JP2003535018A - 骨量増加の方法および組成物 - Google Patents

骨量増加の方法および組成物

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ボードナー，ドナルド
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Abstract

(57)【要約】 開示の発明は、ホルモン転写活性化を引き起こすことなくエストロゲンまたはアンドロゲンレセプターに結合する化合物の宿主への投与によって、骨強度または骨の質を損なうことのない骨質量の増加法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一部国立保健研究所からの助成を受けたものである。従って連邦政
府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】 本発明は骨生理学の分野のものであり、詳細には骨量を増加させるすなわち骨
同化を達成する化合物を含む方法および組成物を提供するものである。当該化合
物は、ホルモン転写活性化をほとんど起こさず、エストロゲンまたはアンドロゲ
ン受容体に結合する。
【０００３】 （背景技術） 骨は、蛋白と無機物の基質内に埋め込まれた生存細胞から成る。骨は動物の重
要な臓器に対して支持および保護を提供し、その構造に対して強度および形を与
える。
【０００４】 骨粗鬆症は、微小構造上の劣化を伴う骨量減少であり、骨が脆弱となり骨折に
つながる。骨粗鬆症の治療ではこれまで、それ以上の骨損失の防止に主眼が置か
れてきた。それとは対照的に、骨同化剤は骨量を大幅に増加させる薬剤である。
今日まで、骨粗鬆症治療に関して米国食品・医薬品局が承認した薬剤がいくつか
あるが、ヒトその他の動物において骨同化剤として米国で使用が承認されている
薬剤はないと考えられる。骨は、洞部を侵食する破骨細胞および新たな骨基質を
合成する骨芽細胞という２種類の細胞によって行われる再構成プロセスによる絶
え間ない吸収と形成を受ける動的な組織である。再構成は主として骨の内部表面
で起こり、個々の細胞によってではなく、前部の破骨細胞と後部の骨芽細胞とい
う組合せを有する基本的多細胞ユニット（ＢＭＵ）という名称の一時的な解剖学
的構造によって起こる。確立されたＢＭＵでは、骨吸収と骨形成が同時に起こる
。
【０００５】 破骨細胞が骨吸収を停止すると、その細胞はアポトーシスによって死に、食細
胞によって直ちに除去される。骨芽細胞の長い寿命中に（約３ヶ月、それに対し
て破骨細胞は３週間）、一部の骨芽細胞は静止骨表面を覆う被覆細胞に変わり、
一部は骨細胞として鉱化基質内に埋め込まれる（Parfitt, In: Bone, Telford a
nd CRC Press, PP351-429, 1990）。しかしながら、最初の再構成部位に集合し
た骨芽細胞の大部分（６５％）はアポトーシスによって死ぬ（Jilka et al., JB
MR 13: 793-802, 1998）。
【０００６】 成人の骨格のほとんどの代謝障害は、破骨細胞による古い骨の吸収とその後の
骨芽細胞による置き換えとの間の不均衡によって生じるものである。個々の細胞
の活性とは対照的に（Manolagas and Jilka, NEJM 332: 305-311, 1995）、３種
類の最も一般的な形の骨粗鬆症、すなわち女性および男性における性ステロイド
欠乏による骨粗鬆症（Jilka et al., Science 257: 88-91, 1991; Jilka et al.
, JCI 101: 1942-1950, 1998; Bellido et al., JCI 95: 2886-2895, 1995; Wei
nstein et al., Endocrinology 138: 4013-4021, 1997）；老齢による骨粗鬆症
（Jilka et al., JCI 97: 1732-1740, 1996）；および糖コルチコイド過剰によ
る骨粗鬆症（Weinstein et al., JCI 102: 274-282, 1998; Weinstein et al.,
Bone, 23: S461, 1998; Bellido et al., Bone, 23: S324, 1998）を含むほとん
どの代謝性骨疾患に関して細胞数変化が原因であると思われる。
【０００７】 骨再構成の活性を阻害することで骨代謝を低下させる薬剤（一般には「抗吸収
薬」と称されるが正確ではない）は、二重エネルギーＸ線吸光光度分析（ＤＥＸ
Ａ）による測定で最大で６〜１０％、より代表的には２〜３％骨量を増加させる
。この増加のほとんどが、最初の１〜２年間のものであり、再構成空間の縮小に
よるものである。わずかではあるがさらなる増加が、より完全な二次鉱化によっ
て生じる場合がある。吸収深さ減少による限局的均衡の改善が動物実験で示され
ているが、ヒト被験者ではまだ明らかになっていない。機序とは無関係に、１０
％未満の増加ではほとんど全ての場合で、骨量がそのピーク値に回復することは
なく、小柱の連結性が再構築されないために、骨折のリスクは高いままである。
【０００８】 ヒトおよび動物において骨同化薬が多様な方面で必要とされている。骨粗鬆症
患者以外に、ヒトにおける骨同化剤使用の例には、スポーツまたは肉体労働など
の激しい肉体活動を行う健常者での骨強化ならびに現在は骨粗鬆症ではないが骨
粗鬆症の危険群に属するために将来的に骨粗鬆症となる可能性がある者における
骨強化などがある。ヒトでの骨同化薬の他の用途には、成長完了時に十分な骨量
が得られない者あるいは異常に脆い骨を持って生まれた者、すなわち骨異化疾患
への遺伝的素因または関節変性、癒着不能性骨折、糖尿病によって生じる整形外
科上の問題、埋込物周囲炎（periimplantitis）、骨移植片に対する不十分な応
答、埋込物、骨折などの整形外科的骨疾患を有する者の治療などがある。
【０００９】 同様に、動物において骨同化薬には多くの用途がある。例えば、労働に用いる
ウマやイヌならびに競争などのスポーツに用いる動物における骨量を増加させる
上でそれは有用であると考えられる。その薬剤はまた、肉生産で用いられるニワ
トリや七面鳥において骨量を増加させて動物当たりの食肉生産量を最大とする上
でも有用であると考えられる。
【００１０】 現在、骨粗鬆症治療に使用される薬剤には、同化ステロイド類、ビスホスホネ
ート類、カルシトニン類、エストロゲン類／プロゲストゲン類、ラロキシフェン
（raloxifene）などの選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭｓ）、フィト
エストロゲン、副甲状腺ホルモン（「ＰＴＨ」）、フッ化物、ビタミンＤ代謝物
およびカルシウム製剤という１０種類がある。これらの種類に入る化合物で骨同
化薬として承認されているものはない。
【００１１】 同化ステロイド類（アンドロゲン類） 同化ステロイド類（アンドロゲン類）は、宿主における筋量を増やすことが知
られている。しかしながら、それが本明細書で定義の骨同化薬として機能するこ
とを示す証拠は報告されていない（Snyder et al., JCEM 84: 1966-1972, 1999
）。アンドロゲン類は代表的には、男性の性機能低下障害に対する置換療法とし
て用いられ、思春期または成長の遅延歴を有する青年男性で使用される。アンド
ロゲンは、長期間にわたって摂取すると重大な副作用を生じる場合があり、それ
には水分貯留、黄疸、高密度リポ蛋白減少および低密度リポ蛋白増加、肝臓毒性
（最も普通には１７α−アルキル化アンドロゲン類に関連）、肝臓癌、心血管疾
患のリスク上昇ならびに大用量で摂取した場合の無分別、心理的エピソード、暴
力的行動および死亡などがある。米国特許５５６５４４４号には、骨損失治療ま
たは骨量増加のためのアンドロゲンの使用が開示されている。
【００１２】 カルシトニン 内因性カルシトニンは、カルシウムおよび骨代謝の調節に関与するポリペプチ
ドホルモンである。治療上使用される形は、ブタ甲状腺から抽出されるカルシト
ニン（ブタ）、合成ヒトカルシトニン、ウナギカルシトニンの合成類縁体である
エルカトニン；ならびに合成サケカルシトニンであるサルカトニン（salcatonin
）などがある。これらはいずれも、骨吸収速度を低下させることで、血漿カルシ
ウム濃度を低下させる性質を有する。カルシトニン類は代表的には、皮下注射ま
たは筋肉注射によって投与される。
【００１３】 ビスホスホネート類 ビスホスホネート類は、骨粗鬆症の治療に広く使用されている。ビスホスホネ
ート・２ナトリウムエチドロネートは、確立した骨粗鬆症における骨量および骨
折に対してカルシトニンと同様の効果を有するが、骨軟化症のリスクがあること
から長期間にわたって投与することができない。１０ｍｇ／日の用量でのビスホ
スホネートアレンドロネート投与によって最初の１年間にわたり脊髄骨密度（Ｂ
ＭＤ）に５％増加が生じる（Dempster, Exploiting and Bypassing the Bone Re
modeling Cycle to Optimize the Treatment of Osteoporosis, Journal of Bon
e and Mineral Research, Volume 12, Number 8, 1997, pages 1152-1154）。速
度は相対的に小さいが、投与の第２年および第３年にわたってその部位でＢＭＤ
は上昇を続ける。ＢＭＤ増加の大きさおよび期間から、アレンドロネートは単に
再構成空間を小さくするだけの作用を行っているのではなく、同化活性を有する
可能性があると考えられるようになってきた。ビスホスホネートエチドロネート
は、投与１年後にほぼ３０％だけヒト腸骨小柱骨における吸収深さを減少させた
が、そのようなデータはアレンドロネートについては得られていない。エチドロ
ネートは小柱塊（packet）の厚さを変えなかったが、骨粗鬆症女性における最近
の研究から、１０および２０ｍｇ／日での２年間にわたるアレンドロネート投与
後にそれが上昇することが示唆されている。この結果は、３年間の投与後には確
認されなかった。
【００１４】 別の論文でデンプスターは（Dempster D. W., New concepts in bone remodel
ing, In: Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism, Chapter 18, pp.261-2
73, Acad. Press, 1999）、骨量を増加させることができることから骨粗鬆症患
者における骨格欠陥を回復させることができる薬剤の可能性が非常に高いもので
あり、特にそれを行って薬剤が微小構造損傷を修復する場合には有効であること
を確認している。彼は、エストロゲン類およびカルシトニン類が主として骨量を
安定させ、さらなる骨損失を防止するが、特に骨再構成レベルの高い患者では量
の増加が一時的に小さいことが報告される場合が多いと記載している。デンプス
ターらは、これは真の同化効果ではなく、代謝に対する一時的効果に関係するも
のであり、最初に吸収が低下し、次に数ヶ月を要する形成低下が生じると結論付
けている。
【００１５】 ただし、ビスホスホネート類は骨芽細胞および骨細胞に対する抗アポトーシス
効果を有する（Plotkin et al., Bone, 23: S157, 1998）。重要な点として、ビ
スホスホネート類のin vitroでの抗アポトーシス効果は、その同じ薬剤が破骨細
胞活性を阻害する用量の１／１００〜１／１０００の用量で得られ、その効果は
さらに破骨細胞活性を全く遮断しないビスホスホネート類（化合物ＩＧ９２０４
）によっても示すことができる。米国特許４８７００６３号には、骨量を増加さ
せるビスホスホン酸誘導体が開示されている。米国特許５５３２２２６号および
５３００６８７号には、骨量増加へのトリフルオロメチルベンジルホスホネート
類の使用が記載されている。パパポウロス（Papapoulos）らへの米国特許５８８
５９７３号には、ビスホスホネートであるオルパンドロネート（olpandronate）
を含む骨量同化組成物が開示されている。
【００１６】 エストロゲン類／プロゲストゲン類 種類としてのエストロゲン類／プロゲストゲン類（抗再構成化合物および抗吸
収化合物）は現在のところ、１０％を超えて骨量を増加させることは明らかにな
っておらず、骨粗鬆症の効果を遅延させるのに使用されている。エストロゲン類
は現在、閉経後女性における骨粗鬆症予防の最も有効な方法である。
【００１７】 米国特許５１８３８１５号には、ヒドロキシアルキル−１，１−ビスホスホネ
ートに共有結合的に連結したステロイドホルモンの使用が開示されている。米国
特許５８４３９３４号には、弱い性関連活性を有するエストロゲンを患者に投与
して、男性または女性における骨粗鬆症の有害効果を遅延させることができるこ
とが特許請求されている。’９３４特許では、骨量増加のための化合物の選択方
法については言及されておらず、骨損失の効果を遅延させる方法について記載さ
れている。フロリダ大学研究財団（University of Florida Research Foundatio
n, Inc.）が出願したＷＯ９８／２２１１３には、エストロゲン化合物の異性体
を利用して、虚血事象に関連する細胞群に細胞保護を提供する方法が開示されて
いる。
【００１８】 フィトエストロゲン類 骨に対するフィトエストロゲン類の作用についてはほとんど解明されていない
（Fitzpatrick, L. A., Mayo Clinic Proceedings, 74: 601-607, 1999）。大豆
蛋白はカニクイザルにおける骨代謝増加を防止せず、実際にはそれを増加させた
。しかしながらＢＭＤは、カルシウムのみを摂取した閉経後女性で２年後に低下
したが、イプリフラボン投与を受けた女性では変化しなかった。４０ｍｇ／日の
大豆蛋白補給（イソフラボン類９０ｍｇを含有）を６ヶ月間行った後の閉経後女
性でイソフラボンは脊髄ＢＭＤを大幅に上昇させたが、低用量（５６ｍｇ／ｋｇ
）ではその効果はなかった（Feinkel, E. Lancet, 352: 762, 1998）。
【００１９】 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ） カルシウムホメオスタシスにおける役割が知られている薬剤である副甲状腺ホ
ルモン（ＰＴＨ）の１日１回投与によって、動物およびヒトにおいて骨量が増加
し、それは唯一知られている他のＰＴＨ受容体リガンドである関係するＰＴＨ関
連ホルモンＰＨＴｒＰと同様である。骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスの広
がり増加が骨粗鬆症の重要な病因上の機序であるが（Weinstein et al., J. Cli
n Invest., 102: 274-282, 1998; Weinstein et al., Bone, 23: S461, 1998; B
ellido et al., Bone, 23: S324, 1998）、逆すなわち骨芽細胞アポトーシスの
延長が、骨への間歇的な副甲状腺ホルモン投与の同化効果における主要な（唯一
でなければ）機序である（Jilka et al., J. Clin. Invest. 104: 439-446, 199
9）。マウスにおける間歇的ＰＴＨ投与によって生じる骨密度、骨芽細胞周およ
び骨形成速度の増加は骨芽細胞産生に変化を起こすことなく生じる。それに対し
て、薬剤の同化効果は、１．７〜２．２％ないしわずか０．１〜０．４％だけ骨
芽細胞アポトーシスの広がりを低下させることで生じるものであり、新たに生じ
た層状海綿骨における骨細胞は、媒体のみを投与した動物で認められるものより
互いに近く、数が多くなる。骨細胞の距離が狭くなり、数が多くなることが、ア
ポトーシスからの骨芽細胞保護の予想される結果である。骨芽細胞ならびに骨細
胞に対するＰＴＨの抗アポトーシス効果は、一次骨細胞培養物および確立された
細胞系を用いてin vitroで確認されている。
【００２０】 骨形成刺激へのテリパラチド（ヒト副甲状腺成長ホルモンの１〜３４アミノ酸
断片）の使用についても研究されており、１日１回投与したテリパラチドが、骨
粗鬆症患者における脊髄の小柱骨密度を選択的に上昇させることが報告されてい
る。
【００２１】 米国特許５５１０３７０号には、骨量上昇のためのＰＴＨおよびラロキシフェ
ン（raloxifene）の併用が開示されている。米国特許４８３３１２５号には、ヒ
ドロキシ化ビタミンＤ誘導体またはカルシウム補助食品のいずれかと組み合わせ
たＰＴＨの使用が開示されている。
【００２２】 カルシウム製剤 カルシウム欠乏者への栄養補助食品として有用なカルシウム製剤が骨量増加に
有効であることは明らかになっていない。しかしながらその製剤は、骨損失速度
を低下させることができる。米国特許５６１８５４９号（カルシウム塩）には、
カルシウムの使用が記載されている。
【００２３】 フッ化物 最も詳細に研究されている同化剤であるフッ化ナトリウムは、少なくとも４年
間にわたり年間１０％だけ脊椎骨量を増加させることができるが、形成される骨
の性質については論争がある。フッ化ナトリウムは骨同化剤としては承認されて
いない。重大な質的異常があることから、抗骨折効力を確立することは困難であ
った。第１に、新たな骨の多くが最初は編組み状であって、層状ではない。第２
にさらに重要な点として、骨量増加に対してフッ化ナトリウムは有効であるが、
骨鉱化に対して重大な障害を生じる。
【００２４】 米国特許５０７１６５５号には、フッ素源および細胞分裂促進性ヒダントイン
を含む骨量増加のための組成物が開示されている。
【００２５】 ＳＥＲＭｓ タモキシフェンおよびラロキシフェンなどのＳＥＲＭも骨粗鬆症治療に用いら
れている。ラロキシフェンを用いて行われた最近の試験では、投与３年後に、ラ
ロキシフェン投与を受けた女性で脊髄骨折が３０〜５０％減少し、臀部および脊
髄で骨密度が２〜３％上昇したが、臀部骨折を含むカテゴリである非脊髄骨折に
おける低下は示されなかった（Ettinger, B., JAMA, 282: 637-645, 1999）。
【００２６】 米国特許第４，９７０，２３７号明細書は、閉経前女性の骨量を増加させるた
めのクロミフェンの使用を開示している。
【００２７】 ビタミンＤ誘導体 骨損失及び骨同化作用に対するビタミンＤまたはその誘導体の有用性について
矛盾する報告がなされている。ビタミンＤのホルモン代謝物であるカルシトリオ
ールに関する幾つかの研究では脊椎骨密度の増加が報告されている一方で、他の
研究では効果がないと報告されている。
【００２８】 米国特許第４，９７３，５８４号明細書、同第５，７５０，７４６号明細書、
同第５，５９３，８３３号明細書、同第５，５３２，３９１号明細書、同第５，
４１４，０９８号明細書、同第５，４０３，８３１号明細書、同第５，２６０，
２９０号明細書、同第５，１０４，８６４号明細書、同第５，００１，１１８号
明細書、同第４，９７３，５８４号明細書、同第４，６１９，９２０号明細書及
び同第４，５８８，７１６号明細書は、骨疾患の治療のためにビタミンＤ誘導体
を使用することを記載している。
【００２９】 他の化合物 骨疾患の治療のために他の化合物を使用することは、米国特許第５，７５３，
６４９号明細書及び同第５，５９３，９８８号明細書（アゼピン誘導体）、同第
５，６７４，８４４号明細書（モルホゲン）、同第５，６６３，１９５号明細書
（シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤）、同第５，６０４，２５９号明細書（イブ
プロフェンまたはフルルビプロフェン）、同第５，３５４，７７３号明細書（バ
フィロマイシン）、同第５，２０８，２１９号明細書（アクチビン）、同第５，
１６４，３６８号明細書（成長ホルモン放出因子）、並びに同第５，１１８，６
６７号明細書、同第４，８７０，０５４号明細書及び同第４，７１０，３８２号
明細書（骨成長因子及び骨吸収阻害剤の投与）に記載されている。
【００３０】 米国特許第５，８５９，００１号明細書は、細胞に対して神経保護を付与する
ために４環シクロペンタノフェナントレン化合物構造中に末端フェノール基を有
する非エストロゲン化合物を使用することを開示している。
【００３１】 米国特許第５，８２４，６７２号明細書は、末端フェノールＡ環を有するシク
ロペンタノフェナントレン化合物を有効量投与することを含む移植術中の組織の
保存方法を開示している。
【００３２】 国際特許出願公開第９８／３１３８１号パンフレット（出願人：Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，
Ｉｎｃ．）は、増強効果を得るために多環式フェノール化合物を抗酸化剤と一緒
に投与するステップを含む細胞群に対する多環式フェノール化合物の細胞保護効
果を増強する方法を開示している。１つの組合せとしてグルタチオンとエストロ
ゲンの組合せが記載されている。
