１１（ＣＯ_３型）」］で脱塩処理したのち、減圧濃縮を行い、Ｄ‐プシコース及び少量の無機イオンを不純物として含む糖濃度約２９．４質量％のシラップを得た。次に陽イオン交換樹脂［ダウケミカル社製、商品名「ダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｃａ型）」］を用い、一次交換水を溶出液としてカラムクロマトグラフィーを行い、Ｄ‐タガトースを分離、精製した。その溶出位置は、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースとは異なり、試薬Ｄ‐タガトースと同一の３７．１分であった。この溶出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースの溶出位置とは異なり、試薬Ｄ‐タガトースと同一の溶出位置２３．０分であった。この操作により３．０ｇ／リットルのＤ‐タガトースが得られた。
この際の高速液体クロマトグラフィー分析は、ＧＬ−Ｃ６１１カラム（日立製作所製）及び８８０Ｐｕ（日本分光社製）を用い、溶離液０．０１ｍＭ−ＮａＯＨ、温度６０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎの条件下、検出器（島津製作所製、商品名「ＲＩＤ−６Ａ」）で行った。
【００１６】
実施例２
グルコース３０ｇ／リットル、ポリペプトン５ｇ／リットル、酵母エキス２ｇ／リットル、リン酸二カリウム１ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．５ｇ／リットルよりなる培地を２Ｍ−ＨＣｌでｐＨ５．０に調整し、その１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。このものにリゾプス・アセトイヌスＨＵＴ１２１９株の胞子を一白金耳量接種し、３０℃で４日間培養した。次いで培養菌体をろ別して回収し、蒸留水で洗浄した。次に、Ｄ‐プシコースを１０ｇ／リットルになるように５０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液１００ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに分注し、これに培養菌体１ｇ（湿重量）を添加した。このものを、３０℃で４６時間振とうしつつインキュベートし反応させた。
【００１７】
反応終了後、菌体をろ去し、実施例１と同様に脱塩、精製を行いＤ‐タガトースを得た。このものを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−１０ＡＤ、カラム；島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｐ、溶出液；蒸留水，温度８０℃、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器；島津製作所製ＲＩＤ−１０Ａ）により分析したところ、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースの溶出位置とは異なる、試薬Ｄ‐タガトースと同一の１３．７分が得られた。この培養菌体によるＤ‐プシコースの転化反応により１．５ｇ／リットルのＤ‐タガトースが得られた。
【００１８】
以上の結果から明らかなように、Ｄ‐プシコースからの転換生成物を異なるカラムを使用した高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果は、標準物質としての試薬Ｄ‐タガトースの値とよく一致し、得られた製品は、Ｄ‐タガトースであることが確認された。
【００１９】
【発明の効果】
本発明方法によると、Ｄ‐プシコースを原料として、効率よく高純度のＤ‐タガトースを簡単に得ることができる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel method for efficiently producing D-tagatose from D-psicose using a microorganism.
[0002]
[Prior art]
In recent years, rare sugars that are only slightly produced in nature, such as D-psicose, D-tagatose, D-allose, D-talitol, and D-allitol, have been attracting attention as functional materials or natural active substances. . Among these, some of them, such as D-psicose and D-tagatose, are chemically synthesized [“Carbohydrate. Res.”, Vol. 70, 209 (1979) )], Commercially available.
However, the conventionally known chemical synthesis methods are complicated, have very low production efficiency, and it is difficult to obtain high-purity products, which makes them unsuitable for mass production and increases costs. I can not escape.
[0003]
On the other hand, as a production method instead of a chemical synthesis method, a method using biotechnology, for example, using a bioreactor in which D-tagatose-3-epimerase is immobilized, producing D-psicose using D-fructose as a raw material [Journal of Bioscience and Bioengineering (J. Biosci. Bioeng.)], Vol. 90, p. 453 (2000)] has entered the stage of practical use. Such a biological method using biotechnology is advantageous because a high-purity target product can be obtained due to the high substrate specificity specific to the enzyme, and is also applied to the production of various rare saccharides. .