【００３３】 本発明の目的は、（インビボでの骨折発生率及びインビトロでの機械的強度に
より定義される）骨強度の低下及び／または（例えば組織形態計測法により測定
される異常なコラーゲン配向及び非鉱物化骨マトリックスの過剰蓄積により規定
される）骨質の劣化を招くことなく宿主の骨量を少なくとも１０％／年増加させ
る方法を提供することである。
【００３４】 本発明の別の目的は、骨消失を更に予防する代わりに強い骨を再構築する方法
を提供することである。
【００３５】 本発明の更なる目的は、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少
なくとも１０％／年増加させる化合物を選択する方法を提供することである。
【００３６】 本発明の更に別の目的は、骨強度を少なくとも２０％増加させる方法を提供す
ることである。
【００３７】 （発明の要旨） 第１態様で、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少なくとも１
０％増加させる方法が提供され、その方法は、 （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でエストロゲンαまたはβ受容体（また、宿主動物中の同等受容体）に結合す
る； （ｉｉ）（ａ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはイ
ンビトロで自然エストロゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは骨細胞かまたはエ
ストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に投与したとき１７β−エストラ
ジオールの１０％以下、好ましくは１７β−エストラジオールの５、１、更には
０．１％以下のレベルでエストロゲン遺伝子転写活性を誘導するか、或いは（ｂ
）子宮重量を１７β−エストラジオール（または、宿主動物中の同等化合物）の
１０％以下増加させる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然エストロゲン受容体を有する骨芽細胞かまたはエストロゲン受容体を
トランスフェクトした細胞に投与したとき細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ
）のリン酸化を誘導する；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然エストロゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは骨細胞かまたはエストロ
ゲン受容体をトランスフェクトした細胞において骨芽細胞及び骨細胞に対して抗
アポトーシス効果を有する； 化合物を有効量投与することを含む。本発明の第１態様の別の面で、前記化合物
は以下に定義するエストロゲン化合物ではない。この第１態様の別の面で、前記
化合物は、該化合物が細胞に入るのを防止するが該化合物のエストロゲン細胞表
面受容体への結合に有意な影響を及ぼさない置換基を結合することにより非エス
トロゲンに変換されるエストロゲン化合物である。
【００３８】 第２態様で、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少なくとも１
０％増加させる方法が提供され、その方法は、 （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でアンドロゲン受容体（また、宿主動物中の同等受容体）に結合する； （ｉｉ）（ａ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはイ
ンビトロで自然アンドロゲン受容体を有する骨芽細胞かまたはアンドロゲン受容
体をトランスフェクトした細胞に投与したときテストステロンの１０％以下、好
ましくはテストステロンの５、１、更には０．１％以下のレベルでアンドロゲン
遺伝子転写活性を誘導するか、或いは（ｂ）筋肉重量をテストステロン（または
、宿主動物中の同等化合物）の１０％以下増加させる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然アンドロゲン受容体を有する骨芽細胞かまたはアンドロゲン受容体を
トランスフェクトした細胞に投与したとき細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ
）のリン酸化を誘導する；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然アンドロゲン受容体を有する骨芽細胞かまたはアンドロゲン受容体をト
ランスフェクトした細胞において骨芽細胞及び骨細胞に対して抗アポトーシス効
果を有する； 化合物を有効量投与することを含む。本発明の第２態様の別の面で、前記化合物
はアンドロゲンではない。この第２実施態様の別の面で、前記化合物は、該化合
物が細胞に入るのを防止するがアンドロゲン細胞表面受容体に結合する該化合物
の能力に有意な影響を及ぼさない置換基を結合することにより非アンドロゲンに
変換されるアンドロゲン化合物である。
【００３９】 本発明の第１または第２態様の別の面で、前記化合物はインビボで少なくとも
０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビトロで自然エストロゲン受容体を
有する破骨細胞かまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞におい
て破骨細胞に対してプロアポトーシス効果も有する。
【００４０】 本発明は、骨芽細胞の増加及び恐らく骨細胞のアポトーシスのために骨量が消
失するが、これは有意にホルモン転写活性化することなくＥＲＫのリン酸化を誘
導するエストロゲンまたはアンドロゲン受容体に結合する化合物により抑制され
得るという根本的知見に基づく。この根本的経路の知見により、骨量及び強度に
対して最大の効果を与える化合物を選択することができる。
【００４１】 従って、第３態様で、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少な
くとも１０％増加させる化合物を選択する方法が提供され、その方法は、化合物
が （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でエストロゲンまたはアンドロゲン受容体（また、宿主動物中の同等受容体）
に結合する； （ｉｉ）（ａ）適宜、インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でま
たはインビトロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有する骨芽細胞
かまたはアンドロゲンまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に
投与したとき１７β−エストラジオールまたはテストステロンの１０％以下、好
ましくは１７β−エストラジオールまたはテストステロンの５、１、更には０．
１％以下のレベルでエストロゲンまたはアンドロゲン遺伝子転写活性を誘導する
か、或いは（ｂ）子宮重量を１７β−エストラジオールの１０％以下または筋肉
重量をテストステロン（または、宿主動物中の同等化合物）の１０％以下増加さ
せる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは破
骨細胞かまたはアンドロゲンまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした
細胞に投与したとき細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘導す
る；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有する骨芽細胞及び骨細胞か
またはアンドロゲンまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞にお
いて骨芽細胞及び骨細胞に対して抗アポトーシス効果を有する； かどうかを評価することを含む。
【００４２】 １７α−エストラジオールのようなエストロゲン化合物及びエストラトリエン
−３−オールのような多環式フェノールは、インビトロで骨芽細胞及び骨細胞の
アポトーシスを抑制する。転写装置との直接的または間接的相互作用を含む従来
のエストロゲン受容体作用の機構とは異なり、前記化合物の受容体依存性抗アポ
トーシス効果は、ＥＲＫの迅速（５分以内）リン酸化のために非ゲノムである。
エストラトリエン−３−オールは富エストロゲンまたは乏エストロゲンマウスに
おいて骨量を増加させる。エストラトリエン−３−オールは、低用量を投与した
ときにはエストロゲンタイプの活性に対して効果を殆ど示さず、骨量に対しても
効果を殆ど示さない。用量を増加させると、両方の効果が高まる。前記化合物ま
たはこの種の活性を示す他の化合物の使用を最適にするために、本明細書に詳記
するようにエストロゲン結合活性を保存し且つ転写活性を低下させるために、例
えば細胞進入を抑制する置換基または部分を結合することにより化合物を誘導体
化することができる。
【００４３】 本明細書に記載の基準に従って選択された化合物は、低い骨量及び高い脆弱性
により特徴づけられる病気において骨量を増加させるため及び／または骨折を予
防するためにも使用され得る。前記化合物は、造骨細胞形成が低下している骨疾
患もしくは状態、例えば老年性骨粗しょう症及びグルココルチコイドが原因の骨
粗しょう症、特に骨再構築の妨害が好ましくない時期の成長中の子供や青年にお
ける骨骨粗しょう症を治療するために使用することができる。
【００４４】 （図面の簡単な説明） 本明細書に添付の図面は本発明の実施態様を例示しているにすぎず、本発明の
範囲を限定するものと解されない。
【００４５】 図１は、骨強度に悪影響を及ぼすことなく骨量を増加させるために使用され得
る化合物の１クラスの非限定例を示す。
【００４６】 図２は、マウス椎骨中の骨芽細胞及び骨細胞のアポトーシス度をエストロゲン
欠乏を関数として示す棒グラフである。Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（４
ヶ月令）の卵巣を摘出した。２８日後、マウスを殺し、椎骨を単離し、固定し、
包埋した後メタクリレートにおいて非脱灰した。骨芽細胞及び骨細胞のアポトー
シス罹患率をＣｕＳＯ４エンハンスメントを用いるＴＵＮＥＬ法により測定し、
骨芽細胞及び骨細胞のアポトーシス罹患率がエストロゲン消失後に劇的に増加す
ることが判明した。＊＊＊Ｐ＜０．００００１、＊Ｐ＜０．０３８２。
【００４７】 図３は、エトポシド誘導骨芽細胞アポトーシス（％）対添加したエストロゲン
、すなわち１７β−エストラジオール、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１
７α−エストラジオール及びエストラトリエン−３−オールの濃度のｌｏｇを示
す棒グラフである。マウス頭蓋冠から得た骨芽細胞をステロールで１時間予備処
理した後プロアポトーシス剤のエトポシドを添加した。６時間後アポトーシスを
トリプシンブルー摂取により測定した（Ｊｉｌｋａら，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ
Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．，１３：７９３：８０２（１９９８））。＊は、分散分析（Ａ
ＮＯＶＡ）（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりエトポシド
単独に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【００４８】 図４は、骨細胞（ＭＬＯ−Ｙ４）のエトポシド誘導アポトーシスの１７β−エ
ストラジオール、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオー
ル及びエストラトリエン−３−オールによる抑制を示す棒グラフである。細胞を
指定濃度の化合物で１時間予備処理した後プロアポトーシス剤のエトポシドを添
加した。６時間後アポトーシスを図３に記載したようにトリパンブルー摂取によ
り測定した。＊は、ＡＮＯＶＡ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法
）によりエトポシド単独に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【００４９】 図５は、骨芽細胞のエトポシド誘導アポトーシスに対する１７β−エストラジ
オール、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール及びエ
ストラトリエン−３−オールの抗アポトーシス効果がエストロゲン受容体アンタ
ゴニストのＩＣＩ１８２，７８０により阻害されることを示す棒グラフである。
マウス頭蓋冠から得た骨芽細胞を純粋な受容体アンタゴニスのＩＣＩ１８２，７
８０（１０−７Ｍ）で１時間予備処理した後試験化合物（１０−８Ｍ）を添加し
た。アポトーシスを誘導し、図３に記載したように定量化した。＊は、ＡＮＯＶ
Ａ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりエトポシド単独に対
してｐ＜０．０５であることを示す。
【００５０】 図６は、ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞に対する１７β−エストラジオール、１７β−エ
ストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール及びエストラトリエン−３
−オー（Ｅ−３−ｏｌ）の抗アポトーシス効果がエストロゲン受容体アンタゴニ
ストのＩＣＩ１８２，７８０により阻害されることを示す棒グラフである。ＭＬ
Ｏ−Ｙ４細胞を純粋な受容体アンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０（１０−７Ｍ
）で１時間予備処理した後試験化合物（１０−８Ｍ）を添加した。アポトーシス
を誘導させ、図３に記載したように定量化した。＊は、ＡＮＯＶＡ（Ｓｔｕｄｅ
ｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりエトポシド単独に対してｐ＜０．０
５であることを示す。
【００５１】 図７は、骨芽細胞のエトポシド誘導アポトーシスに対する１７β−エストラジ
オール、１７α−エストラジオール及びエストラトリエン−３−オールの抗アポ
トーシス効果のためにエストロゲン受容体αまたはβが必要であることを示す棒
グラフである。ＣＭＶプロモータ単独及びｍＥＲαまたはｍＥＲβに対するＣＭ
Ｖプロモータ作動ｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞に安定的にトランスフェクトした。サ
ブ密集培養物を１０−８Ｍの１７α−エストラジオール、１７β−エストラジオ
ールまたはエストラトリエン−３−オールで１時間処理した後エトポシド（５×
１０−５Ｍ）と６時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、ペレット
化し、トリプシンブルー陽性細胞を数えた。各棒は、２回の実験の平均値±ＳＥ
Ｍを表す。＊Ｐはエトポシド単独に対してｐ＜０．０２であることを示す。
【００５２】 図８は、１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、１７β−エ
ストラジオール−ＢＳＡまたはエストラトリエン−３−オールが細胞外シグナル
調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化することを示すウェスタンブロットである。Ｍ
ＬＯ−Ｙ４骨細胞を無血清培地において２５分間インキュベートした。その後、
１０−８Ｍの１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、１７β−
エストラジオール−ＢＳＡまたはエストラトリエン−３−オールを添加し、細胞
を更に５、１５または３０分間インキュベートした。細胞ライゼートを作成し、
タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に移し
た。ホスホリル化ＥＲＫ１及び２を認識する特異的抗体を用いてウェスタンブロ
ッティングを実施した後、全ＥＲＫを認識する抗体を用いて再度ブロッティング
した。ブロットを増強化学発光により展開した。
【００５３】 図９は、ＥＲＫ１／２の活性化に対するエストロゲン化合物の効果がＥＲＫキ
ナーゼの特異的阻害剤のＰＤ９８０５９によりブロックされることを示すウェス
タンブロットである。ＭＬＯ−Ｙ４細胞を無血清培地において５０μＭのＰＤ９
８０５９の存在下または非存在下で２５分間インキュベートした。その後、１０−８ Ｍの１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、１７β−エス
トラジオール−ＢＳＡまたはエストラトリエン−３−オールを添加し、細胞を更
に５分間インキュベートした。細胞ライゼートを作成し、タンパク質をポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ホスホリル化ＥＲ
Ｋ１及び２を認識する特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングを実施した
後、全ＥＲＫを認識する抗体を用いて再度ブロッティングした。ブロットを増強
化学発光により展開した。
【００５４】 図１０は、ＥＲＫ活性化の特異的阻害剤であるＰＤ９８０５９が１７β−エス
トラジオール及び関連化合物の抗アポトーシス効果を無効にすることを示す棒グ
ラフである。ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を５０μＭのＰＤ９８０５９で予備処理した後
１０−８Ｍの１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオールまたは１７
β−エストラジオール−ＢＳＡを添加した。プロアポトーシス剤のデキサメタゾ
ンと６時間インキュベートすることによりアポトーシスを誘導し、図３に記載し
たように定量化した。＊は、ＡＮＯＶＡ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅ
ｕｌｓ法）によりデキサメタゾンを使用しない対応コントロール群に対してｐ＜
０．０５であることを示す。
【００５５】 図１１は、１７β−エストラジオールとは異なり、エストラトリエン−３−オ
ールはＥＲαを介してエストロゲン応答エレメントをトランス作用しないことを
示す。ヒトＥＲαをルシフェラーゼ遺伝子を動かすエストロゲン応答エレメント
の３コピーを含むリポーター構築物と共にＥＲα欠乏２９３細胞において過剰発
現させた。光単位を計数し、トランスフェクション効率の差についてコントロー
ルするために共発現ｂ−ガラクトシダーゼ活性に正規化させた。結果は、２つの
化合物で処理していないＥＲαトランスフェクト細胞と比較した刺激％を表す。
各棒は２回の実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊はステロールと接触させていない
細胞に対してｐ＜０．００１であることを示す。
【００５６】 図１２は、特定の３環化合物、すなわち［２Ｓ−（２ａ，４ａα，１０ａβ）
］−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−７−ヒドロキシ
−２−メチル−２−フェナントレンメタノール（ＰＡＭ）及び［２Ｓ−（２ａ，
４ａα，１０ａβ）］−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒド
ロ−７−ヒドロキシ−２−メチル−２−フェナントレンカルボキシアルデヒド（
ＰＡＣＡ）の化学構造を示す。
【００５７】 図１３は、番号を付した炭素と共に一般化したコア環構造を示す。図１３ａは
４環構造、図１３ｂは３環構造、図１３ｃは２環構造（融合）、図１３ｄは２環
構造（非融合）を示す。
【００５８】 図１４は、エストロゲン活性の３つのメカニズムを示す。図１４Ａはエストロ
ゲンの抗アポトーシス効果、図１４Ｂはエストロゲンの抗再構築（anti-remoldi
ng）効果、図１４Ｃはエストロゲンの女性化効果を示す。
【００５９】 図１５は、骨芽細胞及び骨細胞のアポトーシスに対する抗吸収剤（例えば、１
７β−エストラジオール）対非抗吸収剤（例えば、エストラトリエン−３−オー
ルまたは間欠性ＰＴＨ）の活性を比較する。骨形成は前の破骨細胞の骨吸収部位
、すなわち骨再構築を受けた部位でのみ起こる。各再構築サイクルは、一旦完了
すると取り消せないトランス作用である。右図に示すように、抗吸収／抗再構築
特性を持たない抗アポトーシス性化合物は再構築単位の数（すなわち、トランス
作用の数）を減らさないのでより多くの骨を再構築し、従って全体の骨量を増加
させる。また、骨芽細胞アポトーシス罹患率を低下させることにより、活性化合
物は新たな骨形成部位で成熟骨芽細胞のプールを拡大し、これらの細胞が骨を作
る機会が多くなる。更に、骨細胞アポトーシスを防止して骨細胞−小管ネットワ
ークを支えることにより、１７β−エストラジオールのような従来の抗吸収剤も
抗吸収性を有しない化合物も骨量に対する効果により生ずる以上の抗骨折作用を
有すると予想される。
【００６０】 図１６Ａは、図１に示した化合物のＲ１及びＲ２置換基の例のリストである。
【００６１】 図１６Ｂは、α及びβ−エストラジオールの分子構造を示す。
【００６２】 図１７は、抗アポトーシス特性を有するエストラトリエンの化学構造を示す。
【００６３】 図１８は、抗アポトーシス特性を有するエストラジオール、フェノール及びジ
フェノールの化学構造を示す。
【００６４】 図１９は、遺伝子プロモータを含む最小ＥＲＥの転写活性に対する１７β−エ
ストラジオールの効果及びこの効果のエストロゲン受容体タンパク質のリガンド
誘導特異的コンホメーション変化を認識するペプチド（αＩＩ）による阻害を示
す。２９３個のヒト腎細胞を、ペプチド配列の上流に挿入したＧＡＬ４−ＤＮＡ
結合ドメインを含むＥＲ−特異的αＩＩペプチドを有するプラスミド、ＥＲＥ／
ＩＬ−６プロモーター作動ルシフェラーゼリポータープラスミド及びβ−ガラク
トシダーゼ（β−ｇａｌ）含有プラスミドで一時的にトランスフェクトした。Ｅ
ＲＥ−ルシフェラーゼ構築物はｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ
）においてルシフェラーゼ遺伝子を作動させるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐ ｕｓ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）ＥＲＥの３コピーを有していた。＊は、ＡＮ
ＯＶＡ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりペプチドαＩＩ
をトランスフェクトした細胞に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【００６５】 図２０は、ＩＬ−６プロモーターの転写活性に対する１７β−エストラジオー
ルの効果及びこの効果のエストロゲン受容体タンパク質のリガンド誘導特異的コ
ンフォーメーション変化を認識するペプチド（αＩＩ）による阻害を示す。ＩＬ
−６−ルシフェラーゼプラスミドはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ中のルシフェラーゼの
上流にクローン化した近位ＩＬ−６プロモーターの２２５ｂｐを有していた。α
ＩＩペプチドはＥＲＥ依存転写モデルに対するエストロゲンの転写効果を抑制し
た。αＩＩは、ＩＬ−６遺伝子モデルでＥＲ及び別の転写因子間のタンパク質／
タンパク質相互作用を介して媒介されるとき転写を阻止することも判明した。＊ は、ＡＮＯＶＡ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりペプチ
ドαＩＩをトランスフェクトした細胞に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【００６６】 図２１は、ＢＳＡとコンジュゲートした１７β−エストラジオールの抗アポト
ーシス効果及びこの特殊効果のコンホメーション感受性ペプチドαＩＩによる阻
害の欠乏を示す。アポトーシスに対するペプチドの効果をアポトーシス刺激剤と
してエトポシドを用いてアッセイした。エトポシド処理すると、ＥＲをトランス
フェクトし、１７β−ＢＳＡで処理した細胞はアポトーシスから保護された。Ｇ
ＡＬ４作動ペプチドのコ−トランスフェクション後、細胞はエトポシド誘導アポ
トーシスに対する耐性を維持した。このことから、ペプチドはＥＲの保護・抗ア
ポトーシス作用を抑制しなかったことが示される（図２１）。＊は、ＡＮＯＶＡ
（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法）によりペプチドαＩＩをトラ
ンスフェクトした細胞に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【００６７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、抗アポトーシスシグナル経路をトリガーするようにエストロゲンま
たはアンドロゲン受容体に結合するが転写活性を最小にしかまたは全く示さない
化合物の有効量を宿主に投与することにより、骨質を劣化させることなく骨量を
増加させる方法を提供する。
【００６８】 本発明を用いる最適実施態様では、二重テトラサイクリン標識（Ｃｏｅ及びＦ
ａｖｕｓ編，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ
Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｒａｖｅｎ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９９２年）発行，ｐ．４５５−４７４）により測定される骨形成が
増加すること及び質または強度を増加または少なくとも維持しながらＤＥＸＡ（
Ｊｉｌｋａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１７３２−１７４０，１
９９６）により測定されるＢＭＤが少なくとも５年間の連続増加することを立証
することにより、同化効果が確立される。
【００６９】 本発明は、骨芽細胞のアポトーシスが増えるために骨が消失するが、これは転
写活性を最小にしかまたは全く持たずにエストロゲンまたはアンドロゲン受容体
に結合する（ＥＲＫのリン酸化を誘導する）化合物により抑制され得るという根
本的知見に基づく。この根本的経路の知見により、骨量及び強度に対して最大の
効果を与える化合物を選択することができる。
【００７０】 従って、第１態様で、骨質または強度を低下させることなく宿主の骨量を少な
くとも１０％増加させる方法が提供され、その方法は、 （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でエストロゲンαまたはβ受容体（また、宿主動物中の同等受容体）に結合す
る； （ｉｉ）（ａ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはイ
ンビトロで自然エストロゲン受容体を有するかまたはエストロゲン受容体をトラ
ンスフェクトした細胞に投与したとき１７β−エストラジオールの１０％以下、
好ましくは１７β−エストラジオールの５、１、更には０．１％以下のレベルで
エストロゲン遺伝子転写活性を誘導するか、或いは（ｂ）子宮重量をエストロゲ
ン（または、宿主動物中の同等化合物）の１０％以下増加させる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然エストロゲン受容体を有するかまたはエストロゲン受容体をトランス
フェクトした細胞に投与したとき１０−１１〜１０−７Ｍの濃度で細胞外シグナ
ル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘導する；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然エストロゲン受容体を有するかまたはエストロゲン受容体をトランスフ
ェクトした細胞において１０−１１〜１０−７Ｍの濃度で骨芽細胞及び骨細胞に
対して抗アポトーシス効果を有する； 化合物を有効量投与することを含む。本発明の第１態様の別の面で、前記化合物
は本明細書に定義するエストロゲン化合物ではない。この第１態様の別の面で、
前記化合物は、該化合物が細胞に入るのを防止するが該化合物のエストロゲン細
胞表面エストロゲン受容体への結合に有意な影響を及ぼさない置換基を結合する
ことにより非エストロゲンに変換されるエストロゲン化合物である。
【００７１】 第２態様で、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少なくとも１
０％／年増加させる方法が提供され、その方法は、 （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でアンドロゲン受容体（また、宿主動物中の同等受容体）に結合する； （ｉｉ）（ａ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはイ
ンビトロで自然アンドロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲン受容体をトラ
ンスフェクトした細胞に投与したときテストステロンの１０％以下、好ましくは
テストステロンの５、１、更には０．１％以下のレベルでアンドロゲン遺伝子転
写活性を誘導するか、或いは（ｂ）筋肉重量をテストステロン（または、宿主動
物中の同等化合物）の１０％以下増加させる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然アンドロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲン受容体をトランス
フェクトした細胞に投与したとき１０−１１〜１０−７Ｍの濃度で細胞外シグナ
ル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘導する；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然アンドロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲン受容体をトランスフ
ェクトした細胞において１０−１１〜１０−７Ｍの濃度で骨芽細胞及び骨細胞に
対して抗アポトーシス効果を有する； 化合物を有効量投与することを含む。この第２態様の別の面で、前記化合物はア
ンドロゲンではない。この第２実施の別の面で、前記化合物は、該化合物が細胞
表面アンドロゲン受容体を含む細胞に入るのを防止する置換基を結合することに
より非アンドロゲンに変換されるアンドロゲン化合物である。
【００７２】 本発明の第１または第２態様の別の面で、前記化合物は、インビボで少なくと
も０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビトロで自然アンドロゲン受容体
を有するかまたはアンドロゲン受容体をトランスフェクトした細胞において破骨
細胞に対してプロアポトーシス効果も有する。
【００７３】 従って、第３態様で、骨強度または質を低下させることなく宿主の骨量を少な
くとも１０％増加させる化合物を選択する方法が提供され、その方法は、化合物
が （ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定
数でエストロゲンまたはアンドロゲン受容体（また、宿主動物中の同等受容体）
に結合する； （ｉｉ）（ａ）適宜、インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でま
たはインビトロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有するかまたは
アンドロゲンまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に１０−１ １ 〜１０−７Ｍの濃度で投与したときテストステロンまたは１７β−エストラジ
オールの１０％以下、好ましくは１７β−エストラジオールまたはテストステロ
ンの５、１、更には０．１％以下のレベルでエストロゲンまたはアンドロゲン遺
伝子転写活性を誘導するか、或いは（ｂ）適宜、子宮重量または筋肉重量を１７
β−エストラジオールまたはテストステロン（または、宿主動物中の同等化合物
）の１０％以下増加させる； （ｉｉｉ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビ
トロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲ
ンまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に１０−１１〜１０− ７ Ｍの濃度で投与したとき細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を
誘導する；及び （ｉｖ）インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたはインビト
ロで自然アンドロゲンまたはエストロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲン
またはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞において骨芽細胞に対し
て抗アポトーシス効果を有する； かどうかを評価することを含む。
【００７４】 本明細書に記載されている基準に従って選択される化合物は、少ない骨量また
は高い脆弱性により特徴づけられる疾患において骨量を増加させるため及び／ま
たは骨折を予防するためにも使用され得る。前記化合物は、造骨細胞形成が低下
している骨疾患または状態、例えば老人性骨粗しょう症及びグルココルチコイド
が原因の骨粗しょう症、特に骨再構築の妨害が好ましくない成長中の子供や青年
における骨粗しょう症を治療するために使用することができる。
【００７５】 Ｉ．定義 本明細書中、「エストロゲン化合物」は、発情を起こさせるホルモンの生物学
的活性を有する４環ステロイド化合物、またはそのコンジュゲート化及びエステ
ル化誘導体、または同一の化学組成及び構造を有するが活性形態とは立体化学が
異なるので活性形態の生物学的活性を持たない前記化合物の誘導体を指す。エス
トロゲンの非限定例には、ブロパレストロール、クロロトリアニセン、ジエノエ
ストロール、エピメストロール、エクイリン、エストラプロニケート、エストロ
ピペート、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、ヒドロキシエステ
ロン、メストラノール、エストラジオール、エストリオール、コンジュゲート化
またはエステル化エストロゲン、エストロン、ポリエストラジオール、プロメス
トリエン、キネストラドール、キネストロール、スチルベストロール及びゼラノ
ールが含まれる。
【００７６】 本明細書中、「アンドロゲン化合物」は、睾丸皮質または副実皮質で産生され
得るかまたは合成ホルモンであり、男性二次性的形質を調節するように働く４環
ステロイド化合物、または同一の化学組成及び構造を有するが活性形態とは立体
化学が異なるので活性形態の生物学的活性を持たない前記化合物の誘導体を指す
。アンドロゲン化合物の非限定的例には、ボルデノン、クロステボール、ダナゾ
ール、ドロスタノロン、エピチオスタノール、エチルエストレノール、フルオキ
シメステロン、ホルメボロン、フラザボール、メピチオスタン、メステロロン、
メタンジエノン、メテノロン、メチルテストステロン、ナンドロロン、ノルエタ
ンドロロン、オキサボロン、オキシメトロン、プラステロン、キンボロン、スタ
ノロン、スタノゾロール、テストステロン及びトレンボロンが含まれる。
【００７７】 公知のように、エストロゲン及びアンドロゲンはキラル炭素を有しており、よ
って多数の立体化学構造で存在し得る。通常、１７β−ヒドロキシエストロゲン
は生物学的活性を有するが、１７α−ヒドロキシエストロゲンは性的形質に対し
て僅かしか効果を持たず、よってホルモン様遺伝子転写活性化を殆ど誘導しない
。本発明では、化合物が本発明の特記した基準を満たす限り、生物学的に活性も
しくは不活性、または殆ど活性を持たない構造を含めた立体化学構造のものを使
用することができる。
【００７８】 ニューハンプシャー州ウィルトンに所在のＳｔｅｒａｌｏｉｄｓ，Ｉｎｃ．か
ら発行されている「ステロイド類(Steroids)」の表題のカタログに、多数のエス
トロゲン及びアンドロゲン誘導体を含めた３０００以上のステロイドがリストさ
れている。このカタログは、会社に連絡することにより入手することができ、ま
たｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ．ｃｏｍ．のインターネット上
でも現在得ることができる。このリストに挙げられている化合物はすべて市販さ
れており、よって入手、検討することは簡単であるので本発明で使用するために
選択、購入することができる。また、公知のエストロゲン及びアンドロゲン受容
体結合性化合物を使用してもよい。
【００７９】 用語「骨量」は、骨ミネラルの量を指し、通常Ｄｕａｌ−ＥｎｅｒｇｙのＸ線
吸収計（ＤＥＸＡ）により測定される。
【００８０】 用語「骨強度」は、機械的力に対する抵抗を指し、椎骨の圧縮強度または長骨
の３点屈曲を含めた公知の方法により測定され得る。
【００８１】 用語「骨質」は、非鉱物化骨マトリックスが過度に蓄積することのない正常な
コラーゲン配向を指し、非脱灰骨組織形態計測法を含めた公知の方法により測定
され得る。
【００８２】 用語「骨抗吸収剤」は、骨再構築、または破骨細胞の活性及び／または寿命を
抑制することにより骨吸収を阻止する化合物を指す。
【００８３】 用語「骨減少症」は、構造一体性を損なう閾値以下に骨量が低下した状態を指
す。
【００８４】 本明細書中、用語「代謝性骨疾患」、「整形外科骨疾患」または「歯科疾患」
は、少ない骨量、及び／または骨格及び歯の構造劣化により特徴づけられる状態
と定義される。
【００８５】 本明細書中、用語「アポトーシス」は、形態学的基準及びターミナルウリジン
デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼニック末端ラベリング(Terminal Urid
ine Deoxynucleotidal Transferase Nick End Labeling)（ＴＵＮＥＬ）染色に
より検出される核断片化及び細胞収縮により特徴づけられるプログラム細胞死を
指す。
【００８６】 本明細書中、用語「宿主」は、骨を有する動物を指し、これにはヒト、他の哺
乳動物、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、雄及び雌牛、鳥（ニワトリ、七面鳥及び他の
食用鳥が含まれる）が含まれるが、これに限定されない。
【００８７】 ＩＩ．本発明において有用な化合物 Ａ．少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定 数でエストロゲンαまたはβ受容体に結合するが転写活性化を殆ど示さないエス トロゲン化合物 本発明によれば、本明細書に記載の基準に従ってエストロゲン化合物を評価す
ることにより骨量を有意に増加させるエストロゲン化合物を簡単に選択すること
ができる。
【００８８】 １．エストロゲンαまたはβ受容体への結合 少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数で
エストロゲンαまたはβ受容体（または、宿主動物中の同等受容体）に結合する
化合物を選択しなければならない。前記会合定数は公知の方法により測定するこ
とができる。この例には、リガンド結合アフィニティーを室温で１時間のインキ
ュベーションまたは４℃で一晩の間にトレーサーとしての１０ｎＭ［３Ｈ］エス
トラジオール、精製エストロゲン受容体製剤または細胞質ゾル製剤または無傷の
細胞を用いる競合放射結合アッセイにより測定する受容体結合アッセイが含まれ
る。結合した受容体−リガンド複合体はヒドロキシアパタイトに吸収される。
【００８９】 エストロゲンαまたはβ受容体サブタイプは、リガンド結合及びトランス作用
ドメイン中の主要配列に関して有意に異なる。ＥＲα及びＥＲβは、ホルモン結
合ドメイン／活性化機能−１領域では５６％のアミノ酸相同性を示し、Ａ／Ｂド
メイン／活性化機能−１領域での相同性は２０％にすぎない。ＥＲαとＥＲβの
構造上の違いから、数種の化合物はＥＲαまたはＥＲβのいずれかに結合し得る
が、両方には結合しないと示唆される。このように選択的に結合する化合物のす
べてが本発明の範囲に入ると見做される。
【００９０】 エストロゲン化合物には、ニューハンプシャー州ウィルトンに所在のＳｔｅｒ
ａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．発行の「ステロイド類(Steroids)」、第１１版に記載さ