[0004]
By the way, a biological method of D-tagatose has been described so far, for example, by a method using cells of Arthrobacter globiformis [“Applied Environmental Microbiology (Appl. Environ. Microbiol.)”. 48, p. 1055 (1984)], a method using acetic acid bacterium [“Process Biochem.”, Vol. 36, p. 971 (2001)], these microorganisms. Using a bioreactor immobilized with an enzyme produced by L. arabinose isomerase [Biotechnology Letters (Biotechnol. Lett.), Vol. 23, p. 185 (2001) And "Applied Environmental Microbiology (Appl. Environ. Microbiol.)", Vol. 46, p. 1055 (1984)], etc., but it is still not possible to obtain production efficiency that is sufficiently satisfactory. Did not.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances to provide a biological method capable of efficiently and inexpensively producing high-purity D-tagatose.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies on biological methods for obtaining D-tagatose, and as a result, in microorganisms belonging to the genus Rhizopus, D-tagatose was converted into D-tagatose without digesting it. The present inventors have found that there is a microorganism that can be efficiently converted, and that if this is cultured in the presence of D-psicose, high-purity D-tagatose is produced, and the present invention has been accomplished based on this finding.
[0007]
That is, the present invention has the ability to convert D-psicose to D-tagatose, and a microorganism belonging to the genus Rhizopus that does not digest D-psicose, is cultured in the presence of D-psicose, An object of the present invention is to provide a method for producing D-tagatose, which comprises obtaining D-tagatose.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Microorganisms belonging to the genus Rhizopus, which have the ability to convert D-psicose to D-tagatose and do not digest D-psicose, which are used in the method of the present invention, include zygomycetes, Zygomicotina, and Lactobacillus spp. It belongs to Rhizopus and includes, for example, Rhizopus oryzae, Rhizopus acetoinus, and Rhizopus oligosporus.
In the method of the present invention, not only these strains but also their mutants can be used.
[0009]
In the method of the present invention, spores of a microorganism of the genus Rhizopus are first cultured using a medium containing a germinable carbon source such as D-glucose, a nitrogen source, and an inorganic salt. As this medium, a slightly acidic to neutral liquid medium is preferably used. Then, the cells are cultured at 20 to 35 ° C. for 1 to 2 days under aerobic conditions such as aeration and agitation to germinate spores to form cells, and then D-psicose is aseptically added to the culture system. The concentration of D-psicose added is preferably 5 to 12 g / liter. In this way, the added D-psicose is efficiently converted to D-tagatose by continuing the culture for an additional 2 to 13 days after the addition of D-psicose.
[0010]
The method of the present invention can also be carried out using cells themselves cultured in a general medium used for culturing filamentous fungi. For example, D-psicose dissolved in a phosphate buffer or acetate buffer having a pH of 4 to 7 in a cell obtained by culturing at 20 to 35 ° C. for 3 to 7 days in a malt extract medium or a potato dextrose medium or the like. D-tagatose can be obtained by adding the solution and incubating at 20 to 35 ° C. with stirring for 1 to 5 days. At this time, the concentration of the D-psicose solution is preferably in the range of 8 to 50 g / liter.
[0011]
The D-tagatose thus obtained can be purified by, for example, decolorization by an activated carbon treatment, or desalination by various cation and anion exchange resins, and concentrated to obtain a syrup. If desired, this is subjected to liquid chromatography using various ion exchangers, for example, column chromatography using Dowex (trade name, Dowex 50W-X2, etc.), and high-speed chromatography equipped with a GL-611 column (trade name, manufactured by Hitachi, Ltd.). After further purification by liquid chromatography or the like, the product is concentrated and crystallized to obtain a high-purity product.
[0012]
According to the method of the present invention, D-tagatose can be obtained in a high yield of about 25% w / w or more based on D-psicose as a raw material, and thus is suitable as an industrial production method. D-tagatose can be supplied in large quantities at low cost as a raw material or intermediate in various industries.
[0013]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0014]
Example 1
First, a medium consisting of glucose 2 g / l, ammonium sulfate 2 g / l, dipotassium phosphate 1 g / l, magnesium sulfate 0.5 g / l, KCl 0.5 g / l, and ferric sulfate 10 mg / l was subjected to pH 6 with 1 M-NaOH. Was adjusted to 2.0, and 50 ml thereof was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized in an autoclave. Spores of Rhizopus oryzae strain YPF-61A [American Type Culture Collection (ATCC) accession number MYA-2483] were inoculated to this medium at a concentration of 10 ⁴ / ml, and cultured at 30 ° C. for 1 day. Thereafter, D-psicose was added aseptically to the culture system containing the germinated cells at a concentration of 12 g / liter, and the culture was continued under the same conditions for 8 days.
[0015]
After the culture, the cells were removed by filtration from the culture solution, and the filtrate was treated with activated carbon to remove the color according to a conventional method. Next, desalting is performed with a cation exchange resin [Mitsubishi Chemical's trade name "Diaion SK1B (H type)"] and an anion exchange resin [Organo Corporation, trade name "Amberlite IRA-411 (CO ₃ type)"]. After the treatment, concentration was performed under reduced pressure to obtain syrup having a sugar concentration of about 29.4% by mass containing D-psicose and a small amount of inorganic ions as impurities. Next, using a cation exchange resin [manufactured by Dow Chemical Company, trade name “Dowex 50W-X2 (Ca type)”], column chromatography was performed using primary exchange water as an eluent to separate and purify D-tagatose. . The elution position was 37.1 minutes, which is the same as that of the reagent D-tagatose, unlike the reagent D-psicose as a standard substance. When the eluate was analyzed by high performance liquid chromatography, the elution position was the same as that of the reagent D-tagatose at 23.0 minutes, which was different from the elution position of the reagent D-psicose as a standard substance. By this operation, 3.0 g / liter of D-tagatose was obtained.
The high performance liquid chromatography analysis at this time was performed using a GL-C611 column (manufactured by Hitachi, Ltd.) and 880 Pu (manufactured by JASCO Corporation) under the conditions of an eluent of 0.01 mM-NaOH, a temperature of 60 ° C., and a flow rate of 1 ml / min. The measurement was performed with a detector (manufactured by Shimadzu Corporation, trade name "RID-6A").
[0016]
Example 2
A medium composed of 30 g / liter of glucose, 5 g / liter of polypeptone, 2 g / liter of yeast extract, 1 g / liter of dipotassium phosphate, and 0.5 g / liter of magnesium sulfate is adjusted to pH 5.0 with 2M-HCl, and 100 ml of the medium is 500 ml. The mixture was dispensed into an Erlenmeyer flask and sterilized by autoclaving. One platinum loop of the spores of Rhizopus acetoinus HUT1219 strain was inoculated into this and cultured at 30 ° C. for 4 days. Next, the cultured cells were collected by filtration and washed with distilled water. Next, 100 ml of a solution of D-psicose dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) at a concentration of 10 g / liter was dispensed into a 300 ml Erlenmeyer flask, and 1 g of cultured cells (wet weight) was added thereto. Was added. This was incubated with shaking at 30 ° C. for 46 hours to react.
[0017]
After completion of the reaction, the cells were filtered off, desalted and purified in the same manner as in Example 1 to obtain D-tagatose. This was subjected to high performance liquid chromatography (LC-10AD manufactured by Shimadzu Corporation, column: SCR-101P manufactured by Shimadzu Corporation, eluent: distilled water, temperature: 80 ° C., flow rate: 1 ml / min, detector: RID-10A manufactured by Shimadzu Corporation) As a result, 13.7 minutes identical to the reagent D-tagatose, which was different from the elution position of the reagent D-psicose as a standard substance, was obtained. 1.5 g / liter of D-tagatose was obtained by the conversion reaction of D-psicose by the cultured cells.
[0018]
As is evident from the above results, the result of analyzing the conversion product from D-psicose by high performance liquid chromatography using different columns was in good agreement with the value of the reagent D-tagatose as a standard substance. The product was confirmed to be D-tagatose.
[0019]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, high-purity D-tagatose can be easily and efficiently obtained from D-psicose as a raw material.

Claims

A microorganism belonging to the genus Rhizopus, which has the ability to convert D-psicose to D-tagsose and does not digest D-psicose, is cultured in the presence of D-psicose, and then D-tagatose is obtained from the culture solution. A method for producing D-tagatose.

2. The method according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Rhizopus is Rhizopus oryzae, Rhizopus acetinus, Rhizopus oligosporus, or a mutant thereof.