れており、少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会
合定数でエストロゲン受容体に結合する化合物が含まれる。
【００９１】 ２．エストロゲン誘導転写活性化に対する最小効果 ここでは、エストロゲン誘導転写活性化（または、抑制）に対する効果が最小
のエストロゲン化合物を選択する。この要件は、エストロゲンタイプの化合物に
よる転写活性化の非存在下での受容体結合により骨芽細胞のアポトーシスが低下
するという知見に基づいている。従って、関連しない望ましくないエストロゲン
関連副作用を引き起こすことなく骨に対して最大の治療効果を与えるためには、
転写効果が最小のエストロゲン受容体リガンドを使用すべきである。
【００９２】 受容体結合及び転写活性を分離するために、インビボで少なくとも０．１ｎｇ
／ｋｇ−体重の用量でまたはインビトロで自然エストロゲン受容体を有するかま
たはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に投与したとき１７β−エ
ストラジオールの１０％以下、好ましくは１７β−エストラジオールの５、１、
更には０．１％以下のレベルでエストロゲン遺伝子転写活性を誘導するか、或い
は子宮重量をエストロゲン（または、宿主動物中の同等化合物）の１０％以下増
加させる化合物を選択しなければならない。
【００９３】 特定化合物がインビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量で投与した
ときに１７β−エストラジオールの１０％以下、好ましくは１７β−エストラジ
オールの５、１、更には０．１％以下のレベルでエストロゲン転写活性を誘導す
るどうかは、当該特定化合物を宿主に投与した後にエストロゲン転写活性の代理
マーカーの誘導または抑制レベルをモニターすることにより調べることができる
。エストロゲン転写活性化の代理マーカーの例には、子宮における補体Ｃ−３遺
伝子及びラクトフェリンの発現が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】 別の実施態様では、エストロゲン誘導転写活性のレベルをインビボで評価する
ことができる。特定化合物がインビトロで自然エストロゲン受容体を有するかま
たはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞において１７β−エストラ
ジオールの１０％以下、好ましくは１７β−エストラジオールの５、１、更には
０．１％以下のレベルで転写活性を誘導するどうかは、代理マーカーの誘導また
は抑制レベルをモニターすることにより調べることができる。エストロゲンによ
り誘導または抑制される遺伝子の例には、補体Ｃ−３、ラクトフェリンまたはイ
ンターロイキン−６が含まれるが、これらに限定されない。エストロゲン転写活
性のための好ましいマーカー遺伝子は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝
子を動かすＥＲＥのコピーを１つ以上含む最小遺伝子である。
【００９５】 使用可能な細胞系の例には、ヒト子宮ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎細胞２９３、マ
ウス骨細胞ＭＬＯ−Ｙ４細胞、及びマウス骨芽細胞頭蓋冠からの細胞が含まれる
。
【００９６】 インビボで特定化合物を投与後の子宮重量の増加を評価することができる。好
ましい化合物は、子宮重量をエストロゲン（または、宿主動物中の同等化合物）
の約１０％以下増加させる。これは公知のプロトコルに従って簡単に試験するこ
とができる。例えば、実験マウスにおいて子宮を取りだし、隣接の靱帯及び脂肪
を除去する。湿潤重量をＭｅｔｔｌｅｒ ＰＢ３０３マイクログラムはかり（Ｔ
ｏｌｅｄｏ）で測定し、動物のエストロゲン状態の指標として総体重（ｍｇ／１
００ｇ，ＢＷ）と比較した。女性では、同様の評価を子宮超音波を用いて実施す
ることができる。
【００９７】 有意なエストロゲン様転写活性を誘導しないエストロゲン化合物の例には、エ
ストラトリエン−３−オール、１７α−エストラジオール、ＢＳＡとコンジュゲ
ートした１７β−エストラジオールが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】 ３．細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化の誘導 特定化合物は、インビトロで自然エストロゲン受容体を有するかまたはエスト
ロゲン受容体を公知の方法を用いてトランスフェクトした細胞において１０−１ １〜１０−７Ｍの濃度でＥＲＫのリン酸化を誘導しなければならない。前記した
公知方法には、図８〜９及び実施例７〜９に記載されている方法が含まれるが、
これらに限定されない。
【００９９】 ＥＲＫのリン酸化は、インビトロで自然エストロゲン受容体を有する骨芽細胞
もしくは骨細胞かまたはエストロゲン受容体をトランスフェクトした細胞を用い
て簡単に評価される。ＭＬＯ−Ｙ４細胞におけるＥＲＫのリン酸化の評価は図８
〜９及び実施例７〜９に例示されている。他の適当な細胞モデルには、新生マウ
スの頭蓋冠から単離した骨芽細胞が含まれる。
【０１００】 ４．少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重のインビボ用量または１０−１１〜１ ０−７Ｍまたはそれ未満のインビトロ濃度での骨芽細胞に対する抗アポトーシス 効果 インビボでの骨芽細胞に対する抗アポトーシス効果は、図２及び実施例３に記
載されている方法を含めた公知の方法により評価され得る。インビトロでの抗ア
ポトーシス効果は、図３〜７、図１０、実施例２〜６及び実施例９に記載されて
いる方法を含めた公知の方法により評価され得る。
【０１０１】 Ｂ．少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定 数でエストロゲンαまたはβ受容体に結合するが、転写活性化を殆ど示さない非 エストロゲン化合物 １．エストロゲンαまたはβ受容体に結合する非エストロゲン化合物 本明細書中、「非エストロゲン化合物」は、少なくとも１０８Ｍ−１、好まし
くは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数でエストロゲンαまたはβ受容体に結
合する、上に定義したエストロゲン以外の化合物を指す。エストロゲンではない
が、エストロゲン受容体に結合する化合物は多数報告されている。
【０１０２】 前記した非エストロゲン化合物の例には、Ｓｕｎら，「エストロゲン受容体−
αまたはエストロゲン受容体−βに対する選択的エストロゲンまたはアンチエス
トロゲンとして機能する新規なリガンド(Novel Ligands that Function as Sele
ctive Estrogens or Antiestrogens for Estrogen Receptor-alpha or Estrogen
Receptor-beta)」，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０：２（１９９９）に
記載されているアリール置換ピラゾールが含まれ、その１例を以下に示す。
【０１０３】 別の実施態様では、エストロゲンまたは非エストロゲン化合物は、エストロゲ
ン受容体に対する結合を有意に妨害しないがエストロゲンが細胞に入るのを実質
的に防止する第２部分に共役結合している。１例では、前記した第２部分はタン
パク質、例えばウシ血清アルブミン、ポリエチレングリコールまたはデキストラ
ン、またはリポソームである。別の例では、第２部分はタンパク質でもペプチド
でもなく、極性、立体または他の理由のために細胞の進入を防止する。このよう
な部分の例には、カルボキシレート、アンモニウム及びスルフィドが含まれる。
本明細書中、「リンキング部分」は２つの残基を結合する２価の基であり、その
例にはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ポリアルキレンオキシ（
例えば、−［（ＣＨ２）ｎＯ−］ｎ−）、−Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−１０ア
ルキル−、−Ｃ１−６アルキルチオ−Ｃ１−１０アルキル−、−ＮＲ３−、及び
−（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨ（式中、ｎは独立して０、１、２、３、４、５また
は６である）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、リンキング部分
のいずれかの末端で適当な官能基により当該構造に結合し得る。別の実施態様で
は、結合部分は式： Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ （式中、Ｘ及びＹは結合し得る官能基であって、例えばヒドロキシル、スルフヒ
ドリル、カルボキシル及びアミノ基からなる群から独立して選択され、ｎは０〜
２４の整数であり得る） を有する二官能性リンカー部分である。
【０１０４】 Ｃ．少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定 数でアンドロゲン受容体に結合するが転写活性化を殆ど示さないアンドロゲン化 合物 本発明によれば、本明細書に記載の基準に従ってアンドロゲン化合物を評価す
ることにより骨量を有意に増加させるアンドロゲン化合物も簡単に選択すること
ができる。
【０１０５】 １．アンドロゲン受容体に対する結合 少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数で
アンドロゲン受容体（または、宿主動物中の同等受容体）に結合する化合物を選
択しなければならない。アンドロゲン受容体に結合する会合定数は、非占有受容
体の５０％を飽和し得るリガンドの濃度と定義される。この定数は公知の方法に
より測定される。その例には、リガンド結合アフィニティーを室温で１時間のイ
ンキュベーションまたは４℃で一晩の間にトレーサーとしての１０ｎＭ［３Ｈ］
合成アンドロゲンＲＵ１８８１、精製アンドロゲン受容体製剤または細胞質ゾル
製剤または無傷の細胞を用いる競合放射結合アッセイにより測定する受容体結合
アッセイが含まれる。結合した受容体−リガンド複合体はヒドロキシアパタイト
に吸収される。
【０１０６】 アンドロゲン化合物には、ニューハンプシャー州ウィルトンに所在のＳｔｅｒ
ａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．発行の「ステロイド類(Steroids)」、第１１版に記載さ
れており、少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会
合定数でアンドロゲン受容体に結合する化合物が含まれる。
【０１０７】 ２．アンドロゲン誘発転写活性化に対する最小効果 ここでは、アンドロゲン誘導転写活性化に対する効果が最小のアンドロゲン化
合物を選択する。この要件は、骨芽細胞のアポトーシスがアンドロゲンタイプの
化合物による転写活性化の非存在下での受容体結合により低下するという知見に
基づいている。従って、関連しない望ましくないアンドロゲン関連副作用を引き
起こすことなく骨に対して最大の治療効果を与えるためには、転写活性が最小の
アンドロゲン受容体リガンドを使用すべきである。
【０１０８】 受容体結合及び転写活性を分離するために、インビボで少なくとも０．１ｎｇ
／ｋｇ−体重の用量でまたはインビトロで自然アンドロゲン受容体を有するかま
たはアンドロゲン受容体をトランスフェクトした細胞に投与したときテストステ
ロンの１０％以下、好ましくはテストステロンの５、１、更には０．１％以下の
レベルでアンドロゲン転写活性を誘導するか、或いは前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
前立腺血清アンドロゲンをテストステロン（または、宿主動物中の同等化合物）
の１０％以下増加させる化合物を選択しなければならない。
【０１０９】 特定化合物がインビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量で投与した
ときにテストステロンの１０％以下、好ましくはテストステロンの５、１、更に
は０．１％以下のレベルでアンドロゲン遺伝子転写活性を誘導するどうかは、当
該特定化合物を宿主に投与した後にアンドロゲン転写活性の代理マーカーの誘導
または抑制レベルをモニターすることにより調べることができる。アンドロゲン
転写活性化の代理マーカーの例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるが
、これに限定されない。
【０１１０】 別の実施態様では、アンドロゲン誘導転写活性のレベルをインビトロで自然ア
ンドロゲン受容体を有する骨芽細胞または骨細胞、ｔｒａｆ頭蓋冠細胞、ＭＬＯ
−Ｙ４骨細胞及びＨｅＬａ細胞において評価することができる。
【０１１１】 また、特定化合物を投与後のＰＳＡ血清レベルの増加を評価することができる
。適当な化合物は、アンドロゲン受容体をトランスフェクトしたＰＳＡ細胞にお
いてＰＳＡ血清レベルを増加させる。前記細胞系の例には、テストステロン（ま
たは、宿主細胞中の同等化合物）の約１０％以下のＰＳＡの主要培養物が含まれ
る。これは、公知の方法に従って試験することができる。
【０１１２】 有意なアンドロゲン様転写活性を誘導しないアンドロゲン化合物の例には、テ
ストステロン、ＢＳＡとコンジュゲートした１７β−ヘミスクシネートが含まれ
るが、これらに限定されない。
【０１１３】 ３．細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化の誘導 特定化合物は、インビボで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重の用量でまたは
インビトロで自然アンドロゲン受容体を有するかまたはアンドロゲン受容体をト
ランスフェクトした細胞に投与したとき１０−１１〜１０−７Ｍの濃度でＥＲＫ
のリン酸化を誘導しなければならない。
【０１１４】 宿主におけるＥＲＫのリン酸化は、リン酸化ＥＲＫに対する特異的抗体を用い
て免疫組織染色することにより例えば骨からの生検で評価することができる。ま
た、ＥＲＫのリン酸化は、インビトロで自然アンドロゲン受容体を有する骨芽細
胞または骨細胞またはアンドロゲン受容体をトランスフェクトした細胞を用いて
も簡単に評価される。ＭＬＯ−Ｙ４細胞におけるＥＲＫのリン酸化の評価は図８
〜９及び実施例７〜９に例示されている。
【０１１５】 ４．少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ−体重のインビボ用量または１０−１１〜１ ０−７Ｍまたはそれ未満のインビトロ濃度での骨芽細胞及び骨細胞に対する抗ア ポトーシス効果 骨芽細胞及び骨細胞に対する抗アポトーシス効果は、インビボでは図２及び実
施例１に記載されている方法を含めた公知の方法により、インビトロでは図３〜
７、図１０、実施例２〜６及び実施例９に記載されている方法を含めた公知の方
法により評価され得る。
【０１１６】 Ｄ．少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１であるが
、転写活性化をほとんど示さない結合定数でアンドロゲンレセプターに結合する
非アンドロゲン化合物 本明細書中で使用される、「非アンドロゲン化合物」は、上記に定義のように
、少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１である結合定
数でアンドロゲンレセプターに結合する、アンドロゲン以外の化合物をいう。ア
ンドロゲンではないがアンドロゲンレセプターに結合する化合物は多数報告され
ている。例として、ＢＳＡに結合するテストステロン１７βヘミスクシネートが
含まれる。
【０１１７】 別の実施形態では、アンドロゲン化合物は、アンドロゲンレセプターへの結合
を有意に阻害しないがアンドロゲンの細胞への侵入を実質的に阻害する第２の部
分に共有結合する。一例として、第２の部分は、ウシ血清アルブミンなどのタン
パク質である。別の実施形態では、第２の部分はタンパク質またはペプチドでは
なく、極性、高次構造、または他の理由で細胞侵入を妨害する。これらの型の部
分の例には、デキストランまたはポリエチレングリコールが含まれる。
【０１１８】 Ｅ．骨質量増加に使用することができる他の化合物 本発明での骨質量の増加に使用することができる他の非限定的な例として、末
端にフェニル環（少なくとも第２の炭素環）を有するものが含まれる。これらの
必要な構造に加えて、化合物は、フェニル環または他の位置の任意の利用可能な
部位に結合した多数のＲ基を有しても良い。これらのＲ基を、無機または有機原
子または部分から選択することができる。代表的なＲ基を以下に提供するが、こ
れらの例によって本発明は限定されない。
【０１１９】 （ａ）Ｒ１またはＲ２基は、任意のハロゲン基、アミド基、硫酸塩基、硝酸塩
基、フルオロ基、クロロ基、またはブロモ基を含むヒドロキシル基または無機Ｒ
基を含み得る。さらに、ナトリウム塩、カリウム塩、および／またはアンモニウ
ム塩などのＲ１またはＲ２基は、構造中の任意の利用可能な炭素上で水素を置換
するためにα位またはβ位に結合することができる。Ｒ１またはＲ２基は有機で
あり、有機分子およびイオンの混合物を含むことができる。有機Ｒ１またはＲ２ 基は、直鎖または分岐鎖で６つまでの炭素を含むアルカン、アルケン、またはア
ルキンを含むことができる。例えば、さらなるＲ１またはＲ２基の置換基は、メ
チル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ジメチル、
イソブチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、
メチルフェニル、ネオペンチル、イソヘキシル、ヘキセニル、ヘキサジエン、１
，３−ヘキサジエン−５−エン、ビニル、アリル、イソプロペニル、エチニル、
エチリデン、ビニリデン、イソプロピリデン、メチレン、スルフェート、メルカ
プト、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、メチルスルフィニル、メチルス
ルホニル、チオヘキサニル、チオベンジル、チオフェノール、チオシアナト、ス
ルホエチルアミド、チオニトロシル、チオホスホリル、ｐ−トルエンスルホネー
ト、アミノ、イミノ、シアノ、カルバモイル、アセトアミド、ヒドロキシアミノ
、ニトロソ、ニトロ、シアナト、セレシアナト、アークコサイン（ａｒｃｃｏｓ
ｉｎｅ）、ピリジニウム、ヒドラジン、セミカルバゾン、カルボキシメチルアミ
ド、オキシム、ヒドラゾン、スルフルトリメチルアンモニウム、セミカルバゾン
、ｏ−カルボキシメチルオキシム、アルデヒドヘミアセテート、メチルエーテル
、エチルエーテル、プロピルエーテル、ブチルエーテル、ベンジルエーテル、メ
チルカルボネート、カルボキシレート、アセテート、クロロアセテート、トリメ
チルアセテート、シクロペンチルプロピオネート、プロピオネート、フェニルプ
ロピオネート、炭酸メチルエーテル、ホルメート、ベンゾエート、ブチレート、
カプリレート、シンナメート、デシレート、ヘプチレート、エナンテート、グル
コシドウロネート、スクシネート、ヘミスクシネート、パルミテート、ノナノエ
ート、ステアレート、トシレート、バレレート、バルポエート、デカノエート、
ヘキサヒドロベンゾエート、ラウレート、ミリステート、フタレート、ヒドロキ
シル、エチレンケタール、ジエチレンケタール、ホルメート、クロロホルメート
、ホルミル、ジクロロアセテート、ケト、ジフルオロアセテート、エトキシカル
ボニル、トリクロロホルメート、ヒドロキシメチレン、エポキシ、ペルオキシ、
ジメチルケタール、アセトニド、シクロヘキシル、ベンジル、フェニル、ジフェ
ニル、ベンジリデン、およびシクロプロピル基を含み得る。Ｒ１またはＲ２基は
、任意の構成要素の環と結合して、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、またはｖ
−トリアジンを形成することができる。さらなるＲ１またはＲ２基の置換基は、
以下の第（ｂ）節に記載の任意の６員環または５員環を含み得る。
【０１２０】 （ｂ）末端のフェニル基に加えて、上記の第（ａ）節に記載の任意の置換基を
有する芳香族または非芳香族フェノール環であり、さらに、１つまたは複数の以
下の構造であり得る少なくとも１つの複素環式炭素環（図１ではＲ３と記載）を
含む任意の化合物：フェナントレン、ナフタレン、ナフトール、ジフェニル、ベ
ンゼン、シクロヘキサン、１，２−ピラン、１，４−ピラン、１，２−ピロン、
１，４−ピロン、１，２−ダイオキシン、１，３−ダイオキシン（ジヒドロ形態
）、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、ｓ−トリアジ
ン、ａｓ−トリアジン、ｖ−トリアジン、１，２，４−オキサジン、１，３，２
−オキサジン、１，３，６−オキサジン（ペントオキサゾール）、１，２，６−
オキサジン、１，４−オキサジン、ｏ−イソキサジン、ｐ−イソキサジン、１，
２，５−オキサチアジン、１，２，６−オキサチアジン、１，４，２−オキサジ
アジン、１，３，５，２−オキサジアジン、モルホリン（テトラヒドロ−ｐ−イ
ソキサジン）、化合物の末端基である上記の任意の６員環構造。さらに、任意の
上記の炭素環構造は、直接または結合基を介して、以下を含む任意のさらなる複
素環式芳香族または非芳香族炭素環に結合することができる：フラン、チオフェ
ン（チオフラン）、ピロール（アゾール）、イソピロール（イソアゾール）、３
−イソピロール（イソアゾール）、ピラゾール（１，２−ジアゾール）、２−イ
ソイミダゾール（１，３−イソジアゾール）、１，２，３−トリアゾール、１，
２，４−トリアゾール、１，２−ジチアゾール、１，２，３−オキサチアゾール
、イソキサゾール（フロ（ａ）モノゾール）、オキサゾール（フロ（ｂ）モノゾ
ール）、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−オキサチアゾール、１，２
，４−オキサチアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，５−オキサ
ジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサト
リアゾール、１，２，３−ジオキサゾール、１，２，４−ジオキサゾール、１，
３，２−ジオキサゾール、１，３，４−ジオキサゾール、１，２，５−オキサチ
アゾール、１，３−オキサチアゾール、シクロペンタン。同様に、これらの化合
物は、炭素環上の任意の利用可能な部位で置換されている第（ａ）節または第（
ｂ）節から選択されるＲ１またはＲ２基と会合することができる。
【０１２１】 （ｃ）シクロペンタノフェン（ａ）アントレン環化合物を形成することができ
、例えば、１，３，５（１０）、６，８−エストラペンタエン、１，３，５（１
０）、６，８，１１−エストラペンタエン、１，３，５（１０）、６，８，１５
−エストラペンタエン、１，３，５（１０），６−エストラテトラエン、１，３
，５（１０），７−エストラテトラエン、１，３，５（１０），８−エストラテ
トラエン、１，３，５（１０），１６−エストラテトラエン、１，３，５（１０
），１５−エストラテトラエン、１，３，５（１０）−エストラトリエン、１，
３，５（１０），１５−エストラトリエンからなる群から選択することができる
上記の基を含む任意の化合物。
【０１２２】 （ｄ）ラロキシフェン、タモキシフェン、アンドロゲン化合物、およびその塩
から選択される前駆体または誘導体を含む任意の化合物（式中、完全なフェノー
ル環は、末端フェノール基の炭素１、２、３、および４位に存在するヒドロキシ
ル基と共に存在する）。
【０１２３】 （ｅ）代謝されて骨保護活性を有する活性な多環フェノール化合物を形成する
ことができるプロドラッグ形態の任意の化合物。
【０１２４】 ＩＩＩ．活性化合物の使用法 本明細書中に詳細に記載した基準を満たす活性化合物を使用して、骨質量の確
立に有用または必要な任意の条件を含む広範な種々の医学的条件を治療すること
ができる。骨喪失（不適切な骨芽細胞のアポトーシス）についての基本的根拠の
発見により、初めて、単なる骨喪失の治療とは対照的な健常な骨の確立を想定す
ることができる。
【０１２５】 活性化合物は、宿主（ヒトを含む）における骨同化剤として使用して、スポー
ツまたは肉体労働などの激しい身体活動のために骨を強化し、骨粗鬆症ではない
が宿主が骨粗鬆症の危険群であるので、将来的に骨粗鬆症に罹患する可能性のあ
るヒトまたは他の宿主の骨を強化することができる。ヒトにおける骨同化剤の他
の用途には、生来細いか、小さいか、通常もろい骨（弱い歯を含む）である患者
、遺伝的骨異化疾患または整形外科的骨疾患（骨変性、非癒合性骨折、糖尿病、
移植片周囲の炎症（ｐｅｒｉｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）、骨移植片、移植組織に
対する不十分な応答または骨折に起因する整形外科的問題など）の傾向のある患
者を含む宿主の治療が含まれる。
【０１２６】 これらの化合物を使用して、労働ならびに競争などのスポーツで使用するウマ
およびイヌの骨質量を増加させることができる。この化合物を使用して、処理を
容易にするために精肉に使用されるニワトリおよびシチメンチョウの骨質量を増
加させることもできる。
【０１２７】 代表的な代謝骨疾患は、閉経後の骨粗鬆症、男性および女性の老人性骨粗鬆症
、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、固定化誘導性骨粗鬆症、無重力状態誘導性
骨粗鬆症（宇宙飛行による）、移植後骨粗鬆症、移動性骨粗鬆症、特発性骨粗鬆
症、若年性骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不完全、慢性副甲状腺機能亢進症、
甲状腺機能亢進症、リウマチ様関節炎、ゴーラム−ストウト病、マックキューン
−オールブライト症候群、種々の癌または多発性骨髄腫の溶骨性転移である。整
形外科的骨疾患の特徴は、骨質量の喪失、全体的な骨の脆弱性、関節変性、非癒
合性骨折、糖尿病、移植片周囲の炎症、骨移植片／移植組織／骨置換物質に対す
る不十分な反応、歯周疾患、および骨の老化ならびにその結果に起因する整形外
科的および歯科的問題である。
【０１２８】 ＩＶ．骨質量を増加させる化合物のスクリーニング法 本発明は、ａ）骨芽細胞サンプルと化合物とを接触させる工程と、ｂ）前記化
合物で治療した細胞におけるアポトーシスを受けた骨芽細胞数と未治療の骨芽細
胞サンプルにおけるアポトーシスを受けた骨芽細胞数とを比較する工程とを包含
する、骨同化効果を有する化合物のスクリーニング法を提供する。化合物との接
触後のアポトーシス細胞数の減少により、この化合物は骨同化効果を有すること
が示される。好ましい化合物は、骨細胞のアポトーシスも阻害する。一般に、化
合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞培養）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば
、動物モデル）のいずれかでサンプルと接触させることができる。典型的なアポ
トーシスの同定法は、核の形態学的基準、ＤＮＡ末端標識、ＤＮＡ断片化分析、
および免疫組織化学的分析である。
【０１２９】 別の実施形態では、骨の強度または質を損失することなく少なくとも宿主の１
０％の骨質量を増加させる化合物の選択法を提供し、これには、化合物が（ｉ）
少なくとも１０８Ｍ−１，好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の結合定数でエ
ストロゲンまたはアンドロゲンレセプター（または宿主動物における等価のレセ
プター）に結合する、（ｉｉ）（ａ）天然のアンドロゲンまたはエストロゲンレ
セプターを有する細胞にｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ体重の投
薬量またはｉｎ ｖｉｔｒｏで１０−１１Ｍから１０−７Ｍの濃度で投与するか
アンドロゲンまたはエストロゲンレセプターでトランスフェクトした場合、テス
トステロンまたは１７βエストラジオールのレベルの１０％未満、好ましくは、
１７βエストラジオールまたはテストステロンのレベルの５％、１％、または０
．１％のレベルでエストロゲンまたはアンドロゲン遺伝子転写活性を誘導するか
または（ｂ）１７βエストラジオールまたはテストステロン（または宿主動物に
おける等価の化合物）によって誘導される、適切には１０％未満の子宮もしくは
筋肉の増加または女性の男性化の増加を誘導するかどうか、（ｉｉｉ）ｉｎ ｖ
ｉｖｏで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ体重の投薬量またはｉｎ ｖｉｔｒｏで天
然のアンドロゲンまたはエストロゲンレセプターを有する細胞に投与するかアン
ドロゲンまたはエストロゲンレセプターでトランスフェクトした場合に細胞外シ
グナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘導するかどうか、および（ｉｖ）
ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇ体重の投薬量またはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで天然のアンドロゲンまたはエストロゲンレセプターを有する細胞に投与す
るかアンドロゲンまたはエストロゲンレセプターでトランスフェクトした場合に
骨芽細胞に対して適切な効果を有するかどうかを評価する工程を含む。
【０１３０】 別の実施形態では、エストロゲンまたはアンドロゲンに結合し、転写を活性化
することなく抗アポトーシスシグナル経路を活性化する化合物のスクリーニング
法を提供する。本方法は、アポトーシス阻害に必要なエストロゲンレセプタータ
ンパク質のリガンド誘導性高次構造変化が転写活性に必要な高次構造変化から明
白であるという基本的発見に基づく（図１９〜図２１）。この発見により、小分
子の巨大なライブラリーから抗アポトーシスであるが転写活性を有さない化合物
を選択することができる。リガンド活性化レセプターの転写活性を特異的に阻害
することができるがレセプターの抗アポトーシスシグナルカスケード開始能力を
阻害しない小さなペプチドを用いて選択を行う。
【０１３１】 これを達成するために、転写活性化に必要なタンパク質の高次構造を認識する
が抗アポトーシスであるペプチドを有するか有さないエストロゲンまたはアンド
ロゲンレセプターで細胞をトランスフェクトする。この方法を用いて、転写およ
び抗アポトーシスの両方に適合する高次構造が得られる高次構造変化を誘導する
化合物を、後者の高次構造の変化のみを誘導する化合物と区別することができる
。
【０１３２】 このスクリーニング法の例として、以前に記載の親和性選択法（Ｓｐａｒｋｓ
ＡＢ、Ａｄｅｙ ＮＢ、Ｃｗｉｒｌａ Ｓ、Ｋａｙ ＢＫ、Ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、
Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ Ｋａｙ ＢＫ、Ｗｉｎｔ
ｅｒ Ｊ、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ．編、（Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ）、２２７〜２５３、１９９６）に従ったビオチン化ビテロゲニン
ＥＲＥを用いて、精製レセプタータンパク質をストレプトアビジン被覆プレート
上に肯定するＥＲαまたはＥＲβについてのペプチド結合アッセイが含まれるが
、これに限定されない。種々のリガンドとのインキュベーション後、ペプチドを
添加し、３０分後に結合したペプチドを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させ
た抗Ｍ１３抗体を用いて検出する。レセプターに結合したペプチド（すなわち、
ペプチドはレセプターに結合する）によって認識された高次構造の変化を誘導す
る化合物を捨てた。次いで、残りの化合物を、抗アポトーシス効力についてスク
リーニングする。
【０１３３】 Ｖ．併用療法 本発明の１つの態様では、骨質量を増大させるために、本明細書中に記載の１
つの活性化合物を、第２の薬学的薬剤と組み合わせて宿主に投与することができ
る。第２の薬学的薬剤は、抗骨吸収剤、第２の骨質量同化剤、抗酸化剤、栄養補
助食品、または骨の構造、強度、密度、または質量に対する活性化合物の有利な
効果を増加させる任意の他の薬剤であり得る。
【０１３４】 骨粗鬆症の治療に使用される発明の背景に記載の１０クラスの薬物の任意のメ
ンバーを、主要な活性剤（同化ステロイド、二リン酸塩、カルシトニン、エスト
ロゲンもしくはプロゲステロン、抗エストロゲン（ラトキシフェンもしくはタモ
キシフェン）、副甲状腺ホルモン（「ＰＴＨ」）、フルオリド、ビタミンＤもし
くはその誘導体、またはカルシウム調製物が含まれる）と組み合わせて投与する
ことができる。
【０１３５】 組み合わせに適切な薬剤の例として、アレンドロン酸、クロンドロン酸二ナト
リウム、エチドロン酸二ナトリウム、メドロン酸二ナトリウム、オキシドロン酸
二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、ネリドロン酸、リセドロン酸、酢酸
テリパラチド、チルドロン酸、イプリフラボン、重炭酸カリウム、プロゲストゲ
ン、チアジド、硝酸ガリウム、ＮＳＡＩＤＳ、プリカマイシン、水酸化アルミニ
ウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウム、炭酸マグネシウム、およ
びスクラルフェートが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】 グルタチオンまたは他の抗酸化剤などの還元剤もまた、本発明の任意の化合物
と組み合わせに有用であり得る。本明細書中で使用される時、用語「抗酸化剤」
は、生理学的条件下で酸化可能な化合物の酸化を防止する物質をいう。１つの実
施形態では、化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内因性の酸素ラジカルを還元する場
合、この開示の目的の抗酸化剤と考えられる。抗酸化剤を、酸化条件下で細胞抽
出物に添加し、酸化可能な化合物に対する効果を評価することができる。例とし
て、抗酸化剤は、酸素、スーパーオキシド陰イオン、過酸化水素、スーパーオキ
シドラジカル、リポ酸化ラジカル、ヒドロキシルラジカル（これらに限定されな
い）を除去し、反応物質に結合して脂質、タンパク質、核酸などの酸化によるダ
メージを防止する。用語「抗酸化剤」には、以下のクラスの化合物が含まれるが
、これらに限定されない。
【０１３７】 Ａ）ジチオカルバメート：ジチオカルバメートは、特許書類および科学文献に
広く一般に記載されている。ジチオカルバメートおよび関連化合物は、例えば、
Ｇ．Ｄ．Ｔｈｏｒｎら、「ジチオカルバメートおよび関連化合物」、Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９６２に広範に記載されている。ジチオカルボキ
シレートは、チオール抗酸化剤として公知の一般的なクラスの化合物のメンバー
であるＡ−ＳＣ（Ｓ）−Ｂの構造の化合物であり、カルボジチオールまたはカル
ボジチオレートともいう。−ＳＣ（Ｓ）−部分は、治療活性に必須であり、Ａお
よびＢは化合物の有効性または毒性に逆効果を示さない任意の基であり得るよう
である。ＡおよびＢを、サイズ、電荷、毒性、および安定性（胃などの酸性環境
および腸管などの塩基性環境における安定性を含む）を含む所望の特徴を化合物
に与えるように、当業者によって選択することができる。ＡおよびＢの選択によ
り、化合物の組織分布および薬物動態学に重要な影響も与える。化合物は、腎排
泄によって排泄されることが好ましい。
【０１３８】 Ｂ）Ｎ−アセチルシステインおよびその誘導体 システインは１つのキラルな炭素原子を有するアミノ酸である。これは、Ｌ−
エナンチオマー、Ｄ−エナンチオマーまたはＬ−およびＤ−エナンチオマーのラ
セミ混合物として存在する。Ｌ−エナンチオマーは、天然に存在する配置である
。
【０１３９】 Ｎ−アセチルシステイン（アセトアミド−メルカプトプロピオン酸、ＮＡＣ）
は、システインのＮ−アセチル化誘導体である。これはまた、Ｌ−エナンチオマ
ー、Ｄ−エナンチオマー、いずれか１つのエナンチオマーが豊富な化合物、また
はＬ−およびＤ−エナンチオマーのラセミ混合物として存在する。用語「エナン
チオマーが豊富な組成物または化合物」は、少なくとも９５重量％、好ましくは
少なくとも９７重量％の単一のエナンチオマーを含む組成物または化合物をいう
。ＮＡＣのこれらの任意の形態を、本発明の抗酸化剤として送達させることがで
きる。１つの実施形態では、ＮＡＣのチオエステルもしくはチオエーテルの単一
の異性体またはその塩、最も好ましくは、天然に存在するＬ−エナンチオマーを
、治療プロセスに使用する。
【０１４０】 Ｎ−アセチルシステインは、抗酸化活性を示す（Ｓｍｉｌｋｓｔｅｉｎ、Ｋｎ
ａｐｐ、Ｋｕｌｉｇ ａｎｄ Ｒｕｍａｃｋ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１
９８８、３１９巻、１５５７〜６２頁、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｋ．Ｒ．、ＭａｃＰｈａ
ｄｙｅｎ，Ｋ．、Ｌｅｐｏｒｅ，Ｄ．Ａ．、Ｋｕｗａｔａ，Ｎ．、Ｅａｄｉｅ，
Ｐ．Ａ．、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｂ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉ．、１９９１、８
１、３１〜３６、Ｅｌｌｉｓ，Ｅ．Ｆ．、Ｄｏｄｓｏｎ，Ｌ．Ｙ．、Ｐｏｌｉｃ
ｅ，Ｒ．Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、１９９１、７５巻、７７４〜７７９
頁）。スルフヒドリル官能基は、十分に特徴づけられた、反応性の高い遊離ラジ
カルスカベンジャーである。Ｎ−アセチルシステインは、還元状態における細胞
成分の維持に重要であるグルタチオン（トリペプチド、ｇ−グルタミルシステイ
ニルグリシンとしても公知）の形成を促進することが公知である（Ｂｅｒｇｇｒ
ｅｎ，Ｍ．、Ｄａｗｓｏｎ，Ｊ．、Ｍｏｌｄｅｕｓ，Ｐ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
．、１９８４、１７６、１８９〜１９２）。グルタチオンの形成は、グルタチオ
ンペルオキシダーゼ（過酸化水素を不活化する酵素で、ヒドロキシルラジカルに
対する公知の前駆体）の活性を増加させることができる（Ｌａｌｉｔｈａ，Ｔ．
、Ｋｅｒｅｍ，Ｄ．、Ｙａｎｎｉ，Ｓ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、１９９０、６６巻、５６〜６１頁）。
【０１４１】 Ｎ−アセチルシステインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性が低く、デプレニルより
有意に毒性が低い（例えば、ラットにおけるＬＤ５０は、Ｎ−アセチルシステイ
ンおよびデプレニルについてそれぞれ１１４０および８１ｍｇ／ｋｇと測定され
ている）。
【０１４２】 Ｎ−アセチルシステインおよびその誘導体は、例えば、ＷＯ／０５／２６７１
９に記載されている。この公開で記載されている任意の誘導体を、本発明で使用
することができる。
【０１４３】 Ｃ）カタラーゼおよびピルビン酸塩を含むがこれらに限定されない、ペルオキ
シダーゼのスカベンジャー。
【０１４４】 Ｄ）ジチオスレイトールおよび２−メルカプトエタノールを含むチオール。
【０１４５】 Ｅ）ＴｒｏｌｏｘＴＭ、ＢＨＡ、ＢＨＴ、アミノステロイド抗酸化剤、トコフ
ェロール、およびそのアナログならびにラザロイドを含むが、これらに限定され
ない、脂質過酸化のインヒビターである抗酸化剤。
【０１４６】 Ｆ）抗酸化ビタミン（ビタミンＣもしくはビタミンＥまたは合成もしくは天然
のプロドラッグまたはそのアナログ）のみまたはフラボノイド、フェノール系化
合物、カロテノイド、およびαリポ酸との組み合わせを含む食品抗酸化剤。
【０１４７】 Ｇ）非ステロイド性抗炎症薬、ＣＯＸ−２インヒビター、ベースの化合物、お
よびケルセチンを含むが、これらに限定されないリポキシゲナーゼおよびシクロ
オキシゲナーゼのインヒビター。
【０１４８】 Ｈ）ユビキノールおよびチオール抗酸化剤などを含み、グルタチオン、Ｓｅ、
およびリポ酸を含むが、これらに限定されない体内で生成される抗酸化剤。
【０１４９】 Ｉ）第１相および第２相薬物代謝酵素を誘導する、合成フェノール系抗酸化剤 ＶＩ．薬学的組成物 本明細書中に詳述の基準によって選択した活性化合物またはその薬学的に許容
可能な塩を、任意選択的に薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と共に、本
明細書中に記載の任意の病状の治療有効量で投与することができる。
【０１５０】 活性物質を、液体形態または固体形態で、全身、局部、または局所送達に適切
な任意の経路（例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、口腔内、鼻腔内、
吸入、膣内、直腸、または局所）で投与することができる。本発明の化合物の投
与法は、特定の用量または調節された放出賦形剤によることができる。
【０１５１】 活性化合物の好ましい投与様式は、経口である。経口用組成物には、一般に、
不活性希釈剤または食用キャリアが含まれる。活性化合物を、ゼラチンカプセル
に封入するか、錠剤に圧搾することができる。経口治療投与の目的のために、化
合物を、補形薬に組込んで錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用するこ
とができる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質を、組成
物の一部として含めることができる。
【０１５２】 錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分または類似の性質
の化合物を含むことができる：結合剤（微結晶性セルロース、トラガカントガム
、またはゼラチンなど）；補形薬（デンプンまたはラクトースアルギン酸などの
崩壊剤、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチなど）；滑剤
（ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）など）；潤滑
剤（コロイド状二酸化珪素など）；甘味料（スクロースまたはサッカリンなど）
；および／または香味料（ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香
料など）。投薬単位形態がカプセルである場合、化合物は、上記の型の物質に加
えて、脂肪酸などの液体キャリアを含むことができる。さらに、投薬単位形態に
は、投薬単位の物理的形態を改変する種々の他の物質（例えば、砂糖、シェラッ
ク、または他の腸溶剤の被覆）を含むことができる。
【０１５３】 化合物を、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、チューイングガムな
どの成分として投与することができる。活性化合物に加えて、シロップは、甘味
料としてのスクロースおよび一定の香味料を含むことができる。
【０１５４】 化合物または薬学的に許容可能な誘導体または塩を、所望の作用に影響を与え
ない他の活性物質または所望の活性を補助する物質（１７βエストラジオールま
たはエチニルエストラジオールなどの古典的エストロゲン；アレンドロネート、
エチドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ゾレドロ
ネート、シマドロネート、クロドロネート、イバンドロネート、オルパドロネー
ト、ネリドロネート、ＥＢ−１０５３などの二ホスホン酸塩；サケ、ウナギ、ま
たはヒト起源のカルシトニン；グルタチオン、アスコルビン酸、または亜硫酸水
素ナトリウムなどの抗酸化剤）と混合することができる。皮内、皮下、または局
所投与に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌
希釈剤（注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、
グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など）；抗菌薬（ベン
ジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝液（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など）
、および弾力性調整用の薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口
用調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、また
は多剤投与バイアルに封入することができる。静脈内投与する場合、好ましいキ
ャリアは、生理学食塩水またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）である。
【０１５５】 好ましい実施形態では、活性化合物を、体内からの急速な排泄（移植片および
マイクロカプセルに封入した送達系を含む）に対して化合物を保護するキャリア
（放出調節処方物など）と共に調製する。生分解性の生体適合性ポリマー（エチ
レンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオル
ソエステル、およびポリ乳酸など）を使用することができる。このような処方物
の調製法は、当業者に明白である。
【０１５６】 リポソーム懸濁液（特定の細胞の表面抗原に対してモノクローナル抗体で標的
化したリポソームを含む）はまた、薬学的に許容可能なキャリアである。これら
を、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（その全体
が本明細書中で参考として援用される））にしたがって調製することができる。
例えば、リポソーム処方物を、無機溶媒中に適切な脂質（ステアロイルホスファ
チジルコリンおよび／またはコレステロールなど）を溶解した後蒸発させて、容
器表面上に乾燥脂質の薄層を析出させることによって調製することができる。活
性化合物またはその一リン酸塩、二リン酸塩、および／または三リン酸塩誘導体
の水溶液を、容器に注ぐ。ついで、容器を手で回して容器の側面から脂質物質を
遊離させて脂質凝集体を分散させることにより、リポソーム懸濁液を形成させる
。
【０１５７】 用量および投薬の処方計画は、代謝性骨疾患の性質、特定の活性化合物の特徴
（例えば、その治療指数）、患者、患者の病歴、および他の因子に依存する。投
与される非ゲノムエストロゲン様シグナル化合物アクチベーターの量は、典型的
には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。処方計画は、治療効
果を最適化する一方でマイナスの効果に対して均衡をとるように継続される。Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１
７版、１９９０、Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐ
ｅｎｎ．、およびＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌｉｍａｎ’ｓ、Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第
８版、１９９０、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０１５８】 非経口投与では、最も典型的には、活性化合物を、薬学的に許容可能な非経口
賦形剤と共に単位投薬を注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に処方する。
このような賦形剤は、無毒でかつ非治療用であることが好ましい。このような賦
形剤の例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％
ヒト血清アルブミンである。非水賦形剤（不揮発性油およびエチルオレエートな
ど）を使用することもできる。リポソームを、キャリアとして使用することがで
きる。賦形剤は、少量の添加物（等張性および科学安定性を向上させる物質（例
えば、緩衝液および防腐剤など）を含むことができる。非ゲノムエストロゲン様
シグナル化合物のアクチベーターを、典型的には、約１０ｐｇ／ｍｌ〜約１０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でこのような賦形剤中に処方する。
【０１５９】 薬物組成物中の化合物の濃度は、薬物の吸収、不活化、および排泄速度ならび
に当業者に公知の他の因子に依存する。投薬量は、緩和させる病状の重症度によ
っても変化することに留意すべきである。さらに、有効成分を１回投与すること
も、少量を数回に分割して種々の間隔で投与することもできる。任意の特定の患
者用に、個体による必要性ならびに組成物を投与し投与を監視する専門家の判断
にしたがって時間に関する特定の患者用の処方計画を調整すべきであり、本明細
書中に記載の濃度範囲は、例示のみを目的とし、請求の範囲に記載の組成物の範
囲または実施を限定することを意図しないことがさらに理解される。
【０１６０】 ＶＩＩ．例示的実施例 以下の実施例は、上記の本発明の実施形態の例示であり、本発明の範囲を限定
することを意図しない。
【０１６１】 一例として、強力な神経保護化合物である合成ステロイドエストラトリエン−
３−オールおよび１７α−エストラジオールは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞に
抗アポトーシス効果を有する。
【０１６２】 Ｓｉｍｋｉｎｓに付与された米国特許第５，８４３，９３４号は、実体のない
性関連活性を有するエストロゲンおよび特にα−エストロゲン（１７α−エスト
ラジオールなど）を、男性または女性の骨粗鬆症の副作用を抑制するために患者
に投与することができることを開示している。米国特許第５，８４３，９３４号
は、骨粗鬆症に対して骨質量を増大させるためにどのような化合物を選択するか
については議論されていない。米国食品医薬品局が骨粗鬆症治療用の多数の薬物
を承認しているが、現在まで骨同化剤としていかなる薬物も承認していない事実
によって劇的に示されるように、骨質量の増加は、骨喪失治療とは異なる適応症
であう。
【０１６３】 １７β−エストラジオールを、エストロゲンレセプターに強力に結合し、骨芽
細胞のアポトーシスを阻害するので、これがエストロゲン様遺伝子転写の強力な
アクチベーターであるにもかかわらず、これらの例示的実施例において使用する
。化合物を、遺伝子転写を誘導するために細胞に侵入することができないような
方法での化合物の変化によって本発明の選択基準内に当てはまるように改変しな
ければならない。例えば、直接または結合部分（細胞侵入を防止または制限する
第２の部分）を介した共有結合によって、このような改変を行うことができる。
同様に、関連するレセプターに適切に結合する任意の他のエストロゲンまたはア
ンドロゲンを、骨質量増加に使用するために改変することができる。
【０１６４】 （ａ）骨芽細胞および骨細胞の両方に対する１７β−エストラジオールの抗ア
ポトーシス効果は、膜不浸透性１７β−エストラジオール−ＢＳＡ結合物で再生
されること；（ｂ）これらの化合物の抗アポトーシス効果は、ＩＣＩ １８２７
８０（純粋なエストロゲンレセプターアンタゴニスト）によって減少すること；
および（ｃ）これら全ての化合物の抗アポトーシス効果は、これらの細胞がエス
トロゲンレセプターαまたはエストロゲンレセプターβのいずれかで安定にトラ
ンスフェクトされない場合、ＨｅＬａ細胞では認められないことに注目すべきで
ある。
【０１６５】 以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で記載されており、
いかなる様式においても本発明を限定することを意味しない。
【０１６６】 実施例１ エストロゲン喪失後の骨の再構築速度の増加は、骨吸収が骨形成より速く、新
規のＢＭＵによって作製された骨が古い骨より密度が低いので、ミネラルの喪失
が一時的に加速されるはずである。しかし、再構築の増加のみでは、骨再構築速
度の減速後の長期にわたって継続される進行性骨喪失を説明することができない
。実際、エストロゲン欠乏中／後の骨芽細胞および破骨細胞数の変化に加えて、
定量的異常（破骨細胞が正常な腔よりも深く破壊する）も起こる。これにより小
柱状構造を介して頻繁に侵入させて、いくつかの海綿質エレメントの全体的な除
去を引き起こす。残りはより広範に分離してあまり十分に結合しない。より深い
浸食は、破骨細胞のアポトーシスを促進するエストロゲンの効果の喪失によって
説明されている（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１９９６、２、１
１３２〜１１３６、Ｋａｍｅｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６
、４８９〜４９５、Ｒａｉｓｚ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１９９６、２，１０
７７〜１０７８）。１７β−エストラジオールは、破骨細胞のアポトーシスを約
０．５％〜２．７％にまで増加させた。この変化は、破骨細胞の寿命の延長させ
、その数を２〜３倍に増加させることができるので、小柱の穿孔および皮質内部
縁の粉砕が説明される。
【０１６７】 エストロゲン欠乏の役割が骨芽細胞および骨細胞に影響を与えるかどうかを同
定するために、卵巣切除から２８日後の取り除かれたマウス椎骨柱のこれらの細
胞の罹患率を同定した。これらの実験では、４ヶ月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔ
ｅｒマウスを卵巣切除し、２８日後に動物を屠殺して椎骨を単離し、脱灰しない
でメタクリレート中で固定し、包埋した。図２に示すように、ＣｕＳＯ４を増加
させたＴＵＮＥＬによって同定した骨芽細胞および骨細胞アポトーシスの罹患率
は、それぞれ、１０倍および４倍に増加した。これらの結果は、エストロゲン欠
乏後に起こる骨喪失の促進は、破骨細胞の数および寿命を増加および延長による
だけでなく、骨芽細胞の寿命（作用時間）の早期の減少によることを示す。骨細
胞のアポトーシスの増加は、骨細胞−小管機械的感覚網の欠陥によって骨格がさ
らに脆弱になり得る。
【０１６８】 実施例２ 実施例１に記載のｉｎ ｖｉｖｏデータと一致して、１７β−エストラジオー
ルは、用量依存性様式で、マウス頭蓋冠から単離した骨芽細胞のアポトーシスを
阻害した。特に、骨芽細胞のアポトーシスの阻害はまた、ウシ血清アルブミンと
結合した１７β−エストラジオール（膜不浸透性化合物）によって示すことがで
きた。１７α−エストラジオール（これまで不活性であると考えられていた化合
物）でも同一の効果を示すことができる。さらに、エストラトリエン−３−オー
ル（女性化特性を欠くと考えられていた化合物）によってエトポシド誘導性骨細
胞アポトーシスの阻害が示された（図３）。この実験では、骨芽細胞は、マウス
の頭蓋冠に由来し、ステロールで１時間前処理してプロアポトーシス剤であるエ
トポシドを添加した。
【０１６９】 実施例３ エストロゲン喪失が骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスを増加させることを
示すｉｎ ｖｉｖｏでの結果に関連して、１７β−エストラジオール、ＢＳＡと
結合させた１７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、およびエス
トラトリエン−３−オールはまた、確立された骨細胞株のアポトーシスを用量依
存的に阻害した（図４）。この実験では、ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、表示の濃度の種
々の化合物で１時間前処理し、プロアポトーシス剤であるエトポシドを添加した
。６時間後、アポトーシスを、図３に記載のようにトリパンブルーの取り込みに
よって同定した。
【０１７０】 実施例４ 図５に示すように、細胞を純粋なレセプターアンタゴニストＩＣＩ１８２，７
８０（１０−７Ｍ）で１時間前処理してエストロゲン化合物を添加した場合、骨
芽細胞に対する１０−８Ｍの１７β−エストラジオール、１７β−エストラジオ
ール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール、エストラトリエン−３−オール（Ｅ
−３−オール）の抗アポトーシス効果が抑制された。
【０１７１】 実施例５ 骨芽細胞に対する１７β−エストラジオール、１７β−エストラジオール−Ｂ
ＳＡ、１７α−エストラジオール、エストラトリエン−３−オール（Ｅ−３−オ
ール）のアポトーシス効果の場合のように、細胞を純粋なレセプターアンタゴニ
ストＩＣＩ１８２，７８０（１０−７Ｍ）で１時間前処理した場合、その腔アポ
トーシス効果は抑制された。まとめると、実施例４および実施例５の結果は、骨
芽細胞および骨細胞に対するこれらの化合物の抗アポトーシス効果はエストロゲ
ンレセプター（ＥＲ）によって媒介されていることを強く示唆している。
【０１７２】 実施例６ 本明細書中で試験した１７β−エストラジオールおよび関連化合物の抗アポト
ーシス効果にはエストロゲンレセプターが必要であるという決定的な証拠を、図
７に記載の実験結果から得た。この実験では、頭蓋冠細胞に代えて、たとえ存在
したとしても検出不可能な量のエストロゲンレセプターを含むヒトＨｅＬａ細胞
を使用した。ＨｅＬａ細胞を、マウスエストロゲンレセプターα（ｍＥＲα）の
ＣＭＶプロモーター駆動ｃＤＮＡまたはマウスエストロゲンレセプターβ（ｍＥ
Ｒβ）のＣＭＶプロモーター駆動ｃＤＮＡのいずれかで安定にトランスフェクト
した。安定なトランスフェクタントのサブコンフルエントな培養物を、１７β−
エストラジオール、または１７α−エストラジオール、エストラトリエン−３−
オール（１０−８Ｍ）で１時間処理し、その後エトポシド（５×１０−５Ｍ）と
６時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、トリパン
ブルー陽性細胞を列挙した。図７に示すように、３つの化合物は野生型ＨｅＬａ
細胞のアポトーシスに対していかなる効果も示さなかったが、エストロゲンレセ
プターαまたはエストロゲンレセプターβでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞
においてはエトポシド誘導性アポトーシスを阻害した。
【０１７３】 実施例７ 本明細書中に記載のエストロゲン化合物の抗アポトーシス効果のメカニズムを
、１０−８Ｍの濃度の１７α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、
１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、またはエストラトリエン−３−オールが細
胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化することを示すことによって確立
した。この実験では、ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を、無血清培地中で２５分間インキュ
ベートした。次いで、１７α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、
１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、またはエストラトリエン−３−オール（１
０−８Ｍ）を添加し、細胞をさらに５、１５、または３０分間インキュベートし
た。細胞溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によってタンパ
ク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ１お
よび２を認識する特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、全部の
細胞外シグナル調節キナーゼを認識する抗体で再ブロッティングした。ブロット
を、強化した化学発光によって発色させた。図８に示すように、これら全ての化
合物は、全量のＥＲＫ１／２に影響を受けることなくＥＲＫ１／２のリン酸化画
分を特異的に増加させた。この効果は非常に迅速であるので、エストロゲン作用
の古典的なメカニズムでは説明できない。代わりに、実施例４、実施例５、およ
び実施例６に示した実験によって示唆されるように、この効果は膜会合エストロ
ゲンレセプターによって媒介される非ゲノム作用と一致する。
【０１７４】 実施例８ １７α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、１７β−エストラジ
オール−ＢＳＡ、またはエストラトリエン−３−オールのＥＲＫを活性化する能
力は、ＥＲＫキナーゼの特異的インヒビターＰＤ９８０５９の存在下で抑制され
た。この実験では、ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を、５０μＭのＰＤ９８０５９の存在下
または非存在下で、無血清培地中で２５分間インキュベートした。次いで、１７
α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、１７β−エストラジオール
−ＢＳＡ、またはエストラトリエン−３−オール（１０−８Ｍ）を添加し、細胞
をさらに５分間インキュベートした。細胞溶解物を調製し、ポリアクリルアミド
ゲルでの電気泳動によってタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。リン酸化
細胞外シグナル調節キナーゼ１および２を認識する特異的抗体を用いてウェスタ
ンブロッティングを行い、全部の細胞外シグナル調節キナーゼを認識する抗体で
再ブロッティングした。ブロットを、強化した化学発光によって発色させた。
【０１７５】 実施例９ 実際に、本明細書中で試験した全ての化合物の抗アポトーシス効果がＥＲＫの
活性化によって媒介されていることは、図１０に示した実験の結果によって確立
された。この実験では、ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を、ＥＲＫ活性化の特異的インヒビ
ターであるＰＤ９８０５９で１時間前処理した後、１０−８Ｍの１７α−エスト
ラジオール、１７β−エストラジオール、または１７β−エストラジオール−Ｂ
ＳＡを添加した。図３に示すように、アポトーシスは、プロアポトーシス剤デキ
サメタゾンとの６時間のインキュベーションによって誘導され、定量された。Ｐ
Ｄ９８０５９は、この実験で試験した３つ全ての化合物の抗アポトーシス効果を
阻害した。
【０１７６】 結論として、上記の実施例で得られた結果により、ｉｎ ｖｉｖｏでのエスト
ロゲンの喪失により骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスの罹患が数倍増加する
ことが示される。ｉｎ ｖｉｖｏでの所見と一致して、１７β−エストラジオー
ル、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、およびエストラトリエン−３−オール
と同様に、１７α−エストラジオールもマウス頭蓋冠由来の骨芽細胞または骨細
胞（本明細書中では細胞株ＭＬＯ−Ｙ４）のアポトーシスを阻害する。これら全
ての化合物の抗アポトーシス効果には、エストロゲンレセプターαまたはエスト
ロゲンレセプターβのいずれかの存在が必要であり、これらの化合物の特異的Ｍ
ＡＰキナーゼ（すなわち、細胞外シグナル調節キナーゼ）を活性化する能力によ
って媒介される。
【０１７７】 実施例１０ エストロゲン化合物での結果と類似して、アンドロゲン化合物もまたエトポシ
ドで誘導されるマウス頭蓋冠由来の骨芽細胞のアポトーシスを阻害する（表３）
。これらの実験では、アンドロゲンレセプターアンタゴニストであるフルタミド
の存在下または非存在下で表示濃度の種々の化合物で１時間細胞を前処理し、プ
ロアポトーシス剤エトポシドを添加した。６時間後、アポトーシスを、図３に記
載のようにトリパンブルーの取り込みによって同定した。特に、エストロゲン化
合物の場合のように、これら全ての効果は、アンドロゲンレセプターによって明
らかに媒介されており、これは、特異的なアンドロゲンレセプターアンタゴニス
トによるアンドロゲン化合物の抗アポトーシス効果の阻害によって証明された。
さらに、エストロゲンの場合と同様に、エトポシド誘導性アポトーシスのアンド
ロゲンレセプター媒介性保護が、膜不浸透性アンドロゲン（ＢＳＡと結合したテ
ストステロン−１７β−ヘミスクシネート）で認められ、これは、膜会合エスト
ロゲンレセプターと類似の膜会合アンドロゲンレセプターの存在を強く示唆して
いる。
【０１７８】
【表１】
【０１７９】 実施例１１ エストロゲン化合物の抗アポトーシス効果がその転写活性から無関係であると
いうことを、エストラトリエン−３−オールでさえも１７β−エストラジオール
と同様のアポトーシス阻害であるのに対し、１７β−エストラジオールはエスト
ロゲンレセプターαによってエストロゲン反応エレメントを転写活性化しないこ
とを示すことによって確立した。この実験では、ｈＥＲαを、ルシフェラーゼ遺
伝子を駆動する３コピーのエストロゲン反応エレメントを含むレセプター構築物
と共に２９３細胞（構成ＥＲαを欠く）中で過剰発現させた。光単位を計数し、
トランスフェクション効率の相違を調節するために同時発現したβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を正常化した。
【０１８０】 実施例１２ 本明細書中では、動物モデルにおける骨芽細胞および骨細胞に対して抗アポト
ーシス効果を有するが、転写活性が減少した化合物（例えば、エストラトリエン
−３−オール）を評価することを目的とした研究用の一般的なプロトコールを提
供する。この設計にしたがって、エストロゲン過多またはエストロゲン欠乏マウ
ス、ラット、イヌ、霊長類などまたは退行性骨粗鬆症および／または骨芽細胞産
生不全の代表的動物モデル（例えば、老化促進マウスＳＡＭＰ６（Ｊｉｌｋａら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７、１７３２〜１７４０、１９９６））、
または糖質コルチコイド過剰動物モデル（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２、２７４〜２８２、１９９８）に、エストラ
トリエン−３−オールまたは他の試験化合物を投与して、これらの化合物が骨芽
細胞および骨細胞のアポトーシスを抑制することができるかどうかおよびアポト
ーシスの変化がＢＭＤ、骨形成速度、または海綿状骨体積の変化と関連するかど
うかを同定する。
【０１８１】 この種の代表的な実験では、群あたり６匹の４〜５ヶ月齢の雌のマウスを、成
体のピーク骨質量が得られるように実験開始の直前の４週間にＢＭＤについて２
回スクリーニングする。次いで、マウスの部分集合を卵巣切除する。無傷および
卵巣切除したマウスを、賦形剤または、２０、２００、もしくは２０００ｎｇ／
ｇ体重のエストラトリエン−３−オールまたは別の試験化合物で治療する。比較
のために、卵巣切除マウスを、２０ｎｇ／ｇ体重の１７β−エストラジオールで
も治療する。
【０１８２】 試験薬剤のストック溶液（１０，０００μｇ／ｍｌ）を、約２．０ｍｌの９５
％エタノール中に維持する。このストックを、９５％エタノールで希釈して、１
０００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度にする。ストックの濃度を、分
光光度計でチェックする。各動物への注射用に、試験薬剤をゴマ油で希釈し、超
音波処理する。試験薬剤を、別の日に皮下注射で２８日間投与する。マウスの体
重を毎週測定し、血清サンプルを骨の生化学的マーカー（オステオカルシンまた
はコラーゲン架橋など）の分析用に適切な回数で回収する。各実験終了の２日前
および８日前の抗生物質（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって、テトラサイクリン
標識を行う。表１は、各動物が１回の注射あたり１００μｌの試験薬剤を投与さ
れた、５つの群に分けた２５ｇのマウスの代表例を示す。
【０１８３】
【表２】
【０１８４】 ２８日の実験期間中、０日目、１４日目、および２８日目の生きた動物におい
てＢＭＤを測定した。実験の終了時の動物の屠殺後、椎骨Ｌ１〜Ｌ４を、骨芽細
胞および骨細胞のアポトーシスの罹患の同定および他の静的および動的な組織形
態計測のために脱灰しないでメチルメタクリレートプラスチック中で固定および
包埋する。比較、三点屈曲（３ ｐｏｉｎｔ ｂｅｎｄｉｎｇ）および他の適切
な生化学的試験による化合物の抗骨折効果の同定用にＬ５椎骨を単離する。これ
らの化合物の予想される効果を確認する結果として、骨芽細胞および／または骨
細胞のアポトーシスの減少、および／または正のＢＭＤ変化、および／または海
綿状骨領域の増加、および／または骨形成速度の増加、および／または生体力学
的強度の増加が示される。
【０１８５】 例として、エストロゲン過多（無傷）マウスまたはエストロゲン欠乏（卵巣切
除）マウスに２０００ｎｇ／ｇ体重のエストラトリエン−３−オールを２８日間
投与した実験の結果を、表２に示す。
【０１８６】
【表３】
【０１８７】 各列は、それぞれの動物の値を示す。最初の３つの番号のセットは、０日目の
最初のＢＭＤ測定値（カスタマイズしたソフトウェアを用いた、Ｈｏｌｏｇｉｃ
ＱＤＲ２０００プラスでの２エネルギーＸ線吸光光度分析法による）および最
後の３つは実験終了時のＢＭＤ測定値を示す。全体＝前骨格−頭部および尾部の
ＢＭＤ、片側骨盤＝両後肢の平均ＢＭＤ、脊椎＝頸部、胸部、および腰椎。
【０１８８】 実施例１３ 本明細書中では、エストラトリエン−３−オールなどの化合物の抗骨折効果を
評価する一般的な実験プロトコールを提供する。この設計にしたがって、エスト
ロゲン過多またはエストロゲン欠乏マウス、ラット、イヌ、霊長類などまたは退
行性骨粗鬆症および／または骨芽細胞産生不全の代表的動物モデル（例えば、老
化促進マウスＳＡＭＰ６（Ｊｉｌｋａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７
、１７３２〜１７４０、１９９６））、または糖質コルチコイド過剰動物モデル
（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２、２
７４〜２８２、１９９８）に、エストラトリエン−３−オールを投与して、これ
らの化合物が骨強度を増加させることができるかどうかを同定する。
【０１８９】 この種の代表的な実験では、群あたり７匹の４〜５ヶ月齢の雌のマウスを、成
体のピーク骨質量が得られるように実験開始の直前の４週間にＢＭＤについて２
回スクリーニングする。次いで、マウスの部分集合を卵巣切除する。無傷および
卵巣切除したマウスを、賦形剤または、２０、２００、もしくは２０００ｎｇ／
ｇ体重のエストラトリエン−３−オールまたは別のＡＮＧＥＬ化合物で治療する
。比較のために、卵巣切除マウスを、２０ｎｇ／ｇ体重の１７β−エストラジオ
ールでも治療する。第５の腰椎マウス椎骨（Ｌ５）の性質を保有する最大荷重を
同定する。これは、サーボ制御油圧軸ねじり物質試験装置（Ｍｏｄｅｌ ＭＴＳ
８１０ Ｂｉｏｎｘ、ＭＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．、Ｅｄｅｎ Ｐｒ
ａｉｒｉｅ、ＭＮ）およびＬｅｂｏｗロードセル（Ｅａｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ、Ｔｒｏｙ、ＭＩ）を用いて行う。データを収集し、ＬａｂＶＩＥＷソフトウ
ェアパッケージおよび捕捉／信号処理ボード（Ｍｏｄｅｌ ＮＢ−ＭＩＯ−１６
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕ
ｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて分析する。
【０１９０】 最大荷重の保有に使用したＬ５検体を、周囲の柔組織を取り除き、０．０１ｍ
ｍの分解能のデジタルキャリパ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｍｏｄｅｌ ＃５００−１
９６、Ａｃｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｆｔ．Ｓｍｉｔｈ、ＡＲ）で長さおよび直径を記録
する。椎骨を、調製および試験の間中生理食塩水を染み込ませたガーゼで覆い、
試験まで４℃で一晩保存する。椎骨を、頭尾軸に沿って平行負荷試験台の間で破
壊するまで圧搾し、最大荷重（ニュートン）および移動距離（ｄｉｓｐｌａｃｅ
ｍｅｎｔ）（ｍｍ）を記録する。
【０１９１】 例として、エストロゲン過多（無傷）マウスまたはエストロゲン欠乏（卵巣切
除）マウス（実施例１２に記載の動物と同一）に２０００ｎｇ／ｇ体重のエスト
ラトリエン−３−オールを２８日間投与した実験の結果を、表４に示す。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】 実施例１４ エストロゲン化合物の抗アポトーシス効果がその転写効果と機構的に無関係で
あるかどうかを決定するために、転写活性に対してアポトーシスが阻害されるレ
セプタータンパク質の特異的高次構造変化を模索する。この研究の基本的原理は
、ＥＲの転写活性がレセプタータンパク質のリガンド誘導性高次構造変化に非常
に依存するという最近の証拠に基づいた。実際に、ファージディスプレイライブ
ラリーを用いて、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌおよび共同者は、エストロゲンレセプター
の明確な高次構造の変化を認識する４つのクラスの小さなペプチド（１１アミノ
酸）をスクリーニングして単離し、コンセンサスＥＲＥについて試験した場合、
特異的リガンド（例えば、エストラジオールであるがタモキシフェンではなく、
その逆も同様）由来の転写を選択的に阻害することができるか、またはＥＲαで
あるがＥＲβではない（その逆も同様）によって媒介される転写を選択的に阻害
することができる（Ｎｏｒｒｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、７４４〜７４６
、１９９９）。第１のクラスは、ＬＸＸＬＬモチーフを含み、エストラジオール
活性化ＥＲαおよびＥＲβの両方と相互作用することができる。第２のクラスは
、エストラジオールおよびタモキシフェン活性化ＥＲαと特異的相互作用を示し
、第３のクラスは、タモキシフェン活性化ＥＲβと特異的に相互作用することが
できる。さらに、ＳＲＥＷＦＸＸＸＬ保存モチーフを有する第４のクラスは、タ
モキシフェン活性化ＥＲαおよびＥＲβと複合体を形成することが見出された。
実際、これらのペプチドおよびＧａｌ４−ＤＮＡ結合ドメインで融合タンパク質
を作製して、ＨｅＬａ細胞においてＥＲと同時発現した場合、融合タンパク質は
リガンド−レセプター複合体特異的アンタゴニストとして機能するので、これは
、リガンドの活性化がレセプタータンパク質に特異的な高次構造の変化の付与に
よって転写活性を引き起こすことを示す（Ｐａｉｇｅ ＬＡ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ ＤＪ、Ｇｒｏｎ Ｈ、Ｎｏｒｒｉｓ ＪＤ、Ｇｏｔｔｌｉｎ ＥＢ、Ｐ
ａｄｉｌｌａ ＫＭ、Ｃｈａｎｇｅ Ｃ−Ｙ、Ｂａｌｌａｓ ＬＭ、Ｈａｍｉｌ
ｔｏｎ ＰＴ、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ＤＰ、Ｆｏｗｌｋｅｓ ＤＭ、エストロゲ
ンレセプター（ＥＲ）モジュレーターは、ＥＲαおよびＥＲβにおける明確な高
次構造変化を誘導する、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６、３９
９９〜４００４、１９９９）。
【０１９４】 ＢＳＡと結合させた１７β−エストラジオールなどのエストロゲン化合物が少
なくともエストロゲンほどの強力な抗アポトーシス効果を有する一方で有意に減
少した転写活性を有するという所見に基づいて、エストロゲンの非ゲノム抗アポ
トーシス効果を、ＥＲの転写効果を必要とする高次構造の変化と比較して、ＥＲ
の明確なリガンド依存性高次構造変化によって開始することができるという仮説
を試験した。実際、分離する高次構造の変化が存在することが見出された。これ
に基づいて、２セットの作用の明確な分離機構の基本を説明することができる。
この知識は、非転写効果を示すが、転写活性化の開始能力を欠くリガンドについ
ての、本明細書中に記載のスクリーニングストラテジーの設計の基本を形成する
。
【０１９５】 当業者は、本発明は、目的を遂行し、記載の結果および利点ならびに本明細書
中に固有の目的、結果、および利点を得るために十分に適用されることを容易に
認識する。本発明の実施例は、本明細書中に記載の方法、手順、処理、分子、お
よび特異的化合物と共に、好ましい実施形態の代表および例示であり、本発明の
範囲の限定を意図しない。当業者は、本発明を変更および他の用途で使用するこ
とができるが、これは、特許請求の範囲で定義のように、本発明の精神の範囲内
に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 骨強度に悪影響を及ぼすことなく骨量を増加させるために使用され得る化合物
の１クラスの非限定例を示す。
【図２】 マウス椎骨中の骨芽細胞及び骨細胞のアポトーシス度をエストロゲン欠乏を関
数として示す棒グラフである。
【図３】 エトポシド誘導骨芽細胞アポトーシス（％）対添加したエストロゲン、すなわ
ち１７β−エストラジオール、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エ
ストラジオール及びエストラトリエン−３−オールの濃度のｌｏｇを示す棒グラ
フである。
【図４】 骨細胞（ＭＬＯ−Ｙ４）のエトポシド誘導アポトーシスの１７β−エストラジ
オール、１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール及びエ
ストラトリエン−３−オールによる抑制を示す棒グラフである。
【図５】 骨芽細胞のエトポシド誘導アポトーシスに対する１７β−エストラジオール、
１７β−エストラジオール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール及びエストラト
リエン−３−オールの抗アポトーシス効果がエストロゲン受容体アンタゴニスト
のＩＣＩ１８２，７８０により阻害されることを示す棒グラフである。
【図６】 ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞に対する１７β−エストラジオール、１７β−エストラジ
オール−ＢＳＡ、１７α−エストラジオール及びエストラトリエン−３−オー（
Ｅ−３−ｏｌ）の抗アポトーシス効果がエストロゲン受容体アンタゴニストのＩ
ＣＩ１８２，７８０により阻害されることを示す棒グラフである。
【図７】 骨芽細胞のエトポシド誘導アポトーシスに対する１７β−エストラジオール、
１７α−エストラジオール及びエストラトリエン−３−オールの抗アポトーシス
効果のためにエストロゲン受容体αまたはβが必要であることを示す棒グラフで
ある。
【図８】 １７β−エストラジオール、１７α−エストラジオール、１７β−エストラジ
オール−ＢＳＡまたはエストラトリエン−３−オールが細胞外シグナル調節キナ
ーゼ（ＥＲＫ）を活性化することを示すウェスタンブロットである。
【図９】 ＥＲＫ１／２の活性化に対するエストロゲン化合物の効果がＥＲＫキナーゼの
特異的阻害剤のＰＤ９８０５９によりブロックされることを示すウェスタンブロ
ットである。
【図１０】 ＥＲＫ活性化の特異的阻害剤であるＰＤ９８０５９が１７β−エストラジオー
ル及び関連化合物の抗アポトーシス効果を無効にすることを示す棒グラフである
。
【図１１】 １７β−エストラジオールとは異なり、エストラトリエン−３−オールはＥＲ
αを介してエストロゲン応答エレメントをトランス作用しないことを示す。
【図１２】 特定の３環化合物の化学構造を示す。
【図１３】 番号を付した炭素と共に一般化したコア環構造を示す。図１３ａは４環構造、
図１３ｂは３環構造、図１３ｃは２環構造（融合）、図１３ｄは２環構造（非融
合）を示す。
【図１４】 エストロゲン活性の３つのメカニズムを示す。図１４Ａはエストロゲンの抗ア
ポトーシス効果、図１４Ｂはエストロゲンの抗再構築効果、図１４Ｃはエストロ
ゲンの女性化効果を示す。
【図１５】 骨芽細胞及び骨細胞のアポトーシスに対する抗吸収剤（例えば、１７β−エス
トラジオール）対非抗吸収剤（例えば、エストラトリエン−３−オールまたは間
欠性ＰＴＨ）の活性を比較する。
【図１６Ａ】 図１に示した化合物のＲ１及びＲ２置換基の例のリストである。
【図１６Ｂ】 α及びβ−エストラジオールの分子構造を示す。
【図１７】 抗アポトーシス特性を有するエストラトリエンの化学構造を示す。
【図１８】 抗アポトーシス特性を有するエストラジオール、フェノール及びジフェノール
の化学構造を示す。
【図１９】 遺伝子プロモータを含む最小ＥＲＥの転写活性に対する１７β−エストラジオ
ールの効果及びこの効果のエストロゲン受容体タンパク質のリガンド誘導特異的
コンホメーション変化を認識するペプチド（αＩＩ）による阻害を示す。
【図２０】 ＩＬ−６プロモーターの転写活性に対する１７β−エストラジオールの効果及
びこの効果のエストロゲン受容体タンパク質のリガンド誘導特異的コンフォーメ
ーション変化を認識するペプチド（αＩＩ）による阻害を示す。
【図２１】 ＢＳＡとコンジュゲートした１７β−エストラジオールの抗アポトーシス効果
及びこの特殊効果のコンホメーション感受性ペプチドαＩＩによる阻害の欠乏を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/353 Ａ６１Ｋ 31/353 31/663 31/663 31/7016 31/7016 33/08 33/08 33/10 33/10 33/24 33/24 38/22 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 3/02 Ａ６１Ｐ 3/02 19/00 19/00 39/06 39/06 Ａ６１Ｋ 37/24 (31)優先権主張番号 ６０／１１６，４０９ (32)優先日 平成11年１月19日(1999．1．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１０３，３８５ (32)優先日 平成11年２月８日(1999．2．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３６，２６０ (32)優先日 平成11年５月27日(1999．5．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１５１，４８６ (32)優先日 平成11年８月30日(1999．8．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジルカ，ロバート・エル アメリカ合衆国、アーカンサス・72211、 リトル・ロツク、クレアボーン・14202 (72)発明者 ワインシユタイン，ロバート・エス アメリカ合衆国、アーカンサス・72211、 リトル・ロツク、シヤルメツト・11 (72)発明者 ベリード，テレジータ アメリカ合衆国、アーカンサス・72211、 リトル・ロツク、ウエストグレン・コー ブ・９ (72)発明者 ボードナー，ドナルド アメリカ合衆国、アーカンサス・72227、 リトル・ロツク、フオツクスクラフト・ 3312 (72)発明者 クステーニ，スタブローラ アメリカ合衆国、アーカンサス・72211、 リトル・ロツク、シヤンベリー・ドライ ブ・14715 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 DB01 DB31 DB32 MA52 NA14 ZA962 ZC022 ZC212 4C086 AA02 BA08 EA03 MA04 MA10 MA52 NA14 ZA96 ZC02 ZC03 ZC21 4C206 AA02 AA03 FA23 MA03 MA04 MA72 NA14 ZA96 ZC02 ZC03 ZC21

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨の強度や性質を損なうことなく宿主において骨量を少なく
    とも１０％増加させる方法において、（ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましく
    は少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数を有するエストロゲンαもしくはβ受容
    体（または宿主動物における同等の受容体）に結合する；（ｉｉ）（ａ）少なく
    とも０．１ｎｇ／ｋｇの用量で１０−１１〜１０−７Ｍの濃度でin vivoでまた
    は天然エストロゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは骨細胞またはエストロゲン
    受容体でトランスフェクションされた細胞においてin vitroで投与した場合に１
    ７β−エストラジオールと比較して１０％以下、好ましくは１７β−エストラジ
    オールと比較して５、１または０．１％以下のレベルでエストロゲン遺伝子転写
    活性を誘発する、あるいは（ｂ）１７β−エストラジオール（または宿主動物に
    おける同等の化合物）と比較して１０％以下の子宮重量増加を誘発する；（ｉｉ
    ｉ）少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇの用量でin vivoでまたは天然エストロゲン受
    容体を有する骨芽細胞またはエストロゲン受容体でトランスフェクションされた
    細胞において１０−１１〜１０−７Ｍの濃度でin vitroで投与した場合に、細胞
    外信号調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘発する；さらには（ｉｖ）天然エ
    ストロゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは骨細胞またはエストロゲン受容体で
    トランスフェクションされた細胞においてin vitroで少なくとも０．１ｎｇ／ｋ
    ｇのin vivo用量で骨芽細胞に対して抗アポトーシス効果を有する、有効量の化
    合物を投与する段階を有することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記化合物がエストロゲン化合物以外である請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記化合物がエストロゲンである請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記エストロゲン化合物が、該化合物が細胞に進入するのを
    防止するが該化合物のエストロゲン細胞表面受容体への結合にほとんど影響しな
    い置換基を結合させることで非エストロゲンに変換されている請求項３に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 骨の強度や性質を損なうことなく宿主において骨量を少なく
    とも１０％増加させる方法において、（ｉ）少なくとも１０８Ｍ−１、好ましく
    は少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数を有するアンドロゲン受容体（または宿
    主動物における同等の受容体）に結合する；（ｉｉ）（ａ）少なくとも０．１ｎ
    ｇ／ｋｇの用量でin vivoでまたは天然アンドロゲン受容体を有する骨芽細胞ま
    たはアンドロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞において１０−１１ 〜１０−７Ｍの濃度でin vitroで投与した場合にテストステロンと比較して１０
    ％以下、好ましくはテストステロンと比較して５、１または０．１％以下のレベ
    ルでアンドロゲン遺伝子転写活性を誘発する、あるいは（ｂ）テストステロン（
    または宿主動物における同等の化合物）によって誘発されるものの１０％以下の
    女性における筋量もしくは男性化増加を誘発する；（ｉｉｉ）少なくとも０．１
    ｎｇ／ｋｇの用量でin vivoでまたは天然アンドロゲン受容体を有する骨芽細胞
    またはアンドロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞においてin vitro
    で投与した場合に、細胞外信号調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘発する；
    さらには（ｉｖ）少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇのin vivo用量で骨芽細胞に対し
    てまたは天然アンドロゲン受容体を有するもしくはアンドロゲン受容体でトラン
    スフェクションされた骨芽細胞においてin vitroで抗アポトーシス効果を有する
    、有効量の化合物を投与する段階を有することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 前記化合物がアンドロゲン以外である請求項６に記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 前記化合物がアンドロゲンである請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記アンドロゲンが、該化合物が細胞に進入するのを防止す
    るが該化合物のアンドロゲン細胞表面受容体に結合する能力にほとんど影響しな
    い置換基を結合させることで非アンドロゲンに変換されている請求項８に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 前記化合物がさらに、少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇのin viv
    o用量で破骨細胞に対して、あるいは天然エストロゲン受容体を有する破骨細胞
    またはエストロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞においてアポトー
    シス促進効果をも有する請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記化合物がさらに、少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇのin v
    ivo用量で破骨細胞に対して、あるいは天然エストロゲン受容体を有する破骨細
    胞またはエストロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞においてアポト
    ーシス促進効果をも有する請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 骨の強度や性質を損なうことなく宿主において骨量を少な
    くとも１０％増加させる化合物の選択方法において、該化合物が（ｉ）少なくと
    も１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の会合定数を有するエス
    トロゲンもしくはアンドロゲン受容体（または宿主動物における同等の受容体）
    に結合する；（ｉｉ）（ａ）少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇの用量でin vivoでま
    たは天然アンドロゲンもしくはエストロゲン受容体を有する骨芽細胞またはアン
    ドロゲンもしくはエストロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞におい
    てin vitroで投与した場合に１７β−エストラジオールもしくはテストステロン
    と比較して１０％以下、好ましくは適宜に１７β−エストラジオールもしくはテ
    ストステロンと比較して５、１または０．１％以下のレベルでエストロゲンもし
    くはアンドロゲン遺伝子転写活性を誘発する、あるいは（ｂ）１７β−エストラ
    ジオールによって誘発されるものの１０％以下の子宮重量増加またはテストステ
    ロン（または宿主動物における同等の化合物）によって誘発されるものの１０％
    以下の女性における筋量もしくは男性化増加を誘発する；（ｉｉｉ）少なくとも
    ０．１ｎｇ／ｋｇの用量でin vivoでまたは天然アンドロゲンもしくはエストロ
    ゲン受容体を有する骨芽細胞もしくは骨細胞またはアンドロゲンもしくはエスト
    ロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞においてin vitroで投与した場
    合に、細胞外信号調節キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化を誘発する；さらには（ｉ
    ｖ）少なくとも０．１ｎｇ／ｋｇのin vivo用量で骨芽細胞に対してまたは天然
    アンドロゲンもしくはエストロゲン受容体を有する骨芽細胞またはアンドロゲン
    もしくはエストロゲン受容体でトランスフェクションされた細胞においてin vit
    roで抗アポトーシス効果を有するか否かを評価する段階を有することを特徴とす
    る方法。
  12. 【請求項１２】 骨同化効果を有する化合物のスクリーニング方法において
    、ａ）骨芽細胞サンプルを化合物と接触させる段階；ならびにｂ）化合物処理し
    た細胞中でアポトーシスを受ける骨芽細胞数を、未処理の骨芽細胞サンプル中で
    アポトーシスを受ける骨芽細胞数と比較する段階を有することを特徴とする方法
    。
  13. 【請求項１３】 骨芽細胞／骨細胞抗アポトーシス効果によって患者におけ
    る細胞群への骨保護の提供方法において、該細胞群に対して有効な用量の化合物
    を投与する段階を有し；該化合物が末端フェノール基および少なくとも第２の環
    を有し；該化合物の分子量が１０００未満であることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 前記化合物が１７０を超える分子量を有する請求項１４に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記末端フェニル環が非ステロイド系化合物である請求項
    １４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記末端フェニル環がフェノール性Ａ環である請求項１６
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記化合物の前記有効な用量が、５００ｎＭ未満の血漿濃
    度である請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記血漿濃度が約０．０２ｎＭ〜約５００ｎＭである請求
    項１８に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記血漿濃度が約０．１ｎＭ〜約１ｎＭである請求項１９
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記化合物が、４環構造、３環構造および２環構造からな
    る群から選択される請求項１４に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記化合物が４環構造である場合に、前記有効用量が５０
    ０ｎＭ未満の血漿濃度を与える用量である請求項２１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記化合物が３環構造である場合に、該３環構造がフェナ
    ンスレン化合物である請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記フェナンスレン化合物が、テトラヒドロフェナンスレ
    ンおよびオクタヒドロフェナンスレンからなる群から選択される請求項２３に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記フェナンスレン化合物が、フェナンスレンメタノール
    およびフェナンスレンカルボキシアルデヒドからなる群から選択される請求項２
    ３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記化合物が２環構造である場合に、該２環構造が融合し
    ている請求項２１に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記融合２環構造が、ナフトールおよびナフタレンからな
    る群から選択される請求項２６に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記化合物が２環構造である場合に、該２環構造が非融合
    構造である請求項２１に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記非融合２環構造が連結基を有する請求項２８に記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】 前記化合物を還元剤との併用で投与する請求項１４に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 第２の医薬との併用で前記化合物を投与する段階をさらに
    有する請求項１に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記第２の医薬が骨抗吸収剤である請求項３１に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】 前記第２の医薬が骨量同化剤である請求項３１に記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 前記第２の医薬が酸化防止剤である請求項３１に記載の方
    法。
  34. 【請求項３４】 前記第２の医薬が栄養補助食品である請求項３１に記載の
    方法。
  35. 【請求項３５】 前記第２の医薬が骨の構造、強度または量に対する前記活
    性化合物の有用な効果を増強する請求項３１に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記第２の医薬が、同化ステロイド、ビスホスホネート、
    カルシトニン、エストロゲンもしくはプロゲストゲン、ラロキシフェンもしくは
    タモキシフェンなどの抗エストロゲン類、副甲状腺ホルモン、フッ化物、ビタミ
    ンＤもしくはそれの誘導体またはカルシウム製剤からなる群から選択される請求
    項３１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記第２の医薬が、アレンドロン酸、クロンドロン酸（cl
    ondronate）二ナトリウム、エチドロン酸二ナトリウム、メドロン酸二ナトリウ
    ム、オキシドロン酸（oxidronate）二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、
    ネリドロン酸（neridronic acid）、リセドロン酸（risedronic acid）、酢酸テ
    リパラチド、チルドロン酸（tiludronic acid）、イプリフラボン、重炭酸カリ
    ウム、プロゲストゲン、チアジド化合物、硝酸ガリウム、ＮＳＡＩＤＳ、プリカ
    マイシン、水酸化アルミニウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウム
    、炭酸マグネシウムおよびスクラルフェートからなる群から選択される請求項３
    １に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 第２の医薬との併用で前記化合物を投与する段階をさらに
    有する請求項６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記第２の医薬が骨抗吸収剤である請求項３９に記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】 前記第２の医薬が骨量同化剤である請求項３９に記載の方
    法。
  41. 【請求項４１】 前記第２の医薬が酸化防止剤である請求項３９に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】 前記第２の医薬が栄養補助食品である請求項３９に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 前記第２の医薬が骨の構造、強度または量に対する前記活
    性化合物の有用な効果を増強する請求項３９に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記第２の医薬が、同化ステロイド、ビスホスホネート、
    カルシトニン、エストロゲンもしくはプロゲストゲン、ラロキシフェンもしくは
    タモキシフェンなどの抗エストロゲン類、副甲状腺ホルモン、フッ化物、ビタミ
    ンＤもしくはそれの誘導体またはカルシウム製剤からなる群から選択される請求
    項３９に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記第２の医薬が、アレンドロン酸、クロンドロン酸二ナ
    トリウム、エチドロン酸二ナトリウム、メドロン酸二ナトリウム、オキシドロン
    酸二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、ネリドロン酸、リセドロン酸、酢
    酸テリパラチド、チルドロン酸、イプリフラボン、重炭酸カリウム、プロゲスト
    ゲン、チアジド化合物、硝酸ガリウム、ＮＳＡＩＤＳ、プリカマイシン、水酸化
    アルミニウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウム、炭酸マグネシウ
    ムおよびスクラルフェートからなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
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